Étude structure-fonction du cotransporteur rénal na-k-cl
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MARIE-EVE PELCRAT
ÉTUDE STRUCTURE-FONCTION DU COTRANSPORTEUR RÉNAL
NA-K-CL DE TYPE 2
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en médecine expérimentale
pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
.@ Marie-Eve Pelchat, 2009
F ACUL TÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LA V AL
QUÉBEC
2009
II
RÉSUMÉ
Le cotransporteur Na-K-CI rénal (NKCC2) couple le transport de 4 ions (1 Na+, 1 K+ ou
1 Rb +, et 2 Cr) à travers la membrane apicale de l'anse ascendante de Renle, contribuant
à la réabsorption de l'ultrafiltrat glomérulaire. L'épissage alternatif de l'exon 4 engendre
2 variantes appelées «A» et «F» dont la séquence dans le deuxième segment
transmem-branaire (tm2) et dans la première boucle intracellulaire (cs1) diffère. Il
confère aussi des différences d'affinité ioniques, i.e., « A » a des Km beaucoup plus bas
que « F » pour tous les ions grâce à des résidus spécifiques que nous avons identifiés par
des études mutagéniques, i.e., les résidus 216 et 220 dans tm2 (qui moduleraient l'affinité
pour le Rb et Cl, respectivement) et certains résidus de csl incluant 223, 229, 233 et peut
être 225 (qui moduleraient l'affinité pour le Cl). À ce stade-ci, notre but principal est
d'avancer notre recherche sur la compréhension des déterminants qui confèrent à « A » et
« F» leurs caractéristiques cinétiques propres. Nous savons que les résidus
« modificateurs d'affinité» identifiés opèrent en combinaison mais ignorons la séquence
des cassettes en ~ant que tel et leur spécificité ionique. Nous avons donc créé des .
chimères en interchangeant des paires de résidus entre « A » et « F », i.e. résidus 216 et
220 dans tm2, 223 et 225 dans cs1, 223 et 229 dans csl, et 220 et 225 dans tm2-cs1, pour
ensuite exprimer les mutants dans des oocytes de Xenopus laevis et analyser leur
dépendance à chacun des ions. Nous avons trouvé, de façon fort intéressante, que la
cassette 220;223;225;233 modulait l'affinité pour les ions Na+-Cr (incluant le site à haute
affinité pour le Cl) et que la 'cassette 216;225 modulait celle pour le Rb. Toutefois, les
résultats obtenus pour l'une des chimères (<< F » chez qui les résidus 216 et 220 ont été
remplacés par ceux de « A ») avait un comportement inattendu puisque son affinité pour
le Rb est demeurée identique à celle de « F ». En conclusion, les résidus de tm2 et csl
fonctionnent probablement en synergie pour assurer la coordination ionique par NKCC2.
Par ailleurs, nos résultats suggèrent l'existence d'au moins 2 cassettes « modificatrices
d'affinité », l'une pour le Na-Cl et l'autre pour le K-Cl.
III
AVANT-PROPOS
Je remercie tout d'abord mon directeur de recherche, Dr. Paul Isenring, pour m'avoir
accueilli dans son laboratoire. J'ai appris énormément à ses côtés et j ' ai profité de ses
nombreux conseils durant toutes mes études. Je tiens à souligner sa disponibilité malgré
son horaire chargé. Merci beaucoup.
Je tiens aussi à remercier Luc Caron, Micheline Noël, Mariève Jacob-Wagner, Rachelle
Frenette-Cotton, Marie-Hélène Lefoll, Charles Simard, Nikolas Daigle et Gabriel
Carpentier, mes collèges et amis du laboratoire, qui ont rendu mes études supérieures
agréables. Merci également à tous les membres du personnel administratif et technique
du Centre de recherche L'Hôtel-Dieu de Québec pour leur travail remarquable et leur
générosité.
Un merci tout spécial à mes parents et à mon frère pour leur amour inconditionnel et leurs
encouragements tout au long de mes études. Je leur dois beaucoup d'estime et de
reconnaIssance.
Finalement, je remercie le Centre de recherche de ~'Hôtel-Dieu de Québec et le FRSQ
pour m'avoir soutenu financièrement durant mes 2 années d'études à la maîtrise. Grâce à
des bourses de recherche octroyées par ces organismes, j'ai eu la chance de parfaire ma
formation et mes connaissances en recherche et progresser avec diligence.
IV
TABLE DES MATIÈRES
CHAPITRE 1. INTRODUCTION .................... · ..................................................................... 8 1. Fondements du transport membranaire ........................................................................ 9 2. Les cotransporteurs cation-chlore (CCCs) .................................................... ............... 11 2.1. La famille des CCCs ................................................................................ ............... 11 2.2. Clonage des CCCs .................................................................................................. 11 2.3. Structure des CCCs ................................................................................................. 12 2.4. Rôles des CCCs ...................................................................................................... 12 2.5. Régulation des CCCs .............................................................................................. 14
3. Le cotransport Na-K-CI ............................................................................................... 15 3.1. Découverte et caractéristiques du cotransport N a-K -Cl ...................................... ~ .. 15 3.2. Clonage et isoformes des NKCCs .......................................................................... 16
4. NKCC1 ......................................................................................................................... 16 4.1. Études génomiques ................................................................................................. 17 4.2. Distribution de NKCC1 .......................................................................................... 17 4.3. Rôles de NKCC1 .................................................................................................... 18 4.4. Régulation de NKCC 1 ............................................................................................ 19
4.4.1. Régulation par la phosphorylation ................................................................. 19 4.4.2. Implication du cytosquelette ............................. ~ ............................................ 20
4.5. Implication dans l'hypertension artérielle .............................................................. 20 5. NKCC2 ......................................................................................................................... 20 5.1. Études génomiques ................................................................................................. 21 5.2. Variantes d'épissage de NKCC2 ............................................................................ 21
5.2.1. Généralités ..................................................................................................... 21 5.2.2. Séquences de l'exon 4 de NKCC2 ................................................................. 22
5.3. Distribution de NKCC2 ......................................................................................... 22 5.4. Cinétiques des variantes d'épissage de NKCC2 ..................................................... 23 5.5. Régulation de NKCC2 ............................................................................................ 24
5.5.1. Régulation du niveau d'expression ................................................................ 24 5.5.2. Régulation de l'activité .................................................................................. 25
5.5.2.1. Selon l'osmolalité et le Cl intracellulaire ............................................. 25 5.5.2.2. Par la phosphorylation .......................................................................... 26 5.5.2.3. Par d'autres facteurs ............................................................................. 26
5.6. Mode opérationnel de NKCC2 ............................................................................... 27 5.7. Inhibition du cotransport Na-K-Cl. ......................................................................... 28 5.8. Formation d'oligomères ........................................................................................... 29 5.9. Rôles physiologiques de NKCC2 ........................................................................... 30
5.9.1. Concentration de l'urine ................................................................................ 30 5.9.2. Soutien du « feedback » tubuloglomérulaire ................................................. 31 5.9.3. Maintien de l'équilibre acido-basique ........................................................... 32 5.9.4. Implication dans le maintien de l'intégrité médullaire ....... ~ .......................... 32
5.10. Implications de NKCC2 dans certaines maladies ................................................... 33 5.10.1. Syndrome de Bartter ...................................................................................... 33 5.1 0.2. Hypertension .................................................................................................. 33
v
5.11. Le NKCC2 rénal parmi d'autres systèmes de transport ......................................... 34 6. Commentaires par rapport aux principales méthodes utilisées : ................................... 35 6.1. Systèmes d'expression utilisés pour étudier les NKCCs ........................................ 35
6.1.1. Généralités ..................................................................................................... 35 6.1.2. Les oocytes deXenopus laevis comme système d'expression ...................... 36
6.2. Analyses fonctionnelles .......................................................................................... 36 6.3. Détermination de Kms ............................................................................................. 37
7. Objectifs et hypothèses de recherche ............................................................................ 38
CHAPITRE 2. MÉTHODES GÉNÉRALES ......................................................................... 39 1. Générations des mutants ............................................................................................... 39 2. Expression de NKCC2 ......................... ........................................................................ 40 3. Épreuves fonctionnelles ............................................................................................... 40
CHAPITRE 3. MANUSCRIT EN PRÉPARATION ............................................................ 41 1. Notes.~ ........................................................................................................................... 41 2. Abrégé en français ........................................................................................................ 41 3. Abrégé en anglais .......................................................................................................... 43 4. Introduction .................................................................................................................. 43 5. Material and Methods ................................................................................................... 45 5.1. Overview ................................................................................................................. 45 5.2. Constructs ............................................................................................................... 45 5.3. Expression inX laevis oocytes .............................................................................. 46 5.4. Kinetic studies ..................................................................................................... ~ .. 46
6. Results .......................................................................................................................... 48 6.1. Expression of saNKCC2s in X. laevis oocytes ...................................................... 48 6.2. Kinetics of cation transport ..................................................................................... 48
6.2.1. Previous studies ............................................................................................. 48 6.2.2. CUITent studies ............................................................................................... 49
6.2.2.1. Changes in tm2 ....................... ~ ............................................................. 49 6.2.2.2. Changes in cs1 ...................................................................................... 49 6.2.2.3. Changes in tm2 and cs1 ........................................................................ 50
6.3. Kinetics of Cl transport ........................................................................................... 50 6.3.1. Previous studies ............................................................................................. 50 6.3.2. CUITent studies ............................................................................................... 51
6.3.2.1. Changes in tm2 ........................................ ~ ............................................ 51 6.3.2.2. Changes in cs1 ...................................................................................... 51 6.3.2.3. Changes in tm2 and cs1 ........................................................................ 52
7. Conclusions .................................................................................................................. 52
CHAPITRE 4. DISCUSSION ET CONCLUSION ............................................................... 58
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................... 60
ADNe ALH AMPe Ang-II ARNe ARNm ATP CCC esl C-terminal FTG HEK-293 KCC Km NCC NKCC NKCCI NKCC2 N-terminal oCCC pb Rb sa SLC tm2 WNK
LISTE DES ABRÉVIATIONS
acide désoxyribonucléique complémentaire anse ascendante large de Rente adénosine monophosphate cyclique angiotensine II acide ribonucléique complémentaire acide ribonucléique messager adénosine triphosphate co transporteur cation-chlore boucle intracellulaire suivant le tm2 carboxyle-terminal "feedback" tubuloglomérulaire "human embryonic kidney cells" èotransporteur potassium-chlore constante de Michaelis-Menten cotransporteur sodium-chlore cotransporteur sodium-potassium-chlore cotransporteur sodium-potassium-chlore de type 1 cotransporteur sodium-potassium-chlore de type 2 amino-terminal cotransporteur cation-chlore orphelin paire de bases rubidium Squalus acanthias "solute carrier" deuxième domaine transmembranaire "with no lysine kinase"
VI
Figure 1. Table 1. Figure 2. Figure 3. Figure 4. Figure 5.
Figure 6. Figure 7. Figure 8. Table 2.
VII
LISTE DES TABLES ET FIGURES
Anatomie du néphron ................ ............................ , ........................................... 8 Composition des milieux extracellulaire et intracellulaire chez l'humain ....... 9 Représentation schématique d'une membrane ................................................. 10 Modèle hydropathique d'un NKCC2A de vertébré .......................................... 13 Épissàge alternatif de la cassette « BAF » codant pour l'exon 4 de NKCC2 ... 22 Séquence en acides aminés des exons 4B, 4A et 4F de NKCC2 chez le lapin et le requin ............................................................................................... 22 Modèle .de cotransport Na-K-CI ....................................................................... 27 Représentation de l'anatomie.de l'appareil juxtaglomérulaire ......................... 31 Rôle de NKCC2 dans la réabsorption du NaCI dans l'ALH ............................ 34 Media used for the studies ............................................................................. ~ .. 53
Figure 9. Mutants tested ................................................................................................... 54 Figure 10. Kinetics of cation transport ................................................................................ 55 Figure Il. Kinetics of Cl transport ..................................................................................... 56 Figure 12. Data illustrating the depedence of two mutants on various ions ...................... 57
8
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
Le rein a pour fonction essentielle d'assurer l'équilibre hydro-électrolytique (homéo
stasie) du sang et de l'organisme en général. Il accomplit ce rôle en tenant compte des
pertes d'eau et de sels qui sont dues à la respiration, aux sécrétions glandulaires ( sueur) et
la formation de selles, et en tenant aussi compte des gains d'eau et de sels qui viennent
avec l'ingestion. De façon plus spécifique, le maintien de l'équilibre se fait par les
tubules rénaux du néphron, l'unité structurelle et fonctionnelle de base du rein, qui
« décident» de la quantité d'eau et de sels à laisser passer ou à retenir. Tel qu' illustré à la
Fig. 1, un néphron est constitué d'un glomérule suivi d'un tubule relativement long qui
comprend 4 segments : le tubule proximal, l'anse de RenIe, le tubule distal et le tubule
collecteur 01 altin et Schafer, 1995).
FIGURE 1. Anatomie du néphron. Reproduit de Rose (1994).
Thin de$cendiJ)1 limb ·of loop
of HeriTt
·,t:thidt a~ndj", lim~ ()nÔ/)p
or HénJe
Thiil~ndlnJ lfnlP of!.oop
ofHèÏlk
< COl)nec!in, segmt7!1
Cortical , cQ[Jectin,
tubule
Medullllry eoliéçtln,
tubule
. Cortex
MedUlla
L'anse ascendante de Henle (ALH) est imperméable à l'eau et perméable au sodium. Il
exite des néphrons à anse courte (néphrons corticaux) et des néphrons juxtamédullaires
dont l'anse ascendante longue est composée de deux segments: le segment mince et le
segment large. Ces derniers permettent la formation d'urine concentrée ou diluée, selon le
cas. C'est dans l' ALH des tubules rénaux que 30% de la réabsorption du Na + se produit
grâce au concours du cotransporteur Na-K-CI de type 2 (NKCC2). Cette protéine
membranaire permet le transport simultané des ions Na+, K+ et cr vers l'intérieur de la
cellule tubulaire. Elle est donc appelée à jouer un rôle important dans l'homéostasie des
1 .
9
électrolytes et le maintien du volume extracellulaire. La présente étude porte spécifi
quement sur NKCC2 qui existe en 3 variantes d'épissage et qui est distribué tout le long
de l'ALH.
1. Fondements du transport membranaire
La cellule doit faire en sorte que son cytosol et ses organelles soient en équilibre hydro
électrolytique puisque autrement, elle ne pourrait fonctionner normalement et survivre
Ceci est d'autant plus important que le volume et la composition ionique diffèrent d'un
compartiment cellulaire à l'autre, de même qu'entre chacun de ces compartiments et le
milieu extracellulaire (Table 1). C'est grâce aux systèmes de transport membranaire
exprimés dans la membrane plasmique et les membranes intracellulaires que chacun des
compartiments cellulaires conservent leur identité.
TABLE 1. Composition des milieux extracellulaire et intracellulaire chez 1 'humain.
Ion
cr
[ ] intra (mM)
cellule
12
139
4
[ ] extra (mM)
sang
145
4
116
La membrane cellulaire est composée d'une bicouche de phospholipides et constitue une
barrière sélective entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule (Fig. 2). Elle est pratique
ment imperméable à toutes les molécules à l'exception de celles qui sont très petites et
très hydrophobes (02 et N2). Elle sert néanmoins de support aux protéines transmem
branaires qui elles, permettent de réguler le passage de différentes molécules (eau,
glucose, acides aminés, glycérol, urée, ions, etc.) d'une manière sélective et orientée.
10
Il existe 3 types de protéines de transport ionique : les canaux, les pompes et les
transporteurs. Les canaux permettent le transport passif de molécules grâce à des
gradients électrochimiques. Ils fonctionnent selon un mode ouverture/fermeture en
réponse à différents stimuli et jouent un rôle important dans le maintien du potentiel de
membrane. La vitesse de passage à travers un canal est élevée (106 à 107 ions/s)
contrairement à celle d'un transporteur ou d'une pompe (102 à 104 ions/s). Les
transporteurs permettent aussi le transport passif grâce à des gradients électrochimiques.
Ils peuvent toutefois faire du transport facilité secondaire grâce à la présence de sites de
liaison pour au moins 2 molécules différentes et le mouvement en bloc de ces molécules
à travers la paroi cellulaire. La raison qui explique la cinétique plus lente des
transporteurs est le besoin de changer de conformation pour qu' il y ait translocation des
substrats à travers la membrane. Les pompes, finalement, permettent le mouvement des
ions contre des gradients de concentration en subissant un changement important de
conformation grâce à l'utilisation d'énergie provenant d'un substrat non transporté tel
l'ATP.
Que ce soit pour les canaux, transporteurs ou pompes, la majorité des sites de transport
sont hautement spécifiques à un substrat donné. Le NKCC2, par exemple, possède 1 site
de liaison pour le Na+, 1 site pour le K+ et 2 sites pour le cr. Lorsque tous ces sites sont
occupés, la protéine change de conformation pour permettre le passage des ions vers
l'intérieur de la cellule. (Haas et al., 1989 ; Isenring et Forbush, 2001). Dans ce système,
ainsi, le K+ est attiré contre gradient et subit donc un transport facilité secondaire.
Milieu extraoellulaire
Cytoplasme
FIGURE 2. Représentation schématique d'une membrane. Les protéines transmembranaires sont représentées en bleu et les phospholipides en rouge.
2. Les cotransporteurs cation-Cr (CCCs)
2.1. La famille des CCCs
Il
Les cotransporteurs cation-Cl électroneutres sont classés dans la famille 12 des « solute
carriers» (SLC12). Ce sont des protéines transmembranaires qui couplent le mouvement
de cations (Na+ et/ou K+) et du cr à travers la membrane plasmique avec une
stoechiométrie de 1 cation pour 1 anion. Il existe 9 isoformes dans la famille SLC 12 dont
7 sont bien caractérisés. Ces isoformes s'appellent cotransporteur Na~CI sensible aux
thiazides (NCC), cotransporteurs Na-K-CI sensibles aux diurétiques de l'anse (NKCCI et
2), cotransporteurs K-CI (KCC1 à 4) et cotransporteurs orphelins (CCC8 et 9) dont les
substrats n'avaient pas été identifiés jusqu'à tout récemment.
12
2.2. Clonage des CCCs
Les 2 premiers cotransporteurs dont la séquence en acides aminés a pu être identifiée sont
NCC et NKCCI. Ils ont été isolés à partir de la vessie d'un vertébré marin, le flet, dont le
tissu exploité exprime une activité de cotransport Na-Cl très forte et de la glande rectale
d'un requin, le Squalus acanthias, dont le tissu exploité exprime lui une activité de
cotransport N a-K -Cl très forte. Les investigateurs impliqués dans ces découvertes ont
démontré que l'injection de l' acide ribonucléique messager (ARNm) de NCC dans des
oocytes de Xenopus laevis menait à une augmentation de l'influx en 22Na+ sensible au
thiazide et dépendant au Cl (Gamba et al. , 1993) et que l' expression de l'ADNe de
NKCCI dans des cellules HEK-293 menait à une augmentation de l'influx en 86Rb+
sensible au furosémide et dépendant du NaCl (XU et al., 1994). Il faut mentionner que
dans le cas de NCC, le gène a été découvert grâce à une technique appelée « clonage par
expression» où l'oocyte a servi de système translationnel et que dans le cas de NKCC 1,
le gène a été découvert grâce au criblage d'une librairie d' expression provenant du \
requin. L'anticorps utilisé pour le cotransporteur Na sensible avait été produit quelque
temps avant à partir d'une protéine purifiée grâce à un analogue tritié et photosensible du
furosémide, appelé BSTBA (Xu et al., 1994) ..
Suivant l'identification de NCC et NKCCI et la mise sur pied des banques de nucléotides
EST (expressed sequence tags), il a été facile de cloner les autres CCCs, i.e., NKCC2,
KCCs et CCCs orphelins. Entre autres, on doit à Gillen et al. (1996), la découverte du
premier KCC (KCC 1) et à d'autres investigateurs (Holtzman et al., 1998 ; Race et al.,
1999 ; etc.), celle des isoformes KCC2 à 4.
2.3. Structure des CC Cs
Selon leur séquence en acides aminés, les protéines de la famille des CCCs partagent une
homologie de 25 à 750/0 (Gillen et al. , 1996 ; Caron L. et al., 2000 ; Russell et al., 2000 ;
Haas et Forbush, 2000), plus importante dans la région membranaire centrale. Tel
qu' illustré par la Fig. 3, l'analyse de l'hydrophobicité des acides aminés composant les
13
CCCs, faite selon l'algorithme de Kyle-Doolittle -(Kyte et al., 1982), démontre que la
structure des ces protéines comporte 3 domaines distincts: une région centrale fortement
hydrophobe d'environ 500 acides aminés comprenant au moins 10, généralement 12
segments transmembranaires (tms) arrangés en hélices u, et 2 régions plus hydrophiles
dans le cytoplasme. La région amino-terminale (N-terminale) a une longueur très variable
entre les différents isoformes tandis que la partie carboxyle-terminale (C-terminal) est
beaucoup plus conservée et contient aussi plusieurs hélices u (Gamba et al., .1993 Xu et
al., 1994 ; Gillen et al., 1996 ; Caron et al., 2000). Finalement, tous les CCCs possèdent
plusieurs sites phosphoaccepteurs putatifs dans les régions intracellulaires et des sites de
N-glycosylation dans au moins une boucle extracellulaire.
2.4. Rôles des CCCs
En plus d'être impliqués dans l'absorption et la sécrétion des sels, la plupart des CCCs
sont essentiels au maintien et à la régulation du volume et contenu cytosolique en ions
Na +, K+ et cr des cellules épithéliales et non-épithéliales. Aussi, ils ont la capacité de
trans-porter des substituts ioniques comme le Li+ à la place du Na +, le NH4 + ou le Rb + à la
place du K+ et le B{ à la place du cr (Bergeron et al., 2003 ; Mercado et al., 2001).
D'autres ions se lient aussi aux CCCs (SCN-, r) et en modifient l'activité mais ne sont
pas transportés.
FIGURE 3. Modèle hydropathique d'un NKCC2A de vertébré. Les résidus en rouge correspondent à la région codée par l' exon 4 qui est épissé de façon alternative pour cet isoforme. Adapté de Payne et Forbush (1994).
14
Les NKCCs et les KCCs participent tous deux à la régulation du volume cellulaire mais
de façon contraire. Par exemple, lorsqu'une cellule est exposée à un milieu hyperosmo
laire, les NKCCs sont activés et les KCCs inhibés, ce qui entraîne une accumulation des
io~s Na+, K+ et cr accompagnée par une accumulation d'eau et, ainsi, d ' un
rétablissement du volume cellulaire à la hausse. Les NKCCs jouent donc un rôle de
protection cellulaire en participant à un mécanisme appelé «regulatory volume
increase» ou « RVI » (Russell et al., 2000). Lorsque, à l'inverse, une cellule est exposée
à un milieu hypoosmolaire, les KCCs sont activés et les NKCCs sont inhibés, ce entraîne
une perte des ions K+ et cr accompagnée par une perte d'eau et, ainsi, d'un
rétablissement du volume cellulaire à la baisse. Les KCCs jouent donc aussi un rôle de
protection cellulaire mais en participant à un mécanisme appelé «regulatory volume
decrease » ou « RVD » (Adragna et al., 2004).
Parmi les autres rôles des NKCCs et des KCCs, mentionnons la régulation du
mouvement des ions à travers les épithélia. Ces transporteurs permettent en effet la
réabsorption des sels en déplaçant les ions d'une lumière épithéliale vers le cytosol de la
cellule (NKCC2) ou du cytosol de la cellule vers le compartiment extracellulaire (KCCs).
Ceci s'explique par le fait que NKCC2 est localisé sur la membrane apicale et favorise
l'influx des ions, alors que les KCCs sont localisés sur la membrane basolatérale et
favorisent l ' efflux des ions. NKCC 1, de son côté, permet la sécrétion des sels en
déplaçant les ions du compartiment extracellulaire vers le cytosol de la cellule, et ceci
s'explique par le fait que ce transporteur est localisé sur la membrane basolatérale et
favorise l'influx des ions. Une des seules exceptions aux règles discutées ici concerne les
CCCs exprimés dans le plexus choroïde. À cet endroit, étonnamment, certains membres
de cette famille sont localisés sur la membrane apicale et favorise donc la sécrétion des
ions.
La fonction de la plupart des CCCs est inhibée par des composés chimiques appartenant
à la famille des acides sulfamoylbenzoïques (furosémide, bumétanide, benzmétanide) ou
benzothiazidines (hydrochlorothiazide, metolazone, tri chI orméthi azi de ) et ce, de façon
réversible. La sensibilité à ces inhibiteurs diffère toutefois entre les CCCs. Par exemple,
15
NCC est surtout inhibé par l 'hydrochlorothiazide, les KCCs sont surtout inhibés par le
furosémide et les NKCCs sont inhibés par tous les sulfamoylbenzoïques (Stokes, 1988 ;
Mercado et al., 20.0.1). Dans le cas des NKCCs et probablement des KCCs, l' inhibition
survient seulement si les transporteurs sont dans une conformation active (F orbush et
Palfrey, 1983 ; Hegde et Palfrey, 1992). À noter que KCC4 est aussi sensible au trichlor
méthiazide et moins sensible que les autres KCCs au furosémide (Mercado et al., 20.0. 1).
2.5. Régulation des CCCs
Plusieurs . mécanismes de régulation contrôlent l'activité des CCCs lorsque la
concentration du Cl, volume ou pH change dans la cellule, ou lorsque la concentration de
certaines hormones ou facteurs autocrines change dans le milieu extracellulaire (O 'Grady
et al., 1987 ; Gagnon et al., 20.0.6). Par exemple, une augmentation du Cl intracellulaire
active les KCCs mais inhibe les NKCCs, alors qu'une baisse du pH intracellulaire < 7,5
active KCC4 mais inhibe NKCC2, KCCI, KCC2 et KCC3 (Bergeron et al. , 20.0.3 , 20.0.7).
Le mécanisme régulateur le mieux connu de l'activité CCC implique des changements de
phosphorylation des cotransporteurs eux-mêmes par des enzymes spécifiques. Une acti
vation du cotransport N a-K -Cl est associée à la phosphorylation des NKCCs tandis
qu'une inhibition du cotransport K-CI est associée (semble-t-il) à la déphosphorylation
des KCCs. Par exemple, l'hormone ADH augmente l'absorption de NaCI dans l'anse
ascendante de Henle via la phosphorylation de NKCC2 et via sa migration vers la mem
brane apicale (Giménez et Forbush, 20.0.3). Toutefois, les kinases/phosphatases impli
quées n'ont pas encore été identifiées de façon précise, bien qu'elles pourraient inclure la
PKA (protéine kinase A), la phosphatase PPI, les protéines kinases SPAK (Ste2o.p
related Praline Alanine-rich Kinase) et OSR1 (oxidative-stress-responsive kinase 1), et
les WNKs (<< With No Lysine» kinase) incluant WNK-1 et WNK-4 (Kurihara et al.,
1999 ; Darman et al., 20.0.1 ; Piechotta et al., 2002 ; Kahle et al., 2004 ; Peng et Warnock,
200.7) . . Il est intéressant de noter que WNK -1 et -4 ont été associées au syndrome
héréditaire «pseudohypoaldostéronisme de type II>> caractérisé par une hypertension
artérielle et hyperkaliémie persistante (Gamba, 2005 ; Subramanya et al., 2006).
16
3. Le transport Na-K-CI
3.1. Découverte et caractéristiques du cotransport Na-K-CI
À la suite de la découverte du cotransport Na-K-CI dans des cellules d'Ehrlich (Geck et
al., 1980), il a été établi que ce type de transport ionique était présent dans plusieurs
types cellulaires et tissus. Par exemple, on sait maintenant que la glande rectale du requin
(Hannafin et al., 1983), la glande parotide du lapin (Turner et al., 1986), le cortex du rein
de lapin (Greger et Schlatter, 1981), les érythrocytes du canard (Haas et al., 1982),
l'axone du calmar (Russell, 1983), etc., exhibent tous un cotransport Na-K-Cl.
L'identification de la fo,nction « cotransport Na-K-CI » se base aujourd'hui sur:2 critères.
Premièrement, le mouvement de n'importe quel des ions doit survenir seulement si les 2
autres ions sont aussi présents dans le milieu extracellulaire. Deuxièmement, le
cotransport des ions doit être inhibé par un diurétique de l'anse appartenant à la famille
des sulfamoylbenzoïques qui interagissent tous avec les NKCCs directement sur le
versant externe de la protéine (Haas, 1994).
3.2. Clonage et isoformes des NKCCs
Tel que mentionné, NKCC1 de la glande rectale du requin est le premier CCC à avoir été
cloné (Xu et al., 1994). Par la suite, ce gène a été isolé par criblage de banques d'ADNe
provenant, entre autres, de la souris (Delpire et al., 1994), du lapin (Payne et Forbush,
1994) et de l'humain (Payne et al., 1995). À l'heure actuelle, la séquence de plus de 100
différents NKCC1 est connue grâce, principalement, à l'avènement des banques EST et
génomiques électroniques établies à partir du séquençage systématique des gènes et
ARNm appartenant à plusieurs espèces dont l 'homme, le lapin, la souris, le rat, la
drosophile et bien d'autres.
Suite à la découverte de NKCC 1, l'étude de l'expression du gène par des analyses de
type Northem chez le Squalus acanthias a révélé un ARNm de 7,4 kb dans plusieurs
17
tissus, incluant la glande rectale. Lors de ces études, Xu et al. (1994) ont aussi observé un
message de 5,2 kb exprimé dans le rein exclusivement et dont l'existence a pu être
confirmée par Payne et Forbush (1994) dans le rein du lapin grâce à l' utilisation d 'une
sonde radioactive dérivée du gène squalin. Cette observation laissait donc soupçonner la
présence d'un second isoforme et a aussi été confirmée grâce à des criblages de banques
d'ADNc venant du rein de lapin (Payne et Forbush, 1994), du rein de rat (Gamba et al. ,
1994), du rein murin (Igarashi et al., 1995) et du rein squalin (Gagnon et al. , 2002). À
l'intérieur de chacune des espèces, mentionnons finalement que NKCC1 et NKCC2
partagent ---- 60% d' identité dans leur séquence en acides aminés.
4. NKCC1
Comme pour la plupart des CCC s, la protéine NKCC1 possède 12 segments trans
membranaires avec des régions N-terminale et C-terminale intracellulaires. La partie N
terminale inclut ----250 acides aminés et correspond à celle qui diverge le plus entre les
espèces (----80% d'identité), alors que la partie C-terminale inclut ----450 acides aminés et
est beaucoup plus conservée. Par ailleurs, il existe des sites putatifs de N-glycosylation
dans la boucle extracellulaire située entre les segments transme!llbranaires 7 et 8,
conférant à NKCC1 une masse moléculaire totale de 60-195 kDa (Lytle et al., 1992 ; Xu .
et al. , 1994). Il semble que la présence de ces sites soit nécessaire à l'exportation. de la
protéine vers la menibrane plasmique.
4.1. Études génomiques
NKCC1 (aussi appelé SLC12A2) est codé par un locus qui est situé sur le chromosome
5q23 chez l'humain (Payne et al., 1995) et sur le chromosome 18 chez la souris (Delpire
et al., 1994). L'étude de l'organisation du gène, SLC 12A2 de la souris a révélé l'existence
de 28 exons séparés par des introns dont la longueur varie entre 85 à 15 000 pbs (Randall
et al., 1997). Le promoteur du gène n'a toutefois pas encore été identifié avec précision.
18
L'équipe de Cutlèr et Cramb (2002) ont identifié 2 variantes d'épissage de NKCC1
(appelées NKCC1a et NKCC1b) chez l'Anguilla anguilla. Ces variantes diffèrent dans
les premiers 80-90 résidus du domaine N-terminal et selon le tissu où elles sont
exprimées, la forme «a» étant retrouvée dans tous les tissus et la forme «b» étant
retrouvée dans le cerveau exclusivement. Une troisième variante d'épissage, qui a été
identifiée dans le cerveau de souris (Randall et al., 1997), se caractérise par une délétion
de l'exon 21, i.e., la perte de seize résidus dans le domaine C-terminal, incluant le seul
site putatif qui pourrait être phosphorylé par la protéine kinase A (PKA). Cependant, le
rôle physiologique de cette troisième variante demeure inconnu à ce jour.
4.2. Distribution de NKCCI
NKCC 1 a été retrouvé dans la membrane basolatérale de plusieurs épithélia, incluant
ceux de l'arbre respiratoire, de la glande parotide, de l'intestin, du colon, de certaines
structures oculaires, de l' appreil de Corti dans l'oreille, de la glande mammaire, de la
glande rectale du requin, etc. Ces sites d'expression ont été identifés par des analyses
fonctionnelles et des études d'immunolocalisation à l'aide d'anticorps spécifiques.
NKCC1 a aussi été retrouvé dans le plexus choroïde mais du côté apical avec KCC4 et la
pompe Na-K-ATPase (Plotkin et al., 1997).
Des études d'immunolocalisation additionnelles chez la souris ont aUSSI permIs de
détecter NKCC 1 dans la membrane basolatérale du tubule collecteur médullaire, dans les
cellules mésangiales glomérulaires et extraglomérulaires, de même que dans l'artériole
afférente juxtaglomérulaire (Kaplan et al., 1996). De façon intéressante, Ginns et al.,
(1996) ont confirmé ces trouvailles en montrant que le site d'expression de NKCC1 dans
le tubule collecteur se limitait aux cellules a-intercalaires médullaires. Il apparaît donc
que NKCC 1 pourrait jouer un rôle important dans la sécrétion de . sels dont le cr et le
NH4 + dans le néphron distal, de même quand dans différents processus physiologiques
dépendant de l'appareil juxtaglomérulaire. Toutefois, le rôle de NKCC1 dans le rein n'a .
pas encore été examiné de façon rigoureuse à ce jour.
19
4.3. Rôles de NKCCl
Tel que mentionné précédemment à la section 2.4., le rôle majeur du cotransporteur Na
K-CI dans toutes les cellules (polarisées ou non) est la régulation du volume et du Cl
intracellulaire. En guise de rappel et en complément d'information, mentionnons que
NKCC 1 intervient pour ramener le volume cellulaire à la normale quand celui -ci est
rétréci, ou pour ramener le Cl intracellulaire aussi à la normale quand celui-ci est diminué
par un milieu pauvre en Clou une perte de l'anion via d'autres systèmes de transport.
Dans les épithélia, NKCC 1 favorise le transport vectoriel du N aCI en mode sécrétoire à
cause de sa localisation basolatérale et de sa stoechiométrie de transport. Il contribue
donc à la perte nette de sels et d'eau via plusieurs épithélia dont ceux composant le colon,
les glandes mammaires, le tubule collecteur, le pancréas, les canaux séminifères, etc.
(Payne et Forbush, 1995). Mentionnons pour terminer que NKCC1 pourrait aussi jouer
un rôle dans le maintien de l'équilibre acide-base systémique grâce à sa capacité
d'interagir et de transporter le NH4+. Ceci implique que NKCC1 pourrait aussi veiller au
maintien de l ' équilibre acide-base à l'échelle cellulaire directement.
La création d 'une souris dont le gène NKCC1 a été ablaté a permis de mieux comprendre
les différents rôles physiologiques du cotransport Na-K-CI (Flagella et al., 1999 ; Delpire
et al. , 2000). Entre autres, NKCC 1-1- se caractérise par ·une surdité, une perception
diminuée de la douleur, une azoospermie, une perte de la production de salive et une
diminution de la pression artérielle (secondaire à une interférence du « feeback tubulo
glomérulaire» ?). De façon non surprenante, aussi, d'autres groupes ont montré que
NKCC1 dans les neurones du système nerveux central était primordial pour la
dépolarisation GABA-dépendante (Alvarez-Leefmans et al., 2001) et qu'il était
probablement impliqué dans le développement de formes primaires ou secondaires
d'hypertension artérielle chez les espèces animales (Jiang et al., 2003).
20
4.4. Régulation du NKCCI
4.4.1. Régulation par la phosphorylation
Lytle et Forbush (1996 ; 1997) ont été les premiers à démontrer que le NKCC1 squalin
était régulé par la phosphorylation et à suggérer que le domaine N-terminal (peut-être
aussi le domaine C-tenninal) de la protéine servaient de sites phosphoa?cepteurs. Plus
tard, Darman et Forbush (2002) ont identifié 3 de ces sites en N-terminal (incluant les
thréonines 184, 189 et 202) grâce à analyses de phosphopeptides. D'autres investigateurs
ont émis l'hypothèse que la protéine kinase A (PKA)~ la protéine kinase C (PKC)~ la
caséine kinase II, et les MAPK (mitogen-activated prote in kinase) p38 et JNK (c-jun
NH2-terminal kinase) jouaient également un rôle à cet effet (Kurihara et al., 1999 ;
Russell, 2000 ; Zhang et Cohen, 1996 ; Klein et al., 1999) mais ont basé leurs
conclusions sur des études indirectes, ce qui a amené plusieurs investigateurs à émettre
des réserves quant aux mécanismes par lesquels c.es enzymes agiraient sur NKCC 1.
D'autres enzymes se sont ajoutées à la liste telle qu'évoquée plus tôt, i.e., SP AK (STE20-
related proline-alanine-rich kinase), OSR1 (oxidative stress response 1), et WNK-1 et
WNK-4 (with no lysine kinase) à la suite d'études fonctionnelles et de phosphorylation in
vitro (Piechotta et al., 2002, 2003 ; Dowd et Forbush, 2003 ; Moriguchi et al., 2005 ;
Vitari et al., 2006 ; Gagnon et al., 2006, 2007 ; Capo-Aponté et al., 2007). Entre autres,
un groupe d'investigateurs a récemment suggéré que SPAK, WNK1 et WNK4
fonctionneraient en module pour phosphoryler NKCC1, alors que Darman et al., (2001)
ont démontré que PP 1 (protéine phosphatase de type 1) pouvait interagir avec le domaine
N-terminal de NKCC1 directement et en modifier le niveau dephosphorylation.
4.4.2. Implication du cytosquelette
Le cytosquelette cellulaire jouerait aussi un rôle important dans la régulation du co
transport Na-K-Cl. Par exemple, Mattews et al. (1997) ont démontré que la dépolyméri
sation des microfilaments d'actine par divers agents menait à l'activation de NKCC1
21
dans des cellules intestinales. Dans le même ordre d'idée, d'autres recherches ont montré
qu'une kinase de type MLC (myosin light chain) modulerait l'activité de NKCCI en
phosphorylant la myosine, une protéine du cytosquelette qui interagit avec le cotrans
porteur (Klein et O'Neill, 1995 ; Haas et Forbush, 2000 ; Di Ciano-Oliveira et al. , 2005).
4.5. Implication dans l'hypertension artérielle
Outre le comportement de la souris NKCC 1-1-, d'autres observations suggèrent le rôle de
NKCCI dans la régulation de la pression artérielle. Par exemple, Jiang et al., (2004) ont
trouvé que l'activité et l'abondance du NKCC 1 étaient 5 fois plus élevées chez des rats
hypertendus par rapport à des .rats normotendus. Dans le même ordre d'idée, Orlov
(2007) ainsi que Garg et al., (2007) ont trouvé que NKCC 1 était exprimé dans les
muscles lisses vasculaires où il contrôlait la réponse contractile des vaisseaux en réponse
à des agents vasoconstricteurs. Entre autres, Garg et al., (2007) ont constaté que
l'inhibition de NKCC 1 par le furosémide dans .un modèle de vaisseaux isolés atténue
cette réponse de façon substantielle. Par la suite, d'autres investigateurs ont émis .
l 'hypothèse que l'effet du furosémide dans ce modèle s'expliquait par une diminution du
Cl dans la cellule musculaire. Toutefois, les mécanismes par lesquels un changement de
Cl modifierait la contractilité sont inconnus, bien que certains investigateurs aient
suggéré la mise en œuvre de transporteurs à Ca Cl-sensible dans ce contexte.
5.NKCC2
Chez le rat et la souris, la protéine NKCC2 est constituée de 1095 acides aminés (Gamba
et al., 1994 ; Igarashi et al., 1995), alors qu'elle est constituée de 1099 acides aminés
chez le lapin et l'humain (Payne et Forbush, 1994 ; Simon et al., 1996). Tout comme
NKCCl, elle possède 12 segments membranaires flanqués par un domaine N-terminal de
,....; 160 acides aminés et un domaine C-terminal plus long de ,....;450 acides aminés, de
multiples sites consensus pour la phosphorylation par des enzymes régulatrices et des
sites de N-glycolysation dans la boucle située entre les tms 7 et 8. La masse moléculaire
de cette protéine atteint 150 kDa une fois glycosylée (Kaplan et al., 1996a).
. 22
5.1. Études génomiques
Le gène codant pour NKCC2 (aussi appelé SLC12A1) a été localisé dans le chromosome
15 chez l 'humain (Simon et al. , 1996a), le chromosome 3 chez le rat et le chromosome 2
chez la souris (Quaggin et al., 1995). Il comprend 26 exons et des introns de longueurs
variables allant de 20 à 15000 pbs (Simon et al. , 1996a).
5.2. Variantes d'épissage NKCC2
5.2.1. Généralités
Contrairement à NKCC1, NKCC2 existe en plusieurs variantes d'épissage. Payne et
Forbush (1994) ont découvert 4 de ces variantes durant les expériences qui ont mené au
clonage du NKCC2 de lapin. Nous savons aujourd'hui que les mêmes variantes existent
chez la plupart des espèces, dont la souris (Igarashi et al. , 1995), l 'humain, le rat (Plata et
al., 2001) et le requin (Gagnon et al., 2002). Elles sont produites par l'épissage alternatif
de 3 exons (appelés B, A et F) qui possèdent 32 acides aminés chacun, sont homologues
les uns par rapport aux autres et sont situés en série entre l'exon 3 et 5 (Fig. 4).
Habituellement, un seul des ex ons est retenu durant la maturation de l' ARNm sauf pour
10% des transcrits qui retiennent les exons A et F en tandem (P,:!yne et · F orbush, 1994 ;
Yang et al., 1996 ; Gagnon et al., 2002).
Le gène SLC 12A 1 code aussi pour une variante murine qui est générée par l' épissage
alternatif d'un exon codant pour l'extrémité distale du C-terminus. Bien que tronqué, cet
isoforme est apparemment toujours fonctionnel (Plata et al., 1999 ; Mount et al. 1999).
Pré-ARNm
ARNm
FIGURE 4. Épissage alternàtif de la cassette BAF codant pour l'exon 4 du NKCC2.
23
5.2.2. Séquences de l'exon 4 de NKCC2
L'épissage alternatif des exons 4 produit des NKCC2 qui sont identiques à l'exception
des acides aminés composant le deuxième domaine transmembranaire (tm2) et à la
boucle intracellulaire adjacente (cs1). Les premiers 19 acides aminés font parti d'une
région hydrophobe qui formerait tm2, et les 13 derniers, d'une région hydrophile (très
conservée) qui fonnerait cs1. Entre les variantes d'épissage de l'exon 4, il y a plus de 10
acides aminés diffèrents (Fig. 5). L'importance de ces différences sera discutée plus loin.
saNKCC2A saNKCC2F rbNKCC2A rbNKCC2B rbNKCC2F
GLGVVIVLLATIVTSITGLSTSAISTNGCVRG GLGIIVICLSTVVTVLTCISMSAICTNGVVRG GLGVVIILLSTMVTSITGLSTSAIATNGFVRG GLGVIIIGLAVTVTGITGLSTSAIATNGYVRG GLGIIVIGLSVVVTTLTGISMSAICTNGVVRG
5.3. Distribution et localisation de NKCC2
FIGURE 5. Séquence en acides aminés de l'exon 4 de NKCC2.
La découverte des variantes NKCC? s'est produite grâce au fait que les banques d'ADNc
- rénales criblées provenaient de 2 sources, i.e., de la médulla et du cortex (Payne et
F orbush, 1994). À cause de cette approche, il a été possible de constater que B et A
prédominaient dans le cortex alors que F prédominait dans la médulla. Des études addi
tionnelles par Payne et Forbush, 1994 ainsi que d'autres groupes (Igarashi et al., 1995 ;
Yang et al., 1996) ont ensuite permis de constater que la variante F était présente dans la
médulla externe quoique plus abondante dans la couche interne, que la variante A était
présente dans la couche externe de la médulla externe et le cortex, et que la variante B
était située exclusivement dans le cortex à l'endroit où siègent les glomérules.
Durant les mêmes années, des études -de localisation ont pennis de détenniner avec plus
de précision dans quelles régions du néphron se trouvaient NKCC2 et ses variantes. Elles
ont révélé que tous les NKCC2 étaient situés de façon exclusive dans la membrane
apicale de l'ALH (Lyde et al., 1995 ; Kaplan et al., 1996a), que la variante B était
confinée à la macula densa (une structure spécialisée à la fin de l' ALH), et que la
variante A était aussi exprimée dans la macula densa mais de façon non exclusive et en
24
faible quantité (Yang et al., 1996 ; Obermüller, 1996 ; .Kaplan et al., 1996b; Igarashi et
al., 1995 ; Oppermann et al., 2006). Cette distribution des NKCC2 est donc en accord
avec son rôle dans la réabsorption rénale du NaCI chez les mammifères (Greger, 1985).
5.4. Cinétiques des variantes d'épissage NKCC2
À ce stade-ci, la fonction de deux des variantes identifiées demeure incertaine. D'abord,
il y a la forme AF qui, tout en étant relativement abondante dans le rein du requin et du
rat, ne semble pas être capable de susciter le cotransport Na-K-Cllorsque exprimée dans
des oocytes de Xenopus laevis. Ensuite, il y a les formes tronquées en C-terminal qui
agiraient comme des cotransporteurs Na-Cl sensibles au furosémide mais K -indépendants
et non régulés par l'ADH (Plata et al., 2001). Il importe de mentionner, toutefois, que les
études de Plata et al. n'ont été confirmées par aucun autre groupe à ce jour.
En ce qui a trait aux caractéristiques fonctionnelles des variantes B, A et F, 3 groupes de
travail se sont penchés sur le sujet et sont arrivés à des conclusions similaires bien qu'ils
aient chacun étudié des NKCC2 de différentes espèces, soit du rat, lapin ou requin
(Gimenez et al., 2002 ; Plata et al., 2002 ; Gagnon et al., 2003). Tous, cependant, ont
utilisé le même système d'expression hétérologue (les oocytes du Xenopus laevis) et ont
trouvé que la capacité de transport ionique était maximale pour A et minimale pour B,
alors que l'affinité ionique était maximale pour B et minimale pour F. Lorsque ces
données sont interprétées en considérant la concentration luminale de sels à laquelle
chacune des variantes est exposée (maximale dans la couche interne de la médullaire et
minimale dans le cortex périphérique), il est possible de conclure que la réabsorption de
sels diminue progressivement entre le début et la fin de l'ALH.
Les données présentées dans ce chapitre suggèrent que les propriétés fonctionnelles de
l'ALH sont hétérogènes le long de son parcours dans les différentes couches du rein.
Elles confirment aussi les résultats d'études plus anciennes qui avaient montré un trans
port du NaCI plus rapide dans le cortex par rapport à ~a médullaire mais quantitativement
moins important (Rocha et Kokko, 1973 ; Knepper et Burg, 1983 ; Greger, 1985). Elles
25
soulèvent néanmoins de nouvelles questions quant à la participation que pourrait avoir
chacune des variantes par rapport aux différents rôles qu'assume l'ALH.
5.5. Régulation du NKCC2
5.5.1. Régulation du niveau d'expression
L' augmentation de la réabsorption du N aCI par des hormones qui génèrent de l' AMPc le
long de l'ALH est un mécanisme important pour la régulation du transport de sels dans ce
segment du néphron. La plus -importante de ces hormones semble être la vasopressine
(aussi appelée hormone antidiurétique ou ADH) d'après les données disponibles.
En particulier, des études chez la souris ont démontré que l'ADH augmente l'absorption
du N aCI par l' ALH grâce à une translocation de NKCC2 d'un « pool» vésiculaire vers la
membrane plasmique apicale, et que cette réponse s'accompagne d'une phosphorylation
des résidus thréonines dans le domaine N-terminal de la protéine (Molony et al., 1987 ;
Kim et al., 1999 ; Gimenez et Forbush, 2003). Il est intéressant de mentionner ici que des
changements de diète en eau, qui sont reliés à des changements de niveau de circulation
d'ADH, résultent aussi en des modifications d'expression, surtout pour la variante F
(Marumo et al., 1998 ; Gimenez et Forbush, 2003 ; Brunet et al. , 2005). Par exemple, une
restriction d'eau (ADH élevé) s'accompagne d'une augmentation de l'ARNm de NKCC2
à l'endroit où l'on retrouve F, tandis qu'un apport augmenté en eau s'accompagne d'une
diminution de l'expression de F tel que démontré par des études de RT-PCR.
Il a observé au cours d'études additionnelles que les glucocorticoïdes augmentent aussi
l'expression de NKCC2 (1'ARNm et la protéine) par un mécanisme dépendant de la
vasopressine (Fromm et al., 1990). Il en serait autrement de la prostaglandine E2 qui
inhibe ' l'absorption de N aCI dans l' ALH en diminuant la production de AMPc mais par
un mécanisme dépendant tout de même de la vasopressine (Stokes, 1979 ; Torikai et al.,
1983 ; Kaji et al., 1996).
26
Parmi les autres facteurs qui augmentent l ' expression de NKCC2, mentionnons l ' oxyde
nitrique qui stimule la production de GMPc (Turban et al. , 2003), l'angiotensine II (Ang
II) qui agit sur des récepteurs de AT l dans l'ALH (Kwon et al. , 2003) et l' acidose
métabolique (ou urinaire ?) qui affecte le pH des cellules de l' ALH et stabilise l' ARNm
de NKCC2 (Attmane-Elakeb et al., 1998 ; Karim et al. , 2003). Dans le cas de l'Ang-II,
en plus, il est intéressant de rappeler que cette hormone issue du clivage de l' angiotensine
1 (Valtin et Schafer, 1995) provoque une vasoconstriction de l ' artériole efférente (où l' on
retrouve du NKCC1), ce qui permet de maintenir une preSSIon intraglomérulaire
suffisante pour assurer la formation d'un ultrafiltrat urinaire.
5.5.2. Régulation de l'activité
5.5.2.1. Hypertonicité et abaissement de la concentration intracellulaire en Cl
Isenring et al. (1998a) ont montré pour la première fois que l ' activité de NKCC2 exprimé .
dans des cellules HEK-293 est sensible à des changements de concentration
intracellulaire de Cl, i.e., que le cotransport Na-K-CI médié par cette protéine est
pratiquement nul dans un milieu physiologique alors qu' il augmente de façon
substantielle suivant une baisse du Cl dans le milieu extracellulaire. Ils ont aussi montré
que l'activité de NKCC2 dans le même système est sensible à des changements de
volume cellulaire, i.e., que le cotransport Na-K-CI augmente de façon substantielle
suivant un rétrécissement cellulaire. De façon intéressante, l' activité de NKCC2 est aussi
augmentée par le gonflement cellulaire mais de façon moins importante que par le
rétrécissement cellulaire. À cet égard, les auteurs de l'étude ont suggéré que l'effet d 'un
milieu hypotonique pouvait être relié à une dilution des ions cellulaires induite par un
mouvement d'eau vers le cytosol.
Il semble généralement accepté que les changements de Clou volume cellulaire
engendrent des changements d'activité de NKCC2 via des changements de la confor
mation du transporteur. La possibilité qu'ils engendrent aussi des changements d'expres
sion ne peut être exclue étant donné que peu d'études se sont penchées sur la question.
- -- - - --- --------,
27
5.5.2.2. Rôle de la phosphorylation
Oimenez et Forbush (2003) ont été les premiers a démontré que NKCC2 est régulé par
des changements de phosphorylation du transporteur sans toutefois identifier les enzymes
régulatrices impliquées de façon certaine. Une étude plus récente a démontré que la
kinase AMPK (AMP-activated protein kinase) était impliquée et qu'elle agissait sur le
résidu sérine 206 (Fraser et al. , 2007). Certaines des sérine-thréonine kinases de type
WNK (with no lysine kinase), qui sont exprimées aux jonctions intercellulaires et/ou dans
le cytosol des cellules tubulaires rénales pourraient aussi activer NKCC2 par la
phosphorylation. Entre autres, il a été démontré que la forme inactive de WNK-3
empêche la phospho-rylation de NKCC2 aux sites Thr-184 et Thr-189, i.e. , aux mêmes
sites qui deviennent phosphorylés en présence d'ADH (Rinehart et al. , 2005).
Finalement, NKCC2 interagirait aussi avec SP AKlOSR1 (Piechotta et al., 2002) lorsque
la cellule est à l'état basal, de même qu'avec la PKC et la MLCK (myosin light chain
kinase) suivant le recrutement et l'activation de ces enzymes par le rétrécissement
cellulaire (Hoffman et al., 2007). Il semble que plusieurs des enzymes régulatrices
impliquées sont les mêmes que pour NKCC 1.
5.5.2.3. Par d'autres facteurs
Tel que mentionné" l'Ang-II joue un rôle important dans le transport de certains ions
(Na+, cr, K+, H+) dans plusieurs segments du néphron. Elle accomplirait ce rôle via une
inter-action directe avec certaines structures du néphron ou la production d'aldostérone,
effets qui se solderaient par une modification du transport ionimque ou de la filtration
glomé-rulaire. Entre autres, il a été démontré que l'ArigII augmente l'expression et
l'activité de NKCC2 en stimulant la production de phospholipase C (PLC) dans l' ALH
médullaire et, secondairement, de diacylglycérol (DAO) et du Ca intracellulaire (Amlal et
al., 1998).
Selon des études par notre groupe (B'ergeron et al., 2003) et tel qu'évoqué précédemment,
NKCC2 est aussi affecté par des changements de pH intracellulaire, i.e., qu'il est inhibé
28
par l'acidification cellulaire. Comme NKCC2 est capable de transporter le NH4 +, l'inhi
bition de l'activité NKCC2 par une baisse du pH intracellulaire serait donc bénéfique.
5.6. Mode opérationnel de NKCC2
Pour NKCC1, un modèle opérationnel de translocation des ions a été proposé par
différents investigateurs (Greger et Schlatter, 1981 ; Lytle et al., 1998) il Y a plusieurs
années (Fig. 6). Bien que ce modèle n'ait pas été testé directement pour NKCC2, on
présume qu'il sera identique à celui proposé pour NKCC1 puisque les 2 protéines ont
plus de 50% d'identité entre elles et ont un comportement fonctionnel très similaire. Dans
le paragraphe suivant, nous élaborerons donc sur le modèle décrit précédemment pour
l'isoforme 1 du cotransporteur Na-K-CI en assumant qu'il s'appliquera vraisemblable
ment ad integrum pour l'isoforme rénal.
FIGURE 6. Modèle de cotransport Na-K-CI tirée de Lytle et al., 1998. Dix états intermédiaires du cotrahsporteur sont représentés ici.
D'abord, il a été démontré que NKCC1 transporte ses ions selon une stoechiométrie de
un ion Na+, un ion K+ et 2 ions cr puisque le mouvement de ces substrats n'engendre pas
de mouvement net de ' charge et que la protéine semble posséder 2 sites de liaisons pour le
Cl. Il au aussi été démontré que NKCC 1 ne peut fonctionner que si tous les sites de
1
29
liaisons ioniques sont occupés de façon simultanée par les ions Na+, K+ et cr ou par des
substituts spécifiques tel que décrit à la section 2.4 du mémoire. Finalement, le transport
des ions se ferait de façon interdépendante, i.e. que la liaison d'un ion favorise celle de
l'ion subséquent selon un ordre préétabli : N a-Cl-K -Cl pour 'la liaison du côté extra
cellulaire et Na-CI-K-Cl pour la dissociation du côté intracellulaire. Cet ordre obéirait
donc à un modèle de « glide symmetry » où les ions se lient et se dissocient selon une
séquence identique (Lyde et al., 1998).
5.7. Inhibition du transport Na-K-Cl
Les diurétiques de l'anse inhibent NKCC2 au même titre que NKCC1, empêchant la
réabsorption du Na, K et Cl par l'ALH, et entraînant ainsi une augmentation de
l'excrétion urinaire de ces ions de même que des cations divalents Mg2+ et Ca2+
(Katzung, 1998). La perte en NaCl serait due à un défaut de réabsorption primaire via
NKCC2, la perte des cations divalents, à un défaut de réabsorption secondaire vï'a un
canal intercellulaire de l'ALH appelé paracelline, et la perte de K, à une sécrétion
accélérée via des canaux à K dans le tubule collecteur.
Rappelons ici que le rôle de NKCC2 n'est pas de réabsorber le K étant donné que la
concentration luminale de ce cation dans l'ALH est très faible. Toutefois, NKCC2 est
dépendant du K luminal pour fonctionner et c'est grâce à un canal à K apical (ROMK)
que le K absorbé via le cotransporteur peut être recyclé vers la lumière pour y être
maintenu en concentration suffisante. Or, l'inhibition NKCC2 par des diurétiques
bloquent ce phénomène de recyclage en K, ce qui entraîne une baisse de l' électro
positivité luminale et dissipe donc la gradient électrique pennettant aux cations divalents
d'être réabsorbés par la voie paracellulaire. Même si NKCC2 joue un rôle mineur dans la
réabsorption nette de K, son inhibition entraîne néanmoins une perte importante de K
puisqu'elle se solde par une arrivée importante de Na et Cl dans le tubule collecteur qui,
sous l'effet de l'aldostérone, tendra à réabsorber le N a de façon électrogénique et à
sécréter le K secondairement.
30
Tout comme pour NKCC1 , les diurétiques de l'anse interagissent directement avec
NKCC2 selon une stœchiométrie d'une molécule inhibitrice par cotransporteur (Forbush
et Parfrey, 1983 ; Palfrey et Leung, 1993). Ils possèdent plusieurs points d'ancrage sur la
protéine, notamment sur les tms 2, 4 et 7 ainsi que les tms Il et 12, ce qui lui confère son
affinité pour le cotransporteur (Isenring et al. , 1998c ; Hannaert et al. , 2002).
Habituellement, le bumétanide est utilisé plus que le furosémide pour caractériser les
NKCCs, car il n'inhibe pas les autres CCCs aussi facilement. Il a aussi l'avantage de se
dissocier moins rapidement de ses sites de liaison que le furosémide.
5.8. Formation d'oligomères
Que les CCCs soient organisés en homooligomères dans la membrane plasmique ne fait
maintenant plus de doute. Les premières données ayant établi ce fait ont été obtenues
grâce à des expériences de «cross-linking» et de coimmunoprécipitation. (Lee et al. ,
1997 ; Casula et al. ~ 2001 ; Howard et al., 2002 ; Starremans et al., 2003b ; de Jong et al. ,
2003). Les cotransporteurs étudiés alors incluaient NKCC1 , NKCC2 et NCC.
Dans les années qui ont suivi, des études par notre groupe ont permis de parfaire nos
connaissances concernant l'organisation quaternaire des CCCs sur le plan moléculaire.
Par exempl.e, elles ont mené à l'identification de 2 domaines dans le C-terminus qui
médient l'association des CCCs entre eux et permettraient la formation d'homodimères
ou de tétramères. Dans NKCC1, ces domaines correspondent au segment proximal · du C
terminus (résidus 671 à 816) et au segment distal du C-terminus (résidus 910 à 1098),
lesquels ont la capacité d' interagir entre eux (Simard et al., 2004). De façon non
surprenante, nous avons trouvé que NKCC2 possédait les mêmes domaines d'interactions
(Brunet et al., 2005) et que les KCCs s'organisaient aussi en complexes quaternaires
grâce au C-terminus mais via des segments qui diffèrent par rapport aux NKCCs (Simard
et al., 2007). Grâce à l'étude par Simard et al. (2007), par ailleurs, il a aussi été possible
de démontrer que tous les CCCs avaient la capacité de former des hétérooligomères
composés de différents isoformes, Le., des complexes NKCC-KCC et des complexes
KCCx-KCCy.
31
5.9. Rôles du NKCC2
5.9.1. Concentration de l'urine
La concentration de l'urine permet de minimiser les pertes d'eau dans les états d' anti
diurèse. Ce phénomène est rendu possible par le mécanisme de' la multiplication à contre
courant qui est régit par les anses de Henle des néphrons juxtamédullaires et leur
organisation en épingle à cheveux dans la médullaire rénale (Fenton et Knepper, 2007),
par des transporteurs d'urée qui permettent la concentration de l'interstitium médullaire
et des canaux à ea~ dans le tubule collecteur qui sont activés par l' ADH.
La multiplication à contre courant est un phénomène intéressant qui survient grâce au fait
que le filtrat glomérulaire chemine dans des directions opposées le long des branches
descendante et ascendante de l' anse de Herne, et grâce au fait que les propriétés
fonctionnelles de ces 2 branches sont aussi à l'opposé, i.e., la branche descendante est
perméable à l'eau et permet la diffusion passive de sels alors que la branche ascendante
est imperméable à l' eau et permet la diffusion active de sels. Dans ce contexte, ce sont les
protéines NKCC2 et pompe à Na dans l'ALH qui servent de moteur à la multiplication en
permettant la réabsorption active de NaCI de la lumière tubulaire vers l ' interstitium, alors
que l'eau reste derrière du à l'absence d' aquaporines dans ce segment du néphron.
L'ADH joue un rôle essentiel dans la concentration de l'urine non seulement à cause de
son action sur l' ALH mais aussi parce qu'elle augmente la perméabilité de l'eau via le
tubule collecteur par l'incorporation d'aquaporines à la membrane apicale (Nielsen et al.,
1995). En présence de l'hormone, le fluide tubulaire rendu hypotonique par NCC à
l'entrée du collecteur se reconcentre donc grâce à la réabsorption d'eau vers une _médul
laire rendue hyperosmotique par le transport d'ùrée et la multiplication à contre-courant.
Dans ce contexte, il n'a pas été surprenant de constater que l'ADH accroît l'expression de
NKCC2 et sa translocation à la membrane apicale (Molony et al., 1987; Kim et al.,
1999 ; Gimenez et Forbush, 2003) et qu'elle augmente aussi l'abondance du transporteur
d'urée UTI dans certains segments du néphron (Tsukaguchi et al., 1998 ; Sands, 2004).
32
Un groupe a démontré l'importance de NKCC2 dans la concentration de l'urine en
produisant une souris «knockout » qui n'expriment plus ce gène (Takahashi et al., 2000).
Ces souris NKCC2-1- présentent en effet une polyurie aqueuse importante qui raccourcit
leur survie de façon substantielle à cause d'une contraction volémique secondaire
difficile à corriger. Par ailleurs, les souris hétérozygotes NKCC2-1+ ont une survie
normale mais présentent un défaut subtil de concentration urinaire. Des études sont
actuellement en cours pour tenter de déterminer l'impact d'ablater chacune des variantes
de NKCC2 séparément (voir textes ci-dessous). Une prédiction assez facile à faire est que
la souris NKCC2F-1- se comportera comme la souris NKCC2-1
-.
5.9.2. Soutien du « feedback » tubuloglomérulaire
La filtration glomérulaire et le débit sanguin de chaque néphron sont régulés par le
mécanisme du « feedback » tubuloglomérulaire (FTG). Lorsque la filtration s'accentue,
les pertes excessives d'eau et de solutés qui s'en suivent sont minimisées par un réajuste
ment à la baisse de cette filtration, et l'inverse survient lorsque la filtration s'accentue. Il
appartient à la macula densa (Fig. 7) de réguler la filtration glomérulaire dans ce contexte
grâce à des signaux qu'elle transmet aux capillaires glomérulaires voisins et qui sont
induits par des changements de débit en sels, vraisemblablement en Cl, auxquels elle est
exposée (Guyton, 1991 ; Bell et al., 1989 ,; Lapointe et al., 1990 ; He et al., 1995).
FIGURE 7. Appareil juxtaglomérulaire. La localisation des NKCCs y est également indiquée. MD (macula densa), BSC 1 (bumetanide-sensitive cotransporter isoform 1 ou NKCC2), AA (artériole afférente), EA (artériole efférente), CT AL (cortical thick ascending limb). Tirée de Kaplan et al., 1996b.
33
Il semble généralement admis que le NKCC2B de la macula densa joue le rôle de senseur
du Cl en modulant la concentration de cet anion dans le cytosol et les espaces interstitiels
de l'appareil juxtaglomérulaire où est produit la rénine. Ces changements de
concentration tissulaire en Cl s'accompagneraient de changements de production de
substances comme l' AngII, l' oxide nitrique, les prostaglandines, etc, lesquelles affectent
la réactivité vasculaire des artérioles périglomérulaires. L'importance de NKCC2B dans
le FTG a été démontrée récemment par Oppermann et al. (2006) grâce à la production
d'une souris knockout n'exprimant plus cette variante.
5.9.3. Maintien de l'équilibre acido-basique
Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de la concentration extracellulaire de pro
tons générés par le catabolisme des protéines alimentaires. L'équilibre acido-basique est
atteint en partie grâce à l'excrétion des ions NH4 dans l'urine suivant la sécrétion de NH3
et H dans le tubule collecteur. Ce NH4 doit d'abord avoir été produit par le tubule proxi
mal et avoir cheminé vers le collecteur en suivant un mouvement transtubulaire auquel
participe NKCC2 dans l'ALH et NKCC1 dans le collecteur (Good et al., 1984 ; Kikeri et
al., 1989 ; Wall et al., 1995 ; Knepper, 1991 ; Attmane-Elaked et al., 2001 et 2002 ;
Bergeron et al. 2003). Cette participation des CC Cs est rendue possible grâce au fait que
N~ est un substitut ionique transportable du K. Pour cette même raison, NKCC2 jouerait
aussi un rôle dans le maintien du pH des cellules de f' ALH (Bergeron et al., 2003).
5.9.4. Implication dans le maintien de l'intégrité médullaire
L'ischémie rénale entraîne un rétrécissement des cellules présentes dans tous les
segments tubulaires suivant un manque d'oxygène en plus d'une exposition altérée à des
substrats métaboliques comme l'A TP (Heyman et al., 1997). La médulla serait particu
lièrement vulnérable à l'ischémie puisqu'elle reçoit seulement 10 % du flot sanguin rénal
mais consomme beaucoup d'oxygène pour le transport actif de NaCI médié par la pompe
et NKCC2 (Rose, 1994). À Cet effet, il a été évoqué que l'inhibition de NKCC2 en
période d'ischémie minimiserait 1 'hypoxie médullaire et les dommages secondaires à
34
l'épithélium. Toutefois, les études cliniques ne vont pas dans ce sens, peut être parce que
les diurétiques ont été administrés une fois les dommages installés la plupart du temps. /
5.10. Implications dans certaines maladies
5.10.1. Syndrome de Bartter
Le syndrome de Bartter se traduit par une perte de NaCl, polyurie, alcalose hypokalié
mique, hypercalciurie et hypertrophie du complexe juxtaglomérulaire (Bartter et al. ,
1962). Il est souvent assoc~é à des pressions artérielles et un volume extracellulaire dans
les limites inférieures de la normale. Nous savons maintenant que le syndrome Bartter est
transmis de façon récessive dans la plupart des cas et est associé à 5 gènes différents qui
codent pour des systèmes de transport dans l'ALH (Hebert et-al., 2004). Par exemple, le
syndrome de Bartter de type 1 est dû à des mutations inactivatrices dans NKCC2 (Simon
et al., 1996a; Vargas-Poussou et al., 1998; Starremans et al. , 2003a;. PressIer et al. ,
2006 ; Adachi et al. , 2007), ce qui amène une perte de NaCl, contraction du volémique et
activation secondaire du système rénine-angiotensine-aldostérone. En présence d'un flot
tubulaire élevé dans le tubule collecteur, cet hyperaldostéronisme favorise donc la
sécrétion distale de H et K, ce entraîne une alcalose métabolique et hypokaliémie
secondaire. La perte de fonction NKCC2 restreint aussi la réabsorption du calcium dans
l'ALH pour des raisons qui ont été discutées dans des sections préalables du mémoire.
5.10.2. Hypertension
Le rein joue un rôle clé dans le contrôle de la pression artérielle via le maintien du
volume extracellulaire par des transporteurs de NaCl exprimés le long des néphrons. Ces
transporteurs sont donc des cibles intéressantes dans le traitement de l'hypertension,
d'autant plus que cette anomalie a été associée à des changements d'activité et d'expres
sion de plusieurs de ces transporteurs (dont NKCC2). Par exemple, un groupe
d'investigateurs a récemment démontré que des rats chez qui une hypertension était
induite par de la cyclosporine présentaient une baisse de l'excrétion du Na (Esteva-Font
35
et al., 2007), et un autre groupe, que des mutations dans les WNKs étaient non seulement
associées à de l'hypertension artérielle chez les humains mais augmentaient aussi
l'expression et l'activité de NKCC2 dans des modèles animaux (voir, entre autres,
Flatman, 2008). Le syndrome de Bartter et l'effet hypotenseur transitoire du furosémide
constituent des preuves additionnelles que NKCC2 fait parti du «pool» de gènes qui
régulent la pression artérielle. Il est fort à parier que les différentes variantes d'épissage
de NKCC2 deviendront un jour des cibles thérapeutiques plus sélectives et permettront de
traiter l'hypertension artérielle de certains individus avec moins d'effets secondaires.
5.11. NKCC2 parmi d'autres systèmes de transport
FIGURE 8. Rôle de NKCC2 dans la réabsorption du NaCl dans l'ALH. Tirée de Hebert et al., 2004.
Le tubule de l'ALH est formé d'une seule couche de cellules polarisées, tel qu'illüstré à
la Fig. 8. La membrane apicale de l'ALH exprime NKCC2 et plusieurs canaux à K dont
ROMK (Boim et al., 1995) tandis que sa membrane 'basolatérale exprime la pompe à Na,
plusieurs types de KCCs, des canaux à K et des canaux à Cl (CLC-kb).
Le NKCC2 constitue la porte d'entrée luminale pour les ions Na+, K+ et cr à l'intérieur
de la cellule. Presque tous les ions K+ sont retournés à la lumière tubulaire par les canaux
ROMK. Tel que décrit auparavant, le recyclage des ions K+ assure une concentration suf
fisante de ce substrat dans la lumière tubulaire pour permettre le bon fonctionnement de
NKCC2 (Greger et Schlatter, 1981). Mentionnons, à cet effet, que des mutations dans
l'isoforme 2 du canal ROMK causent aussi un syndrome de Bartter appelé de type 2
(Simon et al., 1996b ; Starremans et al., 2002) puisqueNKCC2 devient secondairement
inactif en ce moment. L'importance du recyclage de K dans la réabsorption des cations
divalents a aussi été discutée ci-dessus (deRouffignac et Quamme, 1994).
36
La pompe à Na, les canaux à Cl (CLC-kb) et à K, et les KCCs constituent les portes de
sortie basolatérale pour les ions, surtout Na+ et cr. À cet effet, mentionnons que des
mutations dans CLC-kb causent un Bartter type 3 et des mutations dans sa sous-unité
Barttin, un Bartter type 4 (Simon et al., 1997). Encore une fois, NKCC2 serait au centre
de l'action dans le développement d'un «Bartter» puisqu'il devient inactif suivant
l'accumulation de Cl intracellulaire par une perte du mouvement basolatéral de l'anion. Il
a été · postulé que NKCC2 serait partiellement inactif dans ces cas pour 3 raisons: un
gradient non favorable pour l'entrée luminale de Cl, ou une baisse de l'expression ou de
la phosphorylation de NKCC2 induit par un Cl intracellulaire élevé.
6. Commentaires par rapport aux principales méthodes utilisées
6.1. Systèmes d'expressions utilisés pour étudier les NKCCs
6.1.1. Généralités.
La fonction des NKCCs chez différentes espèces a été étudiée . dans plusieurs systèmes
hétérologues à ce jour. Par exemple, les cellules HEK-293 ont été utilisées pour exprimer
le NKCC1 du requin, de l'humain et d'autres espèces, révélant un influx en 86Rb bumé
tanide-sensible plus élevé que celui du transporteur endogène (Xu et al., 1994 ; Payne et
al., 1995). Toutefois, les cellules HEK-293 ainsi que d'autres cellules de mammifères se
sont avérées inefficaces pour étudier l'expression fonctionnelle de NKCC2 (Payne et al.,
1995) à moins d'échanger une partie de l'extrémité N-terminale du transporteur par celle
de NKCCI (lsenring et al., 1998). Il semble donc que NKCC2 ait besoin d'un cofacteur
« x » spécifique aux cellules de l' ALH pour transloquer les ions à travers la membrane.
Plusieurs groupes ont tout de même démontré qu'il était possible de faire fonctionner
NKCC2 dans des oocytes de Xenopus laevis et de reproduire les données cinétiques du
transporteur obtenues grâce à des études de microperfusion rénale chez le lapin. Pour ces
raisons, et comme il n'existe que peu de lignées cellulaires fiables qui proviennent de
l'ALH, les oocytes de Xenopus laevis sont considérées comme le système d'expression
- --- ----------
37
de choix pour étudier les caractéristiques de NKCC2 et des ses variantes d'épissage.
6.1.2. Les oocytes de Xenopus laevis comme système d'expression
Dans ce mémoire, nous avons aussi utilisé des oocytes de Xenopus laevis comme système
d'expression. Ces cellules ont la capacité d'exprimer une multitude de systèmes de trans
port parce qu'en étant toujours dans un stade peu différenciés, elles fournissent proba
blement tous les cofacteurs requis à la mise en œuvre de ces protéines. Il n'est donc pas
surprenant que le stade de développement des oocytes soit primordial lors d'études fonc
tionnelles. En somme:> les oocytes ll:tilisés à cette [m doivent être rendus aux stades V-VI
de l' oogenèse tout juste avant la fécondabilité, puisque c'est durant ces stades que la
synthèse protéique est maximale. La taille alors atteinte est d'environ 1.3 ·mm de diàmètre
et une pigmentation brune se forme à l'un des pôles (Dumont, 1972 ; Smith et al., 1991).
Les oocytes sont aussi un système d'expression intéressant pour les études fonctionnelles
des CCCs parce qu'ils expriment un cotransport cation-Cl endogène très faible (Burnham
et al., 1990 ; Suvitayavat et al., 1994) et parce que l'influx en 86Rb dans ces cellules est
surtout causée par la pompe à Na, un transporteur facile à inhiber de façon complète
grâce à la ouabaïne (Shetlar et al., 1990). À noter, pour terminer, que l'expression d'une
protéine par des oocytes est obtenue grâce à l'injection d'ARNm complémentaire
(ARNe) dans le cytoplasme des oocytes (Romero et al., 1998).
6.2. Analyses fonctionnelles
L'usage d'isotopes radioactifs permet d'évaluer l'activité d'une protéine d~ transport
exprimée dans la plupart des types cellulaires. Quand la quantité d'isotopes incorporés
dans l'oocyte par unité de temps est mesurée à la phase linéaire, on parle alors d'un
influx ionique (Starremans et al., 2003a). Évidemment, l'isotope èhoisi doit être trans
porté lui-même par la protéine, i.e., que l'on pourra utiliser, par exemple, l'ion 22Na+ pour
mesurer des influx médiés par NCC et l'ion 86Rb + pour mesurer des influx médiés par les
NKCCs et les KCCs (Geck et al., 1980). En fait, le 86Rb est l'isotope de choix pour les
38
études fonctionnelles des NKCCs car il est transporté par ces protéines selon les mêmes
constantes cinétiques que pour le K+ et puisque sa demi-vie est idéale, i.e., de 14 jours.
Une préincubation des oocytes exprimant NKCC2 est requise avant l'influx afin de
permettre une activation fonctionnelle de la protéine. Par exemple, les NKCCs sont
maximalement actifs lorsque le cr intracellulaire est abaissé par la dilution du milieu
extracellulaire ou par sa déplétion sélective en cr (Xu et al., 1994 ; Payne et al., 1995 ;
Isenring et al., 1998) et lorsque la cellule est rétrécie (Isenring et al., 1998 ; Gagnon et al.,
2003, 2004, 2005). En général, les KCCs sont plutôt activés par l'augmentation du cr intracellulaire et le gonflement cellulaire.
6.3. Détermination des Kms
L'affinité des NKCCs pour les ions transportés peut être obtenue par des mesures de Km
lors d'analyses d'influx en se basant sur l'équation de Michaelis Menten qui se définit
comme suit: f(y) = Yo + ax/(b+x) * où f(y) est la vitesse ou activité mesurée, x, la concen
tration des ions, a, la vitesse maximale, b, le Km, Yo la vitesse initiale et *, le coefficient
de Hill. Ceci implique que l'activité d'un NKCC doit être mesurée à des concentrations
variables d'un ion « x » allant de « 0 » à une valeur où le transport est saturé. Le Km est la
concentration en ion à laquelle la vitesse initiale de la réaction est à la moitié de la vitesse
initiale maximale, impliquant que plus la constante est élevée, moins l'affinité est élevée.
Tel que mentionné antérieurement, le traceur utilisé pour NKCC2 est généralement le
86Rb. Quand le Km à déterminer est pour le Na ou le Cl, on s'attend à ce que la quantité
d'isotopes incorporés augmentent avec la concentration extracellulaire de Na ou de Cl
froid. Quand, d'un autre côté, le Km à déterminer est pour le Rb, on s'attend à ce que la
quantité d'isotopes incorporés diminue avec la concentration extracellulaire de Rb à
cause d'une compétition entre 85Rb et 86Rb pour le même site de liaison. Toutefois, le
taux de transport net augmentera en fonction de la concentration de l'un ou l'autre des
ions puisqu'il est exprimé mathématiquement en tenant compte de la concentration totale
d'ions chauds et froids dans le milieu extracellulaire.
39
Mentionnons pour terminer que les Km calculées ne correspondent pas à des mesures
d'affinités vraies (ou à des Kd) puisqu'elles seront influencées par toutes les constantes et
vélocités de chacune des réactions du cycle du transport ionique, i.e., de la translocation
des ions, d'un changement de conformation, etc. Ainsi, il est plus précis de parler de Km
apparent dans ce contexte bien que pour des raisons de simplicité, nous ne ferons plus de
distinction à ce chapitre dans le reste du mémoire, d'autant plus qu'il n'existe pas d'outils
de travail fiables pour mesurer les ~ ioniques des CCCs.
7. Prémisses spécifiques, hypothèses et objectifs de la recherche
Plusieurs études ont démontré que les résidus situés dans le tm2 des CCCs modulent
l'affinité pour les cations, ce que la caractérisation fonctionnelle des variantes de NKCC2
a permis de confirmer (Isenring et al., 1998b ; Giménez et al., 2002 ; Plata et al., 2002).
Plus récemment, notre groupe a aussi démontré que cs1 était impliqué (Gagnon et al.,
2004, 2005) et a réussi à identifier des résidus spécifiques « modificateurs d'affinité»
dans toute la région codée par l'exon 4. Les résidus en question sont en position 216 et
220 dans tm2 (ces derniers moduleraient l'affinité pour les cations) et en position 223,
229, 233 et peut être 225 dans cs 1 (certains de ces derniers moduleraient l'affinité pour le
Cl). Ces conclusions ont été obtenus grâce à l'analyse de chimères formées à partir des
NKCC2A et F du requin, exploitant les différences fonctionnelles qui existent entre les
varia~tes, i.e., « A » a des Km beaucoup plus bas que « F » pour tous les ions.
Nous pensons maintenant que les résidus « modificateurs-d'affinité» identifiés opèrent
en combinaison - cette idée a déjà été proposée par Scheiner Bobis (2002) pour d'autres
transporteurs - mais ignorons la séquence des cassettes en tant que tel et leur spécificité
ionique. Notre but principal est donc d'identifier ces cassettes, ce qui devrait nous per
mettre d'approfondir notre compréhension quant aux déterminants moléculaires qui con
fèrent à «A» et «F» leurs caractéristiques cinétiques propres. Pour ce faire, nous
créerons des chimères additionnelles en interchangeant des paires de résidus entre « A »
et « F » et exprimerons ensuite ces mutants dans des oocytes de Xenopus laevis afin de
déterminer leur dépendance à chacun des ions.
~~- -~--~---
40
CHAPITRE 2 : MÉTHODES GÉNÉRALES
Les méthodes utilisées pour ce mémoire seront présentées ici en survol. Elles ont déjà été
évoquées à la section précédente et seront décrites de façon plus détaillée au chapitre 3.
1. Génération des mutants
Tel que mentionné, des études structure-fonction récentes ont permis d' identifier des
résidus spécifiques dans tm2 et csI qui conférent à chacune des variantes A et F du
requIn ses caractéristiques cinétiques propres. Les mutants exploités alors
correspondaient à des chimères de saNKCC2A (saA) et saNKCC2F (saF) chez qui un
seul résidu avait été interverti entre les variantes. Toutefois, la caractérisation
fonctionnelle de ces chimères nous a permis de -réaliser que la Km pour un ion «x »
n'était pas déterminée par un seul résidu « modificateur d'affinité» mais bien par un
groupe de résidus, et que chacun des ions bénéficiait probablement de son propre groupe
de résidus. Nous avons donc décidé de générer des mutants chimériques additionnels en
intervertissant des résidus entre saA et saF par groupe de 2 ou de 3 et ceci, afin
d'identifier ce qu'il conviendrait d'appeler « des cassettes de spécification cinétique ».
La création de ces mutations ponctuelles a été réalisée par le biais d' oligonucléotides
mutagéniques et le QuickChange Mutagenic kit® de Stratagene. Les constructions
ciblées ont été les ADNc codant pour saA et saF à l'intérieur du vecteur d'expression
PolI qui contient les UTRs (untranslated regions) de la fi-globine grâce auxquelles
l'expression d'ARNc dans les oocytes de Xenopus lœvis est maximisée.
2. Expression des NKCC2
De l'ARNc a été produit à partir d'ADNc sauvages pu mutés grâce au kit mMESSAGE
mMACHINE (Ambion, TX) et injecté dans des oocytes défolliculés de stade V-VI ('"'-JI 0 à
35 ng/oocyte/ARNc). À noter que plusieurs oocytes ont aussi été injectés avec de l'H20
seulement pour servir de groupes témoins. Une fois les injections faites, ils ont été
41
maintenus 3 à 4 jours à 18°C dans la solution Barth (voir table 2 au chapitre 3) + 125 J.lM
furosémide pour permettre la synthèse de la protéine hétérologue. Mentionnons ici que
les études fonctionnelles ont été complémentées par des analyses d'immunofluorescence
afin de vérifier l'expression des protéines hétérologues. Les méthodes utilisées pour ces
expé-riences ont déjà été décrites en détail dans plusieurs des travaux qui ont été réalisés
dans notre laboratoire.
3. Épreuves fonctionnelles
Les oocytes ont tous été incubés dans un milieu hypertonique pendant 1 heure avant
d'être soumis à des épreuves d'influx. L'incorporation d'isotope a ensuite été mesurée
pendant 45 minutes dans des milieux où la concentration en Na+, Rb+ ou cr a varié de 0 à
87, 0 à 20 ou 0 à 86 mM, respectivement. Les mesures d'affinités ont été obtenues selon
les explications fournies à la section 6.3 du mémoire (chapitre 1) et selon celles qui seront
fournies au chapitre 3. Brièvement, nous avons utilisé l'équation de Michaelis Menten
pour obtenir des paramètres cinétique,s apparents, soit des Kms (affinité), V max (capacité)
et coefficients de Hill (nombre de sites de 'transport). Dans la plupart des cas, les taux de
transport mesurés à une concentration "x" d'un ion particulier ont été normalisés au taux
de transport mesurés à la concentration maximale de l'ion utilisé afin de contrôler pour
les variations intra-expérimentales.
42
CHAPITRE 3 : MANUSCRIT EN PRÉPARATION
1. Notes
L'auteur de ce mémoire a contribué à 80% des données qui sont présentées dans ce
chapitre et a reçu leur aval pour les publier dans le mémoire.
2. Abrégé en français
Le cotransporteur Na-K-Cl rénal (NKCC2) couple le transport de 4 ions (1 Na+, 1 K+ ou
1 Rb +, et 2 Cr) à travers la membrane apicale de l'anse ascendante de Henle, contribuant
à la réabsorption de l'ultrafiltrat glomérulaire. L' épissage alternatif de l' exon 4 engendre
2 variantes appelées «A» et «F» dont la séquence dans le deuxième segment
transmem-branaire (tm2) et dans la première boucle intracellulaire (cs1) diffère. Il
confère aussr des différences d' affinité ioniques, i.e., « A » a des Km beaucoup plus bas
que « F » pour tous les ions grâce à des résidus spécifiques que nous avons identifiés par
des études mutagéniques. Les résidus impliqués sont en position 216 et 220 dans tm2
(ceux-ci moduleraient l'affinité pour le Rb et Cl, respectivement) et en position 223, 229,
233 et peut être 225 dans cs1 (certains de ceux-ci moduleraient l 'affinité pour I.e Cl). À ce
stade-ci, notre but principal est d'avancer notre recherche sur la compréhension des
déterminants qui confèrent à « A ». et « F » leurs caractéristiques cinétiques propres. Nous
savons que les résidus «modificateurs-d'affinité» identifiés opèrent en combinaison
mais ignorons la séquence des cassettes en tant que tel et leur spécificité ionique. Nous
avons donc crée des chimères en interchangeant des pairs de résidus entre « A » et « F »,
i.e., résidus 216 et 220 dans tm2, 223 et 225 dans cs 1, 223 et 229 dans cs 1, et 220 et 225
dans tm2-cs 1, pour ensuite exprimer les mutants dans des oocytes de Xenopus laevis et
analyser leur dépendance à chacun des ions. Nous avons trouvé, de façon fort
intéressante, que la cassette 220;223;225;233 modulait l'affinité pour les ions Na+-Cr
(incluant celle du site à haute affinité pour le Cl) et que la cassette 216;225 modulait celle
pour le Rb+. Toutefois, les résultats obtenus pour l'une des chimères (<< F » chez qui les
rési4us 216 et 220 ont été remplacés par ceux de « A ») avait un comportement inattendu
43
puisque son affinité pour le Rb est demeurée identique à celle de « F ». En même temps,
ce résultat vient probablement appuyer l'idée que plusieurs résidus le long de tm2 et cs!
fonctionnent en synergie pour assurer la coordination ionique par NKCC2. Nos résultats
suggèrent aussi l ' existence d' au moins 2 cassettes «modificatrices d'affinité », l'une
pour le Na+-Cr et l'autre pour le K+-Cr.
3) Abrégé en anglais
The renal Na+-K+-Cr cotransporter (NKCC2) couples the movement of 4 ions (1 Na, 1 K
or 1 Rb, and 2 Cl) across the apical membrane of the thick ascending limb of RenIe
where it reabsorbs an important fraction of the glomerular ultrafiltrate. Alternative
splicing of ex on 4 in the gene leads to the formation of 2 variants called « A » and « F »
that differ in residue sequence across the second transmembrane domain (tm2) and part
of the first intracellular connecting segment (cs 1). It also col)fers differences in ion
affinities, i.e., «A» exhibits much lower Km for ions than «F » because of specifie
residues that we have identified through mutagenic studies. The residues involved are at
positions 216 and 220 in tm2 (they would modulate Rb and Na affinity respectively) and
at positions 223, 229, 233 and perhaps 225 in cs1 (sorne of these residues would
. modulate Cl affinity). At this stage of our investigation, our main goal is to further our
knowledge regarding the molecular determinants through which «A» and «F » have
acquired their differential kinetics traits. We already know that the identified affinity
modifying residues operate in combination in the form of cassettes but have yet to
determine the composition and ion-speéificity of these functional domains. We have thus
generated chimeras by interchanging pairs of residues between «A» and « F », i.e.,
residus 216 and 220 in tm2, 223 and 225 in cs1, 223 and 229 in cs1, and 220 and 225 in
tm2-cs1, and have expressed these mutants in Xenopus laevis oocytes to examine their
ionic dependencies. Quite interestingly, we found that cassette 220;223;225;233 appears
to modulate the affinity for Na-Cl (perhaps at the high-affinity binding site for Cl) and
that cassette 216;225 appears to modulate the affinity for Rb. Surprisingly, however, the
behavior of one of the chimeras (( F » in which residues 216 and 220 were both replaced
by those of A ») exhibited an unexpected behavior in that its affinity for Rb was no
44
different from that for « F ». At the same time, this result probably supports the idea that
many residues along tm2 and cs 1 operate conjointly to ensure proper ionic coordination
through the translocation pocket ofNKCC2. Our data also point towards the existence of
at least 2 putative affinity-modifying cassettes, one for Na-Cl and the other for Rb-Cl.
4. Introduction
The renal Na-K-CI cotransporter (NKCC2) promotes substantial NaCI reabsorption
across the apical membrane of the thick ascending limb of Henle (Greger et al. , 1981 ;
Gagnon et al. , 2002, 2003, 2004, 2005). Alternative splicing of exon 4 leads to the
formation of 3 variants (called NKCC2B, A and F) that are all confined to the T AL and
that are identical to one another except for the second transmembrane domain (tm2) and
part of the following connecting segment (cs 1). Interestingly, these variants are
distributed differentially along the TAL as follows: "B" is in macula densa cells, "A" in
the outer medullary stripe and "F" in the inner medullary stripe (Payne et al., 1994). In
contrast to NKCC2, the secretory NKCC (NKCC1) is ubiquitous and in polarized cells,
is basolaterally disposed.
The main function ofNKCC2 is to couple the movement of one Na+, one K+ and two cr across the cell surface of T AL cells, implying that there is no movement of charge post
translocation. In sorne studies, interestingly, alternate transport modes have been
proposed, i.e., 2Na:1K:3CI for squid NKCC1, 1Na:1K:1CI for NKCC2A (Gagnon et al.,
2003,2004,2005) and KlK ex change for NKCC1 and NKCC2A. It has generally been
hypothesized that large differences in Cl affinities account for these alternate
stoïchiometries, and that partial reactions during the transport cycle account for the
ability ofNKCC2 to promote K movement in the absence of extracellular Na.
The kinetic features of NKCC 1 vary among species and those of NKCC2 vary among
the splice variants. For example, hum an NKCC1 exhibits much lower Kms than shark
(sa) NKCC1 (Isenring et al., 1997, 1998, 2001), and so does NKCC2A when compared
to F (Gagnon et al., 2003, 2004, 2005). In previous analyses, chimeras ofvarious CCCs
45
or species differences in ion affinities were exploited in structure-function studies to
identify residues that are involved in ion movement by these transporters. For instance,
such studies showed that the kinetic characteristics of NKCC2 are specified by variant
residues that are localized in both the tm2 and/or csl regions. In more specific terms, we
found that cs 1 harbors a high affinity-CI binding site, that 5 candidate residues in tm2-
cs 1 play a definite role in Cl transport, and that 2 residues in tm2 are important in
determining Na and Rb affinities. Quite interestingly, our kinetic studies also suggested
that the residues identified belong to distinct ion-binding sites in tm2-cs 1 but they were
not sufficiently high-resolution to identify aIl of the affinity-modifying determinants.
They also suggested that residue along this domain operate in combination to convey
specific kinetic traits.
Chimera approaches are very useful to identify variant residues that convey differences
in the modus operandi of homologous carriers. Their main drawback, however, is that
key residues will be overlooked if they are fully conserved between similar forms of a
protein. This limitation is underscored by sorne of our recent analyses that led to slightly
different interpretations of where affinity-modifying <:Jomains are localized depending on
which NKCC was used to generate the mutants. For instance, it was concluded that the
cs 1 region of NKCC 1 probably did not play an important role in ion transport based on
the behavior of several chimeras but this interpretation has now proven to be incorrect,
perhaps not surprisingly so given that this region is one of the most conserved in the
CCC family.
For the NKCCs, a change in ion affinity at one site induces a change in ion affinity at
another site, implying that the ion-binding sites in these carriers are interdependent
(Isenring et al., 1997, 1998, 2001 ; Lytle et al., 1988). As such, it could be difficult to
determine which ion constants have been actually modified originally through residue
substitutions. At the same time, exhaustive kinetic studies of wild type NKCC 1
expressed in HEK -293 cells in conjunction with previous kinetic models have recently
allowed us to detennine how these constants are interrelated (Isenring et al., 1997, 1998,
2001). The data generated, for instance, have shown that at high extracellular (0) [Na+]
46
or [K+], changes in cation affinity will have sniall effects on Km(cl), while at high [Cr]o, a
change in cr affinity will have a larger effect on Km(cations).
In this study, we have exploited a chimera approach once again but have produced
saNKCC2 mutants in which pairs of residues were interchanged between "A" and "F" to
identify affinity-modifying cassettes that are important in detennining ion affinities and
to detennine whether the movement of each ion through the translocation pocket is
mediated by the same group of residues. Through these analyses, two such ,cassettes that
are each fonned by both tm2 and csls residues were uncovered. Quite interestingly, each
of these cassettes was also found to modulate affinity for a specific group of ions.
5. Material and Methods
5.1. Overview
Structure-function studies were carried out to identify groups of affinity-modifying
residues in the tm2-csl region of Squalus acanthias (sa) NKCC2A and saNKCC2F
(called saA and saF in this work). Carriers were expressed in X lœvis oocytes and
characterized through flux assays.
5.2. Constructs
cDNAs were aIl subcloned in PolI, a X lœvis oocyte expression vector that contains the
T7 promoter, X lœvis ~-globin untranslated regions and a polyA tract. Besides saA and
saF, they included chimeras in which residues were interchanged in combination
between saA and saF, that is, saF216;220, saF223;22S, SaA223;22S, saF223;229, SaA223;229 and
saF220;22S, using a capital letter to indicate the NKCC2 variant in which residues were
substituted, and numbers to indicate where these residues were altered (see Fig. 9). Note
that the choice of sites to mutate was based on the results of previous structure-function
studies in which only one residue had been interchanged between saA and saF. Aiso note
47
that the chimeras saA21 6;220 and saA220;225 were not included in the analyses given that
they did not appear to be functional.
AIl of the mutations were generated through pairs of mutagenic oligonucleotides (Sigma)
using the Quick Change Mutagenesis Kit (Stratagene) and verified through automated
sequencing. In each reaction, the templates used included wild-type saA or saP, or saA or
saF that had already been mutated at another site.
5.3. Expression in X lœvis oocytes
Defolliculated stage V-VI oocytes were injected with saNKCC2/Poll-derived cRNA (",5
to 25 ng/oocyte diluted in H20) and .maintained for 3 days at 18°C in Barth's (B)
medium (see Table 2)+ 125 JlM furosemide. Groups of oocytes were also injected with
H20 alone as controls. In aIl studies, cotransporter . expression was assessed through
immunofluorescence studies as previously described using a NKCC specific antibody.
SignaIs observed among oocytes expressing any given variant or mutants exhibited
similar localization and intensities (results not shown).
5.4. Kinetic studies
Ion transport rates were determined by 86Rb influx measurements at ----22°C uSlng
different media (shown in Table 2). Each of these media is derived from a regular (R)
medium that is isoosmolar relative to plasma for the X lœvis frog. One of the modified
media (called R+) was obtained by adding 84 mOsM sucrose and the other types of
media (called R~) were obtained by replacing the ions of medium R with K+ or N-methyl
gluconate (as cation substituents) or with gluconate ± S04 (as anion substituents).
Before, the flux assay per se, furosemide was first removed through several rinses in
medium R. Eggs were then subjected to 2 consecutive incubation steps: one of 60 min in
medium R+ (to activate the cotransporter) and another of 45 min in various medium R~ +
1-2 JlCi/mL 86Rb + 10 JlM ouabain ± 250 JlM bumetanide (to allow NKCCC-mediated
48
intracellular accumulation of the radioactive tracer). During this second 45-min time
interval, transport activity vs. time is in a linear range, regardless of the ion concentration
used. Here, the various medium R~ were produced by varying [Na+] from 0 to 87 mM,
[Rb+] from 0.1 to 20 mM or [Cr] from 0 to 86 mM (see Table 2). Fluxes were terminated
with washes in a high K medium R~ + 10 }lM ouabain ± 250 }lM bumetanide, and
oocytes were transferred to 96-well plates (1 oocyte/well) prefilled with 2% SDS and
scintillation fluid. After a short stabilization period, accumulated 86Rb was detected with
the TopCountNXT microplate counter (Packard).
~n each experiment, counts among several oocytes (generally 4 to 6) were averaged and
transposed into fluxes (F). The equation used for this calculation was F = (counts/oocyte
x [85Rb] in the flux solution) 7 ([ counts] in the flux solution x time of incubation in the
flux solution), assuming that mean membrane surface areas between groups of stage V
VI oocytes are very similar; for kinetic determinations (see below), mean fluxes were
also normalized to those obtained at the highest ion concentration. All of the averages
calculated (normalized or non normali~ed) were subsequently reaveraged from several
replicate experiments (n = 2 to 5) and the data obtained was expressed as means ± S.E.
Ion constants (expressed as Kms) were calculated with the programs PLOT (Biff
Forbush) or SigmaPlot 4.00 for Windows using the Michœlis-Menten equation (for a
one-binding site model), the Hill equation with a coefficient (n) of 2 (for a 2-binding site
model), or the Hill equation with an undetermined value of "n". In each case, least
square analyses were carried out with a 3 or 4 parameter-equation (variables: V max, Km
and V min ± Hill) to allow a 0 offset, assuming that 86Rb influx is never completely absent
even if one of the cotransported ions is removed from the flux solution (as occurs when
the transporter is in the KlK exchange mode for example). The kinetic parameters
obtained are shown as results of single fits using averaged activity vs. concentration data
points from replicate experiments.
Lastly, itshould be noted that kinetic parameters were calculated without subtracting
bumetanide-sensitive 86Rb influxes measured in H20-injected eggs. In fact, oocytes
49
exhibit very low levels of 86Rb influxes under the experimental conditions used for the
flux assays and, accordingly, the dependence of saNKCC2 activity on [Na+] , [Rb+] or
[CI-] should remain unaltered whether background activity is subtracted or not. As will
be discussed later, previous studies have confirmed this prediction on multiple occasions
even for heterologously expressed carriers with transport activities that were as low as 2-
fold above background.
6. Results
6.1. Expression of saNKCC2s in oocytes
Immunofluorescence studies of oocytes expressing the saNKCC2s that were included in
the CUITent structure-function analysis, i.e., saA and saF, that is, saF216;220, saF223;22S,
saA223;22S, saF223;229, saA223;229 and saF220;22S, revealed that the antibody used labels the
heterologous proteins specifically, and that most of the signal occurs at the cell surface
(results not shown). Functional analyses, during which cotransporter activity was
determined under subsaturating concentrations of Na +, Rb + and cr, confirmed the
localization . data in showing bumetanide-sensitive 86Rb influx that are clearly above
those of the X lœvis NKCC 1 and relatively similar among wild-type and mutants.
6.2. Kinetics of cation transport
6.2.1. Previous studies
As stated earlier, we have observed that saA and ~aF exhibit substantial differences in
regard to Na+ and Rb+ affinities. We have also observed that Km(Na) remains low even
when the tm2 of saA is replaced by that of saF (to generate a chimera that will be called
saF / A hereafter), suggesting that variant residues in this do main convey no differences in
Na+ affinity as long as cs! is from saA (Gagnon et al., 2004).
Further analyses revealed that replacement of residue 216 or 220 (tm2) in saA by those
50
of saP did not lead to changes in Km(cations), as was anticipated based on the behavior of
saF/A, and that replacement of residue 223, 229 or 233 (cs1) in saF by those of saA
produced no changes either as was also anticipated from the behavior saF/A. Conversely,
the y revealed that complementary replacements produced changes in Km(cations) that were
differential, that is, the saF220 substitution affected Km(Na) predominantly, the saF216
substitution affected Km (Rb) predominantly and the other substitutions in cs1 produced
even though saF/A exhibited a saA-type behavior. These results suggested that
combinations of residues operate with one another to specify kinetic traits, all the more
so that the saF220 and saF216 substitutions had each produced an intermediate phenotype
between saA and saF in regard to the ion constant changed.
6.2.2. Current studies
To test our hypotheses, we examined the behavior of mutants in which combinations of
residues were interchanged between sA and saF at previously tested positions (216, 220,
223 , 229) and at a new position (225). Ion constants are presented in Fig. 10 and
discussed further below. I1lustrative activities vs. ion concentration relationships are also
presented in Fig. 12 for one of the mutants tested, i.e., saF 220~225.
6.2.2.1. Changes in tm2
Figs. 10B and F show that when 2 substitutions are created in tm2 (positions 216 and
220), the mutant saF carrier still exhibits an intermediate behavior between wild~type
carriers in regard to Km(Na) but has now adopted the behavior wild-type saF in regard to
Km(Rb). These results confirm the role of residue 220 in Na transport but would now
suggest that residue 216 is not involved in Rb transport. One explanation that might
account for this discrepancy is discussed below.
6.2.2.2. Changes in esl
When substitutions are created in the cs1 of saA (see Figs. 10C and G), Km(cations) are seen
51
to be near identical to those of saA, a finding that was expected given that in this regard,
the behavior of chimera caIled saAIF (in which the tm2 is from saA and csl from saF)
was also similar to that of saA. Interestingly, the behavior of the saF mutants are almost
identical to wild-type except that the double substitution at positions 223 and 225
decreases Km(Na) by about half relative to saF.
In conjunction with a previous finding that a single point A ~ F exchange at either of
these sites produces no kinetic effect, these results suggest that the residues at positions
223 and 229 operate in combination and they do play a role in Na transport under suc4
circumstances. They also suggest that the same combination of residues at these sites
does not affect Rb transport unless they were to require another, as of yet undetermined
site in tm2 and/or c~1. At this stage of our analyses, thus, we can conclude that residues
220, 223 and 229 are aIl important in determining Na+ affinity for the NKCC2s.
6.2.2.3. Changes in both tm2 and esl
The last mutant tested (see Fig. 10D) reveals that the residue at position 225 (not tested
previously) plays an unexpected role in cation transport. Indeed, the pair of substitutions
created in saF (at positions 220 and 225) converts saF into a SaA-type phenotype in
regard to Na+ transport and leads to Km(Rb) that are intermediate between wild-type
carriers. As such, another affinity modifying residue (at position 225) that is important in
determining Km(Na) is added to the list, and the first affinity modifying residue (at the
same position) that is important in determining Km (Rb) is uncovered through these
analyses.
6.3. Kineties of CI transport
6.3.1. Previous studies
We have observed that SaA also exhibits Cl affinities that are --5-fold higher compared to
saF (Gagnon et al., 2004 and 2005). Interestingly, however, the behavior of chimeras
52
saA/F and saF/A later revealed that Km(Cl) only remains low if the csl of saNKCC2 is
from saA, suggesting that variant residues in this domain dictate the kinetic
characteristics of cr transport to a large extent. Our past studies also revealed that tm2
could play a role in anion transport as weIl, but as part of a low Cl-affinity binding site.
This possibility was evoked by the fact that the saF mutant in which tm2 was replaced by
that of saA (saAlF) behaved as if it had lost of the cr transport sites.
Further analyses revealed that replacement of residue 216 or 220 (tm2) in saA by those
of saF did not lead to changes in Km(cl), a finding that was not necessarily surprising
·given that saA and saP differ at many other positions in tm2. They also revealed,
however, that replacement of residue 223, 229 or 233 (csl) in saF by those of saA
produced no changes either. In conjunction with the earlier observation that Km(cl) are
identical between saF / A and saA, these results thus suggested that affinity-modifying
residues must operate together to specify kinetic traits even in regard to cr transport.
6.3.2. Current studies
The same mutants were used to identify groups of residues in tm2-cs 1 that are important
in determining Km(cl). Data are presented in Fig. Il, and illustrative activities vs. Ion
concentration relationships are also presented in Fig. 12.
6.2.3.1. Changes in tm2
Fig. Il J shows that even with the double substitution in tm2 (positions 216 and 220), the
mutant saF carrier still exhibits a wild-type behavior in regard to ·Km(CI). The same was
also true in regard to Hill coefficient (not shown).
6.2.3.2. Changes in cs1
As for the csl substitutions (see Fig. 11K), results show Km(CI) that are similar between
saA and mutants with F~A substitutions (saA in which cs1 residues were replaced by
53
those of saF), suggesting that residue group 223 and 225 or 225 and 229 are not affinity
determining based on this kinetic parameter alone. On the other hand, interestingly, Hill
coefficients were much higher for both mutants relative to saA (not shown). The
behavior of the complementary chimeras confirms tha.1 the residue groups tested play a
role in anion transport. Indeed, Km(cl) are seen to be much lower than those for saF but in
this case, interestingly, Hill coefficients did not differ compared to saF. Taken together,
these results are consistent with the idea that residue group 223, 225 and 229 is important
in determining the kinetic characteristics of Cl transport.
6.2.2.3. Changes in both tm2 and cst
As shown in Fig. IlL, saF220;225 behaved as saA or as the saF mutants in which csl
residues were substituted (saF/A). Another Km(cl)-determining residue (at position 220)
has thus been identified.
7. Conclusion
A brief discussion in french of the results obtained is provided in the next chapter of this
memoir.
R:
R+:
B:
R~:
R~:
R~:
R~:
54
TABLE 2
Composition of flux solutions. Medium R+ also contains 84 mM sucrose, Barth's medium
(B) 0.7 mM N03- and 2.4 mM HC03-. AlI solutions are at pH 7.4. Kwas used for the wash
solution, whereas Rb+ was used for the others. Here, R = regular medium, B = Barth's
medium, R+ = regular medium that was rendered hypertonie, and RI':J. = regular medium that
was modified through cation or anion replacements.
[ion] (mM) cr
Regular 87 5 86 2 2 10 0 0
Hyperosmolar 87 5 86 2 2 10 0 0
Barth's medium 90.4 90 0.7 0.8 0 0.8 10 0 0
Rb dependence 87 0.1-20 86 2 2 10 0-20 15
Na dependence 0-87 5 86 2 2 1 10 0-87 0
Cl dependence 87 5 0-86 2 2 1-10 10 0 0-78
Wash 19 73 8 2 2 10 0 78
200
284
200
230
200
200
200
55
FIGURE 9
Sites at which residues were interchanged between «A» and «F ». The alternative
spliced region is colored in pale blue and positions where ' residues were substituted
between the variants are colored in red.
216
223
229
233
220
225
FIGURE 10
Na+ or Rb+ dependence ofion transport by wild-type saA, saF and different mutants.
120
100
80
60
40
20
o
12
10
8
6
4
2
o
wt
A
E
tm2 cs! tm2-cs!
B c D
F G H
56
57
FIGURE 11
CI- dependence of ion transport by wild-type saA, saF and different mutants. Note that aIl
carrier but saA had Hill coefficients of2.
wt tm2 csl tm2-csl
100 1 J K L
80 ~
~ a '-" 60 ~
U ~
t8 40
~ 20
0
< ~ 0 ln ln 0\ 0\ ln N N N N N N c:'! c:'! N c:'! c:'! c:'! • r.
\0 M ~ ~ M 0 ~ N N N N N N N N N N N
~ ~ ~ ~ ~ ~
FIGURE 12
Illustrative carrier activity vs. ion concentration relationships for mutant saF220 )25.
10
2 -...... 8 Q)
+-> s 0 0
SaF220;225 -...... 6 0
ê
(f "-'"
~ 4 ~ .S
~ 2 1 tm2 CS! \0 00
o 1 1 1 1 1 0 20 40 60 80
Na concentration (mM)
% 8 r------f-------f f 6 /r saF220;225
! 4 ; ~ ] 1 f 2
• o r o
8
tm2
1 10
Rb concentration (mM)
csl
1 20
~~T
/T saF22o;225
. ~
2/ / •••••
o 1 o
tm2 1* 1 1
20 40 60
Cl concentration (mM)
CS!
1 80
58
59
CHAPITRE 4 : DISCUSSION ET CONCLUSION
Dans l'article de ce mémoire (chapitre 3), nous avons cherché à identifier des groupes de
résidus dans tm2 et/ou cs 1 qui contribuent à moduler l'affinité pour les ions transportés.
Après avoir examiner les propriétés fonctionnelles de mutants où une seule substitution
était présente, nous savions déjà que certains résidus jouaient un rôle à cet égard.
Toutefois, nous savions aussi qu'ils devaient coopérer entre eux pour générer un effet
cinétique précis mais n'avions pas tenté d'identifier les combinaisons de séquence en jeu.
C'est pour cette raison que nous avons construit une série de chimères comprenant des
mutations doubles.
L'analyse de ces nouvelles chimères fabriquées à partir des variantes « A » et « F » du
NKCC2 squalin nous a permis d'identifier 2 groupes de cassettes «modificatrices
d'affinité» composées d'une part des résidus 220;223;225;233 et d'autres part, des rési
dus 216;225 (elles seront dorénavant appelées « x » et « y » jusqu'à la fin du chapitre).
Ces résultats suggèrent donc que les régions tm2 et cs 1 fonctionnent en coopération pour
déterminer de l'affinité ionique. De façon intéressante, par ailleurs, nous avons aussi
trouvé que ces cassettes étaient ion-spécifiques en ce sens que l'une d'elle (<< x »)
semblait moduler l'affinité pour les ions Na+-Cr et l'autre, l'affinité pour le Rb + (i.e., le
K+).
Il faut mentionner ici que l'un des résidus préalablement identifié (position 216) avait été
considéré comme important dans la modulation de l'affinité pour le K+, mais qu'un
double mutant « F » à l'intérieur duquel ce résidu et un autre (en position 225) avaient été
remplacés par ceux de «A» n'avait pas permis de confirmer cette donnée. Nous
persistons néanmoins à croire que le site du résidu 216 joue le rôle attribué initialement
en misant sur l 'hypothèse que la cassette contient des résidus additionnels et qu'en
existant sous une forme hybride « A-F », elle pourrait ne plus fonctionner adéquatement.
Si cette hypothèse s'avérait exacte, des triple ou quadruple mutants « F » comprenant les
résidus de « A » en position 216 et 225 avec d'autres résidus « modificateurs-d'affinité»
60
pour le K+ devraient éventuellement se comporter comme «A» pour ce qUI est du
paramètre cinétique .Km(K).
Nous sommes tentés de proposer l'idée que la cassette « x » module l'affinité du Na au
site de liaison du Na (appelons celui-ci BS-Na) et celui du Cl au site de liaison de haute
affinité du Cl (appelons-le BS-CI1). Deux arguments iraient dans le sens de cette idée.
D'abord, 3 des résidus identifiés sont dans cs! , un segment qui inclurait ce BS-Clt tel que
suggéré par Gagnon et al. (2005). Ensuite, le Cl se lie à BS-Clt juste après que le Na se
soit lié à BS-Na selon le modèle de translocation ionique ordonnée proposé par Lytle et
al. en 1998. Il serait donc logique de penser que les résidus « modificateurs-d'affinité»
pour ces 2 sites sont très près l'un de l'autre ou sont en fait les mêmes.
À partir de l'argumentaire étayé dans le paragraphe précédant, on pourrait donc
s'attendre à ce que la cassette «y» module l'affinité du K à son site de liaison du K
(appelons celui-ci BS-K) et celui du Cl au site de liaison basse affinité (appelons-:le BS
Ch). Gagnon et al. (2005) ont effet démontré que tm2 modulerait l'affinité pour BS-CI2
et Lytle etaI. (1998) que l'ordre des ions venant après les 2 premiers était K suivi de Cl.
Il est important de mentionner que l'approche mutagénique utilisée dans ce travail a été
conçue pour identifier des résidus qui confèrent des différences de paramètres cinétiques
et que ces résidus pourraient ne pas être les mêmes que ceux dont le rôle est de lier les
ions directement. Toutefois, il serait très surprenant que les résidus «modificateurs
d'affinité» et « de liaison» soient situés loin de l'autre et il est même probable que ces
deux variétés de résidus soient en fait côte à côte dans l'espace. À cet effet, il a déjà été
proposé que des résidus contigus dans une hélice a-transmembranaire interagiraient entre
eux par des liaisons entre leurs chaînes latérales. Nous pensons que ce phénomène
permettrait aux « modificateurs-d'affinité» de moduler la force de liaison d'un ion à des
résidus adjacents et expliquerait aussi l'interdépendance cinétique des sites de liaison
ionique.
61
Les travaux menés ici nous ont permis de mieux comprendre le principe structural de la
translocation ionique par NKCC2. Ils serviront éventuellement de base à la genèse de
diurétiques dont l'action est spécifique à chacune des variantes et donc plus ciblée.
62
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