UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ESTUDIO CLNICO-EPIDEMIOLGICO DE LAS ANOMALAS CROMOSMICAS QUE CONLLEVAN UN EXCESO DE MATERIAL GENTICO NUMRICO Y ESTRUCTURAL, EXCLUYENDO TRISOMAS 13, 18 Y 21

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Laura Mara Rodrguez Martnez Bajo la direccin de la Doctora: Mara Luisa Martnez-Fras Madrid, 2003

ISBN: 84-669-1715-2

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Estudio clnico-epidemiolgico de las anomalas cromosmicas que conllevan un exceso de material gentico numrico y estructural, excluyendo trisomas 13, 18 y 21.

Memoria que presenta LAURA M RODRIGUEZ MARTINEZ Para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biolgicas, Dirigida por La Prof. Dra. MARIA LUISA MARTINEZ-FRIAS

MADRID,2003

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

Estudio clnico-epidemiolgico de las anomalas cromosmicas que conllevan un exceso de material gentico numrico y estructural, excluyendo trisomas 13, 18 y 21.

VB ML Martnez-Fras Directora de la tesis

VB Toms Naranjo Tutor de la tesis

El interesado Laura Rodrguez Martnez

Maria Luisa Martnez-Fras, Profesor titular de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense de Madrid, Directora del Estudio Colaborativo Espaol de Malformaciones Congnitas (ECEMC) y del Centro de Investigacin sobre Anomalas Congnitas (CIAC), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Sanidad y Consumo,

CERTIFICA:

Que ha dirigido el trabajo Estudio clnico-epidemiolgico de las anomalas cromosmicas que conllevan un exceso de material gentico numrico y estructural, excluyendo trisomas 13, 18 y 21, que ser presentado por Da. Laura Rodrguez Martnez para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biolgicas.

En Madrid, a veinticinco de Febrero de dos mil tres.

Fdo. Prof. Dra. Mara Luisa Martnez-Fras Profesora titular de Farmacologa

A mis padres A mi hija A Rafa

AGRADECIMIENTOS

La gestacin de esta memoria no ha sido nada fcil, pero en cualquier caso me siento en deuda con las personas que han gastado generosamente su tiempo enriquecindola con sus sugerencias. Quera darle las gracias a las valiossimas aportaciones de la Profesora Mara Luisa Martnez-Fras, directora de esta tesis, de quin he recibido en todo momento contnua comprensin, apoyo y asesoramiento, y cuyo ejemplo me ha servido de estmulo. Tambin quiero mostrar mi agradecimiento a las familias de los nios que nacen con defectos congnitos, por su entereza y serenidad para enfrentarse a su caso personal y prestar ayuda a la investigacin, colaborando as para que otros nios nazcan sanos.

Tambin le estoy agradecida a mis padres, que en ningn momento han dudado en poner a mi alcance todo lo necesario para que consiguiese desarrollar mis objetivos profesionales. Y a Rafa, mi marido, que con su apoyo moral, paciencia y perseverancia me ayud a que esta memoria fuese finalizada.

Esta memoria tampoco habra salido a la luz sin el trabajo realizado por D. Mariano Llorente Cerro y D. Emilio Snchez Cerrato en el tratamiento informtico de los datos, y por el resto de mis compaeros del Grupo Coordinador del ECEMC, que siempre me han prestado colaboracin. As como por el Grupo Perifrico del ECEMC, formado por pediatras y gineclogos, que en su afn por colaborar con la investigacin de las causas de las malformaciones nos envan los casos que se han incluido en esta memoria.

He pensado siempre en l el bebe que tanto anhelaba he sentido en mis entraas la alegra deseada...... Pasa el tiempo y no te noto.... Pasa el tiempo y no te siento... Pasa el tiempo y no te veo.... Pasa el tiempo y .....Nuevo ser! Hoy te tengo en mis brazos Hoy te noto Hoy te siento Hoy te veo Hoy te beso y te quiero.

P.M de la Puerta

ndice

INDICE

ndice

INDICE

1.- INTRODUCCIN 1.1.- Breve resumen de los antecedentes histricos 1.2.- Terminologa cromosmica 1.3.- Tcnicas de bandeo cromosmico 1.4.- Actualizacin de la terminologa cromosmica 1.5.- Nuevas tcnicas de citogentica y citogentica molecular 1.6.- Anomalas cromosmicas 1.6.1.- Anomalas numricas 1.6.2.- Anomalas estructurales 1.6.3.- Anomalas en mosaico 1.7.- Epidemiologa Citogentica 1.7.1.- Estudios citogenticos en gametos humanos 1.7.2.- Estudios citogenticos en abortos 1.8.- Factores relacionados con la aparicin de anomalas cromosmicas 1.9.- Revisin bibliogrfica de las anomalas cromosmicas que conllevan un exceso de material cromosmico 1.9.1.- Anomalas numricas autosmicas 1.9.2.- Mosaicos numricos autosmicos 1.9.3.- Anomalas numricas gonosmicas 1.9.4.- Mosaicos numricos gonosmicos 1.9.5.- Poliploidas 1.9.6.- Anomalas estructurales 1.9.7.- Mosaicos estructurales 1.9.8.- Marcadores 1.10.- Estudios en grupos de poblaciones 1.10.1.- Poblaciones seleccionadas 1.10.2.- Poblaciones no seleccionadas 2.- OBJETIVOS 3.- MATERIAL Y METODOS 3.1.- MATERIAL

1 4 7 9 16 19 24 24 25 28 30 31 38 43

48 48 50 54 56 57 58 89 92 94 95 96 99 101 102

ndice3.2.- METODOS 3.2.1.- Para recogida de la informacin 3.2.2.- Descripcin del ECEMC 3.2.3.- Estructura y funcionamiento del ECEMC 3.2.4.- Informacin que se recoge 3.2.5.- Recogida de muestras para el estudio citogentico 3.2.6.- Anlisis clnico de los nios malformados 3.2.7.- Identificacin de los casos para el presente estudio 3.2.8.- Seleccin de los controles para el presente estudio 3.2.9.- Variables y factores analizados 3.2.10.-Metodologa estadstica 4.- RESULTADOS 4.1.- Resultados citogenticos obtenidos de los 149 casos 4.1.1.- GRUPO I: Casos con un exceso de material cromosmico autosmico conocido 4.1.1.1.- Ejemplos de los aspectos clnicos y citogenticos de los casos incluidos en el Grupo I (exceso de material cromosmico autosmico conocido) 4.1.2.- GRUPO II: Casos con un exceso de material cromosmico gonosmico conocido 4.1.2.1.- Ejemplos de los aspectos clnicos y citogenticos de los casos incluidos en el Grupo II (exceso de material cromosmico gonosmico conocido) 4.1.3.- GRUPO III: Casos con exceso de material cromosmico de origen desconocido 4.1.3.1.- Ejemplos de los aspectos clnicos y citogenticos de los casos incluidos en el Grupo III (exceso de material cromosmico de origen desconocido) 4.1.4.- GRUPO IV: Casos cuyo reordenamiento cromosmico implica a dos cromosomas diferentes de origen conocido 4.1.4.1.- Ejemplos de los aspectos clnicos y citogenticos de los casos incluidos en el Grupo IV (Casos cuyo reordenamiento cromosmico implica a dos cromosomas diferentes de origen conocido) 4.1.5.- GRUPO V: Casos que presentan poliploidas 4.1.5.1.- Ejemplos de los aspectos clnicos y citogenticos de los casos incluidos en el Grupo V (Casos que presentan poliploidas) 4.2.- Anlisis de variables 4.2.1.- Variables continuas 4.2.1.1.- Peso 4.2.1.2.- Edad gestacional 4.2.1.3.- Edad materna 4.2.1.4.- Edad paterna 4.2.1.5.- Media de las diferencias de edades de los padres 4.2.1.6.- Nmero de embarazos anteriores 4.2.1.7.- Edad de la menarquia 4.2.1.8.- Peso de la placenta 150 155 155 159 165 165 169 172 175 180 184 146 149 145 140 136 138 127 135 106 106 106 107 108 108 109 115 117 117 119 121 124 124

ndice4.2.2.- Variables discontinuas 4.2.2.1.- Sexo 4.2.2.2.- Nmero de vasos del cordn 4.2.2.3.- Concibe fcil 4.3.- Anlisis clnico de los defectos congnitos 4.3.1.- Frecuencia de afectacin de las diferentes reas por grupo de estudio 4.3.2.- Tipo y localizacin de defectos en el Grupo I 4.3.3.- Tipo y localizacin de defectos en el Grupo II.a 4.3.4.- Tipo y localizacin de defectos en el Grupo II.b 4.3.5.- Tipo y localizacin de defectos en el Grupo III.a 4.3.6.- Tipo y localizacin de defectos del Grupo III.b 4.3.7.- Tipo y localizacin de defectos en el Grupo IV.a 4.3.8.- Tipo y localizacin de defectos en el Grupo IV.b 4.3.9.- Tipo y localizacin de defectos del Grupo V.a 4.3.10.- Tipo y localizacin de defectos en el Grupo V.b 4.3.11.- Tipo y localizacin de defectos ms frecuentes en todos los grupos estudiados 5.- DISCUSIN 6.- CONCLUSIONES 7.- BIBLIOGRAFIA 188 188 189 191 194 194 198 203 205 207 210 212 214 217 220 222 226 237 241

TABLAS

TABLA 1.- Clasificacin cromosmica por tamao y localizacin del centrmero TABLA 2.- Tcnicas de bandeo cromosmico TABLA 3.- Smbolos de la nomenclatura cromosmica (Tomado de Thompson Y Thompson,1986) TABLA 4.- Smbolos utilizados por el ISCN: An International System For Human Cytogenetic Nomenclature.1995 TABLA 5.- Tipos de anomalas cromosmicas humanas TABLA 6.- Frecuencia de no-disyuncin, de distintos cromosomas durante la espermatognesis (Spriggs y cols. 1996) TABLA 7.- Trisomas autosmicas en abortos espontneos (16-18 semanas) (Hook, 1983) TABLA 9.- Anomalas detectadas en abortos espontneos ( [] Cen Chr Cht : :: , . de novo Dir Dis Fra H Idic Inc Mat Min Mos () Pat + Prx Psu ? Rec Sce Sct ; Fragmento acntrico. Material desconocido de origen desconocido. De punto a punto. Nmero de clulas. Centrmero. Cromosoma. Cromtida. Rotura en. Rotura y reunin. Separa nmero de cromosma, cromosomas sexuales y anomalas cromosmicas. Referido a subbandas. Anomala cromosmica que no ha sido heredada. Directo. Distal. Sitio frgil. Heterocromatina. Cromosoma isodicntrico. Cariotipo incompleto. Origen materno. Mnimo fragmento acntrico. Prdida. Mosaico. Rodea al cromosoma con anomala estructural. Origen paterno. Ganancia. Proximal. PseudoDudosa identificacin cromosmica. Cromosoma recombinante. Intercambio de cromtidas hermanas. Constriccin secundaria. Separa cromosomas alterados y puntos de rotura en reordenamientos estructurales que implican ms de un cromosoma. Tandem. Asociacin telomrica. Telmero. Terminal.

Tan Tas Tel Ter

18

Introduccin 1.5.NUEVAS TCNICAS DE CITOGENETICA Y CITOGENTICA

MOLECULAR.

En los ltimos aos la citogentica ha evolucionado mucho de modo que ha permitido aumentar el nivel de resolucin (aumentando el nivel de bandas) de los cromosomas con los que trabajamos en el laboratorio. Actualmente se trabaja con cromosomas de alrededor de 850 bandas, lo que nos va a permitir detectar alteraciones cromosmicas de alrededor de 5 megabases, que hoy son visibles al microscopio y hace unos aos hubieran pasado totalmente desapercibidas (Fig. 7). Este tipo de alteraciones cromosmicas crpticas slo son visibles con un cariotipo de alta resolucin, por lo que un cariotipo estudiado hace unos aos e informado como normal con el nivel de resolucin de entonces, hoy podra ser anmalo. No obstante, a pesar de que hoy trabajamos con cromosomas de alta resolucin, los mtodos citogenticos revelan informacin acerca de la estructura general del cariotipo y de los

reordenamientos cromosmicos, pero son de difcil interpretacin a la hora de valorar puntos de rotura exactos.

No fue hasta los aos 80, cuando aparecen los primeros resultados de la aplicacin de tcnicas de Biologa Molecular sobre el ADN. Esto permiti aumentar la capacidad para identificar puntos de rotura y anomalas estructurales microscpicas de los cromosomas.

A partir de 1980, comienzan a perfeccionarse las tcnicas de Biologa Molecular, tales como la Polimerasa Chain Reaction (PCR: Reaccin en Cadena con Polimerasa) y la Fluorescence In Situ Hibridization (FISH: Hibridacin In Situ Fluorescente).

La tcnica de PCR, se utiliza para conseguir grandes cantidades de ADN, bien de un slo fragmento, o de un gen concreto (previamente clonado), mediante ciclos sucesivos de sntesis de ADN. Una vez obtenida la cantidad suficiente de ADN, ste puede ser observado directamente mediante fluorescencia ultravioleta, despus de teirlo con bromuro de etidio (Boehringer, 1992). Inicialmente present una serie de desventajas a la hora de su aplicacin por necesitar19

Introduccin condiciones muy determinadas y complejas. Sin embargo, con el desarrollo y perfeccionamiento del instrumental requerido han sido superadas, obtenindose un amplio abanico de aplicaciones tanto en gentica bsica como en gentica clnica.

Figura 7 Cromosoma 1 con distintos niveles de resolucin

400 bandas

550 bandas

+850 bandas

CROMOSOMA 1FIGURA 7.- Cromosoma 1 con distintos niveles de resolucin

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Introduccin Una ventaja de la PCR, es que el ADN, puede ser procedente de muy diversas fuentes tales como: sangre, raspado bucal, material patolgico de archivo y cantidades tan pequeas como una "nica clula" (Boehringer, 1992). Del mismo modo, otra tcnica de Biologa molecular, es el Souther-blotting (llamada as por su creador Edward Southern), tcnica de transferencia de fragmentos de ADN desde gel de agarosa a un filtro en el que pueden hibridarse con un ADN complementario. Tambin, la tcnica de Norther-blot, similar a la anterior pero utilizando fragmentos de ARN.

La tcnica de hibridacin in situ fluorescente, (FISH) es una tcnica relativamente simple, cuyo uso esta cada vez ms difundido en todos los laboratorios. Es una tcnica que exige escasa inversin en infraestructura, aunque es imprescindible disponer de las sondas especficas para los genes que se desean estudiar. Consiste en la aplicacin de tcnicas de hibridacin para ADN, sobre clulas en metafase o interfase, ya sea en extendidos citolgicos o en secciones de tejido, lo que permite reconocer individualmente los cromosomas y detectar anomalas citogenticas. Suelen utilizarse sondas marcadas con fluorocromos y requiere la observacin directa con microscopios de fluorescencia. Hoy en da, algunas de sus aplicaciones han sido sustituidas por la mayor especificidad de la PCR, pero no obstante, esta tcnica de FISH, ha revolucionado el funcionamiento habitual de todos los laboratorios de citogentica, ya que nos permite en unos casos confirmar una alteracin que sospechbamos con las tcnicas convencionales (generalmente de alta resolucin), y en otros casos diagnosticar, gracias sobre todo a la aplicacin de sondas puntuales de regiones especficas.

Estas nuevas tcnicas son ms rpidas, precisas y eficaces, y permiten estudiar anomalas an ms finas que las que se podan definir hasta ahora. Por ello, hoy se defiende el uso conjunto de tcnicas citogenticas de alta resolucin y moleculares para la mejor interpretacin de los resultados en pacientes con anomalas cromosmicas, marcadores o con reordenamientos cromosmicos complejos (Kuznetzova T. 1995).

21

Introduccin Recientemente, la aplicacin de estas tcnicas de FISH, ha puesto de manifiesto una posible asociacin entre anomalas cromosmicas telomricas crpticas y rasgos clnicos como la dismorfia facial y/o distintos grados de retraso mental. De hecho Knight y cols. (1999) encontraron diversas alteraciones crpticas telomricas en el 23% de los nios estudiados por presentar retraso mental moderado o severo, que tenan un cariotipo anterior normal. Por otro lado Ballif y cols. (2000), reducen este porcentaje de individuos portadores de anomalas cromosmicas telomricas crpticas, a un 2,6%. No obstante, Shaffer (1999) estudiando este tipo de anomalas y utilizando estas tcnicas de FISH, ha encontrado algunos polimorfismos cromosmicos que supuestamente no tendran ninguna repercusin en el fenotipo.

Todo esto nos lleva a la conclusin de que hoy da, con la utilizacin conjunta de los procedimientos de alta resolucin cromosmica y de los mtodos de la Biologa molecular, se ampla sustancialmente las expectativas citogenticas para los prximos aos, ya que suponen un incremento de la capacidad para la deteccin de anomalas cromosmicas cada vez ms finas, en las que pueden simplemente estar implicados unos pocos genes, e incluso un slo gen (Emery y cols. 1992). De hecho en nuestro grupo, se estn encontrando anomalas cromosmicas cada vez ms finas que permiten dar un diagnstico definitivo a un paciente que hasta ahora no tena diagnstico, a pesar de tener un cariotipo normal, informado hace algunos aos. As en el periodo comprendido entre 1981 y 2000, del total de nios malformados a los que hicimos el cariotipo, en un 32,72% se identific que exista una anomala cromosmica. No obstante, dado que los nios con anomalas cromosmicas suelen ser polimalformados, excluyendo los nios que presentaron malformaciones aisladas, el porcentaje en los que se detectaron anomalas cromosmicas, es del 46,49% (Figura 8).

22

Introduccin

Figura 8 DISTRIBUCIN ETIOLGICA DE NIOS MALFORMADOS CON CARIOTIPO IDENTIFICADOS EN EL ECEMC (Perodo: 1981/2000)

TOTAL (Incluyendo aislados)De causa Cromosmica 32,72% De causa Ambiental 1,62% Otras causas Gnicas 12,38%

TOTAL (Excluyendo aislados)

De causa Cromosmica 46,49%

Otras causas Gnicas 13,17%

De causa Ambiental 1,41% De causa Desconocida 53,29%

De causa Desconocida 38,94%

23

Introduccin 1.6.- ANOMALIAS CROMOSOMICAS.

En los seres humanos, por su reproduccin sexual, las clulas somticas son diploides (con 2n cromosomas), mientras que los gametos son haploides (con n cromosomas). En los procesos de divisin celular tanto somtica como para la formacin de los gametos, pueden ocurrir accidentes espontneos o inducidos que producen anomalas cromosmicas. La porcin de material gentico implicado en estas anomalas cromosmicas puede ser muy variable y puede suponer tanto la ganancia como la prdida de una pequea porcin de cromosoma, de uno o varios cromosomas completos, la ganancia de dotaciones cromosmicas completas como es el caso de las poliploidas. Por consiguiente, las anomalas van a ser numricas estructurales, y pueden involucrar tanto a los autosomas, como a los cromosomas sexuales.

1.6.1.- Anomalas numricas.

Se consideran anomalas numricas de los cromosomas, aquellas que suponen una modificacin del nmero normal de cromosomas. Cuando sta

modificacin supone la prdida o ganancia de alguno de los cromosomas, hablamos de aneuploidas, y cuando afecta a una dotacin cromosmica completa, hablamos de poliploidas.

Ejemplos de aneuploidas: - monosoma (2n-1): falta un cromosoma de cualquier par. - nulisoma (2n-2): faltan los dos cromosomas del mismo par. - doble monosoma (2n-1-1): faltan dos cromosomas de distinto par. - trisoma (2n+1): existen tres cromosomas del mismo par. - doble trisoma (2n+1+1): existen tres cromosomas en dos pares distintos. - tetrasoma (2n+2): existen cuatro cromosomas del mismo par.

Ejemplos de poliploidas: - triploida (3n): tres dotaciones cromosmicas haplodes (69 cromosomas). -tetraploida (4n): cuatro dotaciones cromosmicas haplodes (92 cromosomas).

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Introduccin 1.6.2.- Anomalas estructurales.

Son las anomalas que afectan a la estructura de los cromosomas. Estas se deben a roturas cromosmicas que van seguidas de una reconstruccin anormal. Estos procesos van a dar lugar a estructuras que pueden ser

balanceadas (cuando ha existido reordenamiento, pero est presente todo el material cromosmico) o desbalanceadas (cuando existe un reordenamiento que supone la prdida o la ganancia de material cromosmico). Las anomalas estructurales balanceadas, son: las inversiones y las traslocaciones. Las anomalas estructurales desbalanceadas, son: las deleciones, duplicaciones, inserciones, isocromosomas, cromosomas dicntricos, cromosomas acntricos y anillos.

En funcin del comportamiento de stas anomalas durante la divisin celular, podemos distinguir las formas estables, (que se mantienen inalteradas durante la divisin celular) que son: deleciones, duplicaciones, inversiones,

traslocaciones, inserciones e isocromosomas; y las formas inestables (que pueden sufrir cambios durante la divisin celular, producindose nuevos reordenamientos cromosmicos) que son: los cromosomas dicntricos, acntricos y anillos.

1.6.2.1.- Anomalas estructurales estables.

1.6.2.1.1.- deleciones.- prdida de una porcin de un cromosoma que puede ser terminal, producto de una sola rotura, o bien intersticial, producto de dos roturas. La parte delecionada, que no tiene centrmero (fragmento acntrico), va a perderse en la siguiente divisin celular. El cromosoma estructuralmente anormal va a perder la informacin que exista en ese fragmento que se ha perdido. Es por tanto una anomala desbalanceada.

1.6.2.1.2.- duplicaciones.- Consiste en la presencia de un segmento extra duplicado de un cromosoma. En funcin de la orientacin que25

Introduccin mantenga el segmento extra, van a ser directas (cuando conservan la orientacin original), o invertidas (cuando la orientacin es opuesta a la original). Son anomalas desbalanceadas.

1.6.2.1.3.- inversiones.- suponen la rotura de un cromosoma por dos puntos, seguido de una reconstruccin con inversin de la seccin del cromosoma entre los puntos de rotura. Si la inversin ocurre en uno slo de los brazos del cromosoma, sin implicar al centrmero, hablamos de una inversin paracntrica, mientras que si el centrmero queda implicado, hablamos de una inversin pericntrica. Son anomalas balanceadas porque no ganan ni pierden material

cromosmico. El individuo portador es en general fenotipicamente normal; no obstante si en los puntos de rotura se producen microdeleciones se producir el desbalance y tendr las

correspondientes repercusiones fenotpicas. No obstante, el portador de una inversin producir gametos desbalanceados.

1.6.2.1.4.- traslocaciones.- pueden ser de dos tipos, recprocas o robertsonianas.

1.6.2.1.4.1.-

Traslocaciones

recprocas.-

consisten

en

el

intercambio de bloques de cromatina entre dos cromosomas no homlogos; esto supone roturas en ambos cromosomas, y va a producir un reordenamiento anmalo. Al ser una anomala balanceada, el portador de este tipo de traslocaciones no presenta ninguna manifestacin fenotpica, pero es susceptible de generar gametos anmalos desbalanceados.

1.6.2.1.4.2.cromosomas

Traslocaciones acrocntricos

robertsonianas.que van a

implican

a por

dos los

fusionarse

centrmeros perdiendo la heterocromatina de sus brazos cortos. Son balanceadas, al igual que las traslocaciones recprocas, por lo que no tienen repercusin fenotpica en los portadores, pero s en la formacin de sus gametos.26

Introduccin

1.6.2.1.5.- inserciones.- constituyen un tipo de traslocacin no recproca, que supone tres roturas, con un fragmento de un cromosoma que se inserta en otro cromosoma no homlogo. Son desbalanceadas. Cuando este fragmento se inserta manteniendo su orientacin original, hablamos de una insercin directa, mientras que si lo hace con una orientacin opuesta hablamos de una insercin inversa.

1.6.2.1.6.- isocromosomas.- son cromosomas que se han formado durante la divisin celular; el centrmero de un cromosoma a veces se divide de forma incorrecta, de modo que en lugar de separarse las dos cromtidas lo hacen, por un lado los dos brazos cortos y por otro los dos brazos largos, dando lugar a cromosomas iguales en todos sus puntos (iso-cromosomas).

1.6.2.2.- Anomalas estructurales inestables.

1.6.2.2.1.- cromosomas dicntricos.- son cromosomas en los que podemos encontrar dos centrmeros con una localizacin muy prxima, lo cual va a suponer la inactivacin de uno de ellos, permitiendo as que la estructura dicntrica supere la divisin celular y se transmita a las clulas hijas.

1.6.2.2.2.- cromosomas acntricos.- son cromosomas o fragmentos cromosmicos en los que no existe centrmero, y por tanto van a perderse durante la divisin celular.

1.6.2.2.3.- anillos, son un tipo especial de delecin, en los que se producen dos roturas prximas a los telmeros con posterior unin de ambos extremos. Se forman as estructuras similares a anillos en las que se ha perdido parte de material telomrico. Si se mantiene el centrmero, ste anillo superar divisiones celulares aunque sufriendo todo tipo de reestructuraciones.

27

Introduccin

En la Tabla 5, mostramos la clasificacin de las anomalas cromosmicas humanas. TABLA 5 Tipos de anomalas cromosmicas humanas. Anomalas numricas: 1.- Aneuploidas: Monosoma, (2n-1). Nulisoma, (2n-2). Doble monosoma, (2n-1-1). Trisoma, (2n+1). Doble trisoma, (2n+1+1). Tetrasoma, (2n+2). 2.- Poliploidas: Triploida, (3n). Tetraploida, (4n). Anomalas estructurales: 1.- Estables: Deleciones. Duplicaciones. Inversiones. Traslocaciones. Inserciones. Isocromosomas. 2.- Inestables: Cromosomas dicntricos. Cromosomas acntricos. Anillos.

1.6.3.- Anomalas en mosaico.

Las anomalas cromosmicas, tanto numricas como estructurales, pueden ser homogneas y estar presentes en todas las clulas del organismo, o bien slo en una o varias lneas celulares. Hablamos entonces de mosaicismos. Por definicin, un mosaicismo cromosmico significa la presencia de 2 ms lneas celulares, con distintos complementos cromosmicos en un mismo individuo.

28

Introduccin Siempre es el resultado de un acontecimiento postcigtico, que puede sobrevenir en cualquier momento del desarrollo embrionario, fetal, o de la vida postnatal, y tener lugar en cualquier tipo celular (Dagmar y cols. 1989). La importancia de un mosaicismo va a depender de:

- La naturaleza de la anomala cromosmica que se produzca. - Momento del desarrollo embrionario en que tenga lugar. - La estirpe celular implicada.

El mosaicismo cromosmico puede estar presente de forma generalizada, estando afectados todos los tejidos como consecuencia de una alteracin que se ha producido en la primera o en la segunda divisin postzigtica (Dagmar y cols. 1989).

Tambin existen los mosaicos confinados a distintos tejidos, aunque son menos conocidos. Segn Dagmar y cols. (1989), cuando los mosaicismos estn confinados a la placenta, parecen ser resultado de alteraciones viables que ocurren en el trofoblasto, o en clulas progenitoras extratrofoblsticas, durante los estados de mrula o blastocisto. Estos mosaicos van a originar bien la prdida del embrin por alterarse las funciones placentarias, o bien un retraso en el crecimiento intrauterino (Vera y cols. 1996).

Los mosaicismos confinados al embrin se originan despus de la implantacin e inicio del desarrollo embrionario en un pequeo nmero de embrioblastos, pudindose originar discrepancias cariotpicas en distintos tejidos (Vera y cols. 1996). Cuando dos o ms lneas celulares distintas estn confinadas a las clulas germinales de un individuo, se trata de un mosaicismo gonadal.

A pesar de la existencia de mosaicismos, se ha descrito un proceso de seleccin celular en casos de trisomas en mosaico (Taylor, 1968). Esta seleccin celular puede ocasionar la eliminacin de la lnea celular alterada. Tambin Ford (1967) afirmaba que sta seleccin celular es ms pronunciada en tejidos con un alto ndice de divisin celular.

29

Introduccin 1.7.- EPIDEMIOLOGIA CITOGENETICA.

La epidemiologa de las anomalas cromosmicas trata de determinar la frecuencia, causas, efectos selectivos de las diferentes anomalas cromosmicas, en distintas poblaciones de individuos, y las caractersticas de los afectados.

Las

primeras

referencias

que

existen

relacionadas

con

estudios

de

epidemiologa citogentica datan de 1969 (Sergovich y cols. 1969; Ratchiffe y cols. 1970), cuando aparecen los primeros estudios de series de recin nacidos vivos a los que se les realiza el cariotipo. Con la aparicin de las tcnicas citogenticas de diagnstico prenatal, se analizan las frecuencias de anomalas en fetos y se comparan los resultados entre los cariotipos pre y postnatales.

Es en los ltimos 20 aos, gracias a la mejora en la calidad de los registros de casos, cuando se han publicado estudios citogenticos realizados en mltiples grupos poblacionales, tales como: grupos de padres aosos, con problemas de fertilidad, con distintas ocupaciones, con retraso mental, sobre gametos masculinos y femeninos, abortos espontneos o inducidos, recin nacidos vivos o muertos, con cardiopatas o con otros defectos estructurales, nios de distintas edades en los que se sospecha una cromosomopata, etc. Estos estudios tienen como finalidad analizar las frecuencias de las distintas anomalas cromosmicas, sus distintos efectos en la poblacin, as como observar si existen otros factores individuales o poblacionales que influyan en la produccin de stas anomalas cromosmicas.

A pesar de los grandes avances en el conocimiento citogentico, existen todava muchas incgnitas por resolver acerca del origen y causas de las diferentes anomalas cromosmicas humanas, as como del comportamiento cromosmico en general.

Antes de centrarnos en nuestro tema, vamos a mencionar las frecuencias de las anomalas cromosmicas detectadas en gametos y en abortos, ya que aunque nuestro estudio va a centrarse en recin nacidos tanto vivos (RNV) como muertos (RNM), son muchos los cigotos con estas anomalas que van a originar prdidas30

Introduccin embrionarias espontneas, sobre todo precoces, aunque tambin a lo largo de la gestacin.

1.7.1.- Estudios citogenticos en gametos humanos.

El estudio citogentico en gametos ha permitido identificar la frecuencia de anomalas cromosmicas en clulas germinales, permitiendo determinar si stas haban ocurrido antes o despus de la formacin del cigoto, cules eran las ms comunes y qu repercusin podan tener en la formacin y desarrollo del embrin.

Para poder entender mejor los resultados citogenticos obtenidos por los distintos autores, vamos a describir brevemente los procesos de

gametognesis masculina y femenina. Ambos procesos son distintos, y se llevan a cabo durante distintos periodos de vida.

Las clulas germinales femeninas inician su maduracin durante la vida intrauterina, pero sta maduracin no llega a trmino, las clulas quedan estacionadas en un estado (dictiotene) en el que permanecen hasta la pubertad, momento en el que reanudan el proceso, madurando de una en una cada 28 das.

Sin embargo, las clulas germinales masculinas maduran durante la infancia del individuo hasta alcanzar un estado en el que quedan estacionadas. Su maduracin continuar a partir de la pubertad, producindose como norma unos doscientos millones de espermatozoides en cada gametognesis.

En los fetos femeninos, las clulas germinales maduran rapidamente durante la vida intrauterina, transformndose en oogonias, que despues de un nmero limitado de divisiones mitticas se convierten en oocitos, stos entran en la primera profase meitica en torno a la novena semana de la vida intrauterina de la futura mujer. La leptotene y la cigotene, van a ser periodos muy cortos comparados con la paquitene que dura aproximadamente dos semanas. Despus de trece semanas de vida intrauterina, los oocitos31

Introduccin alcanzan el estado de diplotene y pasan a un estado especial, la dictiotene, en el que van a permanecer hasta la pubertad de la mujer, momento en que ocurrir la primera ovulacin, con la primera divisin meitica, seguida de la segunda divisin meitica slo si existe fertilizacin (Hulten y cols. 1985).

En la gametognesis masculina, al contrario que en la femenina, las clulas germinales se multiplican, evolucionan y maduran durante la infancia del varn hasta el estado de espermatognias (clulas madre de los gametos). Durante la pubertad, stas clulas comienzan a proliferar mitticamente para transformarse en espermatocitos primarios, despus de aproximadamente un mes. En estos espermatocitos comienza la profase meitica, durando el estado de preleptotene alrededor de un da. La leptotene y la cigotene tienen lugar durante la siguiente semana, durando la paquitene alrededor de dos semanas ms. El resto de la primera divisin meitica y toda la segunda divisin se completan en tan slo un da. El producto de las dos divisiones meiticas es la espermtida, que se transforma en espermatozoide mvil y frtil a lo largo de la espermiognesis, proceso complejo en el que no hay ms divisiones celulares, sino slo los cambios morfolgicos que dan lugar a la forma final del espermatozoide. Todo esto tiene lugar en un tiempo aproximado de tres semanas (Hulten y cols. 1985), y se calcula que se produce un promedio de 200 millones de espermatozoides en cada gametognesis. Esta espermatognesis es un proceso continuo que dura, prcticamente, toda la vida del hombre desde la pubertad.

Los conocimientos que tenemos acerca de los oocitos humanos son pocos, comparados con los que tenemos de los espermatozoides, esto se debe sobre todo a las dificultades para la obtencin de oocitos para su estudio (Rene y cols. 1991). Adems, todos los estados meiticos estn presentes en el testculo humano adulto, por lo que su anlisis, si se dispone de material procedente de biopsia testicular, es mucho ms sencillo e informativo que el anlisis de los gametos femeninos.

Con el fin de aumentar el conocimiento sobre los oocitos, se han realizado estudios a partir de vulos obtenidos de ovulaciones inducidas con clomifeno32

Introduccin en mujeres con problemas de fertilidad (Wramsby y cols. 1987). Estos investigadores, encontraron un aumento en la frecuencia de anomalas cromosmicas en abortos espontneos, (prxima al 36%), lo cual hizo pensar que ste y en general otros inductores de la ovulacin aumentan el riesgo para la produccin de vulos cromosmicamente desbalanceados. En este mismo trabajo, se muestra como en los vulos, los complementos cromosmicos hipohaploides, (debidos a prdidas anafsicas que dan lugar a clulas con un nmero de cromosomas menor del normal), aparecen con una frecuencia de 21,4%, siendo ms comunes que los complementos cromosmicos hiperhaploides, (debidos a procesos de no-disyuncin y que dan lugar a clulas con un nmero de cromosomas superior al normal), que aparecen con una frecuencia de 14,3%.

Trabajos posteriores en los que el nmero de vulos estudiado era mayor, han seguido manteniendo mayor frecuencia de clulas hipohaploides con respecto a clulas hiperhaploides.

Los primeros estudios que aportan informacin sobre la constitucin cromosmica de los espermatozoides humanos, aparecen en 1978, cuando Rudak y cols. publican un mtodo que resolva la incapacidad para el anlisis directo de los cromosomas en los espermatozoides, ya que stos no son visibles hasta que se forma el proncleo, una vez fertilizado el vulo. Este mtodo consista en fertilizar la zona pelcida de vulos de hmster con esperma humano, y analizar los cromosomas del proncleo masculino en el huevo fertilizado.

En 1978, Rudak y cols., estudiando 60 espermatozoides de un nico varn, encuentran que slo un 5% de las clulas son aneuploides. Mas tarde, Brandiff y cols. (1984) y Martin y cols. (1985), estudiando muestras, de 909 y 1426 espermatozoides respectivamente, procedentes de 4 varones sanos en el primer caso y de 45 en el segundo, encuentran una frecuencia, de clulas portadoras de una anomala cromosmica, de un 8,1% y de un 8,9% respectivamente.

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Introduccin En 1991, en un slo trabajo se recopilan conjuntamente datos procedentes de 11.615 espermatozoides y 772 vulos cariotipados. En el estudio de espermatozoides se encontr una frecuencia media de un 10% de anomalas de cualquier tipo; mientras que en vulos sta frecuencia era de un 20%. Esta mayor frecuencia de anomalas en vulos, coincide con los resultados obtenidos en 1983 por Juberg y cols., y en 1984 por Hassold y cols., que estudiaron el origen parental de las trisomas autosmicas, concluyendo que la contribucin materna aneuploide es mucho ms comn que la paterna.

Spriggs y cols. (1996), estudiaron la frecuencia de aneuploidas para cromosomas seleccionados en el esperma humano (Tabla 6). Para ello

analizan, en cinco donantes sanos y cromosmicamente normales, un mnimo de 10.000 espermatozoides por cada cromosoma a estudiar, haciendo un total de 418.931 espermatozoides. Estos autores (Spriggs y cols.1996) aplican la tcnica de fertilizacin artificial descrita por Rudak y cols. (1978), y obtienen las frecuencias medias de disoma para los distintos cromosomas que se muestran en la Tabla 6. En sta tabla podemos observar que los cromosomas sexuales y el cromosoma 21 son los ms susceptibles a la nodisyuncin durante la espermatognesis.

Ante los resultados obtenidos, Spriggs y cols. (1996) estiman, que hasta un 35% de los abortos espontneos van a ser producto de aneuploidas de cualquiera de los cromosomas. Les sorprende, no obstante, la relativa alta frecuencia de disoma del cromosoma 1 (0,09%), ya que es el nico cromosoma que no se ha observado como trisoma en abortos espontneos. Slo en 1987, Watt y cols. describieron un caso de trisoma del cromosoma 1, en un pre-embrin de 8 clulas (en estudios de laboratorio), que, a pesar de su dotacin cromosmica, no presentaba ninguna anomala en relacin a sus caractersticas foliculares o de morfologa embrionaria.

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Introduccin

TABLA 6 Frecuencias de no-disyuncin, de distintos cromosomas durante la espermatognesis (Spriggs y cols. 1996). CROMOSOMA cromosoma 1 cromosoma 2 cromosoma 4 cromosoma 9 cromosoma 12 cromosoma 15 cromosoma 16 cromosoma 18 cromosoma 20 cromosoma 21 cromosomas sexuales FRECUENCIA 0,09% 0,08% 0,11% 0,14% 0,16% 0,11% 0,11% 0,11% 0,12% 0,29% 0,43%

Este mismo autor propona el hecho de que la ausencia de casos con cromosoma 1 extra, es un ejemplo de seleccin gentica, ya que gametos portadores de dos cromosomas 1 van a ser inviables o incapaces de llevar a cabo la fertilizacin. Esto no ocurre in vitro, donde un embrin con trisoma 1 puede ser capaz de iniciar su desarrollo, aunque no sea capaz de llevar a cabo una correcta implantacin. Sandford y cols., (1997), publicaron el primer caso de un embarazo clnicamente reconocido con una trisoma del cromosoma 1, que se perdi a las 8-9 semanas, por lo que propusieron que un cigoto con trisoma del cromosoma 1 es capaz de llevar a cabo la implantacin pero no es capaz de llevar a cabo ningn tipo de desarrollo posterior.

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Introduccin En teora, el proceso de no-disyuncin debera tener una frecuencia similar de hipohaploida e hiperhaploida. Rene y cols. (1991), estudiaron la distribucin de las aneuploidas en gametos humanos, y observaron que tanto en los vulos como en los espermatozoides los complementos cromosmicos hipohaploides eran ms frecuentes que los hiperhaploides, y que se pierden ms cromosomas pequeos que cromosomas grandes. Estos autores sugieren que los cromosomas pequeos tienen ms dificultades para fijarse al huso acromtico durante la divisin celular que los cromosomas grandes, lo que favorece su prdida. No obstante, Spriggs y cols. (1996), observan una mayor frecuencia de hiperhaploida para cromosomas del grupo G

(cromosomas pequeos) tanto en vulos como en espermatozoides, sugiriendo que al menos parte del exceso en ste grupo de cromosomas se deba a un proceso de no-disyuncin.

Spriggs y cols. (1996), proponen que el proceso de no-disyuncin cromosmica puede verse influido por distintos factores, tales como:

1.- Presencia de regiones organizadoras nucleolares, NORs. 2.- Presencia de variantes de heterocromatina. 3.- Frecuencias alteradas de recombinacin. 4.- Diferencias en el tamao cromosmico. 5.- Apareamiento no homlogo de los cromosomas sexuales.

En el caso concreto del cromosoma 16, cuya frecuencia de no-disyuncin durante la espermatognesis, segn Spriggs y cols. (1996), es de 0,11%, cabra esperar que algunas de las trisomas 16 identificadas fueran de origen paterno; no obstante Hassold y cols. (1995), estudiaron 62 abortos espontneos con trisoma 16, resultando todas ellas ser de origen materno. Ante los resultados obtenidos, Hassold y cols. proponen que esto pueda deberse a dos causas:

1.- El cromosoma 16 tiene mayor tendencia a la no-disyuncin durante la ovognesis que durante la espermatognesis.

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Introduccin 2.- Fetos trismicos con un cromosoma 16 extra de origen paterno, se pierden muy precozmente en la gestacin, por lo que no llegan a identificarse.

En 1995, Meck y cols. describieron el que parece ser el primer caso de trisoma del cromosoma 16 en mosaico, cuyo origen, al contrario de lo que se podra esperar, por lo descrito en el prrafo anterior, ha sido identificado como paterno.

Rene y cols. en 1991, estudiando la distribucin de aneuploidas tanto en vulos como en espermatozoides, encontraron que la distribucin de cromosomas en ambos tipos celulares, posee una serie de similitudes pero tambin de diferencias, que resumimos a continuacin:

1.- Similitudes entre gametos masculinos y femeninos (Rene y cols. 1991):

a.- Las hiperploidas estaban representadas en todos los cromosmas, a pesar de que en recin nacidos vivos y abortos espontneos slo se observaban hiperploidas de varios cromosomas. Estos autores afirman que debe existir un mecanismo comn de no-disyuncin que afecte a todos los cromosomas, y proponen como ejemplo, fallos en la unin de los cromosomas al cinetocoro durante el proceso de divisin celular.

b.- Aumento significativo, respecto al resto de los cromosomas, en la frecuencia de hiperploida para el cromosoma 21, por lo que proponen la existencia de algn aspecto de ste cromosoma que produzca una predisposicin a la no-disyuncin, tal como la asociacin satelitar.

2.- Diferencias entre gametos masculinos y femeninos (Rene y cols. 1991):

a.- Mayor frecuencia de anomalas cromosmicas numricas en vulos que en espermatozoides humanos. Encuentran que en los espermatozoides, las aneuploidas suponen menos de la mitad de las alteraciones, mientras que en los vulos, ms del 90% de las anomalas se deben a aneuploidas. Por el

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Introduccin contrario, observan anomalas estructurales en un 5% de espermatozoides, mientras que slo en el 1% de los vulos estudiados.

b.- Aumento significativo en la frecuencia de hiperploida para los cromosomas sexuales en los espermatozoides humanos, a diferencia de los vulos, donde esto no ocurre. Por tanto, estos autores sugieren que la mayora de las aneuploidas gonosmicas de abortos espontneos y recin nacidos vivos, son debidas a una no-disyuncin paterna.

1.7.2.- Estudios citogenticos en abortos.

Se considera un aborto todo embarazo que acaba antes de la 22 semana de gestacin (24 semana contando desde la fecha de la ltima regla), o un feto con un peso aproximado de menos de 500 grs. (Vogel y Motulsky, 1986). Si ste ocurre sin ningn tipo de intervencin humana, se dice que es espontneo, considerndose que alrededor de un 15% de los embarazos reconocidos, terminan como abortos espontneos. En el ser humano, hay evidencias de que se pierden muchos ms cigotos en los estados ms tempranos del desarrollo, siendo stos por lo general severamente malformados (Carr, 1967; Creasy y cols. 1976). Estas prdidas, que pasan desapercibidas, se pensaba que eran debidas principalmente a factores ambientales, como una implantacin defectuosa que interfera con la nutricin normal del embrin (Lauritsen, 1977). No obstante, Vogel y Motulsky en 1986 propusieron causas ms endgenas, como la constitucin cromosmica del embrin.

Los dos primeros abortos espontneos con estudio cromosmico publicados, corresponden a 1961, (Delhanty y cols. 1961; Penrose y cols. 1961) coincidiendo en ambos casos con la presencia de una dotacin triploide. Ms tarde, en 1963, se publicaron dos series de abortos con estudios citogenticos, que mostraron un elevado porcentaje de abortos con anomalas cromosmicas (Clendenin y cols. 1963). En los aos siguientes, fueron publicadas varias series de abortos con estudios citogenticos, con resultados38

Introduccin diversos. No obstante, existan muchos factores selectivos que podan influir en los resultados, tales como el inters clnico, el fenotipo, la edad materna y la edad gestacional.

Carr en 1971, y Pawlowski en 1972, publicaron los primeros resultados del estudio de dos series de abortos en las que se tuvieron en cuenta dos factores importantes, la edad gestacional y la edad materna. La frecuencia de anomalas cromosmicas que observaron fue de entre un 36% y un 37%. Esos autores, partiendo de que hasta un 15% de los embarazos reconocidos terminan en aborto espontneo, pudieron concluir que entre un 5% y un 6% de las concepciones humanas reconocidas (es decir, el 15% del 36%-37%), eran portadoras de una anomala cromosmica (Carr. 1971 y Pawlowski. 1972). Este valor es 10 veces superior a las anomalas cromosmicas observadas en 1975 por Nielsen y cols. en recin nacidos vivos (0,5%- 0.6%).

En 1976 Creasy y cols., estudiando una serie de 183 abortos, obtuvieron las frecuencias de trisomas para cada uno de los cromosomas autosmicos. Posteriormente, Bond y Chandley (1983), en una serie de 950 abortos de edad gestacional inferior a 22 semanas, encontraron frecuencias muy similares, que presentamos en la Tabla 7.

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Introduccin

TABLA 7 Trisomas autosmicas en abortos espontneos (16-18 semanas). (Hook, 1983). ANOMALA 47,+21 47,+18 47,+13 47,XXX 47,XXY 47,XYY 45,X Marcador Traslocaciones e inversiones balanceadas. 2,8 % 30,1 68,0 42,9 0,0 8,1 3,0 75,0 0,0

Este autor (Hook, 1983) observ diferencias en los porcentajes de mortalidad entre los casos diagnosticados pre y postnatalmente, y propuso que stas se deben a la existencia de un alto ndice de muerte fetal despus de las semanas 16-18 de gestacin. Esto produca un efecto enmascarado de las frecuencias al nacimiento, debido al efecto deletreo de las anomalas cromosmicas sobre el desarrollo del feto, provocando una muerte selectiva a lo largo de la gestacin de todos los fetos con anomalas cromosmicas. De ste modo, no todos los casos diagnosticados prenatalmente, con una anomala cromosmica, hubieran llegado a finalizar con xito la gestacin.

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Introduccin Los abortos espontneos son una poderosa fuente de eliminacin de cigotos defectuosos (Hook,1983).

La observacin de Hook (1983), es confirmada en un reciente trabajo realizado en nuestros datos (Martnez-Fras y cols., 2000) en el que sumando al total de RN con trisoma 21 el total de interrupciones de la gestacin por trisoma 21, la frecuencia obtenida es superior a la frecuencia poblacional, indicando que una gran proporcin de casos hubieran sido abortos espontneos.

Vogel

y

Motulsky

(1986),

tambin

observaron

que

las

anomalas

cromosmicas encontradas en abortos, presentan una distribucin que difiere de las encontradas en recin nacidos. As, algunas anomalas como 45,XO, frecuente en recin nacidos, lo es mucho ms en abortos. Las triploidas van a aparecer casi siempre en abortos, y de modo excepcional pueden aparecer en recin nacidos vivos, otras como la trisoma 16, slo se observan en abortos (Vogel y Motulsky, 1986).

Hecht y Hecht (1987) hacen una recopilacin de las anomalas detectadas en varios estudios de abortos espontneos, y observaron (Tabla 9) que un 50% corresponden a trisomas, un 20% a monosoma del cromosoma X, un 15% a triploidas y un 6% de tetraploidas. Como podemos observar en la Tabla 9, la mayora de anomalas detectadas en abortos van a ser numricas, siendo las ms comunes las trisomas con una frecuencia de alrededor del 51%,.

Los estudios de abortos de edad gestacional inferior a 11 semanas, siguen siendo poco precisos. No obstante gracias al desarrollo de las tcnicas citogenticas con fines diagnsticos, tales como la biopsia corial, existe la posibilidad de llevar a cabo un anlisis cromosmico en el material obtenido del tejido placentario. Nuevos avances fueron aportados por Kullander y Sandahl (1973) y tambin por Hahnemann (1974). Warburton y cols. (1980) quienes en un estudio realizado en una pequea muestra de abortos con una edad gestacional de 11 semanas, obtuvieron una frecuencia de anomalas

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Introduccin cromosmicas del 20%. Esta cifra hay que considerarla como estimativa, ya que la muestra era muy pequea.

TABLA 9 Anomalas detectadas en abortos espontneos. (