tumeur cellule tumorale sang/moelle adnarnproteine temps marqueur diagnostic pronostic réponse...
TRANSCRIPT
tumeur
Cellule tumorale
Sang/Moelle
ADN ARN PROTEINE
Temps
MarqueurDiagnosticPronostic Réponse
traitement
Suivi
Rechute
APL: Différenciation in vitro
Cytologie
Test NBT
Culture des blastes leucémiques au diagnostic pendant 3-6 jours avec ATRA 0.1µM
Bon RépondeurMauvais Répondeur
days
P(s
urvi
val)
0 500 1000 1500 2000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Diff<50%
Diff > 50%
P= 0.10
days
P(r
elap
se f
ree)
0 500 1000 1500 2000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Diff<50%
Diff > 50%
P= 0.04
days
P(e
vent
fre
e)
0 500 1000 1500 2000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Diff<50%
Diff > 50%
P= 0.01
APL 93: Différenciation in vitrofacteur de pronostic indépendant
N= 77
Event-free survival Relapse-free survival
Overall Survival
Diagnostic Maladie Résiduelle Rechute
PCR +++ + _ _ + +++
Applications de la PCR
Translocations des APL
PML-RAR
PLZF-RAR
NuMA-RAR
NPM-RAR
STAT5b-RAR
t(15;17)insertions
t(11;17) (q23;q21)
t(11;17) (q13;q21)
t(5;17)
der(17)
> 95%
1%
1 cas
< 1%
1 cas
RT-PCR
RT-PCR
?
?
?
Exons 3 4 5 6 7a 3 4
Bcr3 Bcr1Bcr2
PMLchromosome 15
RARchromosome
Translocations t(15;17)
Bcr1 : 60%
Bcr2 : 10%
Bcr3 : 30%
RAR-PML exprimé chez seulement 75% des patients
Protocole de RT-PCR Nichée
2072
600
100
bpBcr3 bcr2 bcr1 MW
2072
600
100
bp bcr3 bcr2 bcr1 MW
PML RAR
exon 3bcr 1bcr 2bcr 3exon 3
O7 O8
RARPML
R5M7
RARPML
Points de Cassure t(15,17)
PCR N°1
PCR N°2
Sensibilité: 10-5 à 10-6
Diagnostic et MRD Typage
O1M7
RARPML
p= 0.06
0
,1
,2
,3
,4
,5
,6
,7
,8
,9
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
months
bcr2, bcr3bcr1
Event-free survival
p= 0.05
0
,1
,2
,3
,4
,5
,6
,7
,8
,9
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
months
bcr2, bcr3bcr1
Time to relapse after remission
Pronostic selon le typage Bcr
p= 0.05
0
,1
,2
,3
,4
,5
,6
,7
,8
,9
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
months
bcr2, bcr3bcr1
Overall survival
N= 110
RT-PCR standard après le diagnostic (APL93)
Nombre de prélèvements % de prélèvements
4 - 6 mois après diagnostic N = 84
010203040506070
Positif (%) Négatif (%)
Bcr1Bcr2+3
12 mois après diagnostic N = 65
0
10
20
30
40
50
Positif (%) Négatif (%)
Bcr1Bcr2+3
Nombre de prélèvements % de prélèvements
P= 0.61
0
10
20
30
40
50
Positif Négatif
total
Bcr1
Bcr2+3
0
10
20
30
40
50
Positif Négatif
total
Bcr1
Bcr2+3
0
5
10
15
20
<50% >50%
PCR positive
PCR négative
0%
20%
40%
60%
80%
<50% >50%
PCR positive
PCR négative
PCR standard après 4 - 6 mois (APL93) et Différenciation in vitro au diagnostic
% de cellules différenciées à J3 de culture % de cellules différenciées à J3 de culture
N= 37
Nombre de Patients % de Patients
P= 0.038
0
5
10
15
20
25
30
35
PCRPositive
PCRNégative
rechute +
rechute -
0
20
40
60
80
100
Positif Négatif
rechute + (%)
rechute - (%)
PCR standard après 4 - 6 mois (APL93)et Risque de Rechute
Nombre de Patients % de Patients
N= 84
P= 0.010
Valeur Prédictive Négative= 82.5 %
Approches par RT-PCR standard
Sensibilité importante (10-6)
- 50% des patients positifs après consolidation
- 80% des patients négatifs post-conso ne vont pas rechuter
- incapacité à prédire le pronostic des patients encore positifs
- positivité de patients en rémission à long terme
Sensibilité médiocre (10-4)
- < 10% des patients sont positifs après consolidation : mauvais pronostic
- incapacité à prédire le pronostic des patients négatifs:
30% des rechutes sont précédées d ’une PCR négative
- forte probabilité (70%) de rechute des patients se repositivant
- essai de traitement de la rechute moléculaire : allo BMT
RT-PCR Quantitative en temps réel
PCR quantitative en temps réel
Idée: suivre l ’apparition des produits de PCR au fur et à mesure de leur formation
et non plus en point final
But: détecter le point de démarrage de la partie exponentielle de la réaction
qui est proportionnelle à la quantité initiale de matériel
Moyen: générer un signal fluorescent proportionnel à la quantité de matériel
et suivre la fluorescence au cours de la réaction
Agents Intercalants
3’ 5’5’ 3’
5’
3’
Amorce sens
Amorceantisens
R Q
3’
3’
3’ 5’5’ 3’
5’
Q
3’
R
3’
3’ 5’5’ 3’
5’
Q3’
3’
3’ 5’5’ 3’
5’
Q3’
Polymérisation
Déplacement du brin
Clivage
Fin de la polymérisation
R
R
R = ReporterQ = Quencher
Sonde Taqman
Source laser
Spectrographe
Lentille
Lentille
Miroir dichroïque
Fibres optiques
Plaque96 puits
Multiplexer
REPRESENTATION DU SYSTEME DE DETECTIONDE LA FLUORESCENCE (Abi Prism 7700)
Accumulation des produits de PCR
Seuil
Cycle Seuil = Ct
Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10
Ct des différentes dilutions
Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10
Temps
MarqueurDiagnosticPronostic Réponse
traitement
Suivi
Rechutes
DiagnosticMaladie Résiduelle Rechute
PCRStandard +++ + _ _ + +++
PCRQuantitative
Sonde
Protocole de RT-PCR Quantitative en temps réel
1 2 3 4 5 6
RARPML
Sonde
1 2 3 4 5 6
Bcr1
Bcr2
Sonde
1 2 3
RARPML
Bcr3
Normalisation par rapport à un gène de ménage: Housekeeping gene
RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003
Comparaison Moelle - Sang
DFS, %
Cutoff Relapses / Patients P value 1 y 2y 3y
> 10-5 6/9 56 44 33
< 10-5 16/44
0.008
86 72 65
> 10-7 / 10-8 8/13 0.074 62 54 46
<10-7 / 10-8 14/40 88 72 63
>10-10 11/21 0.244 67 62 52
negative 11/32 91 70 64
RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003
Risque de rechute et DFS selon cutoff de positivité après consolidation
Indétectable
10
102
103
104
105
106
107
Diagnostic 1 mois
RQ-PCR: nombre de copies au diagnostic et après 1 mois
N= 25
No
mb
re d
e c
op
ies
au
dia
gn
ost
ic
1 mois après le Diagnostic N= 15
0
2
4
6
8
10
12
<50% >50%
Positif
Négatif
No
mb
re d
e p
atie
nts
% de cellules différenciées à J3 de culture
p=0.022
RQ-PCR: Positivité et Différenciation au diagnostic
Corrélation entre différenciation au diagnostic et positivité
en RQ-PCR à 1 mois
Indétectable
Mois
Rechute
10
102
103
104
105
106
Suivi par RQ-PCR: Exemple de résultat N
om
bre
de
Co
pie
s N
orm
alis
é
Conclusion
Méthode de choix: RQ-PCR- quantifier la qualité des échantillons- suivi cinétique de la réponse au traitement- suivi cinétique d ’une re-positivation- évaluer des seuils
Objectifs : - établir un schéma précis des temps de prélèvements- Sang ou moelle ?- établir des seuils prédictifs de l ’évolution des patients
* seuil après traitement : Induction? Consolidation?* seuil de re-positivation* seuil de positivité d ’un échantillon pour autogreffe
- standardisation
Question : traitement de la rechute moléculaire? Arsenic?
Induction Consolidation Entretien Rémission
Début Fin Fin 1/6 mois 1/6 moisMOELLE
• RQ-PCR
Entretien Rémission
1/3 mois 1/6 mois
SANG
• RQ-PCR
Protocole de prélèvements dans la leucémie aiguë à promyélocytes
Références Bibliographiques
- David Grimwade
The significance of minimal residual disisease in patients with t(15;17)
Best Practice and research Clinical Haematology Vol15, n°1, p137-158, 2002
- Grimwade D, Lo Coco F Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and
residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia.
Leukemia. 2002 Oct;16(10):1959-73.
- Gallagher RE et al.
Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RARa mRNA in acute
promyelocytic leukemia: assessment of prognostic significance in adult
patients from intergroup protocol 0129
Blood Vol 101, n°7 p2521-2528, 2003