440 Br~ves communications - Brevi comunicazioni [ExPERIENTIA VOL. X I / 11]

Total ultraviolet absorption at 260 m/~ of perchloric acid extracts of non-aqueous nuclei isolated from various rabbit tissues 1 ml extract is derived from an amount of nuclei containing 10 ~g DNA-P.

Tissue Optical density (mean and range)

Appendix Bone marrow Intestinal mucosa Lung Thymus. Embryo liver

DNA-P RNA-P % dry wt

1.01 0.48 0.67 0.30 0"64 0'45 0"45 0"27 1.68 0.35 0.38 0,37

0.469 (0-294-0.644) 0-580 (0-440-0.720) 0.673 (0-493-0.853) 0.818 (0-551-1-085) 0-277 (0-183-0.371) 1.031 (0.512-1.550)

(12)* ( 5 ) ( 7 ) (11) ( 7 ) ( 3 )

* Figures in brackets show the

t i s sues m a y be a r r a n g e d in t h e fo l lowing o rde r of de- c reas ing c o n t e n t of ac id so lub le u l t r a v i o l e t a b s o r b i n g m a t e r i a l : - L u n g , I n t e s t i n a l mucosa , B o n e mar row, A p p e n d i x , T h y m u s .

In e m b r y o l iver nucle i t h e m e a n va lue is h ighe r t h a n for a n y of t h e a d u l t t i s sues b u t aga in t h e s c a t t e r is v e r y grea t . H i g h va lues were also f o u n d in t w o p r e p a r a t i o n s of n o n - a q u e o u s nucle i f r o m t h e fowl G R C H 16 t u m o u r .

T h e n u c l e o t i d e bases f o u n d in t h e acid e x t r a c t s in- c l u d e d a d e n i n e w h i c h was m o s t a b u n d a n t , h y p o x a n t h i n e , guanine , uraci l a n d v e r y smal l a m o u n t s of cy tos ine . In t h e nuc leos ide a n d free base f r ac t ion t h e bases were less p l en t i fu l t h a n in t h e n u d e o t i d e f rac t ion . A d e n i n e a n d h y p o x a n t h i n e were m o s t a b u n d a n t ; guan ine a n d uraci l were p r e s e n t in smal le r a m o u n t s a n d cy to s ine was f o u n d only in t races .

The s c a t t e r of va lues in d i f f e ren t p r e p a r a t i o n s was v e r y g rea t b u t t h e t i s sues could be a r r a n g e d in t h e fol lowing o rder of dcc reas ing base c o n t e n t :

Nucleotide bases: (a) Adenine. I n t e s t i n a l mucosa , bone mar row, a p p e n -

d ix = lung, t h y m u s . (b) Hypoxanthine. I n t e s t i n a l m u e o s a = lung, bone mar -

row, a p p e n d i x , t h y m u s . (c) Guanine. I n t e s t i n a l mucosa , b o n e m a r r o w = lung,

a p p e n d i x , t h y m u s . (d) Uracil. I n t e s t i n a l m u cosa = bone m a r r o w = a p p e n -

dix = lung, t h y m u s . (e) Cytosine. No i m p o r t a n t d i f f e r ences -a l l va lues low.

Non-nueleotide bases: (a) .4 denine. No p a r t i c u l a r t r e n d as i nd iv idua l d i f fe ren-

ces were t oo grea t . (b) Hypoxanthine. I n t e s t i n a l m u c o s a = lung, bone m a r -

row = a p p e n d i x , t h y m u s . (c) Guanine. No i m p o r t a n t d i f f e rences -a l l va lues low. (d) Uracil. No i m p o r t a n t d i f f e r ences -a l l va lues low. (e) Cytosine. P r e s e n t on ly in t races .

Resu l t s f r o m t w o p r e p a r a t i o n s of G R C H 16 t u m o u r nucle i sugges t t h a t t h e s e nuc le i a re r ich in a d e n i n e nuc leo t ides b u t t h e m o s t su rp r i s ing f ea tu re of t h i s ma te r i a l is t h e v e r y h igh c o n t e n t of n o n - n u c l e o t i d e h y p o x a n t h i n e . This m a y be due in p a r t t o autol~cic changes occur r ing e i ther before r e m o v a l f r o m t h e an ima l or dur ing the p rocess ing of t h e t i ssue ,

Since mono- , di- a n d t r i -nuc l eo t ides of aden ine , guanine , cy tos ine a n d uraci l are k n o w n to be p r e s e n t genera l ly in l iv ing cells (SACKS, LUTWAK, a n d HURLEY1; SCHMITZ, POTTER, HURLBERT, a n d WHITE2; SCHMITZ,

I j . SACKS, L. LUTWAK, and P. D. HURLEY, J. Amer. chem. Soc. 76, 424 (1954).

2 H. SCHMITZ, V. R. POTTER, R. B. HUELBERT, and D. M. W~txrE, Cancer Res. 14, 66 (1954).

number of extracts examined.

HURLBERT, a n d POTTE~I; SMITH a n d MILLS2), i t is no t s u r p r i s i n g to f i nd ev idence of t h e occu r r ence of t h e s e bases a n d h y p o x a n t h i n e as nuc leo t ides , nuc leos ides a n d free bases in ac id e x t r a c t s of n o n - a q u e o u s rmclei. Nueleo- t i des of t h e s e bases h a v e also been o b s e r v e d b y E•- MUNDS a n d LEPAGE a in nucle i p r e p a r e d in a q u e o u s sucrose h o m o g e n a t e s of l ive r a n d of F l e x n e r Job l ing c a r c i n o m a .

I t is i n t e r e s t i n g h o w e v e r t o f i nd t h a t in a d u l t r a b b i t t i s sues t h e r e is no ev idence of a n y p r e f e r e n t i a l a c c u m u l a - t ion of such m a t e r i a l s in t h o s e t i s sues in wh ich cell d iv i s ion is ac t ive a n d t h e t u r n o v e r of D N A is h igh (SMELLIE et al.~).

This w o r k is be ing c o n t i n u e d on a larger scale w i th m a t e r i a l label led w i t h x*C.

Acknowledgment :-This work was carried out with the aid of grants from the Medical Research Council and the British Empire Cancer Campaign.

E. R. M. KAY ~ a n d J. N. DAVIDSON

Department o[ Biochemistry, The University o/ Glas- gow, Scotland, August 30, 1955.

Zusammen/assung Zel lkerne, die aus K a n i n c h e n g e w e b e m i t t e l s e ines

nichtw~tssr igen V e r f a h r e n s b e r e i t e t w e r d e n , e n t h a l t e n in ih ren s / iurel6sl ichen B e s t a n d t e i l e n N u k l e o t i d e y o n Aden in , H y p o x a n t h i n , Guan in , Urac i l und (in s e h r ge- r i ngen Mengen) y o n Cytos in . Diese Stof fe w u r d e n in Lunge , D a r m - M u c o s a , K n o c h e n m a r k , A p p e n d i x und T h y m u s in a b n e h m e n d e r K o n z e n t r a t i o n v o r g e f u n d e n .

1 H. SCHMITZ, R. B. HURLBERT, and V. R. POTTER, J. biol. Chem. 209, 41 (1954).

2 E. E. B. Smr~i and G. T. MILLS, Biochim. biophys. Acts 13, 386 (I954); 13, 587 (1954).

a M. P. EDMONDS and S. A. LEPAOE, Cancer Res. 15, 93 (1955). 4 R. M. S. SMELLm, G. F. HUMeHREV, E. R. M. K~Y, and J. N.

DAVIDSON, Biocheul. J. 60, 177 (1955). s British Empire Cancer Campaign Research Fellow.

tiber das 2+ • C u - B m d u n g s v e r m b g e n einiger Aminosiiuren und Peptide

Metallionen und biologische Wirkung 1

Wir h a b e n in e iner f r t iher e r s c h i e n e n e n A r b e i t 2 ge- zeigt , wie das Cu2+-Bindungsve rm6gen y o n b io log ischen S y s t e m e n d u r c h das V o r h a n d e n s e i n y o n gel6s ten basi- s chen P a r t i k e l n b e s t i m m t wird. Die Menge der ge funde-

x 37. Mitteilung; 36. Mitteilung: R. GAI.n und H. F.RLENMEYER, Helv. chim. Acta 38, 1421 (1955).

2 S. FALLAB und H. ERLENMEVER, Exper. 11, 174 (1955).

[15. XI. 1955] Kurze Mitteihmgen - Brief Reports 441

nen Cu 2+ im Plasma wird demnach in der l-Iauptsache yon der l~onzentration und der Art der vorhandenen Proteine abhXngen. Ausgehend yore Cu2+-Bindungs - verm6gen einfacher Peptide als Proteinmodelle, wie Glycyl-Glycyl-Glycin, hatten wir versucht, das Verh~ilt- nis yon gebundenen und freien Cu 2+ im Plasma des Menschen zu berechnen.

Um gerlauere Kenntnis fiber die sich im Organismus a b s p i e l e n d e n IReakt ionen, a n d e n e n Cu2+ b e t e i l i g t s ind , zu e r h a l t e n , i n t e r e s s i e r t e n wir u n s in der Fo lge ftir da s C u 2 + - B i n d u n g s v e r m 6 g e n y o n in P l a s m a p r o t e i n e n vor - k o m m e n d e n S t r u k t u r k o m p o n e n t e n .

Be i e i n f a c h e n V e r b i n d u n g e n gen i ig t die A n g a b e e ine r e inz igen Masszah l , z u m Beisp ie l de r G l e i c h g e w i c h t s - k o n s t a n t e n , zu r B e r e c h n u n g de r K o n z e n t r a t i o n e n a l le r a n e i n e m G l e i c h g e w i c h t b e t e i l i g t e n P a r t i k e l , u n d d a m i t a u c h zu r E r m i t t l u n g des C u 2 + - B i n d u n g s v e r m 6 g e n s .

"Wenn h i n g e g e n die S t r u k t u r de r V e r b i n d u n g m e h - re re zu r K o m p l e x b i l d u n g bef~ihigte G r u p p e n aufweis t , wie dies be i P e p t i d e n u n d P r o t e i n e n de r F a l l is t , i s t es b e d e u t e n d schwier iger , die fi ir die C h a r a k t e r i s i e r u n g a l le r m 6 g l i c h e n G le i chgewich t e n o t w e n d i g e n K o n s t a n - t e n zu e r m i t t e l n u n d a n H a n d so lche r K o n s t a n t e n die Menge Cu "+, die diese V e r b i n d u n g . a u s e ine r L 6 s u n g zu b i n d e n v e r m a g , zu b e r e c h n e n .

Es w a r d a h e r fiir e ine S y s t e m a t i k b io log i sche r Sy- s t e r n e e rwi in sch t , e ine e in fache , d i r ek t e M e t h o d e zu r E r m i ~ t l u n g y o n v e r g l e i c h b a r e n W e r t e n des Cu~+-Bin - d u n g s v e r m 6 g e n s v e r s c h i e d e n e r S y s t e m e zu e n t w i c k e l n .

E i n e solche M e t h o d e i s t gegeben d u r c h V e r w e n d u n g des s eh r s t a r k gef/~rbten ~Fe(Dipy)~]~+-Komplexes als I n d i k a t o r . [Fe(Dipy)a~ ~+ reag ie r t , wie f r t ihere V e r s u c h e gezeig t h a b e n ~, m i t Cu ~+ n a c h de r G l e i c h u n g (1) :

[Fe(Dipy)a] ~+ + 3 Cu ~+ ~ Fe ~+ + 3~Cu(Dipy)] 2+ (1)

W i r d zu e i n e m Sys t em, das [Fe(Dipy)a] a+ u n d e inen w e i t e r e n K o m p l e x b i l d n e r en th i i l t , Cu ~+ h inzuge f i ig t , so s t e h t f i i r diese A u s t a u s c h r e a k t i o n (1) n u r so viel Cu 2+ zu r V e r f ~ g u n g , als y o n d i e sem K o m p l e x b i l d n e r n i c h t g e b u n d e n wird . Die d u r c h s p e k t r o p h o t o m e t r i s c h e Mes- s u n g e n zu e r m i t t e l n d e Z u n a h m e a n v e r b l e i b e n d e r ~Fe(Dipy)s~ ~+ - gegen i ibe r e i n e m V e r g l e i c h s v e r s u c h n u r aus [Fe(Dipy)a]~+ u n d Cu ~ + - i s t d e m n a c h e in Mass fi ir das C u ~ + - B i n d u n g s v e r m 6 g e n des h ie r i n t e r e s s i e r e n d e n K o m p l e x b i l d n e r s .

W i r h a b e n m i t d iese r M e t h o d e das C u ~ + - B i n d u n g s - v e r m 6 g e n e ine r R e i h e y o n A m i n o s ~ u r e n u n d P e p t i d e n e r m i t t e l t .

Die M e s s r e s u l t a t e s ind in den A b b i l d u n g e n 1 u n d 2 g r a p h i s c h da rges t e l l t . Als Absz i sse i s t die K o n z e n t r a t i o n des i m S y s t e m v o r h a n d e n e n K o m p l e x b i l d n e r s aufge- t r a g e n , als O r d i n a t e die k o l o r i m e t r i s c h e r m i t t e l t e ve r - b l e i b e n d e [Fe (Dipy )a ]~+- K onzen t r a t i on . Die Messgr6sse i s t in e r s t e r N / i h e r u n g zug le ich e in Mass f/ ir die Menge de r - u n t e r den gewt ih l t en V e r s u c h s b e d i n g u n g e n - a n d e n K o m p l e x b i l d n e r g e b u n d e n e n Cu "+. B e i gen f igend h o h e r K o n z e n t r a t i o n des zu p r t i f e n d e n K o m p l e x b i l d n e r s e r r e i c h t sie in j e d e m Fa l l e inen b e s t i m m t e n g l e i chen M a x i m a l w e r t . S i g n i f i k a n t ~fir die U n t e r s c h i e d e i m t ( o m p l e x b i l d u n g s v e r m 6 g e n s s i n d d e m n a c h v o r a l l e m die V e r s u c h e m i t n i e d r i g e r K o n z e n t r a t i o n a n K o m p l e x - b i l dne r .

Die h i e r d u r c h g e f i i h r t e n V e r s u c h e l ie fe rn n u r Ver - g l e i chswer t e f/dr das K o m p l e x b i l d u n g s v e r m 6 g e n so lche r b a s i s c h e r V e r b i n d u n g e n . D e r p H w u r d e au f 5,2 4- 0,1 k o n s t a n t g e h a l t e n . D e r zu u n t e r s u c h e n d e K o m p l e x -

1 p. G. LAUGER, S. FALLAB und H. ERLENMEYER, Helv. chim. Acta SS, 92 (1955).

b i l d n e r w u r d e zunAchs t in k o n z e n t r i e r t e r L 6 s u n g au f das p H 5,2 g e b r a c h t u n d d a n n m i t A z e t a t p u f f e r v o m p H 5,2 a u f e in b e s t i m m t e s V o l u m e n v e r d i i n n t . Z u m I n d i k a t o r s y s t e m , b e s t e h e n d aus je 5 c m a de r L 6 s u n g e n :

2

H/stidyl-lYis/iUin

~o~oC~ ~°~°

I ~ ~ oxypm/n

£..r ~__....-A~::::::=~4------~wycio ( . ~ ' ~ ~ . . . . . . -_ G/ycy/-a/rcr/- " ~3 ~.) a/ycin

I t I I I

0,2 0,5 1 15 2, w -2

Abb. L

6 • 10 -4 m Fe(NH4)2(SO4)2 ' 6 H , O in Wasse r , 18 • 10 -4 m D i p y r i d y l in A z e t a t p u f f e r u n d 14 • 10 -4 m CuSO4 • 5 H , O in A z e t a t p u f f e r , w u r d e a l s d a n n e ine b e s t i m m t e Menge de r L 6 s u n g des K o m p l e x b i l d n e r s zugef t ig t u n d m i t

6,1°5- - - " ~ . . . . . . . . . a/u/athion F " Cystdn

5

4

3

2

~ Glutam/nsa'ure G/yc/n

!

I ~ I I I

0.z 0,5 i 1,5 z,7o'2 Abb. 2.

A z e t a t p u f f e r au f 50 c m 3 aufgef i i l l t . N a c h 24 h w a r das G l e i c h g e w i c h t e inges te l l t , u n d es w u r d e die A b s o r p t i o n be i 5250 2k gemessen . I n j e d e m Fa l l k o n n t e d u r c h e inen

442 Br6ves communications- Brevi comunicazioni [EXPERIENTIA VoL. XI/ll]

Kontrollversuch gezeigt werden, dass bei den gew~ihlten Konzentrat ionen der Komplexbi ldner dem [Fe (Dipy)a ] l+- Gleichgewicht kein Fe 2+ entzieht. Der Durchmesser der Kreise in den Abbildungen 1 und 2 entspricht dem gr6ss- ten beobachteten Fehlerintervall .

Die kolorimetrischen Messungen wurden mit einem Unicam-Spekt rophotometer SP 500 durchgef/ihrt. Bei den pH-Messungen bedienten wit uns eines Metrohm- Potent iometers E 187 mit kombinier ter Glaselektrode.

Den l~esultaten ist zu entnehmen, dass unter den untersuchten Aminos/turen Cystein und Hist idin ein er- heblich st~irkeres Cu2+-Bindungsverm6gen aufweisen. Ausser den in den Abbildungen 1 und 2 aufgefiihrten Aminos~iuren untersuctlten wir Asparagins/iure, die sich wie Glutamins~iure verh~ilt, ferner Arginin und Serin, die yon Glycin nicht signifikant verschieden sind.

]3ei den Pept iden zeigt Glycyl-Glycyl-Glycin kein stark abweichendes Verhalten gegentiber der einfachen Aminoslture. Das Tripept id Glutathion verh~ilt sich praktisch gleich wie sein Baustein Cystein. AuIfallend ist das potenzierte Cu2+-Bindungsverm6gen yon Hi- s t idyl-Hist idin gegeniiber seiner Komponente . 13ei einer Konzentra t ion yon 0,2. 10 -2 binder das Pept id fund 10mal mehr Cu 2+ als die Aminos/iure.

G. W O L F F , S . F A L L A B u n d H. ERLENMEYER

A ns/Mt/i~r anorganische Chemic der Universitdit Basel, den 20. August 1955.

Summary

The capaci ty of binding copper ions of several amino- acids and peptides has been investigated. A direct colorimetric method measuring comparable values of bound Cu 2+ has been developed.

(3ber die W i r k u n g v o n M i s c h u n g e n eines ant igen- halt igen P l a s m a s m i t e i n e m a n t i k 6 r p e r h a l t i g e n S e r u m auf die E n t w i c k l u n g d e s F r e m d k 6 r p e r -

g r a n u l o m s

In einer vorhergehenden Mittei lung haben wir be- schrieben, dass bei Zusammenbringen yon Ant iserum mit entsprechenden Antigenen eine deutliche emigrations- I6rdernde "Wirkung an Leukozyten auf t r i t t 1. D a Stoffe, besonders Bakterienpolysaccharide, welche eine solche Xgirkung an Leukozyten besitzen, eine wachstums- anregende W i r kung am Fremdk6rpergranulom aus- iiben 2, schien es m6glich, dass ein Gemisch von Plasma und ant ikSrperhal t igem Serum auch im tierischen Organismus eine solche Wirkung haben k6nnte. Diese Frage hat besonderes Interesse hinsichtlich des Ent - s tehungsmeehanismus der allergisch bedingten Binde- gewebsreaktion.

Es wurden die Wirkung der Einzelkomponenten, ver- schiedene Antiseren und das homologe Serum oder Plasma und die Mischungen dieser Einzelkomponenten auf ihre Wirkungen am Fremdk6rpergranulom in den yon uns entwickelten Testen untersucht. Als Antigen- Antik6rperseren wurden folgende gepriift :

1. Pr/izipitierendes Antihi ihnergansserum (BEHRING) 2. Pr~izipitierendes Antipferdeserum (S. B.).

1 R. MEIER und B. SCUXR, Exper. (im Druck). 2 R. MEIER und 13. SCItXR, Exper. 9, 93 (1953); 10, 376 (1954). -

R. MEIER, P. DESAULLES und B. SCHXR, Arch. Exp. Path. Pharma- kol. 224, 104 (1955).

Ftir die Untersuchung ist es Voraussetzung, dass unter vol lkommen sterilen Kautelen gearbei tet wird. Diese wurden dadurch garantiert , dass folgende Vorsichts- massnahmen getroffen wurden: Antigene und die ver- schiedenen ant ik6rperhal t igen Seren wurden mit sterilen Tuberkulinspri tzen in der gewiinschten genauen Menge in der K/ilte auf sterile Whatman-Papiers t re i fen aufge- bracht und das Material lyophil getrocknet und gepresst. Die daraus hergestel l ten Presslinge wurden nach unse- rem iiblichen technischen Verfahren zur Erzeugung yon Fremdk6rpergranulomen 1 Ra t t en dorsal einge- pflanzt. Das ents tehende Granulom wurde nach einem In terva l l yon 7 Tagen herauspr~pariert und untersucht.

Das Ergebnis der Untersuchungen ist folgendes: I-tiihnerplasma und Pferdeserum und die verschiedenen Antiseren 16sen auch bei Anwendung ohne jede Ver- diinnung praktisch keine granulomerregende Wirkung aus. Es kann in einzelnen F~illen eine ganz geringe, noch in der Fehlerbrei te der Methode liegende Ver/inderung des Granulomgewichtes auftreten, doch ist.sie in keinem Falle signifikant. Benutz t man zur Impr~tgnierung der Papierstreifen Mischungen von entsprechenden Mengen Antiseren in homologem Plasma, so erh/ilt man deutliche granulomwachstumsf6rdernde Wirkung gegeniiber den Kontrollen, die mit den Einze lkomponenten behandelt wurden. In quant i ta t iver Hins icht 1/isst sich dieser Effekt bei Verwendung yon Verdiinnungen yon Anti- serum zu Plasma noch deutl icher nachweisen, wie fol- gende Tabelle ergibt.

Granuloingewebegewich t

Tierzahl

12 Kontrollen 6 Antihtihnergans-

s e r u m (BEHRING) . . 6 Hiihnerplasma. . . 6 Antipferdeserum

(S.B). 6 Pferdeserum . . . . 6 Hiihnerplasma

+ Antiserum 3/2 6 Pferdeserum

+ Antiserum 3/2

Dosis

10-s 10-5

10-~ 10-s 10-s

5 × 10-6 10-5

5 x 10 -s

A b s o l u t

nag S.E.

146 ~ 12

156 + 12,7 160 ~_ 11

154 q~ 12,2 150 d_ 11,7 221 4- 14,3 186 ~ 12,7 194 ~ 20,0 173 -E 13,0

Diffe- .CllZ mg

+10 + 4

+ 8 + 4 +75 +40 +48 +27

Dieser Effekt l~isst sich sowohl mit Antihiihnergans- serum als auch mit Antipferdeserum mit homologem Plasma bzw. Serum zeigen, obwohl im letzteren Falle die ents tandene f6rdernde Wirkung weniger ausgespro- chen war, als es mit Antihi ihnerserum der Fall war.

Analog wie bei den Befunden an isolierten Zellen ist zu erw~igen, welche Stoffe fiir die beobachtete Wirkung in Bet racht gezogen werden kSnnen. Nach unseren eigenen Versuchen sind Histamin, Serotonin, Adrcnalin. Hepar in und Bradykinin, die eventuel l bei dieser Anti- gen-AntikSrperreaktion auftreten, auszuschliessen, w e l l sic nur in Konzentrat ionen, die etwa der Gesamtmenge des angewandten Serums entsprechen, eine deutliche granulomf6rdernde Wirkung zeigen. Ebenso rufen sic zum Teil eine ausgesprochene Reizwirkung hervor, bzw. eine Gef~isserweiterung an der Konjunkt iva des Ka- ninchenauges, die yon dem Antiserumplasmagemisch in diesen Konzentra t ionen nicht gegeben wird. Damit dtirfte es ausgeschlossen sein, dass diese Stoffe fiir die heobachtete granulomf6rdernde Wirkung in diesen

1 R. MEIER, W . SCHULER u n d P. DESAULLES, E x p e r . 6, 469 (1950).