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Étude du mécanisme moléculaire d'incorporation de la molécule de l'hôte ICAM-1 par le VIH-1
Thèse
Pascal Jalaguier
Doctorat en Microbiologie et Immunologie Philosophiae Doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
© Pascal Jalaguier, 2013
iii
Résumé
Le virus de l’immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1) a été identifié comme
étant l’agent responsable de la pandémie qui frappe actuellement notre civilisation. En une
trentaine d’années le virus à causé la mort de plus de 35 millions de personnes. Une telle
épidémie dans l’histoire de l’humanité n’est pas une première; rappelons-nous dans le
passé, la peste noire ou encore la grippe espagnole qui ont fait elles aussi des millions de
morts. Cependant, pour la première fois dans l’ère moderne, nous avons la possibilité de
lutter contre ce fléau grâce à l’étude approfondie de la biologie du virus qui a permis, entre
autres, l’avènement de la trithérapie. Le VIH-1 acquiert un nombre impressionnant de
molécules cellulaires tout au long de son cycle réplicatif. En dépit de tous les efforts
consacrés à l’étude des molécules de l’hôte, le(s) mécanisme(s) exact par lequel toutes ces
molécules sont acquises n'est toujours pas connu. Néanmoins, dans le cas d'ICAM-1, une
des molécules transmembranaires les plus étudié il apparaît que le précurseur viral Pr55Gag
est un candidat potentiel d'interaction avec ICAM-1. Par conséquent, nous avons étudié et
caractérisé au niveau moléculaire le processus d'incorporation d'ICAM-1 en utilisant dans
un premier temps un modèle de pseudo particules virales (VLPs) dérivé de Pr55Gag. La
substitution de plusieurs domaines de Pr55Gag tels que la nucléocapside, SP2 et p6 n'ont pas
eu d'effet sur son acquisition. Par la suite, nous avons démontré que la protéine de matrice
(MA) est nécessaire à son incorporation. Nous avons confirmé ces résultats préliminaires
en générant le mutant de matrice dans un clone moléculaire couramment utilisé en
laboratoire (NL4.3). Des études complémentaires suggèrent que les deux tiers C-terminal
de la MA sont importants et en particulier treize acides aminés présents dans l'hélice-α 5.
De plus, en se basant sur la modélisation 3D des interactions protéines-protéines et en
validant par la suite ces prédictions par immunocapture, nous avons trouvé qu'une série
d'acides aminés acides de la MA interagit avec des acides aminés basiques présents sur le
domaine cytoplasmique d'ICAM-1 et sont responsables de son incorporation. En résumé,
nos résultats apportent de nouvelles connaissances dans le mécanisme moléculaire régissant
l'acquisition d'ICAM-1, une molécule de l'hôte connu pour renforcer l'infectiosité virale et
moduler la pathogénèse du VIH-1.
v
Table des matières Résumé .............................................................................................................................................. iii
Table des matières ............................................................................................................................. v
Liste des illustrations ....................................................................................................................... ix
Liste des tableaux ............................................................................................................................. xi
Liste des abréviations ..................................................................................................................... xiii
Avant-propos ................................................................................................................................. xvii
Remerciements .............................................................................................................................. xvii
Contributions scientifiques ............................................................................................................ xix
Introduction ....................................................................................................................................... 1
Chapitre 1 : Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) ................................... 1
1.1. Origine des VIH et VIS ....................................................................................................... 4
1.2. L'infection par le VIH-1 ...................................................................................................... 5
1.3. Premiers cas documentés .................................................................................................... 5
1.4. Classification ....................................................................................................................... 6
1.5. Organisation génomique et morphologique ........................................................................ 7
1.6. Les protéines virales ............................................................................................................ 9
1.6.1. Group-specific antigen (Gag) ...................................................................................... 9 1.6.2. Matrice (MA) ............................................................................................................ 10 1.6.3. Capside (CA) ............................................................................................................. 11 1.6.4. Nucléocapside (NC) .................................................................................................. 13 1.6.5. Domaine tardif (p6) ................................................................................................... 14 1.6.6. Gag-Pol ..................................................................................................................... 14 1.6.7. Protéase (PR) ............................................................................................................. 14 1.6.8. Transcriptase inverse (RT) ........................................................................................ 15 1.6.9. Intégrase (IN) ............................................................................................................ 15 1.6.10. Enveloppe (Env)........................................................................................................ 16 1.6.11. Protéines virales régulatrices ..................................................................................... 18 1.6.12. Protéines virales accessoires ..................................................................................... 18
1.7. Tropisme viral et corécepteurs .......................................................................................... 20
1.8. Le cycle réplicatif .............................................................................................................. 23
1.8.1. Les étapes précoces ................................................................................................... 23
vi
1.8.2. Les étapes tardives ..................................................................................................... 29 1.9. Encapsidation du génome viral ..................................................................................... 34
1.10. Transport des composants viraux au site d'assemblage ................................................. 36
1.11. Acquisition de l’enveloppe virale .................................................................................. 39
1.12. Libération des particules virales .................................................................................... 41
1.13. Modèle de fission membranaire .................................................................................... 44
1.14. Maturation des virions ................................................................................................... 45
1.14.1. Protéolyse séquentielle de Gag .................................................................................. 45 Chapitre 2 : La pathogenèse virale et traitement ......................................................................... 49
2.1 La pathogenèse .................................................................................................................. 49
2.2. Le traitement antirétroviral ................................................................................................ 52
Chapitre 3 : L’incorporation des molécules de l'hôte par le VIH-1 ........................................... 55
3.1. Identification des protéines étrangères acquises par le VIH-1 .......................................... 55
3.2. Mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte ....................................................... 58
3.3. Principales protéines de l'hôte incorporées par le VIH-1 .................................................. 61
3.3.1. ICAM-1 ..................................................................................................................... 62 3.3.2. HLA-II ....................................................................................................................... 63 3.3.3. Autres molécules de surface ...................................................................................... 63 3.3.4. La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) ............................................................... 64 3.3.5. INI1/HSNF5 .............................................................................................................. 64 3.3.6. APOBEC3G .............................................................................................................. 65 3.3.7. Cyclophiline A (CypA) ............................................................................................. 65 3.3.8. Le cytosquelette d'actine ........................................................................................... 65 3.3.9. Les tétraspanines ....................................................................................................... 66
Chapitre 4 : L'interaction entre ICAM-1 et LFA-1 ..................................................................... 67
4.1. Les Intégrines .................................................................................................................... 67
4.1.1. Les gènes de LFA-1 .................................................................................................. 67 4.1.2. Structure de LFA-1 .................................................................................................... 68
4.2. La superfamille des Immunoglobulines ............................................................................ 69
4.2.1. Gène ICAM-1 ............................................................................................................ 70 4.2.2. Structure ICAM-1 ...................................................................................................... 70 4.2.3. ICAM-1 en tant que molécule de co-stimulation ...................................................... 72
vii
4.2.4. La signalisation dépendante d'ICAM-1 ..................................................................... 72 4.2.5. ICAM-1 et les radeaux lipidiques ............................................................................. 74
4.3. Mécanisme et fonction de l'interaction ICAM-1/LFA-1 ................................................... 75
4.4. Les pathologies associées aux molécules de surface LFA-1 et à ICAM-1 ....................... 77
Chapitre 5 : Hypothèses et objectifs .............................................................................................. 79
Chapitre 6 : La production efficace de pseudo particules virales du VIH-1 à partir d'un vecteur d'expression de mammifère nécessite la présence du domaine N-terminal de la capside. ............................................................................................................................................. 83
Chapitre 7 : L'acquisition sélective d'ICAM-1 par le VIH-1 est dépendante du domaine de matrice............................................................................................................................................ 123
Chapitre 8 : Discussion, perspectives et conclusion ................................................................... 165
8.1. Caractérisation fonctionnelle des VLPs .......................................................................... 166
8.2. Capacité des VLPs à incorporer ICAM-1 ....................................................................... 168
8.3. Passage du modèle de VLPs au VIH-1 ........................................................................... 169
8.4. Stratégies d'entrée des peptides de pénétration cellulaire (CPP) ..................................... 175
8.5. Conception d’un peptide inhibiteur d'ICAM-1 couplé à des CCP .................................. 178
Bibliographie ................................................................................................................................. 181
Annexe : L'expression de la forme activée du LFA-1 à la surface des cellules cibles permet l'infection des virus ICAM-1 positifs par un mécanisme indépendant du CCR5. .................. 213
ix
Liste des illustrations
Figure 1. Microscopie électronique de virus produits à partir de lymphocytes. ................................. 3 Figure 2. Organisation génomique du VIH-1 ..................................................................................... 7 Figure 3. Organisation morphologique de virion ................................................................................ 7 Figure 4. Le précurseur protéique Pr55Gag . ......................................................................................... 9 Figure 5. Structure 3D de la matrice du VIH-1. ................................................................................ 10 Figure 6. Structure 3D de la capside du VIH-1 ................................................................................ 11 Figure 7. Structure 3D de la nucléocapside....................................................................................... 13 Figure 8. Étapes précoces du cycle viral. .......................................................................................... 23 Figure 9. Résumé de l'entrée du VIH-1. ............................................................................................ 26 Figure 10. Étapes tardives du cycle réplicatif. .................................................................................. 30 Figure 11. Structure et modélisation 3D de la capside mature. ......................................................... 33 Figure 12. Structure secondaire de la région 5' de l'ARN du VIH-1. ................................................ 35 Figure 13. Transport et assemblage de Pr55Gag à la membrane. ....................................................... 38 Figure 14. Modèle du «myristyl switch». ......................................................................................... 40 Figure 15. Résumé de la machinerie de bourgeonnement ESCRT. .................................................. 44 Figure 16. Représentation des étapes de maturation du VIH-1. ........................................................ 47 Figure 17. Cinétique d'infection. ....................................................................................................... 50 Figure 18. Méthodes de détection de protéines cellulaires présentes sur le VIH-1. ......................... 57 Figure 19. Mécanismes d'incorporation potentielle des protéines de l'hôte par le VIH-1. ................ 61 Figure 20. Les trois états conformationnels des intégrines. .............................................................. 69 Figure 21. Représentation schématique d'ICAM-1. .......................................................................... 70 Figure 22. Modèle d'oligomérisation d'ICAM-1. .............................................................................. 71 Figure 23. ICAM-1 et signalisation. ................................................................................................. 73 Figure 24. Structure simplifiée des radeaux lipidiques.. ................................................................... 74 Figure 25. Mécanismes d'entrée des CPP dans la cellule. ............................................................... 177
xi
Liste des tableaux
Tableau 1. Corécepteurs du VIH-1, VIH-2 et VIS ............................................................................ 22 Tableau 2. Liste non exhaustive des CPP ....................................................................................... 175
xiii
Liste des abréviations
ABCE1 ATP binding cassette E1 ADN Acide désoxyribonucléique ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire AP Activator protein APOBEC3G Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalytic Polypeptide-like-3G ARN Acide ribonucléique ARNt Acide ribonucléique de transfert ARV AIDS-associated retroviruses ATP Adénosine-5'-triphosphate BCL-2 B-cell lymphoma 2 CA Capside Ca2+ Ion calcium CD4BS CD4 binding site CDC Centers for disease control CHMP Chromatin modifying proteins CPA Cellule présentatrice d’antigène cSMAC Central supramolecular activation clusters CT C-tail CTD C-terminal domain CTL Cytotoxic T lymphocyte CypA Cyclophiline A DIS Dimerization initiation site dNTP Désoxyribonucléotide EF1-α Elongation factor-like alpha EIF4G Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma Env Enveloppe ESCRT Endosomal sorting complexes required for transport Gag Group-specific antigens GM1 Ganglioside 1 GRID Gay-related immune deficiency HR Heptad repeat helice HRS Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate HSI Hematopoietic lineage cell-specific protein 1 HSP70 Heat shock protein 70 HTLV Human T lymphotropic virus
xiv
ICAM-1 Intercellular adhesion molecule type 1 IFNα Interféron alpha IGSF Immunoglobulin superfamily IN Intégrase INI1 Integrase interactor 1 ITIM Immunoreceptor tyrosine based inhibition motif JAM-1 Junctional adhesion molecule 1 kDa Kilodalton LAD Leukocyte adhesion deficiency LAV Lymphadenopathy associated virus LEDGF Lens epithelium-derived growth factor LFA-1 Leukocyte function associated-1 antigen LTR Long terminal repeat MA Matrice Mac-1 Macrophage-1 antigen MADCAM Mucosal vascular addressin cell adhesion molecule MIDAS Metal ion dependent adhesion site MHR Major homology region MPER Membrane proximal external region MSD Major splice donor MVB Multivesicular bodies NC Nucléocapside NEF Negative regulatory factor NFAT Nuclear factor of activated T cell NF-κB Nuclear factor kappa B NRE Negative regulatory element NSI Non-syncytium-inducing NTD N- terminal domain PABP Poly(A)-binding protein PBS Primer binding site PECAM Platelet endothelial cell adhesion molecule pH Potentiel hydrogène PHA Phytohémaglutinine PIC Pre-integration complex PKC Protéine kinase C PIP2 Phosphatidylinositol-biphosphate PBMC Peripheral blood mononuclear cell Pol Polymérase PR Protéase pSMAC Peripheral supramolecular activation clusters RER Réticulum endoplasmique rugueux
xv
REV Regulator of expression of virion proteins RMN Résonance magnétique nucléaire RT Reverse transcription RTC Reverse transcription complex SH Src homology domain SHP-2 SH2–containing protein tyrosine phosphatase 2 SI Syncytium-inducing SIDA Syndrome de l’immunodéficience humaine acquise SL Stem loop SP1 Spacer peptide 1 SP2 Spacer peptide 2 SRC Sarcome de souris STAT Stransducers and activators of transcription TAF TBP (Tata binding protein) associated factor TAR Tat responsive region TAT Trans-activator of transcription TCR T cell receptor TEM Tetraspanin enriched microdomain TI Transcriptase inverse TIP-47 Tail-interacting protein 47 7TM 7 Transmembrane domain TMD Transmembrane domain TRIM Tripartite motif TSG101 Tumor susceptibility gene 101 U3 Unique 3' sequence UEV Ubiquitin E2 variant UNG2 Nuclear uracil-DNA glycosylase UTR Unstranslated regions VCAM Vascular cell adhesion molecule 1 VIF Viral infectivity factor VIH Virus de l’immunodéficience humaine VIS Virus de l’immunodéficience simienne VLP Virus-like particle VPR Viral protein R VPS Vacuolar protein sorting VSV-G Vesicular stomatitis virus G glycoprotein ZAP70 Tyrosine kinase ζ-associated protein-70
xvii
Avant-propos
Remerciements
Mes premiers remerciements sont adressés aux Drs. Benoit Barbeau, Louis Flamand et Caroline Gilbert pour avoir accepté d’évaluer ma thèse dans un délai relativement court. Je souhaite remercier mon directeur de thèse le Dr. Michel J. Tremblay de m’avoir accueilli si gentiment durant ces cinq années. Merci pour votre disponibilité, votre efficacité et votre humanité. Je voulais associer ces remerciements à mon co-directeur de thèse le Dr. Réjean Cantin qui, en plus du temps qu’il m’a accordé tout au long de ma thèse, m’a fait partager sa passion pour le golf. Ce qui fut une de mes plus belles découvertes au Québec. Merci Redge d’avoir pris le temps de corriger ma thèse pendant ton congé parental. Par la suite, et pour être sûr de n’oublier personne, un grand merci à l’ensemble des membres passés et présents de l’équipe MJT. Ainsi qu’aux personnels du CRI. Si je fais allusion au CRI que dire alors de mes amis du Bloc T. Un grand merci à mon ami de longue date Mathieu ainsi qu’à ses acolytes. J’ai dû venir au Canada pour trouver des Français qui pensent comme moi…
Une mention spéciale à mes amis de toujours Jo, Tony, Cyril et Jérémy qui m’ont manqué toutes ces années. Ne vous inquiétez pas les gars, je suis de retour.
Bien sûr, je veux remercier mes parents et ma sœur à qui je dois tout, et même plus, pour leur soutien inconditionnel, même s’ils n’ont jamais vraiment compris ce que je faisais à la fac et encore moins au doctorat. Vous avez toujours été là pour moi. Un grand merci à mes beaux-parents que je n’ai pas souvent vu ces dernières années, mais je suis ravi de faire partie de leur famille.
Finalement, mes derniers remerciements iront à ma fiancée Sandra pour avoir vécu loin des siens pendant mon doctorat et de m’avoir supporté au quotidien. Merci pour ce merveilleux cadeau que tu m’as fait en me donnant une fille. J’espère qu’elle sera un jour aussi fière de moi que je le suis d’elle. Je vous aime.
xix
Contributions scientifiques
Mes études de doctorat ont mené à la publication d'un article scientifique dans la
revue PLOS One en 2011, d'une déclaration d'invention, suivi d'un dépôt de brevet et de deux autres papiers en premiers auteur soumis en 2013.
Le premier article «Efficient Production of HIV-1 Virus-Like Particles from a Mammalian Expression Vector Requires the N-Terminal Capsid Domain » publié en 2011. Dans cet article, j'ai réalisé et conçu l'essentiel des expérimentations à l'exception des mutants de Pr55Gag qui ont tous été réalisés par Karine Turcotte et Alexis Danylo. Réjean Cantin m'a suivi dans ma démarche scientifique sous la supervision de Michel J. Tremblay. Karine Turcotte a écrit la partie «Pr55Gag molecular construct» du matériel et méthode. J'ai effectué l'analyse des résultats et rédigé l'article. Réjean Cantin et Michel J. Tremblay ont effectué la correction de l'article.
Le deuxième article «Selective acquisition of host-derived ICAM-1 by HIV-1 is a matrix-dependent process: consequences for subsequent course of infection and therapeutic approaches» a fait l'objet de la déclaration d’invention, d'un dépôt de brevet et est rédigé pour être potentiellement soumis à la revue scientifique PLOS Pathogens. Dans cet article, j'ai réalisé et conçu l'essentiel des expérimentations à l'exception de la partie de modélisation 3D et d'interactions des protéines réalisée par Halim Maaroufi. Réjean Cantin m'a suivi dans ma démarche scientifique sous la supervision de Michel J. Tremblay. Halim Maaroufi a réalisé la figure 5 ainsi que la description correspondante dans le matériel et méthode. J'ai effectué l'analyse des résultats et rédigé l'article. Réjean Cantin et Michel J. Tremblay ont effectué la correction de l'article.
Le troisième article «High affinity LFA-1 on HIV-1 target cells allows R5-tropic strains carrying cellular ICAM-1 to bypass CCR5 usage» a fait l'objet d'une soumission dans la revue scientifique Journal of Virology. Dans cet article, j'ai réalisé la totalité des expérimentations. Réjean Cantin m'a suivi dans ma démarche scientifique sous la supervision de Michel J. Tremblay. J'ai effectué l'analyse des résultats et rédigé l'article. Réjean Cantin et Michel J. Tremblay ont effectué la correction de l'article.
xxi
Citation «…»
À la mémoire de mes grands-parents…
1
Introduction
Chapitre 1 : Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)
À la fin des années 70 et au début des années 80, des médecins aux États-Unis ont noté une
augmentation de consultation quelque peu inhabituelle, où des jeunes hommes
précédemment en bonne santé venaient consulter pour des troubles immunologiques. Ce
nouveau syndrome est caractérisé par une lymphadénopathie généralisée, des infections
opportunistes (pneumonie à Pneumocystis carinii, rétinite associé au cytomégalovirus et
méningite à cryptocoque) ainsi qu'une variété de cancers non conventionnels de type
lymphome non Hodgkinien et sarcome de Kaposi [1]. Le dénominateur commun de ces
malades était une déplétion massive des lymphocytes T CD4+ dans le sang périphérique. Ce
n'est que le 5 juin 1981 que commence officiellement l'épidémie du Syndrome de
l’Immunodéficience Acquise (SIDA), lorsque le CDC note dans sa revue Morbidity and
Mortality Weekly Report une recrudescence de cas de pneumocystose chez cinq hommes
homosexuels à Los Angeles [2,3,4]. En raison du fait que la majorité des patients ont eu de
nombreuses relations sexuelles, il est suggéré en juin 1982 qu'un agent infectieux transmis
sexuellement pourrait être la cause de cette immunodépression, mais rien n'est vraiment sûr
à ce moment [5,6]. Comme les premiers malades sont exclusivement homosexuels, le
syndrome est appelé dans un premier temps le gay-related immunodeficiency disease
(GRID), mais les autorités sanitaires se rendent compte rapidement que d'autres populations
sont touchées, comme les hémophiles [7], les usagers hétérosexuels de drogues par
injection intraveineuse, ou encore des immigrants haïtiens [8]. En vue d'abandonner cette
dénomination erronée, le CDC créé le terme Acquired immune deficiency syndrome (AIDS)
ou en français le SIDA [9]. Dès le départ, l'origine virale est privilégiée, eu égard aux
modes de transmission alors identifiés (sanguin et sexuel). Robert Gallo et son équipe, qui
ont découvert le premier rétrovirus humain, le HTLV-1 [10], pensent qu'un mutant de ce
dernier est la cause du SIDA. Il justifie son hypothèse par le fait que le HTLV-1 fait
2
proliférer les T CD4+. Cet agent infectieux faisant l'inverse, une mutation peut donc en être
la cause. Cette hypothèse est renforcée par le fait que certains des cas haïtiens sont positifs
à un test de dépistage du HTLV-1. Cette positivité se révèlera être causée par un biais, car
la prévalence du HTLV-1 était très élevée en Haïti.
À partir de 1982, avec les premiers cas identifiés en France, la recherche française débute
sur ce sujet. Willy Rozenbaum, médecin à l'hôpital Bichat de Paris, veut inciter les
chercheurs à étudier plus en amont le SIDA et à en trouver la cause. Par l'intermédiaire de
Françoise Brun-Vézinet, une collègue médecin, Willy Rozenbaum contacte Jean-Claude
Chermann, Françoise Barré-Sinoussi et Luc Montagnier, de l'unité d'oncologie virale de
l'Institut Pasteur, qui disposaient des outils nécessaires pour étudier les rétrovirus. Ces
derniers acceptent de commencer les recherches. En 1983, après l'échec de Robert Gallo
dans sa tentative d'isoler le virus dans les échantillons sanguins de patients atteints du
SIDA. Willy Rozenbaum pense alors que chez les malades du SIDA, la plupart des cellules
infectées sont détruites et que c'est la raison du manque de résultats dans ces tentatives
d'isolement du virus. Il a alors l'idée de chercher le virus dans un organe riche en
lymphocytes, les ganglions lymphatiques de personnes malades mais qui ne sont pas encore
en phase de SIDA. En janvier 1983, suite au prélèvement d'un échantillon d'un patient
atteint d'une lymphadénopathie, pathologie identifiée comme une maladie opportuniste du
stade pré-SIDA. Cet échantillon est mis en culture par Françoise Barré-Sinoussi qui
découvre une activité de transcriptase inverse, confirmant la présence d'un rétrovirus. Une
apoptose apparaît et l'adjonction de globules blancs à la mise en culture relance alors
l'activité de transcriptase inverse. Un examen au microscope électronique a permis de
visualiser, pour la première fois, le virus, le 4 février 1983 (figure 1) [11].
3
Figure 1. Microscopie électronique de virus produits à partir de lymphocytes.
Adaptée de [11]
Après une prise de contact avec Robert Gallo, pour un échange d'informations, l'équipe de
l'Institut Pasteur confirme que le virus identifié chez le patient lymphadénopathique n'est
pas le HTLV-1. Ce nouveau rétrovirus est alors appelé Lymphadenopathy Associated Virus
(LAV) et les résultats sont publiés dans Science le 20 mai 1983 [11]. À ce stade, le lien
entre le LAV et le SIDA n'est pas clairement établi par l'équipe de Luc Montagnier. David
Klatzmann découvrent peu de temps après que le virus détruit les T CD4+ avec lesquels il
est mis en culture [12]. On savait que le nombre de lymphocytes T CD4+ diminuait
fortement chez les malades atteints du SIDA. Le LAV était donc sûrement l'agent
provoquant cette maladie. L'équipe de Robert Gallo publie le 4 mai 1984, dans Science, les
résultats de l'isolement d'un virus qu'elle considère comme responsable du SIDA et le
nomme HTLV-3, qui s'avérera, bien plus tard, provenir d'un échantillon envoyé par
l'Institut Pasteur [13]. L'équipe de Jay A. Levy à San Francisco fait de même le
24 août 1984 et trouve plusieurs rétrovirus, qu'elle nomme AIDS-associated retroviruses
(ARV) [14]. Pendant un temps, les trois dénominations HTLV-3, LAV et ARV
cohabiteront. En 1986, l’acronyme HIV (ou VIH en français) est choisi.
4
Le 18 juillet 1986, les résultats de l'étude d'un patient venant d'Afrique de l'Ouest sont
publiés, dans Science, par l'équipe de Luc Montagnier, en collaboration avec des médecins
portugais [15]. Les examens ont permis d'identifier un nouveau type de LAV, le LAV-2. Le
séquençage du nouveau virus est réalisé l'année suivante, ainsi que la mise au point d'un
test de dépistage. En 1986, le LAV (ainsi que les autres dénominations) est officiellement
renommé en virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le LAV-1 devient VIH-1 et le
LAV-2, le VIH-2.
1.1. Origine des VIH et VIS
Les deux types de VIH (VIH-1 et VIH-2) infectant l'espèce humaine dérivent des virus de
l'immunodéficience simienne (VIS), équivalents simiens des VIH [16]. Ainsi, certaines
souches de VIH-2 sont impossibles à distinguer des souches VIS retrouvées chez les
mangabeys de l'Ouest Africain et il existe une superposition parfaite des zones d'épidémies
humaines et simiennes pour le VIH-2. En 1990, une équipe suggérait que le VIH-1 avait
pour origine les populations de chimpanzés, se fondant sur l'organisation identique des
génomes des souches VIH-1 et des VIS retrouvées chez les chimpanzés [17]. En 1999,
l'origine simienne des souches humaines de VIH-1 était confirmée par la mise en évidence
chez des patients camerounais de souches extrêmement proches des VIS circulant chez les
chimpanzés de la même région.
L'analyse phylogénétique des lentivirus a confirmé le lien entre le VIS et le VIH.
Cependant, les deux types de VIH (VIH-1 et VIH-2) sont assez éloignés l'un de l'autre ; et,
alors que le VIH-1 est proche du VIScpz (infectant une sous-espèce de chimpanzés dits Pan
troglodytes troglodytes) [18], le VIH-2 est plus proche des VISsmm (infectant les mangabeys
couronnés) et des VISmac (infectant les macaques). Ainsi, le VIH serait issu de deux
introductions séparées, une pour le VIH-1 et une autre pour le VIH-2 [19].
5
L'infection par le VIH doit être considérée comme une zoonose, au même titre que d'autres
maladies virales. Le réservoir de VIS est particulièrement important : on a recensé dix-huit
espèces de singes infectés par des virus très différents sur le plan génomique et antigénique,
ce qui implique que de nouvelles souches pourraient infecter l'espèce humaine [19].
1.2. L'infection par le VIH-1
Le passage des différentes souches de VIS, du singe à l'Homme, peut être expliqué par le
fait que les singes sont souvent capturés pour servir de gibier ou d'animal de compagnie, et
des expositions à du sang contaminé, lors de morsures ou par blessures lors du dépeçage
des animaux peuvent expliquer comment ces virus ont infecté l'homme. C'est la théorie dite
«du chasseur de viande de brousse», qui a été retenue par la communauté scientifique. Bien
que généralement létal pour les virus, le franchissement de la barrière d'espèce, s'il réussit,
peut permettre au virus de muter et ainsi de s'adapter à son nouvel hôte [19]. La datation du
franchissement de la barrière des espèces n'est pas clairement définie, mais plusieurs études
font remonter l'apparition du VIH au début du XXe siècle [20], voire avant, soit entre 1884
et 1924 [21].
1.3. Premiers cas documentés
Le premier signe documenté d'infection par le VIH chez l'homme remonte à 1959, année où
une prise de sang est effectuée sur un homme à Léopoldville (l'actuelle Kinshasa), dans le
Congo belge [22]. Suivent alors plusieurs patients atteints de maladies rares (notamment la
maladie de Kaposi), aujourd'hui considérées comme maladies opportunistes dans les cas
d'infections par le VIH. Des tests VIH ont par la suite confirmé la présence du virus. En
1969, aux États-Unis, un adolescent de quinze ans meurt à l'hôpital de Saint-Louis
(Missouri) d'une forme particulièrement violente de maladie de Kaposi. Un test VIH est
6
effectué en 1987 par des chercheurs de l'université Tulane qui détectent la présence du
VIH-1 dans le sang de l'adolescent, confirmant ainsi les soupçons apparus dès 1984 [23].
Lors de son entretien avec les médecins, le garçon avait déclaré être né à Saint-Louis et
n'avoir jamais voyagé ou reçu de transfusion sanguine. Les médecins soupçonnaient le
garçon d'être un prostitué, ce qui soutiendrait la thèse d'une contamination sexuelle et
impliquerait l'existence d'un cas préalable aux États-Unis. En 1976, un matelot norvégien,
sa femme et leur fille de neuf ans meurent des suites du SIDA. Le matelot avait présenté les
premiers signes d'infection dès 1966, soit quatre ans après avoir séjourné dans des ports le
long des côtes de l'Afrique de l'Ouest [24,25]. En 1977, une chirurgienne danoise, le
Dr Grethe Rask, décède des suites du SIDA, après avoir séjourné au Congo dans les années
1970 [26].
1.4. Classification Le VIH-1 est classé en quatre différents groupes (M, N, O et P). Chacun de ces groupes est
le résultat d'événement de transmission entre espèces indépendantes. Le groupe M a été le
premier à être découvert. Il représente la forme pandémique du VIH-1, responsable de
l'infection de millions de personnes dans le monde. Il est virtuellement présent dans tous les
pays. Le groupe O, a été découvert dans le années 1990 et il est moins prévalent que le
groupe M [27,28]. En effet, il représente moins de 1% des infections au VIH-1. Il est
présent au Cameroun, Gabon et dans les pays voisins [29,30]. Le groupe N a été identifié en
1998 et il est encore moins prévalent que le groupe O [31]. Actuellement, on a recensé
uniquement 13 cas d'infection avec le groupe N d'individus vivant au Cameroun [32].
Finalement, le groupe P a été découvert en 2009 chez une Camerounaise vivant en France
[33]. En dépit d'une recherche intensive, on a recensé uniquement qu'un autre cas de groupe
P également au Cameroun [34]. Il existe neuf sous-types de VIH à l'intérieur du groupe M
(A-D, F-H, J et K). À l'échelle mondiale, c'est le sous-type C qui est le plus répandu.
Cependant, en Europe, en Amérique, au Japon et en Australie, c'est le sous-type B qui
domine [35].
7
1.5. Organisation génomique et morphologique
Figure 2. Organisation génomique du VIH-1
Adaptée de [36]
Figure 3. Organisation morphologique de virion
Adaptée de [37]
8
Le VIH-1 est un virus enveloppé d’un diamètre variant de 120 à 200 nm contenant deux
molécules d’ARN de polarité positive de 9200 nucléotides (figure 2) [38]. Il est composé
d’une bicouche lipidique provenant de la membrane plasmique de la cellule productrice
[39,40,41,42,43]. Toutefois, la composition de celle-ci est légèrement différente. En effet,
l’analyse des phospholipides de l’enveloppe du VIH-1, comparée à ceux des cellules
productrices, montre un enrichissement en cholestérol et en sphingolipides [44]. Dans cette
bicouche sont insérées les glycoprotéines de l’enveloppe (Env). Ces dernières sont
composées d’un trimère de sous-unités de gp120 et de gp41 reliées de façon non covalente.
La quantité moyenne de protéines d’enveloppe à la surface des virions a été estimée par
tomographie en microscopie électronique, à 14 trimères par particule [45]. Deux sortes de
particules du VIH-1 sont observées en microscopie électronique : les particules immatures
et les particules matures. Les particules VIH-1 sont produites par la cellule infectée sous
forme immature. Ces particules virales sont non infectieuses. En microscopie électronique,
elles se caractérisent par une couche dense aux électrons correspondant à l’accumulation de
précurseurs Gag et Gag-Pol organisés de manière radiale sous l’enveloppe virale. Le
nombre de précurseurs Gag est estimé à environ 2 500 pour un virion de 130 nm de
diamètre [46]. A la fin du bourgeonnement ou peu de temps après leur libération dans le
milieu extracellulaire, les particules du VIH-1 immatures sont converties en virus matures
et infectieux. La protéase virale (PR) est activée et permet la libération de la transcriptase
inverse (RT) et de l’intégrase (IN) à partir de la protéolyse du précurseur Gag-Pol. De plus,
le précurseur Gag subit un clivage en 5 sites libérant les domaines de la matrice (MA), de la
capside (CA), de la nucléocapside (NC) ainsi que les peptides SP1, SP2 et p6. Le virion
subit alors un réarrangement de sa structure interne aboutissant à sa forme mature visible en
microscopie électronique (figure 3). La face interne de la bicouche lipidique délimitant la
particule est tapissée par les protéines MA. Celle-ci renferme une capside de forme conique
formée par les protéines CA. L’analyse biochimique du contenu de la capside a permis de
mettre en évidence une structure appelée nucléocapside. Elle est constituée des deux copies
du génome ARN dimérisées liées aux protéines NC. La capside contient également les
enzymes libérées par la protéolyse du précurseur Gag-Pol : PR, RT et IN. Outre les
protéines de structures, le virion renferme également les protéines virales Vpr, Nef et Vif
9
[47], ainsi que de nombreux composants cellulaires dont les mieux caractérisés sont le
ARNtLys3 et la cyclophiline A.
1.6. Les protéines virales
1.6.1. Group-specific antigen (Gag)
Le gène viral Gag code pour une polyprotéine de 500 acides aminés (figure 4) [48]. Cette
protéine est conservée chez tous les rétrovirus et code pour les protéines structurales. Suite
au bourgeonnement, la protéine subit un processus de maturation clivée en de multiples
endroits par la protéase virale pour relâcher les protéines de structure du virus, décrites ici-
bas [49]. Ce processus est absolument nécessaire pour la création de particules infectieuses
matures [50]. Les virions immatures sont quant à eux incapables de procéder à la
décapsidation nécessaire pour libérer le génome viral dans le cytoplasme.
Figure 4. Le précurseur protéique Pr55Gag . Adaptée de [51].
10
1.6.2. Matrice (MA)
La MA est une protéine de 132 acides aminés composée de deux domaines de structure et
de fonction distinctes. Le domaine N-terminal forme une tête globulaire constituée de
quatre hélices-α qui intervient dans la liaison de la membrane plasmique grâce à son
groupement myristyl positionné en N-terminal (figure 5). Comme le domaine MA du
précurseur Gag, la partie N-terminale de la protéine MA mature est myristoylée par
l’enzyme cellulaire N-myristyltransférase [52]. Pourtant, la capacité de liaison de la
protéine MA à la membrane est moins efficace que celle du précurseur Gag. Ce phénomène
s'explique par un changement de conformation du groupement myristyl qui lui permet
d’être exposé dans le contexte du précurseur Gag et d’être séquestré dans le contexte de la
protéine MA [53]. La protéine MA cytoplasmique a un rôle important lors des étapes
précoces du cycle réplicatif du VIH-1, car elle assiste à des étapes d’import nucléaire du
complexe de préintégration (PIC) [54]. Le domaine C-terminal de MA est formé d’une
hélice-α projetée hors de la tête globulaire dont l’extrémité est non structuré [55]. Des
analyses cristallographiques [53,56,57] ont montré que MA forme préférentiellement des
trimères en solution et il semblerait que cette protéine s’assemble à la membrane sous
forme d’hexamères de trimères [58]. Les résidus 42 à 77 sont impliqués dans la
trimérisation de la protéine. Des mutations au niveau de ces résidus inhibent l’assemblage
de la particule virale.
Figure 5. Structure 3D de la matrice du VIH-1. Adaptée de [56].
11
1.6.3. Capside (CA)
Les protéines CA sont les composants majeurs de la capside virale dans la particule mature.
Celle-ci est composée d’environ 1500 molécules de CA [59] assemblées en réseau de 252
hexamères et de 12 pentamères [60]. La protéine CA monomérique est une protéine de 24
kDa composée de trois domaines : un domaine N-terminal (ou NTD), un domaine C-
terminal (ou CTD) et un domaine «linker» flexible reliant les domaines NTD et CTD
(figure 6). Le NTD, formé des résidus 1 à 145, est composé d’une structure en épingle à
cheveux-β, de 7 hélices-α et d’une boucle riche en résidus proline intervenant dans la
liaison de la protéine chaperon cellulaire cyclophiline A (CypA) [61].
Figure 6. Structure 3D de la capside du VIH-1
Adaptée de [62].
L’épingle à cheveux-β intervient comme un «interrupteur» moléculaire entraînant
l’hexamérisation des protéines CA en se repliant dans l’interface formée par les hélices 1 à
3, aidant ainsi à placer le domaine NTD sous sa configuration mature [63,64]. La région
linker, composée de six résidus, est non structurée dans CA monomérique. Toutefois, suite
à l’oligomérisation de CA, elle se replie en hélice 310 [65]. Cette région permet le
positionnement des NTD et CTD favorablement à l’assemblage de la capside virale
12
[65,66]. Le CTD, composé des résidus 151 à 231, est structuré en 4 hélices-α. C’est un
domaine très flexible [67,68] permettant à CA de modifier sa conformation sans
déstabiliser sa structure en réseau [69]. La protéine CA mature est stabilisée par trois
interfaces CA-CA intermoléculaires [70]. La première interface engage les trois premières
hélices du domaine NTD pour former un réseau de 18 hélices au centre de l’hexamère (ou
un réseau de 15 hélices pour les pentamères de CA). La deuxième interface lie les domaines
CTD entre protéines de CA d’hexamères (ou pentamères) adjacents. La troisième interface
permet la stabilisation des contacts des protéines de CA au sein d’un même hexamère (ou
pentamère) grâce à l’interaction de la quatrième hélice du domaine NTD avec le domaine
CTD de la protéine CA voisine. Les rôles respectifs de ces trois interfaces ne sont pas
encore strictement établis dans la détermination de la structure conique et de la géométrie
de la capside virale. Une simulation de la dynamique moléculaire assistée par informatique
a montré que les interactions NTD-NTD seules aboutissent à la formation d’une capside
tubulaire plate et que les interactions NTD-CTD sont indispensables à la structure en
coque. Ainsi, la force des interactions NTD-NTD détermine le degré de courbure des
extrémités de la capside [70]. Ce type d’interaction semble varier le long de son axe de
symétrie (figure 6) [71]. La capside est une structure dont la stabilité est finement régulée
lors des étapes précoces du cycle réplicatif. Le maintien de la morphologie de la capside
virale est essentiel car les mutants ayant une capside dont la morphologie est aberrante
perdent leur pouvoir infectieux lors des étapes précoces du cycle réplicatif [72,73]. De plus,
les virions ayant subi des modifications de la région N-terminale de CA, au niveau de la
boucle fixant la cyclophiline A (CypA), présentent un défaut des étapes d’initiation de la
transcription inverse [74,75]. CypA est une cis-trans-peptidyl-propyl isomérase [76]
possédant une activité de protéine chaperone dans les cellules [77]. Elle interagit avec la
boucle riche en proline de la partie N-terminale du domaine CA du précurseur Gag. Il a été
estimé qu’une protéine CypA est incorporée pour 10 précurseurs Gag [78,79,80]. CypA est
un facteur indispensable au pouvoir infectieux lors des étapes précoces du cycle réplicatif.
En effet, l’inhibition de l’incorporation de CypA par un traitement des cellules productrices
à la cyclosporine A (un inhibiteur de CypA), ainsi que par des mutations dans le motif de
fixation de CypA, entraîne une forte diminution du pouvoir infectieux des virus produits
[78,80] caractérisée par un défaut de la synthèse des premiers intermédiaires de l’ADN
13
proviral [74]. Bien que CypA intervienne dans le repliement des protéines, elle ne semble
pas être impliquée dans les étapes d’oligomérisation de Gag, ni dans la stabilité du virion
immature. En effet, la visualisation de virions comportant des mutations au niveau du motif
de fixation de CypA ne présentent aucun défaut de structure [81].
1.6.4. Nucléocapside (NC)
La protéine de nucléocapside (p7) est composée de 55 acides aminés et est fortement
associée aux deux molécules d'ARN viral présent dans chaque virus (figure 7) [82]. NC
facilite la dimérisation des molécules d'ARN virale ainsi que plusieurs étapes de la
transcription inverse (association de l'ARNt [83], initiation et élongation de la transcription
inverse, transfert de brin positif et négatif, déplacement de brin [84]) et de l'intégration. La
protéine jouerait aussi un rôle protecteur pour l'ADN viral suite à la transcription inverse
[85].
Figure 7. Structure 3D de la nucléocapside
Adaptée de [48].
14
1.6.5. Domaine tardif (p6)
La protéine p6 est composée de 52 acides aminés. Elle est située à la fin du précurseur Gag.
Elle est impliquée dans l'incorporation de la protéine accessoire Vpr à l'intérieur de la
particule virale [86] et dans le processus de bourgeonnement [87], notamment le
recrutement du complexe ESCRT de par son interaction avec la protéine Tsgl0l et ALIX
[88].
1.6.6. Gag-Pol
Cette protéine est produite suite à un changement de cadre de lecture du ribosome (-1) et
code pour une polyprotéine de 1451 acides aminés codant à la fois pour les protéines
structurales décrites précédemment et les protéines virales enzymatiques : protéase,
transcriptase inverse et intégrase. Le changement de cadre de lecture est causé par une
structure ARN secondaire et d'une «séquence glissante» composée de six résidus uridine
[89,90]; la polyprotéine Gag-Pol est produite avec un rapport de 1 pour 20
comparativement à Gag.
1.6.7. Protéase (PR)
La protéase virale est constituée de 99 acides aminés. Elle doit se libérer par auto-catalyse
du précurseur Gag-Pol avant de pouvoir cliver les autres composants enzymatiques et
structuraux. Le dimère ainsi libéré engendre une réaction en chaîne, clivant les autres sites
de clivage des précurseurs Gag-Pol présents à l'intérieur de la particule virale, menant à la
formation rapide de nouveaux homodimères [91]. Le processus de maturation se poursuit
jusqu'à ce que tous les précurseurs Gag soient clivés; la protéase est alors inhibée par
l'accumulation du peptide p6 libéré de Gag. La protéase ne reconnaît pas ses cibles selon
une séquence consensus, mais plutôt par des facteurs comme l'hydrophobicité, la
disponibilité spatiale et la structure secondaire. La protéase virale peut également cliver
certaines protéines cellulaires, dont des composantes du cytosquelette (ex. actine, laminine
15
et vimentine [92]), des protéines impliquées dans l'apoptose (Bcl-2 [93] et caspase 8 [94])
et dans la traduction des ARNm (EIF4G [95] et PABP [96]).
1.6.8. Transcriptase inverse (RT)
La transcriptase inverse est une enzyme de 560 acides aminés responsable de la conversion
de l'ARN génomique viral en ADN double brin pour l'intégration dans le génome de la
cellule hôte. Bien qu'étant libérée du précurseur Gag-Pol par la protéase virale suite au
bourgeonnement de la particule virale, la conversion du génome ne s'effectue qu'après les
étapes d'entrée et de décapsidation. La transcriptase inverse est en fait un hétérodimère
composé de deux sous-unités : p66 et p51 [97]. Les deux sous-unités contiennent un
domaine ADN polymérase ARN dépendant alors que p66 contient en plus un domaine
RNaseH [98]. Ce domaine est responsable de la dégradation de la portion ARN contenue
dans l'hybride ADN/ARN formé dans les étapes intermédiaires de la transcription inverse.
La transcriptase inverse ne contient aucune activité d'édition 5'—»3', ce qui se traduit par
une incapacité de corriger les erreurs introduites lors de la conversion du génome [99,100].
Par conséquent, le VIH-1 comporte un taux d'accumulation de mutations très élevé,
pouvant atteindre 10-3 à 10-4, soit une ou deux mutation(s) par cycle de réplication. Cette
lacune constitue dans certains cas un avantage pour le virus qui peut ainsi rapidement
développer les mutations nécessaires pour échapper au système immunitaire et aux drogues
antirétrovirales.
1.6.9. Intégrase (IN)
L'intégrase virale est composée d'une chaîne de 288 acides aminés et catalyse l'insertion du
génome viral (lorsque converti sous forme ADN double brin) avec le génome de la cellule
hôte. Le choix du site d'intégration ne semble pas suivre de règles strictes. Toutefois, il est
reconnu que les zones transcriptionnellement actives du génome sont favorisées [101].
L'intégrase est responsable de la catalyse de deux événements principaux, à savoir
l'excision de deux nucléotides à chaque extrémité 3' du génome viral [102] et l’insertion de
16
celui-ci dans le génome cellulaire. La forme active de l'intégrase est un homodimère [103];
des formes d'ordre supérieur sont hypothétiquement possibles (tétramère, octamère).
L'intégrase interagit avec la protéine cellulaire LEDGF pour se lier à la chromatine.
L'événement d'intégration occasionne des dommages à l'ADN et provoque une réponse
cellulaire en ce sens [104].
1.6.10. Enveloppe (Env)
Le gène Env code pour une polyprotéine de 856 acides aminés appelée gpl60 qui contient
les deux composantes de l'enveloppe virale, gpl20 et gp41. Les protéines de l’enveloppe
gp120 et gp41 sont libérées à partir du clivage du précurseur Env (ou gp160) synthétisé au
niveau des ribosomes associés au réticulum endoplasmique. Le précurseur Env est tout
d’abord synthétisé sous la forme d’une protéine de 90 kDa (p90) [105] possédant à son
extrémité N-terminale un peptide signal éliminé une fois entré dans le RE. Lors de son
transport jusqu’à la membrane plasmique, il subit d’importantes modifications. Il est
glycosylé et oligomérisé en trimère; on parle alors du précurseur gp160. Il contient dans sa
partie centrale un site de clivage reconnu par une enzyme cellulaire, la furine. La protéolyse
de gp160 génère les glycoprotéines d’enveloppe matures : la glycoprotéine de surface
gp120 et la glycoprotéine transmembranaire gp41. Ces deux protéines forment un
complexe relié par des interactions non covalentes.
Glycoprotéine 120 (gp120)
La première composante issue de gpl60 est une protéine de 483 acides aminés nommée
gpl20. Elle est responsable de l'interaction avec le récepteur CD4 [12,104] et corécepteurs
CXCR4 et/ou CCR5 [106,107,108,109] à la surface de la cellule. La gp120 contient 5
domaines relativement bien conservés (C1-C5) et 5 boucles variables (V1-V5) nommées
ainsi de part leur grande hétérogénéité génétique. Chacune de ces régions variables
possèdent une structure en boucle formée par un pont disulfure à sa base à l'exception de
V5. Ces boucles variables sont présentes à la surface de la gp120 et elles participent à
l'évasion immunitaire et à l'interaction avec les corécepteurs (V3) [110,111]. La préférence
17
pour l'un ou l'autre des corécepteurs est déterminé par la boucle V3 et influence grandement
le type cellulaire que le virus infecte. Cette région hypervariable est aussi la cible de la
plupart des anticorps neutralisants, de par son exposition à la surface de la molécule [111].
Des études de tomographie ont démontré que la gpl20 est retrouvée sous forme de trimère
[112] et est acquise à la particule virale par l'intermédiaire de gp41.
Glycoprotéine 41 (gp41)
La gp41 est une glycoprotéine transmembranaire d’environ 345 acides aminés organisée en
trois domaines majeurs : le domaine extracellulaire (ectodomaine), le domaine
transmembranaire (TMD pour Transmembrane Domain) et le domaine C-terminal appelé
CT (C-Tail). Le domaine extracellulaire contient les régions impliquées dans les étapes de
fusion dont la partie N-terminale hydrophobe appelée peptide de fusion [113], une région
polaire et deux régions hydrophobes (HR1 et HR2) en hélice-α. HR1 et HR2 sont liées
ensemble par la formation d’un pont disulfure avec une boucle hydrophile. Le peptide de
fusion est normalement caché dans la structure quaternaire gp120/gp41. Lors des étapes de
fixation des glycoprotéines d’enveloppe sur les récepteurs et corécepteurs cellulaires, la
gp41 change de conformation et expose le peptide de fusion au niveau de la membrane
cellulaire. Cette étape permet la formation du pore de fusion [112,114,115]. La région HR2
est suivie d’un domaine de 24 acides aminés, riche en tryptophane appelé Membrane
Proximal External Region (MPER) [116,117]. Cette région très conservée est indispensable
à la «fusogenécité» et donc au pouvoir infectieux du virus. Le TMD de la gp41 est une
petite séquence très conservée de 25 acides aminés. Deux modèles topologiques de la gp41
coexistent actuellement. Dans le premier modèle, le TMD constitué d’hélice-α traverse la
membrane plasmique une seule fois, plaçant le domaine CT dans la particule. Le deuxième
modèle, basé sur la reconnaissance d’épitopes par des anticorps neutralisants, propose que
le domaine TMD traverse trois fois la membrane et expose ainsi une partie du domaine CT
du côté externe de la membrane [118]. Le domaine CT est constitué en son centre de trois
segments amphiphiles en hélice-α appelés LLP-1, LLP-2 et LLP-3. La structure des
segments LLP est très conservée chez les lentivirus.
18
1.6.11. Protéines virales régulatrices
Transactivator of Transcription (Tat)
La protéine Tat est une protéine de 14-kDa, constituée de 86 acides aminés qui peut être
divisée en cinq domaines. Les domaines 1 à 3 sont essentiels pour son activité de
transactivation. Le domaine 4 permet sa liaison à l'ARN viral et sa localisation nucléaire
tandis que le domaine 5 contribue à l'infectiosité virale et est responsable des autres
fonctions de Tat. Les mécanismes d'action de Tat sont décrits en de plus amples détails
dans la partie du cycle réplicatif.
Regulator of expression of virion proteins (Rev)
La protéine Rev est une petite protéine de 13-kDa et de 116 acides aminés ayant deux
domaines fonctionnels. Elle est responsable de l'export des ARNm non-épissés et mono-
épissés [119,120]. Le domaine N-terminal est riche en arginine et permet la liaison
spécifique des ARNm viraux et sa localisation nucléaire. De chaque côté se trouvent des
séquences requises pour la multimérisation de Rev [121]. Le domaine C-terminal est riche
en leucine et contient le signal d'export nucléaire [122].
1.6.12. Protéines virales accessoires
Viral infectivity factor (Vif)
La protéine Vif contient 192 acides aminés et a été rapidement reconnue comme essentielle
pour la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T [123,124]. Toutefois, la permissivité
de certaines lignées cellulaires à l'infection par des virus déficients pour Vif laissait
supposer l'importance de l'interaction de Vif avec un facteur cellulaire [125,126]. Ce
facteur est la molécule APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic
polypeptide-like 3G) dont l'activité antivirale est neutralisée par Vif [127]. Pour ce faire,
19
Vif empêche l'incorporation d'APOBEC3G dans la particule virale en favorisant la
polyubiquitination de la molécule qui sera ainsi dégradée par le protéasome [128,129].
Viral Protein R (Vpr)
Le gène Vpr code pour une protéine de 96 acides aminés qui est incorporée dans la
particule virale [130,131] via son interaction avec p6 [132]. La protéine incorporée dans le
virion ou nouvellement synthétisée dans la cellule infectée possèdent divers propriétés : i)
par sa présence dans le PIC, Vpr facilite l'import nucléaire du PIC notamment lors de
l'infection de cellule quiescente comme les macrophages [133,134], ii) l'incorporation dans
le virion de l'uracil-DNA glycosylase 2 (UNG2) par Vpr diminue les erreurs induite par la
transcriptase inverse [135], iii) Vpr induit la mort cellulaire par arrêt [136] ou non [137] du
cycle cellulaire en phase G2 et iiii) Vpr participe à la trans-activation de gènes cellulaires et
viraux induisant une immunosuppression [138,139,140].
Viral protein unique (Vpu)
La protéine Vpu est une protéine membranaire de 81 acides aminés composée de 3 hélices-
α. Elle est exprimée à un stade tardif du cycle réplicatif et possède deux fonctions
principales. La première est de séquestrer le récepteur viral CD4 à l'intérieur de la cellule
infectée afin de le faire dégrader par le protéasome, empêchant ainsi la surinfection et
facilitant le bourgeonnement des virus produits [141,142]. La seconde est de bloquer
l'action de la tétherine qui empêche le bourgeonnement du virus [143]. La tétherine est une
protéine transmembranaire qui retient les virions nouvellement formés à la surface
cellulaire en absence de la Vpu [143,144]. Lorsque Vpu est présente, elle interagit avec la
tétherine pour induire sa dégradation et favoriser alors la libération des virions [145,146].
20
Negative Regulatory Factor (Nef)
La protéine Nef est une protéine d’environ 206 acides aminés qui peut subir plusieurs
modifications post-traductionnelles. Elle débute en N-terminal par une séquence très
conservée reconnue par la N-myristyl transférase dont le motif est MGXXXXS/T [147].
Lors de la réaction de myristoylation, la méthionine de cette séquence est éliminée. Cette
modification permet l’ancrage de la protéine Nef aux membranes de la cellule infectée.
L’étude de la localisation de Nef par fractionnement cellulaire, dans des cellules
transfectées, a montré que moins de 60% des protéines exprimées ont une localisation
membranaire et que la portion restante a une localisation cytoplasmique [148]. La protéine
Nef peut être clivée par PR au sein du virion, séparant le domaine d’encrage myristoylé du
domaine central de la protéine [149]. Le domaine central est constitué d’une boucle flexible
de 33 résidus en C-terminal qui permet des interactions avec différents facteurs cellulaires
via différents motifs de Nef [150]. Nef participe à la régulation de l'expression de surface
du CD4 et du CMH-I [151,152,153]. De plus malgré son nom, Nef augmente l'infectiosité
des virions et modules certaines voies de signalisation cellulaire [154].
1.7. Tropisme viral et corécepteurs Peu de temps après la découverte du CD4 comme étant le récepteur principal du VIH-1 et
du VIS, de nombreuses évidences se sont accumulées et ont indiqué que le CD4 n'est pas le
seul responsable pour que la fusion virale opère. En 1986, Maddon a montré que des
cellules murines exprimant le CD4 à la surface permettaient la liaison du virus mais ne lui
conféraient pas la possibilité d'entrée [155]. Les données de cette étude suggèrent alors que
les cellules murines n'expriment pas un cofacteur ou un corécepteur nécessaire à l'entrée du
VIH-1. Une observation majeure sur les différents isolats viraux ont permis de les classer
en deux groupes distincts dépendamment de leurs propriétés biologiques. En effet, en 1986
Asjo a été le premier à décrire ces deux groupes en fonction de leurs taux de réplication
dans les peripheral blood mononuclear cells (PBMC) (lent/faible vs rapide/élevé) [156].
Des rapports concordants en 1988 par Tersmette faisaient état de deux groupes de virus :
des virus d'un côté capables d'induire des syncytia (SI) et de l'autre côté incapable d'induire
21
des syncytia (NSI) [157]. Les travaux de Gartner en 1986 ont également confirmé
l’existence de virus infectant soit les macrophages (M-Tropique), soit les cellules T (T-
Tropique) [158]. Les différences entre les types d'isolats sont localisées essentiellement sur
la boucle V3 de la gp120 [159]. A partir de là, la communauté scientifique a admis que les
deux groupes de virus utilisaient différents corécepteurs à la surface pour entrer dans les
cellules cibles. En 1996, Berger et ses collaborateurs ont été les premiers à cloner le
corécepteur du VIH-1, le CXCR4 [109]. La co-expression du CXCR4 avec le CD4 dans les
cellules murines permettait la fusion des virus T-Tropique et SI mais pas ceux M-Tropique
et NSI. Depuis, plusieurs groupes ont identifié simultanément le CCR5 comme étant le
corécepteur pour les NSI [106,108,160]. Le CCR5 et le CXCR4 sont les deux corécepteurs
majeurs du VIH-1 et toutes les souches virales peuvent utiliser soit un (virus R5 et X4) soit
les deux (virus R5X4) pour rentrer dans les cellules T CD4+. Les virus R5 sont transmis dès
le début de l'infection et persistent tout le long de la maladie, alors que les virus X4
apparaissent tardivement dans la maladie et sont présent dans près de 50% des isolats chez
les personnes sidéennes. Le CCR5 et le CXCR4 sont tous les deux des membres de la
famille des récepteurs de chimiokine à 7 domaines transmembranaires (7TM). Plus d'une
douzaine d'autres 7TM on été reportés comme étant des corécepteurs dans des lignées
cellulaires T CD4+ pour des souches virales particulières (tableau 1). Ces corécepteurs sur
aussi des récepteurs de chimiokines ou apparentés. Actuellement, il existe peu d'évidence
sur le fait que ces corécepteurs jouent un rôle in vivo.
22
Tableau 1. Corécepteurs du VIH-1, VIH-2 et VIS
Corécepteurs Virus Références CCR1 VIH-2 [161] CCR2b VIH-1, VIH-2 et VIS [108] CCR3 VIH-1 et VIH-2 [107] CCR4 VIH-2 [161] CCR5 VIH-1, VIH-2 et VIS [162] CCR8 VIH-1, VIH-2 et VIS [163] CCR9 VIH-1 [164]
CXCR2 VIH-2 [165] CXCR4 VIH-1, VIH-2 et VIS [166] CXCR5 VIH-2 [167] CX3CR1 VIH-1 et VIH-2 [163]
GPR1 VIH-1, VIH-2 et VIS [168] CPR15 VIH-1, VIH-2 et VIS [168]
STRL33 VIH-1, VIH-2 et VIS [169] APJ VIH-1, VIH-2 et VIS [164]
ChemR23 VIH-1 et VIH-2 [170] RDC1 VIH-1, VIH-2 et VIS [171] BLTR VIH-1 [172]
CMV (US28) VIH-1 et VIH-2 [173]
Modifiée de [174].
Un certain nombre de corécepteurs alternatifs incluant CCR3, CCR8 et STRL33 sont
utilisés efficacement par certaines souches virales pour infecter des lignées indicatrices
[163,175,176]. STRL33 est exprimé dans le placenta et CPR15 dans le colon [177]. Par
conséquent, ces deux corécepteurs ont le potentiel de jouer un rôle lors de la transmission
maternelle et homosexuelle respectivement [176]. En effet, des isolats pédiatriques ont été
reportés comme étant capable d'utiliser le STRL33. ChemR23 est quant à lui exprimé sur
les cellules dendritiques et il est un candidat potentiel impliqué dans la transmission virale
[170]. Une étude récente à identifié une nouvelle mutation du CCR5 chez le Mangabey qui
lui permet d'utiliser le CXCR6, le GRP15 et GPR1 dans un contexte d'infection non
pathogénique du VIS in vivo [178], suggérant un éventail plus large de cellules
potentiellement cibles chez le VIS [179].
23
1.8. Le cycle réplicatif
1.8.1. Les étapes précoces
Figure 8. Étapes précoces du cycle viral.
Modifiée de [180].
Attachement et entrée L'entrée du VIH-1 est la première étape du cycle réplicatif. Elle commence par l'adhésion
du virus à la cellule hôte et finie avec la fusion des membranes virales et cellulaires qui
aboutit à la libération de la coque virale dans le cytoplasme. Ces événements dépendent
d'une série d'interaction protéines-protéines qui peut être divisée en plusieurs phases.
Certaines d'entres elles sont essentielles et d'autres servent à moduler l'efficacité du
processus d'entrée.
Tout d'abord, le virus doit se lier à sa cellule cible par l’intermédiaire de l'enveloppe virale
ou bien par les protéines membranaires cellulaires qu'il a incorporées. C'est le cas avec la
molécule ICAM-1 et son ligand lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1), mais
aussi de la sélectine-L et de son ligand CD62 exprimé à la surface des cellules
endothéliales. L'attachement peut être relativement non spécifique, comme l'interaction
d'Env avec les héparan sulfates chargés négativement présents à la surface cellulaire [181].
Elle peut être plus spécifique comme l'interaction entre Env et l'intégrine α4β7 ou le
24
dentritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-intergrin (DC-SIGN)
[182,183]. L'attachement du VIH-1 à la cellule hôte via l'ensemble de ces facteurs va
permettre à Env de s'approcher intimement du récepteur viral, le CD4 ainsi que des
corécepteurs favorisant l'infection [184]. Cependant, les facteurs d'attachement diffèrent des
récepteurs par le fait qu'ils ne sont pas essentiels à l'entrée. Bien qu'ils augmentent
l'infection in vitro, leurs rôles physiologiques in vivo n'est pas encore clairement établis.
La seconde étape de l'entrée du virus et la première absolument nécessaire à l'infection est
la liaison d'Env sur son récepteur primaire, la protéine cellulaire, le CD4 [155,185]. Env est
un trimère glycoprotéique hautement glycosylé constitué d'un hétérodimère de gp120 et
gp41. La sous unités gp120 est responsable de la liaison au CD4. Le CD4 est quant à lui un
membre de la super famille des immunoglobulines qui a comme fonction physiologique le
renforcement de la signalisation médiée par le T-cell receptor (TCR). Env va interagir avec
CD4 de part son site de liaison au CD4 (CD4bs) présent sur gp120. Cette liaison entraîne
un réarrangement de V1/V2 et par la suite de V3 [186]. De plus, la liaison au CD4 entraine
la formation d'un feuillet de relais ou «bridging sheet» qui est constitué de 4 feuillets β
organisées par paires antiparallèles et spatialement non reliées entre elles [187]. Le bridging
sheet et le repositionnement de la boucle V3 jouent un rôle critique dans l'accomplissement
des étapes subséquentes: le réarrangement des corécepteurs [187,188].
La troisième étape de l'entrée du virus, est la liaison au corécepteur (voir la section sur le
tropisme viral et les corécepteurs). C'est cette étape qui va activer la fusion membranaire.
La quatrième étape est la migration du virus au site de fusion. Une série de nouvelles études
ont montré que le virus détourne différentes voies de transport cellulaire pour atteindre des
régions membranaires spécifiques favorisant ainsi une entrée efficace et une infection
productive. Certains virus sont capables de glisser sur la membrane jusqu'à un site propice
favorable à son entrée. Enfin, le virus a souvent besoin d'être internalisé par la cellule hôte
par la machinerie d'endocytose pour permettre une fusion efficace [189,190,191]. On sait
depuis longtemps que l'entrée du VIH-1 s'effectue de manière pH indépendante, ce qui a
longtemps était perçu comme le signe d'une entrée par fusion à la surface membranaire
25
[192]. Toutefois le fait que le virus ne requiert pas une acidification du pH pour son entrée
n'implique pas forcement que la fusion s'effectue à la surface cellulaire. Bien au contraire,
l'endocytose du VIH-1 aurait un rôle majeur dans l'infection des T CD4+ [193]. En effet,
malgré que la plupart des virus internalisés par endocytose dans les T CD4+ soient
ultérieurement dégradés, la voie d'endocytose procure une voie d'entrée productive pour le
virus dans ce type cellulaire [193]. Cette voie aurait été longtemps sous-estimée, comme le
démontre l’étude de Miyauchi dans laquelle les auteurs concluent que la voie d'endocytose
est une voie d'entrée majeure pour le virus dans ces cellules [194]. De plus, des études in
vitro ont montré que la dissémination du VIH-1 d'une cellule à l'autre était plus efficace que
la transmission avec des particules libres [195,196]. Si on a d'abord cru que cette
observation était due à la formation de syncytia entre les cellules infectées et les cellules
avoisinantes [196], il est maintenant établi que la grande efficacité de transmission du virus
d'une cellule à l'autre serait plutôt due à la formation de synapses virologiques, des
structures adhésives intercellulaires formées entre les lymphocytes T CD4+ infectés et non
infectés [197]. Il a été démontré que les virus transférés d'une cellule à l'autre seraient
d'abord internalisés par endocytose [198] par une voie dépendante des molécules de
clathrine et de dynamine [199]. Ce mécanisme de transfert donne de nombreux avantages
au virus; il a notamment été démontré que celui-ci était beaucoup moins sensible à l'action
des anticorps neutralisants lorsqu'il était transmis par ce mécanisme plutôt que sous sa
forme libre [200].
La cinquième et dernière étape de l'entrée du virus est la fusion membranaire médiée par
Env. L'interaction de la gpl20 avec son corécepteur produit un deuxième changement de
conformation qui permet l'exposition de l'ectodomaine de la gp41 (forme fusogénique).
Sous cette conformation, les domaines HR 1 et 2 de la gp41 sont exposés et le peptide de
fusion est inséré dans la membrane plasmique. Cet intermédiaire est sensible à l'action des
inhibiteurs de fusion. La gp41 effectue finalement un dernier changement conformationnel
lui permettant d'adopter une structure en épingle. Il y a ensuite hémifusion et formation du
pore de fusion (figure 9) [201,202].
26
Figure 9. Résumé de l'entrée du VIH-1. Adaptée de [202].
Décapsidation
Les mécanismes de la décapsidation sont encore peu documentés car difficiles à étudier. En
effet, à cause de l’absence de détection de la capside dans le cytoplasme en microscopie
électronique, et de l’absence de la protéine CA dans les complexes de transcription inverse
(RTC reverse transcription complex) purifiés, il a tout d’abord été suggéré que la
décapsidation avait lieu immédiatement après les étapes de fusion, à proximité de la
membrane plasmique.
Un deuxième modèle de décapsidation a ensuite été proposé, indiquant que la capside reste
intacte durant une courte période après son entrée dans le cytoplasme et que la
décapsidation se déroule graduellement durant le transport et les étapes de transcription
inverse. Des expériences de purification de RTC à partir de cellules infectées ont montré
que ces complexes contiennent des quantités variables de protéines de CA
[203,204,205,206]. La décapsidation serait déclenchée par des changements successifs de
l’environnement cellulaire, permettant le contact avec différents facteurs cellulaires
nécessaires à la transcription inverse.
Un dernier modèle de décapsidation propose que la capside reste intacte durant son trafic
jusqu’au pore nucléaire, où auraient lieu les étapes de la transcription inverse. Ce modèle
suggère que l’intégrité de la capside préserve l’échappement de RT du complexe viral et
que la transcription inverse est facilitée au voisinage du pore nucléaire par une
27
concentration plus forte de dNTP dans cet environnement que dans les autres régions du
cytoplasme [207].
A l’heure actuelle, aucun de ces trois modèles n’a été véritablement validé. Une
décapsidation totale directement après la fusion, telle qu’elle est proposée dans le premier
modèle, ne permet pas d’expliquer le faible pouvoir infectieux des particules dont la
morphologie est modifiée et semble peu propice au trafic du RTC par le cytosquelette
d’actine. De plus, elle est en désaccord avec les expériences mettant en évidence les
facteurs de restriction TRIM qui ont permis de montrer la persistance de la capside dans le
cytoplasme. L’analyse des RTC purifiés peut présenter de nombreuses erreurs dues à la
sensibilité de ces complexes vis-à-vis des tampons d’extraction utilisés. La faible quantité
de protéines CA liées au RTC, comme proposé dans le deuxième modèle, pourrait être liée
à une perte de protéines lors de l’extraction des RTC. Les récentes visualisations en
microscopie électronique des RTC immunomarqués aux abords des pores nucléaires ne
permettent pas de distinguer nettement l’intégrité de la capside à cette localisation,
suggérant que la décapsidation pourrait être partielle avant l’arrivée au pore nucléaire. De
plus, l’utilisation de virus pseudotypés avec la glycoprotéine G du virus de la stomatite
vésiculaire (VSV-G) lors de ces expériences ne permet pas de valider le modèle étudié dû
au contournement des voies d’entrée par les particules.
Transcription inverse Le RTC est constitué de deux molécules d’ARN viral (ARNv), l’ARN de transfert lysine 3
(ARNtLys3) qui sert d’amorce à la RT, la RT, l’IN, la MA, la NC et la protéine accessoire
Vpr. La transcription inverse, étape qui convertie l’ARN en ADN est un processus
hautement régulé. Chez les rétrovirus, l’initiation requiert l’appariement de dix-huit
nucléotides en extrémité 3’ de l’ARNt cellulaire à une région spécifique appelée Primer
Binding Site (PBS), située près de l’extrémité 5’ de l’ARN génomique [208,209,210]. Dans
le cas précis du VIH-1, il existe une forte pression de sélection qui fait en sorte que l’ARNt
utilisé est l’ARNtLys3. Une fois l’ARNt hybridé, la RT synthétise une copie d’ADN
complémentaire (ADNc) puis, à l’aide de son activité RNase H, dégrade le brin d’ARN
résiduel et termine la synthèse de l’ADN proviral en synthétisant le second brin [211].
28
Intégration
Une fois à l'intérieur du noyau, l'ADN viral s'intègre dans le génome de la cellule hôte par
l'intermédiaire de l'IN qui se lie à la fin de l'ADN viral [54]. L'IN retire quelques
nucléotides de l'ADN viral, coupe l'ADN génomique et y enlève des nucléotides afin de
catalyser la jonction entre l'ADN viral et le chromosome cellulaire. Cependant, dans
certains cas, l'ADN viral ne s'intègre pas et peut se retrouver sous trois formes. Il peut y
avoir la formation d'un cercle contenant deux LTR qui est le résultat de la ligature des deux
extrémités de l'ADN viral, la formation d'un cercle, mais avec seulement un seul LTR ce
qui correspond à la recombinaison homologue du génome viral ou bien encore l'ADN peut
rester linéaire [212]. Certaines données prouvent que ces formes de génomes viraux
retrouvées dans les T CD4+ quiescents mènent à la transcription des gènes Tat et Nef [213]
et peut aussi réguler l'expression du récepteur CD4 [214].
Transcription
Suite à l’intégration du génome viral, les gènes viraux sont transcrits par des processus
communs à la transcription des gènes cellulaires. La transcription des gènes viraux se
divise en deux phases distinctes. La phase initiale se produit immédiatement après
l'intégration et s'appuie uniquement sur des facteurs de transcription cellulaire. Elle permet
la transcription des gènes Tat, Rev et Nef. Toutefois, dans ce contexte, la transcription ne se
prolonge pas de façon suffisante pour générer de longs transcrits. Ceux-ci sont donc
générés au cours d'une seconde phase initiée suite à l'accumulation d'une quantité suffisante
du transactivateur viral Tat. La transcription du provirus est régulée par l’activation du LTR
en 5’ qui possède plusieurs séquences permettant la fixation des facteurs cellulaires
intervenant dans l’initiation de la transcription [215]. Ce promoteur comporte trois
séquences en tandem permettant la fixation de protéines cellulaires SP1 [216], une boîte
TATA [217] ainsi qu’une séquence initiatrice [218]. Chacun de ces trois éléments
participent de manière coopérative à la fixation du facteur d’initiation TFIID (Transcription
Factor IID) [215] associé à son cofacteur TAF (TBP [Tata Binding Protein] Associated
Factor). De plus, le LTR en 5’ contient deux séquences de fixation au facteur de
transcription NF-κB qui sont appelées séquences augmentatrices. Elles sont placées en
29
amont des trois séquences de fixation de SP1 et permettent la fixation des protéines de la
famille NF-κB [219] ou de NFAT [220]. La fixation de NF-κB est plus efficace que celle
de NFAT car elle se fait de manière coopérative avec la fixation de SP1 [221]. Ainsi, la
fixation des facteurs cellulaires au niveau du LTR en 5’ permet l’initiation de la
transcription caractérisée par la fixation de l’ARN polymérase II et par la synthèse d’une
courte chaîne d’ARN. Par la suite la transcription génère un grand nombre de transcrits
[222]. Ces transcrits peuvent être divisés en trois classes : i) les ARN non épissés
constituant l'ARN génomique ou les ARNm codant pour Gag et le précurseur GagPol, ii)
les ARN partiellement épissés qui codent pour Env, Vif, Vpu et Vpr et iii) les petits ARN à
épissage multiple qui codent pour Rev, Tat et Nef. Les transcrits partiellement épissés et
non épissés du VIH-1, en raison de la présence d'introns, sont exportés du noyau vers le
cytoplasme par un mécanisme de transport unique dirigé par la protéine virale Rev [223].
1.8.2. Les étapes tardives
La morphogénèse des particules virales peut être divisée en trois étages successives (figure
10) : l'assemblage qui se réfère à la formation du virion et où tout les composants viraux
sont incorporés; le bourgeonnement qui correspond au passage du virion au travers de la
membrane cytoplasmique et à l'acquisition subséquente de son enveloppe lipidique et
finalement, la maturation qui permet au virion de réarranger sa structure et de devenir
infectieux. Toutes ces étapes sont orchestrées par le précurseur polyprotéique Pr55Gag et ses
produits de maturation.
30
Figure 10. Étapes tardives du cycle réplicatif.
Adaptée de [37].
Multimérisation de Pr55Gag et formation des particules virales immatures Une particule virale immature est formée d'une structure sphérique composée d'environ
1200 molécules de Pr55Gag [224,225]. Pr55Gag est la seule protéine nécessaire à la formation
de VLPs [226,227]. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes
moléculaires d'interactions permettant sa multimérisation sont nécessaires pour tenter de
mieux comprendre le déroulement de l'assemblage viral.
Les techniques de cryo- et de microscopie électronique à haute résolution ont permis de
visualiser Pr55Gag au sein des VLPs immatures. Les molécules individuelles de Pr55Gag sont
organisées radialement [228,229,230]. L'extrémité N-terminale est associée à la membrane
et la partie carboxy-terminale pointe vers l'intérieur des particules. Les molécules de
Pr55Gag sont rangées côtes à côtes au sein d'un réseau multimérique de forme hexamérique
[224,231,232,233]. Pr55Gag apparaît sous forme d'anneau composé de quatre domaines
individuellement structurés; MA, CA NTD et CTD, NC séparés par des régions non
structurées. Malheureusement la structure tridimensionnelle de Pr55Gag n'existe pas, due en
partie à sa grande taille. Toutefois, les structures isolées de ses différents domaines sont
31
disponibles grâce à des études de cristallographie à rayon-X et de spectrométrie à
résonnance magnétique nucléaire (RMN) [56,61,65,234,235,236,237]. La combinaison de
ces structures avec les nombreuses études génétiques ont permis d'identifier plusieurs
régions tout au long de Pr55Gag impliquées dans sa multimérisation.
Matrice Une région de la matrice allant des résidus 54-68 qui correspond à l'hélice-α 4, est
impliquée dans l'assemblage [56,57,129,238,239,240,241]. Des substitutions d'acides
aminées localisés sur la partie hydrophobe de cette hélice abolissent partiellement
l'assemblage des particules virales. Ce défaut est corrélé avec l'incapacité de la MA a
former des trimères en solution [57]. Cependant, les interactions entres les trimères de MA
sont relativement faibles et une délétion de la MA n'empêche pas l'assemblage correct des
domaines en aval (CA, SP1 et NC) [242,243,244,245,246,247]. En conclusion, bien que la
MA peut jouer un rôle dans l'assemblage des particules virales, il n'est pas un déterminant
majeur. La MA intervient principalement dans le transport de Gag à la membrane ainsi que
dans l'incorporation d'Env. Ces deux points seront détaillés plus bas.
Capside et SP1 Les parties essentielles pour la multimérisation de Pr55Gag sont localisées dans le CTD ainsi
que dans la région SP1 [61,65,234,235,248]. A première vue, le NTD n'a pas de rôle
significatif dans l'assemblage du virion car sa délétion totale ne semble pas perturber la
production de VLPs. Cependant, quand le NTD est présent, des mutations ponctuelles dans
les hélices 4-6 diminuent fortement la production de particules virales, suggérant de ce fait
que cette région peut former des interactions faibles durant l'assemblage ou alors que ces
mutations peuvent désorganiser le repliement global de la CA [249]. De plus, il a été
proposé que les contacts NTD-CTD sont importants pour obtenir un assemblage correct
[250].
Le domaine CTD de la CA joue quant à lui, un rôle majeur dans la multimérisation de
Pr55Gag, en particulier de part sa capacité à former des dimères. Les dimères de CTD ont été
32
caractérisés à la fois en solution et en cristallographie [248,251]. La dimérisation s'opère au
niveau de deux hélices-α 9 parallèles. La déstabilisation de la zone de contact entre les
dimères induits par des mutations des résidus de l'hélice 9 (184, 185) déstabilisent en
grande partie les interactions intermoléculaires de Pr55Gag in vitro [61,248]. Notons que
l'assemblage des virions n'est pas complètement aboli par les mutations des résidus 184/185
[43,249,252]. Par conséquent, l'interface entre les dimères de CTD n'est pas le seul
phénomène mis en jeu dans le processus d'assemblage. Le CTD contient aussi la région
majeure d'homologie (MHR Major Homology region), une séquence de 20 acides aminés
hautement conservée parmi les rétrovirus [253]. Des études de génétique ont mis en
évidence que des mutations ponctuelles dans la MHR entraînent un défaut d'assemblage
majeur mais affectent également d'autres étapes du cycle réplicatif [254]. La contribution
structurale du MHR dans la formation du réseau de Pr55Gag n'est pas clairement identifiée,
si on se base sur le cristal de la CA, le MHR n'est pas situé au niveau de l'interface entre les
dimères, il forme plutôt un assemble complexe de liaison hydrogènes [248].
Les résidus présents à la base du CTD apparaissent importants pour obtenir une structure
ordonnée. La mutation de ces résidus diminue considérablement la production de particule
virale tout en n'empêchant pas complètement la multimérisation de Pr55Gag. Le
prolongement de cette région s'associe avec les 14 acides aminés de SP1, qui sont non
structurés et hautement flexibles [65,248,255]. Néanmoins, cette région est supposée
adopter une conformation en hélice-α qui recouvre les deux régions CA/SP1 [236,255,256].
La jonction CA/SP1 forme une région importante pour l'assemblage des virions. Des
mutations à la fois dans les résidus CTD de CA et dans le N-terminal de SP1 abrogent la
production de particule [249,257]. Cette jonction est responsable d'une forte interaction
entre les protéines Gag-Gag qui est une étape critique dans la formation d'un haut niveau de
multimérisation [57,257,258]. Les propriétés physiques de cette région, en particulier, le
motif charnière riche en Glycine présent dans la portion C-terminale située juste avant
l'hypothétique hélice-α, confère une flexibilité structurale à la molécule Pr55Gag lui
permettant ainsi de prendre une multitude de conformations, ce qui lui permet la formation
de multimères hautement ordonnés [259].
33
La protéine CA mature est stabilisée par trois interfaces CA-CA intermoléculaires (figure
11) (voir aussi la section sur la CA précédemment décrite). Durant l'assemblage, la CA se
lie à la CypA favorisant l'incorporation d'une quantité non négligeable de la molécule dans
les virions [78,80,260,261]. La CA interagit avec la CypA par l'intermédiaire d'une boucle
riche en Proline présente dans le NTD de la CA [61]. Bien que la fonction de cette liaison
ne soit pas complètement connue, il apparaît que cette association confère au virus une
protection contre le facteur de restriction cellulaire TRIM5α [262,263,264,265].
Figure 11. Structure et modélisation 3D de la capside mature.
A) Capside mature, les hexamères sont représentés en orange et les pentamères en beige. B) Structure en hexamère de CA. C) Structure en pentamère de CA. D) Interface structurel entre CANTD et CANTD. E) Structure détaillée de l’interface entre CANTD (orange) et CACTD (beige). F,G) structures alternatives des dimères de CTD. Adaptée de [51].
34
Nucléocapside Le domaine d'interaction (I) de Pr55Gag est localisé dans la NC et joue un rôle important
dans la multimérisation de Pr55Gag et par conséquent dans l'assemblage. La nucléocapside
possède deux motifs en doigt de zinc entourés par des séquences basiques [266,267]. Les
doigts de zinc bien que contribuant à l'encapsidation spécifique de l'ARN viral, ne sont pas
requis pour l'assemblage, ce qui n'est pas le cas des séquences hautement basiques qui
constituent l'essentiel du domaine I [268,269,270,271]. La NC, grâce à sa capacité à lier
l'ARN fournit un appui structural fondamental à Pr55Gag lui permettant de se multimériser
en créant un microenvironnement propice à l'interaction de protéines Gag-Gag
[269,272,273,274]. Dans le contexte d'une infection virale, la NC a une forte préférence
pour l'encapsidation d'ARNv pleine longueur. Cependant, si l'ARNv n'est pas disponible la
NC est capable d'interagir et d'incorporer d'autres acides nucléiques cellulaires de diverses
tailles pour permettre quand même l'assemblage [269,272,273,274].
1.9. Encapsidation du génome viral Durant l'assemblage, le virus immature incorpore deux copies pleines longueurs identiques
d'ARN viral qui se présentent sous forme dimérique. La formation de ce dimère dépend
d'une structure dite de «kissing-loop». L'incorporation d'ARNv n'est pas nécessaire à
l'assemblage mais est essentiel pour l'infectiosité du VIH-1. L'ARNv est spécifiquement
sélectionné lors du processus d'encapsidation. Ce processus est principalement du aux
interactions entres le domaine NC et l'extrémité 5' du génome viral dénommé, élément
d'encapsidation (E), ou site Ψ [275,276,277].
Nucléocapside et encapsidation La nucléocapside régule à la fois l'efficacité et la spécificité de l'encapsidation de l'ARN.
Les éléments responsables de l'encapsidation sont les deux doigts de zinc
[278,279,280,281,282,283]. Les doigts de zinc sont des motifs de type CCHC (Cys-X2-
Cys-X4-His-X4-Cys) et se lient fermement à l'ion Zn2+ in vitro et in vivo [266,284,285,286].
L’ion Zn2+ présent dans la NC promeut le repliement de deux structures articulées
35
indépendantes favorisant leurs rapprochements [236,266,267,287]. Les données de RMN
indiquent que la structure globulaire ainsi formée interagit directement avec l'ARNv
[288,289]. La délétion par mutagénèse de cette liaison zinc dépendante empêche
l'encapsidation d'ARNv et par conséquent abroge l'infectiosité. Il existe une différence
fonctionnelle entre les deux doigts de zinc; le premier joue un rôle proéminant dans
l'encapsidation. Bien que les doigts de zinc soient nécessaires pour l'encapsidation, ils ne
sont pas suffisants; les résidus basiques avoisinant et la région SP1 sont également
impliqués dans la liaison aux acides nucléiques [269,289,290,291,292,293].
Signal d'encapsidation viral (Ψ). Le segment d'ARN responsable de son encapsidation représente une centaine de
nucléotides de long et s'étend de la région 5' UTR (untranslated region) à la moitié 5' de
Gag [275,276,294]. Dans cette région on retrouve un signal d'encapsidation de 120
nucléotides désigné le site Ψ (figure 12), qui est impliqué dans le processus d'encapsidation
en formant une structure secondaire stable constitué de 4 motifs proches en tête d'épingles
1-4 (SL1, SL2, SL3 et SL4) [295,296,297,298].
Figure 12. Structure secondaire de la région 5' de l'ARN du VIH-1.
Adaptée de [48].
Les études de génétique suggèrent que ces quatre motifs jouent un rôle indépendant dans
l'encapsidation de l'ARN [294,296,297,298,299]. SL2 et SL3 sont les premiers acteurs
favorisant l'interaction de haute affinité avec les doigts de zinc de NC [288,289]. En plus de
ce rôle, SL2 possède une région MSD (major splice donor) fournissant un mécanisme
36
sélectif d'encapsidation de l'ARNv pleine longueur car les ARNv épissés sont dépourvus de
cette séquence [275,276,277]. SL1 et SL4 ne se lient pas à la NC avec une grande affinité
mais ont un rôle dans l'encapsidation de l'ARNv [300,301]. SL1 contient le site primaire
d'initiation de dimérisation (DIS) qui permet la dimérisation de l'ARNv et favorise son
incorporation [302]. SL4 à quant à lui un rôle dans l'interaction ARN-ARN en stabilisant la
structure tertiaire du site Ψ [300]. Un modèle a même été suggéré dans lequel la structure
tertiaire résultant de la formation du dimère SL1 est stabilisée par SL4 et va favoriser
l'exposition de haute affinité pour la NC de SL3 et de SL4 [300]. En dépit de l'importance
de SL1-SL4 dans l'encapsidation de l'ARN, la cartographie globale du signal
d'encapsidation est plus long que ce qu'il apparait et s'étend jusqu'à l'extrémité 5' de la
molécule et inclus d'autres éléments structurels comme TAR, la structure en épingle à
cheveu poly A et le PBS [275].
1.10. Transport des composants viraux au site d'assemblage L'assemblage des particules virales nécessite que tous les composants viraux soient présents
au site d'assemblage membranaire [303].
Transport de Gag Pr55Gag est synthétisé à partir de ribosomes libres dans le cytosol. Une fois traduit, il est
capable de se lier à la protéine motrice cellulaire KIF4 mais également à de nombreux
composants du système de transport vésiculaire [42,304,305,306]. Néanmoins, leur rôle
exact n'est pas encore tout à fait compris. Quoi qu'il en soit, Gag est dirigé à la membrane
sous forme monomérique soluble plutôt que sous forme polymérique [307,308,309,310].
Pr55Gag est replié sur lui-même formant un monomère compact. Sa polymérisation au site
de nucléation fait appel à la formation d'un complexe Gag-ARN. Il a été démontré que
l'ATPase cellulaire, ABCE1 est impliqué dans la stabilisation des intermédiaires
d'assemblage qui se lient à la membrane, même si nous n'en connaissons pas tous les détails
mécanistiques [311]. La visualisation directe des particules en cours d'assemblage et de
bourgeonnement a pu être réalisée en marquant les molécules de Gag avec un fluorochrome
37
et en les suivants par microscopie à haute résolution et en temps réel [310,312,313]. Ces
observations ont démontré que l'ARNv est sous forme dynamique en absence de Gag alors
que lorsque l'on surexprime Gag, une fraction de l'ARN devient tout à coup immobile au
site membranaire d'assemblage [310]. Le niveau de Gag à la membrane augmente
exponentiellement jusqu'à atteindre une phase de plateau. C'est à ce moment là que le
bourgeonnement commence. Le temps moyen d'assemblage pour une particule individuelle
est d’environ 10 minutes [312,313]. Notons que l'accumulation de Gag à la membrane
provient de sa réserve cytoplasmique plutôt que de la diffusion latérale de molécules de
Gag préexistantes à la membrane ou bien de Gag contenus dans des vésicules de transport
(figure 13).
Les déterminants viraux qui dirigent Pr55Gag à la membrane sont localisés dans le domaine
de la MA. Il existe un signal de liaison multiple (M) localisé dans la partie N-terminale de
MA. Une partie de ce signal est imputable à l'acide myristique lié de manière covalente à la
Glycine N-terminale de MA. Des études où la Glycine est mutée, ont montré que l'acide
myristique ne pouvait plus se lier à la MA, ce qui entraînait une interruption de
l'assemblage viral [240,314,315]. De plus, une région basique allant des résidus 17 à 30
fournit la seconde partie du signal de liaison membranaire [131,316]. A noter que des
substitutions alanine ponctuelles entre les résidus de MA 84 à 88 redirigent l'assemblage
viral de la membrane cytoplasmique vers les membranes intracellulaires des endosomes
tardifs ou MVB [240,258].
Le ciblage de Pr55Gag à la membrane est également dépendant de différents facteurs
cellulaires, dont notamment le phosphatidylinositol-4,5-diphosphate [PI (4.5) P2] [317]. Ce
lipide régule la localisation membranaire de plusieurs protéines cellulaires. L'altération du
niveau de PI(4.5)P2 entraîne une relocalisation de l'assemblage viral de la membrane
cytoplasmique aux endosomes tardifs/MVB [318,319,320,321]. La sous-unité δ du
complexe adaptateur de la clathrine AP-3, interagit directement avec la MA. AP-3 dirige le
transport des protéines cellulaires jusqu'au MVB [322]. Une perturbation de l'interaction
entre AP-3 et la MA empêche Pr55Gag de se lier au MVB dans les cellules HeLa, entraînant
ainsi une distribution diffuse et cytoplasmique de Pr55Gag [322,323,324].
38
Figure 13. Transport et assemblage de Pr55Gag à la membrane.
Adaptée de [43]. Transport des glycoprotéines d'enveloppe Le précurseur des glycoprotéines d'enveloppe ou gp160 est synthétisé par des ribosomes
associés au réticulum endoplasmique rugueux (RER) et devient une protéine intégralement
associée à la membrane de part son signal hydrophobe présent dans le domaine gp41. La
gp160 est transportée par le système de sécrétion à la membrane cytoplasmique. Des
analyses biochimiques démontrent que la longue queue intracytoplasmique participe à son
transport jusqu'aux radeaux lipidiques. Durant ce processus, la gp160 subit de nombreuses
modifications post-traductionnelles (glycosylation), oligomérisation en trimère, et
maturation via une protéase cellulaire de type furine qui le clive en forme mature
comprenant la gp120 et la gp41 [48,303,325].
Le complexe gp120/gp41 est rapidement internalisé après son transport à la membrane
cytoplasmique. Ce processus d'internalisation est en partie lié au motif Tyr-X-X-Leu
présent dans la queue cytoplasmique de gp41 [326,327]. Les motifs Tyr sont connus pour
réguler l'endocytose des protéines membranaires en liant la chaine µ2 du complexe associé
à la clathrine AP-2. C'est ce type d'interaction qui survient avec le domaine cytoplasmique
de gp41 [328,329]. Suite à son internalisation, le complexe gp120/gp41 est transporté au
compartiment endosomal/lysosomal. La queue cytoplasmique de gp41 est également
39
reconnu pour interagir avec le facteur tail-interacting protein of 47 kD (TIP47). Cette
interaction favoriserait le transport rétrograde d'Env des endosomes au réseau trans-golgien
et pourrait être impliqué dans l'incorporation d'Env par le virion [330]. L'enveloppe virale
n'est constituée que de 7 à 14 trimères de glycoprotéines par virion [45,331]. Ce nombre
relativement faible par rapport à d'autres rétrovirus comme par exemple le SIV (80 trimères
par virion) suggère que la distribution d'Env tout autour de l'enveloppe est peut être plus
organisée qu'il n'y parait, dans le but d'assurer une entrée optimale dans les cellules cibles
[45].
1.11. Acquisition de l’enveloppe virale Liaison de Gag à la membrane La liaison de Pr55Gag à la membrane cytoplasmique est due à un double signal de liaison
membranaire (M), composé de l'acide myristique en position N-terminale et d'un domaine
hautement basique localisé dans la MA. Des études structurelles ont montré que les résidus
basiques forment un agrégat à la surface des trimères de MA et sont orientés vers la
membrane, créant ainsi une surface potentielle de liaison avec la membrane de part des
interactions électrostatiques avec les groupements polaires des phospholipides chargés
négativement [56]. Plus récemment, des études de RMN ont mis en évidence que la MA est
capable de se lier à un phospholipide chargé négativement le PI(4,5) P2 présent
naturellement sur le feuillet interne de la membrane cytoplasmique [318,320,332]. La tête
polaire inositol et la chaîne acide gras 2' du lipide viennent se loger dans le sillon
hydrophobe de la matrice et les charges négatives des phosphates forment des ponts salins
avec les résidus basiques de MA, permettant la liaison de la MA à la membrane.
Ancre myristique de MA adopte deux états conformationnels (exposé ou séquestré) Le passage entre ces deux états s'appelle le «myristyl switch» (figure 14) [53]. Ce
changement conformationnel permet une fine régulation de la liaison membranaire de MA
[333,334]. Durant l'assemblage viral, la MA dans un contexte associé à Pr55Gag a besoin de
se lier à la membrane pour favoriser la multimérisation de Gag. Cependant, une fois sous
40
forme mature, la MA doit pouvoir se dissocier rapidement de la membrane dans les étapes
précoces post-infection pour préparer le prochain cycle d'infection. Par conséquent, l'ancre
myristique doit être exposé lorsque la MA est associé avec Pr55Gag pour promouvoir les
interactions hydrophobes avec la membrane et être dans une configuration séquestrée au
sein d'une cavité formée par la MA mature pour permettre sa dissociation de la membrane
lors de l'entrée du virus dans une nouvelle cellule [53,147,335,336,337].
Initialement, il a été proposé que la régulation du «myristyl switch» dépendait de l'état
conformationnel de la MA après l'action de la protéase virale [147]. Néanmoins, des études
structurales ont démontré que suite à la protéolyse de Gag, la matrice ne subit pas de
réarrangement significatif. Il apparaît alors que la régulation du «myristyl switch» dépend
de l'état multimérique de la protéine. Le myristate est séquestré sous forme monomérique et
exposé sous forme trimérique [53,338]. De plus, la liaison de la MA au PI(4,5) P2 favorise
l'exposition de l'ancre myristique et facilite ainsi sa liaison membranaire [320].
Figure 14. Modèle du «myristyl switch».
Adaptée de [37].
41
Incorporation des glycoprotéines d'enveloppe L'interaction entre la MA et le long domaine intracytoplasmique de gp41 sont à l'origine de
l'incorporation d'Env lors de l'assemblage viral [325,339,340,341,342]. Cette interaction
apparaît essentielle à l'incorporation d'Env lorsque les expériences sont faites sur des
modèles cellulaires physiologiques (ex. cellules T ou des macrophages dérivés de
monocytes). Cependant dans certaines lignées cellulaires (ex. HeLa et MT-4), la délétion
du domaine intracytoplasmique de gp41 n'a que peu d'effet sur son incorporation suggérant
que l'incorporation des glycoprotéines d'Env peut survenir de manière relativement non
spécifique [342]. Ces observations qui suggèrent que le domaine cellulaire de la gp41 est
plus ou moins important, laisse croire à l'implication de facteurs cellulaires dans le
processus d'incorporation d'Env. TIP-47 pourrait bien être un acteur clé car il se lie à la fois
à gp41 et à la MA (résidus 5-16), ce qui pourrait servir de lien entre Gag et Env durant
l'assemblage [343]. Néanmoins, nous ne savons toujours pas où et quand Gag et gp41
s'associent. En plus d'Env, l'enveloppe virale contient de nombreuses molécules cellulaires
à sa surface. Leurs importances dans l'assemblage ou le bourgeonnement du VIH-1 ne sont
actuellement pas établies. Ces protéines cellulaire incluent des protéines membranaires (ex.
ICAM-1 et HLA-DR) [344,345,346] mais également des protéines cytoplasmiques qui
peuvent être incorporées directement ou indirectement par des interactions avec Gag (ex.
actine, les protéines de liaison à l'actine, Cyclophiline A, ubiquitine et de nombreuses
protéines de liaison à l'ARN) [347].
1.12. Libération des particules virales Une fois assemblés, les virus doivent être libérés de leur cellule productrice pour pouvoir
infecter de nouvelles cellules. Un événement de fission membranaire apparaît à cette
occasion permettant la libération du virus de la membrane cellulaire. Pour faciliter cette
étape, le virus va détourner le système cellulaire de transport de vésicules à son avantage.
42
Domaines tardifs et recrutement de la voie ESCRT
Bien que Gag est responsable à la fois du recrutement des cofacteurs et de l'assemblage, le
virus va détourner la voie cellulaire ESCRT pour terminer sa polymérisation et catalyser sa
libération dans le milieu extracellulaire. D’un point de vue fonctionnel, les facteurs ESCRT
recrutés sont les mêmes que ceux nécessaires à la libération des vésicules dans la lumière
endosomale, ou bien ceux indispensables à la séparation de deux cellules filles lors de la
cytocinèse.
Le domaine p6 contient deux motifs tardifs qui se lient et recrutent divers facteurs du
système ESCRT [348,349,350,351,352]. Le principal PTAP se lie à Tsg101, une sous unité
du complexe hétérotétramérique ESCRT-I [348,350,351,353,354]. Chacun de ces quatre
résidus (Pro-Thr/Ser-Ala-Pro) établissent des contacts spécifiques avec l'extrémité N-
terminale ubiquitine E2 (UEV) de Tsg101 [355]. À noter que le motif PTAP est également
présent sur une protéine cellulaire capable de recruter ESCRT aux membranes
endosomales, soit HRS [356,357]. Par conséquent, le motif PTAP du domaine p6 mime le
signal de recrutement cellulaire d'ESCRT. Gag et HRS apparaissent tout deux comme des
adaptateurs spécifiques membranaires de la voie ESCRT [358].
Le second domaine tardif de p6, YPXL (Tyr-Pro-X-Leu, ou «X» varie en composition et en
longueur), se lie au facteur ALIX [352,359]. Le motif YPXL contribue significativement à
la réplication virale, mais il joue un rôle secondaire par rapport à PTAP [360,361]. Il existe
de nombreuses variations du motif YPXL, mais la tyrosine reste conservée. Elle vient se
lier dans une poche profonde du domaine ALIX V. Plus précisément, elle rentre en contact
avec tous les résidus hydrophobes du sillon adjacent [362,363]. Une fois de plus, le virus
mime un motif cellulaire utilisé par les ligands d'ALIX pour recruter la voie ESCRT [364].
Le domaine N-terminal d'ALIX Bro, interagit également avec la NC. Des mutants de la NC
peuvent entraîner un défaut de bourgeonnement, démontrant le rôle de la NC dans ce
processus [365,366]. Finalement, l'extrémité carboxy-terminale de la CA interagit avec
NEDD4L, un membre de la famille des ubiquitines ligases E3 (NEDD4). Bien que cette
interaction ne contribue que modestement au bourgeonnement viral, les membres de la
43
famille NEDD4 joue un rôle critique dans le bourgeonnement chez d'autres rétrovirus en
faisant une interaction directe avec le motif PPXY (Pro-pro-X-Tyr) [348,349,350,351,352].
Rôle et formation du système ESCRT Des études fonctionnelles récentes ont identifié la composition minimale de la machinerie
ESCRT nécessaire pour le bourgeonnement du VIH-1. Elle est constituée de
Tsg101/ESCRT-I et d'ALIX qui vont toutes les deux recruter les complexes ESCRT-III et
Vps4 lesquels vont organiser la fission membranaire et le recyclage des facteurs ESCRT.
Chez l'homme, on connait 12 protéines différentes reliées à ESCRT-III, qui sont divisées en
7 familles. Ces protéines partagent toutes une architecture commune avec un cœur en
position amino-terminal comprenant un faisceau de 4 hélices [367,368,369] et une queue
carboxy-terminale qui peut se replier et inhiber l'oligomérisation du cœur
[367,370,371,372]. Uniquement CHMP2 et 4 participent réellement au bourgeonnement du
VIH-1 même si un rôle mineur a été attribué à CHMP1 et 3 [373,374]. Toutefois, les
interactions d'ESCRT-I qui aboutissent aux recrutements de CHMP2/CHMP4 ne sont pas
claires. Heureusement, la partie concernant ALIX est plus détaillée. (1) La liaison du
domaine tardif à la protéine soluble ALIX induit un changement conformationnel ainsi que
sa dimérisation (forme active), ce qui lui permet de se lier à la membrane et de recruter
ESCRT-III [375,376]. (2) Une fois ALIX activée, le domaine Bro se lie à l'extrémité C-
terminale des hélices de CHMP4 [377]. (3) Cette interaction lève l'auto-inhibition de
CHMP4 et induit la polymérisation de la protéine sous forme de filaments
[375,376,378,379,380]. (4) Les filaments de CHMP4 vont ensuite être soit recrutés ou
copolymérisés avec la protéine CHMP2 [374,381]. (5) L'extrémité C-terminale de CHMP2
va se lier à un motif MIT de l'ATPase Vps4 [382,383,384]. (6) Le recrutement de Vps4 va
favoriser son assemblage en un complexe enzymatique hautement ordonné [385,386,387].
Vps4 prend une forme d'anneau hexamérique et l'activité enzymatique est constituée de
deux couches d'anneaux hexamériques superposées (figure 15) [388]. Chaque site de
bourgeonnement contient approximativement trois à cinq dodécaèdres de Vps4 [389] qui
peuvent être reliés ensembles par un pont moléculaire composé du complexe activateur
CHMP5/LIP5 [390].
44
Figure 15. Résumé de la machinerie de bourgeonnement ESCRT.
Adaptée de [37].
1.13. Modèle de fission membranaire Le mécanisme détaillé de la fission membranaire assuré par le système ESCRT fait toujours
l'objet de recherche intense et récemment certains aspects ont pu être élucidés. Les sous-
unités CHMP4 possiblement en association avec CHMP2 et d'autres protéines du complexe
ESCRT-III, forment des filaments en spirale tout autour du virus en bourgeonnement
[391,392,393,394,395]. Cette formation en spirale à l'intérieur génère des «dômes» qui
rapprochent les deux membranes opposées. Vps4 joue un rôle actif dans la fission
membranaire, car cette enzyme est recrutée très tôt au site de bourgeonnement et surtout
parce que le recrutement de ESCRT-III n'est pas suffisant à lui seul pour permettre la
libération de virions [379,380,396]. Les rôles potentiels de Vps4 sont de promouvoir la
création des dômes d'ESRCT-III et/ou d'enlever les sous-unités d'ESCRT-III lors de la
fission. Dans l'étape finale du cycle de fission, Vps4 hydrolyse l'ATP pour favoriser le
désassemblage des filaments d'ESCRT-III et favoriser ainsi les formes monomériques non
45
activées de Vps4 [373,380,381,389,391]. En d'autres termes, une partie de l'énergie
nécessaire au bourgeonnement viral est assurée par l'hydrolyse de l'ATP [385,392,395,397].
Le bourgeonnement et la libération de particules virales sont essentielles à la propagation
de l'infection virale. Il n'est donc pas surprenant que l'immunité innée ait évolué dans le but
de prévenir ces phénomènes. Il est maintenant clairement établi que la tétherine agit comme
une protéine antivirale qui bloque la dissémination des virions en les retenant piégés à la
surface des cellules hôtes. Malheureusement, l'action de la tétherine est inhibée par la
protéine virale Vpu [398]. Récemment, Leis et collaborateurs [399] ont démontré qu'une
protéine inductible par l'interféron (ISG-15) peut inhiber précocement la libération de
particules virales en interagissant avec l'activité des protéines du complexe ESCRT-III.
ISG-15 peut se lier de manière covalente avec le résidu lysine présent sur la chaîne latérale
d'ESCRT-III [400]. ISG-15 va séquestrer l'activateur de Vps4, le complexe CHMP5/LIP5
ce qui a pour conséquence de diminuer à la fois le recrutement et l'activité de Vps4
[399,401].
1.14. Maturation des virions
Durant ou juste après le bourgeonnement, Pr55Gag et Pr160Gag-Pol sont clivés pour former les
protéines virales matures par la protéase virale (PR) dans un processus de maturation. Tout
comme les virus immatures, les virus matures possèdent une matrice associée à la
membrane virale, la NC se condense avec les deux copies d'ARN viral, la CA qui s'est
réorganisée pour former une structure conique recouvrant le complexe ribonucléoprotéique
(RNP). Ce changement structural permet la maturation du virus, qui devient infectieux et
peut par la suite infecter une cellule cible et poursuivre son cycle réplicatif [303].
1.14.1. Protéolyse séquentielle de Gag
Les protéases rétrovirales, incluant la protéase du VIH-1, sont liées à la famille des aspartyl
protéases. Elles sont constituées d'un site actif composé de deux résidus aspartate au sein
d'un motif conservé Asp-Thr/Ser-Gly qui coordonne, avec une molécule d'eau, l'hydrolyse
46
de la liaison peptidique de la protéine cible. Une fois activée, la protéase se présente sous
forme dimérique où les deux sites catalytiques se font face. L'efficacité de clivage de PR est
finement régulée de façon séquentielle [402,403,404].
L'activation de la protéase doit s'effectuer au moment ou peu de temps après le
bourgeonnement de la particule virale pour éviter le clivage de Gag et un défaut
d'assemblage. La protéase n'est active que sous forme homodimérique; cependant, la
conformation du domaine correspondant à la protéase à l'intérieur du précurseur Gag-Pol
n'est pas favorable à sa dimérisation [303]. L'hypothèse la plus acceptée suggère que ce
n'est qu'une fois que les précurseurs sont accumulés à la membrane que le processus est
favorisé, permettant le clivage auto-catalytique de la protéase. La dimérisation et son
activation sont des fonctions étroitement liées et doivent être finement contrôlées pour
éviter une activité excessive ou prématurée qui serait néfaste pour le virion
[226,405,406,407]. Il a été suggéré que la concentration des molécules de Gag-pol au sein
des particules en cours d'assemblage est le mécanisme par lequel PR est activé [407].
Toutefois, les facteurs qui contrôlent l'activation de PR ne sont pas tous connus. Comme
PR fait partie du précurseur Gag-pol, l'initiation de la dimérisation survient lorsque Gag-pol
est sous la forme d'une polyprotéine. Par conséquent, son clivage initial est
intramoléculaire [408]. La protéase va être ensuite libérée du précurseur polyprotéique pour
former un homodimère de PR mature capable de cliver le précurseur en protéine mature. Le
processus protéolytique de Pr55Gag suit une série d'événements contrôlés par le taux de
clivage de chaque site individuel de Gag [52,409,410,411,412,413]. Le premier clivage
libère les fragments NC-SP2-p6 et MA-CA-SP1 qui sont par la suite clivés au niveau de
MA-CA et SP2-p6 et finalement CA-SP1 et NC-SP2 (figure 16).
47
Figure 16. Représentation des étapes de maturation du VIH-1.
Adapté de [414].
La régulation du clivage de Gag est essentielle pour la production de particules virales
infectieuses, car des mutations qui perturbent les sites de clivage ou l'altération de l'ordre du
site de clivage entraînent la formation de particules aberrantes qui ne sont pas ou peu
infectieuses [256,413,415,416,417]. En plus d'obtenir des protéines matures, chaque
évènement de clivage est associé à une fonction précise. Le clivage SP1/NC active Env et
promeut la condensation des complexes de RNP, la libération de SP2 induit l'activité
chaperonne de la NC, ce qui lui permet de stabiliser l'ARNv dimérique. Le clivage MA/CA
induit le désassemblage du réseau immature et libère CA-SP1, qui va être à son tour clivé
pour former des molécules de CA libres nécessaire à la formation de CA conique.
49
Chapitre 2 : La pathogenèse virale et traitement
2.1 La pathogenèse Le VIH-1 infecte et tue directement les cellules qui sont à la base d'une réponse immune
efficace. Suite à une interaction directe entre l'enveloppe virale et son récepteur cellulaire
CD4 et les corécepteurs de chimiokines CCR5 ou CXCR4, le virus infecte les cellules clés
de la réponse immune adaptative, ce qui explique les manifestations cliniques de la maladie
caractérisées par une profonde immunodépression. La progression de la maladie varie
énormément entre personnes infectées. Le délai entre l'infection dite aigue et le
développement du stade SIDA, défini par un nombre de cellules T CD4+ inférieur à 200
cellules/µl ou bien l'apparition d'infections opportunistes liées au SIDA, peut être très
rapide et survenir dans les 6 mois [418,419]. Néanmoins, d'autres personnes qui sont
infectées depuis plus de 25 ans sont capables de maintenir un niveau normal de
lymphocytes T CD4+ et ne présentent pas de déficience immune. Pourtant, ces personnes
n'ont jamais été traitées avec des médicaments anti-VIH-1. Encore aujourd'hui, une
explication claire sur ces différences dans la progression de la maladie n’est pas encore
connue. Toutefois, de nombreuses preuves suggèrent que les événements précoces au
moment de l'infection aigue en association avec des éléments génétiques de l'hôte et du
virus jouent un rôle déterminant sur la progression de la maladie [418,419].
50
Phases de l'infection
Figure 17. Cinétique d'infection.
Modifiée de [420].
L'infection par le VIH-1 est composée de trois phases (figure 17). Tout commence suite à
l'infection du virus par la phase aiguë, qui correspond à la primo-infection, suivie de la
phase chronique, qui est en général asymptomatique, et pour finir le, SIDA. Le stade de
l'infection peut être déterminé en mesurant le nombre de lymphocytes T CD4+ et la quantité
de virus présents dans le sang périphérique (charge virale).
La phase aiguë se déroule dès les premiers jours suivant l'infection et dure quelques
semaines. Pendant cette phase, le virus se réplique efficacement et est retrouvé en
abondance dans le sang périphérique ; les individus infectés sont donc très susceptibles de
transmettre l'infection [421]. Il se produit également une chute spectaculaire du nombre de
cellules T CD4+ circulants. C'est la population des cellules mémoires qui est la plus
touchée. Dans les étapes précoces de l'infection, plus de la moitié de l'ensemble des
lymphocytes T CD4+ mémoires sont ainsi éliminées [422]. Des études à la fois sur des
51
patients infectées par le VIH-1 et des modèles d'infection macaque au VIS, fournissent
d'importants nouveaux éléments sur le fait que l'infection aigüe soit aussi déterminante sur
la progression de la maladie [423,424,425]. L'infection et la déplétion d'une grande quantité
de cellules T CD4+ mémoires (repos et activées) dans l'intestin durant l'infection primaire
est assurément ce qui alimente le pic initial de virémie et définit des contraintes
subséquentes sur la réponse adaptative [423,426,427]. Des détails sur ce qui ce passe au
niveau cellulaire lors de l'infection aigüe viennent d'expériences réalisées principalement
chez le macaque. Chez le macaque, au moment de l'infection aigüe, il y a une infection
massive des tissus lymphoïdes associés au tube digestif où entre 30-60% des cellules T
CD4+ associées au tube digestif deviennent productivement infectés, menant ainsi à une
déplétion massive de ces cellules dans un délai de 4 jours [428]. Ces expériences chez le
macaque sont très certainement représentatives de ce qui se passe lors de l'infection aigüe
chez l'homme [425]. La plupart des cellules T CD4+ déplétées au niveau de la muqueuse
intestinale de l'homme lors de l'infection aigüe, sont des T auxiliaires qui produisent de
l’IL-17 [423,426]. Ces cellules sont essentielles au maintien de l'intégrité de la barrière
mucosale, et leur élimination par le VIH-1 entraîne une rupture de l'intégrité de la
muqueuse, ce qui permet la translocation de produits microbiens dans la circulation
générale. Ces produits sont en grande partie responsables de la suractivation systémique du
système immunitaire qui est un des caractéristiques de la pathogenèse du VIH-1. Cette
phase peut s'accompagner de symptômes similaires à ceux de la grippe ou de la
mononucléose (fièvre, douleurs musculaires, lymphadénopathie, pharyngite, rash) qui
peuvent perdurer de quelques jours à un mois [429]. Durant cette période, le virus se
propage de façon systémique. C'est également pendant cette période que se produit la
séroconversion.
La phase de latence débute à la suite d'une diminution du nombre de particules virales et à
une restauration partielle du nombre de cellules T CD4+ présents dans le sang périphérique
grâce à la réponse du système immunitaire [429]. Cette phase doit son nom à la quasi-
absence de symptômes qui y sont associés et peut durer de deux semaines à plus de 20 ans.
Elle ne correspond toutefois pas à une phase de latence virale. En effet, pendant cette
période, le VIH-1 est toujours actif dans les ganglions et le système immunitaire est en
52
constante activation [430]. Il en résulte une augmentation dans le temps du nombre de virus
plasmatiques accompagné d'une chute équivalente du nombre de cellules T CD4+
circulantes.
La phase du SIDA débute lorsque le compte de cellules T CD4+ devient très bas
(<200cellules/µl) et se caractérise par une déficience du système immunitaire qui mène à
l'infection par des pathogènes opportunistes (ex. Pneumocytis carinii, Mycobacterium
tuberculosa, Candida albicans, etc.) [431] et à l'apparition de cancers (sarcome de Kaposi
et lymphome des cellules B) [432]. Une forte proportion des gens atteints du SIDA
présente également des symptômes neurologiques (ex. troubles moteurs, cognitifs et
comportementaux) regroupés sous le terme de démence associée au VIH-1 [433]. Sans
traitement, les patients atteints du SIDA meurent généralement des suites d'infections
opportunistes. Une certaine proportion d'individus infectés arrive à conserver un haut
niveau de T CD4+, malgré la présence du virus dans leur sang. Ces patients passent
éventuellement au stade SIDA, mais de façon beaucoup moins rapide que le reste de la
population. Ces individus sont appelés contrôleurs (long-term non-progressors) [434]. Il
existe également des individus qui maintiennent un niveau indétectable de virus dans leur
sang à long terme sans aucun traitement. Ces individus ne développent pas le SIDA. Ceux-
ci sont appelés contrôleurs élites [435].
2.2. Le traitement antirétroviral
La prise en charge des personnes séropositives nécessite l'utilisation d'une combinaison de
molécules antirétrovirales dans le but de contrôler l'infection au VIH-1. Il existe différentes
classes d'agents antirétroviraux qui agissent sur différentes étapes du cycle réplicatif.
L'utilisation combinée de ces molécules sur différentes cibles est connu sous l'acronyme de
HAART (highly active antiretroviral therapy). Cette trithérapie a pour but de diminuer
chez les patients la charge virale, de maintenir le système immunitaire et de prévenir les
infections opportunistes qui précédent la mort.
53
L'avènement de la trithérapie a été officialisé lors de la 11ème conférence internationale
AIDS à Vancouver en Juillet 1996. Lors de cette conférence, David Ho et George Shaw ont
présenté des résultats sur la charge virale des patients infectés par le VIH-1. Ils ont détecté
en moyenne 109 virions produits par jour, suggérant fortement le fait que cette infection
virale devait être traitée par des antiviraux. Cette conférence à été suivi par des publications
dans The New England Journal of Medicine par Hammer et Gulick, illustrant le bienfait de
la trithérapie basée sur l'Indinavir. Ce concept de combiner trois médicaments a été très
rapidement appliqué en clinique lors de la prise en charge des patients. A partir de ce
moment, nous avons noté une diminution de 60 à 80% des décès dus au SIDA.
Les classes de médicaments
Il existe plusieurs classes de médicaments, lesquelles sont souvent combinées pour traiter
l'infection au VIH-1. Classiquement nous combinons 2 NRTI (nucleoside reverse
transcriptase inhibitors) + 1 PI (protease inhibitor) ou bien 2 NRTI + 1 NNRTI (non-
nucleoside reverse transcriptase inhibitor).
- Les inhibiteurs d'entrée (inhibiteur de fusion) interfèrent avec la liaison, la fusion et
l'entrée du VIH-1 dans la cellule hôte. Le Maraviroc et l'Enfuvirtide (T20) sont deux
molécules actuellement commercialisées. Le Maraviroc se lie au CCR5 alors que le T20 est
un peptide qui interagit avec la partie N-terminale HR de la gp41 pour former un complexe
bloquant le mécanisme de fusion.
- Les inhibiteurs nucléosidiques (NRTI) et non nucléosidiques (NNRTI) de la transcriptase
inverse sont des analogues nucléosides et nucléotides qui vont comme leurs noms
l'indiquent inhiber la transcription inverse. Les NRTI sont des terminateurs de chaînes qui,
une fois incorporés, vont prévenir l'ajout de nouveaux nucléosides de part l'absence du
groupe -OH à leur extrémité 3'. Ce sont donc des inhibiteurs compétitifs pour le substrat. La
Zidovudine, Lamivudine et le Tenofovir sont des exemples de NRTI. Les NNRTI inhibent
la transcriptase inverse en se liant proche du site actif de l'enzyme. Ce sont des inhibiteurs
non compétitifs de la transcriptase inverse. Les NNRTI une fois fixés proche du site actif
54
de l'enzyme vont empêcher la liaison des nucléosides. La Nevirapine et l'Efavirenz sont des
exemples de NNRTI.
- Les inhibiteurs de l'intégrase agissent au niveau de l'intégrase. Le Raltegravir possède
deux groupes de liaisons aux ions métalliques qui entrent en compétition avec le site de
liaisons aux ions métalliques de l'intégrase pour les ions Mg2+ empêchant ainsi l'intégration
de l'ADN proviral dans le génome de la cellule hôte.
- Les inhibiteurs de la protéase imitent les substrats naturels de la protéase et, en s'y liant,
inhibent le clivage post-traductionnel de certaines protéines virales. Ils bloquent ainsi la
maturation des nouveaux virus. L'Indinavir et le Nelvinavir sont des exemples de PI. Il
existe aussi des inhibiteurs de la maturation. Ces molécules ont la faculté de se lier à Gag
comment le Bevirimat et le Vivecon.
55
Chapitre 3 : L’incorporation des molécules de l'hôte par le VIH-1 Le VIH-1 a un génome de taille limité qui code que pour 9 protéines. Le VIH-1, parasite
intracellulaire obligatoire, s'est adapté au cours de l'évolution en détournant la fonction
naturelle de certaines molécules de la cellule hôte. Un exemple de ce détournement va être
décrit en détail tout au long de ce chapitre et se réfère à l'incorporation des molécules de
l'hôte. Nous allons commencer par une liste non exhaustive des techniques utilisées pour
les identifier suivi par la présentation des différents mécanismes permettant leur
incorporation et nous finirons par une description des plus importantes molécules
membranaires et cytoplasmiques acquises par le VIH-1.
3.1. Identification des protéines étrangères acquises par le VIH-1 Les protéines de l'hôte sont incorporées par le virion durant l'assemblage et le
bourgeonnement. Elles se retrouvent soient présentes à l'intérieur du virus soient à la
surface de son enveloppe [303,344,346,436,437,438]. Conceptuellement parlant, détecter la
présence de protéines acquises par le VIH-1 est relativement simple. Il suffit, de purifier les
particules et d'en étudier le contenu. Cependant, dans la pratique, le surnageant viral est
contaminé par une multitude de vésicules de même densité que le virus [439,440]. Ces
vésicules sont composées essentiellement des microvésicules libérées dans le milieu
extracellulaire par exocytose à partir de MVB ou endosomes. Une fraction considérable de
ces vésicules a la même taille et la même densité que le virus. Par conséquent, en purifiant
le virus, on co-purifie aussi de nombreuses vésicules [439,441]. Pour compliquer le tout,
ces vésicules ont souvent une composition protéique proche pour ne pas dire semblable au
VIH-1 [347,439]. Heureusement, il existe deux stratégies principales pour étudier les
molécules de l'hôte sans contaminant (figure 18).
La première approche concerne l'identification des protéines de surface à l'aide d'un
anticorps spécifique qui permet de reconnaître la protéine d'intérêt et de la discriminer des
56
vésicules en utilisant une propriété propre au virus : Par exemple, la présence d'une protéine
virale (CA; p24) ou d'une activité enzymatique (RT). La détection va être indirecte, car le
signal obtenu correspond aux virus capturés et non pas à la protéine étudiée elle-même
[345]. Cette technique est efficace mais présente certaines limitations, car elle permet
d'étudier uniquement les protéines membranaires et il faut que l'anticorps utilisé pour la
capture soit disponible.
La deuxième approche, est une analyse biochimique des virions qui permet la détection
directe des protéines présentes dans un échantillon donné. Toutefois, elle ne permet pas de
distinguer s’il s'agit d'une protéine membranaire ou cytoplasmique. De plus, il faut
travailler avec des échantillons extrêmement purs pour éviter la contamination avec les
vésicules. Pour purifier les virions, deux techniques sont disponibles: la digestion par des
protéases ou la déplétion par immunoaffinité. La digestion des préparations virales par des
protéases non spécifiques est en général assurée par la subtilisine. Cette protéase permet
d'enlever la quasi totalité des protéines contenu dans les vésicules tout en laissant les virus
intacts [79,270,345,442]. On ne sait pas pourquoi les protéines des vésicules sont plus
sensibles à la digestion par rapport aux protéines virales. Possiblement, les vésicules sont
plus perméables à la protéase ou la majorité des protéines des vésicules sont membranaires.
Quoi qu'il en soit, la digestion des vésicules diminue leur densité, ce qui permet de les
éliminer par centrifugation en gradient de densité. Cette technique permet d'éliminer plus
de 95% des contaminants protéiques d'origine vésiculaire [79,270,345,442]. Le désavantage
de cette méthode est que les protéines de surface du virion sont également digérées par la
subtilisine. Une méthode alternative consiste en une déplétion par immunoaffinité de CD45
[441]. Le principe clé de cette méthode repose, sur le fait que les cellules infectées par le
VIH-1 proviennent de cellules hématopoïétiques qui exprimant le CD45 mais
contrairement aux vésicules qui incorporent la molécule les virions eux, ne l'incorporent
pas [41,443]. Les préparations virales sont mises en présence d'un anticorps anti-CD45,
lequel se lie à la fois aux vésicules et à des billes magnétiques. Nous pouvons, par sélection
négative, récupérer la fraction enrichie de virus sans les vésicules. Notons quand même que
certaines vésicules n'incorporent pas le CD45 et se retrouvent dans la fraction virale
[444,445]. L'utilisation de nombreux contrôles sont nécessaires pour valider la déplétion,
57
tel qu’une condition sans virus dans laquelle on s'assure, qu'après capture avec l'anti-CD45,
il ne reste plus de protéines vésiculaires dans la fraction négative. Toutefois, les études
précédemment réalisées ont permis de vérifier que l'essentiel des virus libérés par les
macrophages dérivés de monocytes ou d'autres lignées de cellules T et lymphocytes
primaires sont dépourvus de contaminants vésiculaires [347,441]. Cette technique a permis
de quantifier de manière précise les molécules HLA-II à la surface du virus par une étude
protéomique sur des virions produits à partir de macrophages primaires [441]. La limitation
principale de cette méthode biochimique c'est que malgré la quantification à la fois des
protéines membranaires et cytoplasmiques, on ne peut déterminer leurs distributions ainsi
que la quantité exacte de molécule par virions. Il est envisageable que la quantité
incorporée d'une même molécule varie en fonction des virions.
Figure 18. Méthodes de détection de protéines cellulaires présentes sur le VIH-1.
Adaptée de [446].
La nature de la cellule infectée affecte également le répertoire de protéines que l'on va
identifier. Il est connu que le profil d'expression des protéines varie considérablement en
fonction du type cellulaire. Une protéine peut ne pas être exprimée dans la cellule hôte et en
58
réalité jouer un rôle important pour le virus. C'est souvent le cas, lorsque l'on utilise des
lignées épithéliales pour la transfection des plasmides viraux qui ne sont pas toujours
représentatives des cellules naturellement infectées par le virus, à savoir les cellules
hématopoïétiques. En plus de cela, de nombreuses lignées cellulaires T ont perdu
l'expression de plusieurs molécules de l'hôte, comme par exemple, HLA-II et le CD3 qui
sont bien entendu présentes sur les T CD4+ in vivo. Il est important de prendre en compte ce
paramètre lorsque l'on étudie les molécules de l'hôte. Le plus rigoureux est d'étudier
directement ces molécules sur des T CD4+ ou des macrophages primaires [347] et sachant
là aussi que le protéome cellulaire varie en fonction des donneurs et de l'état d'activation
cellulaire.
3.2. Mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte
Bien que plusieurs études aient démontré que la promiscuité entre les composantes
d’origine cellulaire et virale permet l’incorporation d’un vaste répertoire de molécules
étrangères dans la membrane virale, un nombre très restreint d’études s’est intéressé aux
mécanismes de sélection et d’exclusion de ces constituants par le VIH-1. La membrane du
VIH-1 s’adapte à un grand nombre de protéines étrangères et semble parfois peu sélective.
Par contre, certains constituants sont préférentiellement sélectionnés. Plusieurs de ces
constituants partagent même certaines activités enzymatiques ou interactions protéiques
suggérant l’existence de mécanismes de sélection communs [447,448]. Or, quatre grands
modèles ont été proposés afin d’expliquer l’acquisition ou l’exclusion de protéines
étrangères (figure 19). De nombreuses protéines membranaires sélectionnées par le VIH-1
interagissent directement ou indirectement avec le cytosquelette d’actine cortical. Le
premier modèle propose l’implication du cytosquelette de la cellule infectée dans
l’acquisition des constituants cellulaires par le VIH-1 [449]. D’autre part, certaines
protéines d’origine cellulaire sont exclues de la surface du VIH-1. Parmi ces protéines, on
compte le CD45, le CXCR4 et le CCR5. Ces protéines partagent certains points communs.
En effet, elles possèdent un domaine cytoplasmique de très haute masse moléculaire pour le
CD45 ou elles sont fortement reliées à la membrane cellulaire par de nombreuses régions
transmembranaires pour les CXCR4 et CCR5. Il a donc été proposé que l’exclusion de
59
certains constituants de la cellule hôte soit provoquée par l’encombrement stérique. En
effet, la matrice VIH-1 est très espacée étant fixée sous la bicouche lipidique, et la capside,
mais certains domaines cytoplasmiques pourraient s’avérer trop grands pour leur
acquisition par le VIH-1. Une étude a d’ailleurs démontré que l’encombrement stérique
pouvait jouer un rôle important sur la sélection de protéines par le VIH-1. En effet, le
clivage de la portion intracytoplasmique de la protéine EGFR a permis de démontrer
l’importance de la taille du domaine intracytoplasmique dans l’acquisition d’une protéine
par le VIH-1 [448,450,451,452,453]. D’autre part, l’attachement à la membrane cellulaire,
par de nombreux domaines transmembranaires, pourrait limiter leur capture par le virus lors
du bourgeonnement. Ainsi, malgré une grande permissivité membranaire offerte par le
VIH-1, l’acquisition de constituants étrangers demeure limitée par la taille du domaine
intracytoplasmique et par le type d’attachement membranaire de la protéine étrangère. Il a
été préalablement décrit que les protéines structurales du VIH-1 s’assemblent au niveau de
la membrane plasmique chez la cellule T et les monocytes/macrophages. Dans ces deux
cas, l’assemblage des précurseurs est orchestré dans des régions riches en cholestérol et en
sphingolipides que l’on nomme radeaux lipidiques. Cette voie naturelle de bourgeonnement
permet l’acquisition de matériaux étrangers qui y sont également localisés. Notons que la
composition de la membrane virale du VIH-1 est également riche en cholestérol et en
sphingolipides. Dans la physiologie cellulaire, les radeaux lipidiques ont comme
principales fonctions : la transduction de signaux, le transport membranaire et la
réorganisation des protéines de surfaces. Il n’est donc pas surprenant d’y retrouver un grand
nombre de protéines spécifiquement associées. De ce fait, un modèle d’acquisition passive
par le VIH-1 a été proposé. Dans ce cas, les protéines retrouvées dans les radeaux
lipidiques seraient préférentiellement acquises par les particules virales en formation. La
contiguïté entre les protéines d’origine cellulaire et virale tout au long du cycle de vie du
VIH-1 a permis de faciliter la réplication et l’évasion de ce dernier. Une telle promiscuité
entre les protéines d’origine cellulaire et virale permet l’instauration d’interactions entre le
virus et l’hôte. Par ailleurs, le seul déterminant viral essentiel au bourgeonnement chez la
majorité des cellules eucaryotes est le précurseur Gag. Il est connu pour diriger
l’assemblage et permettre la localisation du site de bourgeonnement (voir la section sur le
cycle réplicatif du VIH-1: Assemblage, bourgeonnement et maturation). D’autre part, les
60
glycoprotéines structurales de l’enveloppe (gp41 et gp120) sont également associées au site
de bourgeonnement et interagissent avec le précurseur immature Gag. Or, une interaction
directe ou indirecte avec l’une de ces protéines structurales du virus permettrait
l’acquisition de certains constituants cellulaires. De ce fait, le quatrième et dernier modèle
consiste en une sélection positive. Ce modèle propose que certaines interactions directes ou
indirectes prennent place entre des protéines cellulaires et des protéines virales afin de
promouvoir leur acquisition. Quelques études ont d’ailleurs proposé l’existence de ce
modèle. En effet, l’incorporation d’EF1-α et d’HO3 par le VIH-1 serait entreprise par une
interaction directe avec la matrice du VIH-1. Néanmoins, une étude a démontré que la
sélection des molécules de l’hôte par le VIH-1 suit un processus passif et non actif. Ils ont
observé que la grande majorité des protéines d’origine cellulaire sont représentées, en
surface du VIH-1, qu’en proportion inférieure à 1% de Gag. Par contre, cette même étude
fait la mention de quelques exceptions. En effet, plusieurs protéines de différents poids
moléculaires (i.e. 18, 22, 27, 69, 97 kDa) sont enrichies lorsqu’acquises par le VIH-1 et ce,
dans des concentrations similaires à celle de Gag. Par ailleurs, l’incorporation des
molécules de l’hôte est un phénomène dépendant de la lignée cellulaire et du virus. Or, les
cellules 293T et les BHK-21 ont été utilisées dans cette étude. Il s’agit ici de lignées
cellulaires déficientes en plusieurs protéines de l’hôte dont ICAM-1 et HLA-DR. Cette
étude apporte plusieurs considérations d’intérêt, mais l’approche expérimentale permet
difficilement l’application des résultats en théorie. Bien que plusieurs hypothèses ont été
suggérées afin d’expliquer l’acquisition de protéines de la cellule hôte, peu de
démonstrations ont été réalisées. D’autres expériences devront être tentées afin de mieux
caractériser ces mécanismes. La présente thèse s’inscrit parfaitement dans ce sujet.
61
Figure 19. Mécanismes d'incorporation potentielle des protéines de l'hôte par le VIH-1.
a) Exclusion dépendante du cytosquelette. B) Incorporation dépendante du cytosquelette. C) Incorporation passive. D) Incorporation sélective. Adaptée de [346].
3.3. Principales protéines de l'hôte incorporées par le VIH-1 Dans cette partie, je ne vais pas décrire ou énumérer l'ensemble des molécules de l'hôte
acquises par le VIH-1, car actuellement, on recense plus de 300 molécules cellulaires
incorporées par le virion. La liste est régulièrement mise à jour et accessible sur internet à
l'adresse suivante: http://web.ncifcrf.gov/research/avp/. L’incorporation de protéines
cellulaires par le virus influence les différentes étapes du cycle viral. Certaines protéines
favorisent les événements précoces de l’infection, alors que d’autres activent les cellules du
système immunitaire ou encore protègent le virus contre sa neutralisation et/ou sa
dégradation. Je vais m'attarder sur les principales molécules et définir leurs impacts sur le
cycle de réplication virale.
62
3.1.1. ICAM-1
ICAM-1 est un constituant majeur de l'enveloppe virale qui influence de façon significative
la réplication du VIH-1. Cet effet est dépendant de son affinité envers son ligand naturel, la
molécule LFA-1. Les virus qui possèdent ICAM-1 à leur surface vont voir leur infectiosité
décuplée. La présence d'ICAM-1 augmente l'infectiosité du VIH-1 de 5 à 10 fois sur des
cellules T [454]. De plus, lorsque le ligand LFA-1 est exprimé sous sa forme de haute
affinité pour ICAM-1, l'infectiosité virale peut être augmentée jusqu'à 100 fois [455]. Il
s’agit ici de la plus forte augmentation de l’infectiosité virale induite par une protéine
étrangère d'origine transmembranaire. ICAM-1 est capable de restaurer l'infectiosité de
virus incorporant une quantité suboptimale d'Env. Notons toutefois, que ces études ont été
réalisées sur des virus produits à partir de cellules surexprimant ICAM-1. Les travaux
portant sur l'entrée du virus, incluant les expériences de fractionnement subcellulaire de
cellules T primaire, ont clairement démontré que l'acquisition d'ICAM-1 par les particules
virales modifiait la voie d'entrée du virus dans les cellules cibles. Les virus ICAM-1 positifs
vont préférentiellement délivrer leur contenu dans le cytoplasme des cellules T suite à une
étape de fusion. La fusion va permettre d'établir une infection dite productive [456]. Alors
que les virus déficients en ICAM-1 vont être endocyter, et par la suite dégrader aboutissant
à une infection abortive [457]. Une étude a étendu ces observations à un système à la fois
plus complexe et plus physiologique de culture ex vivo d'homogénat d'amygdale. Dans ce
modèle expérimental, l'infection est plus soutenue par les virus ICAM-1 par rapport à des
virus dépourvus de la molécule (5 à 10 fois) [458]. L'induction de la forme activée de LFA-
1 par des anticorps entraîne une plus grande déplétion des cellules T CD4+ résidant dans
l'organe lymphoïde secondaire. De surcroit, les virus produits de novo suite à l'infection de
la culture ex vivo d'amygdale possèdent ICAM-1 à leur surface [458]. L'incorporation
d'ICAM-1 par le VIH-1 lui confère également une résistance à certains anticorps
neutralisants monoclonaux, tout particulièrement lorsque LFA-1 est dans une conformation
activée [459,460,461,462]. La présence d'ICAM-1 à la surface du VIH-1 interfère aussi
avec l'action de l'inhibiteur de fusion T20, lorsque des PBMCs sont traités au T20 et par la
suite infectés avec des virus plus ou moins ICAM-1 [463]. Cette étude à montré que les
virus ICAM-1 positifs sont deux fois moins sensibles à l'action de l'inhibiteur par rapport
63
aux virus isogéniques dépourvus d'ICAM-1. La sensibilité diminue jusqu'à 5 fois quand
LFA-1 est sous forme activée [463]. L'augmentation de la résistance des virus ICAM-1
suite au traitement avec un antirétroviral comme le T20 est à prendre en considération lors
de la prise en charge des patients séropositifs.
3.3.2. HLA-II
Le HLA-II a été l'une des premières protéines identifié dans les préparations virales. C'est
la molécule de surface la plus représentée sur le virus. Les analyses biochimiques des virus
purifiés ont pu déterminer qu'on a 4 molécules de HLA-II pour 1 molécule d'Env à la
surface de lignée T CD4+ [441]. Tout comme ICAM-1, le HLA-II ne nécessite pas la
présence d'Env pour être incorporé [464]. Le HLA-II n'augmente que modestement
l'infectiosité du VIH-1 par rapport à ICAM-1. Son rôle principal est lié à
l'immunopathogénèse virale. Le HLA-II sur les virions est biologiquement actif et il peut
présenter des super antigènes [465] et des antigènes spécifiques [466] aux cellules T CD4+.
Des virus HLA-II positifs chimiquement inactivés sont capables d'induire l'apoptose des T
CD4+ et des T CD8+. Des études complémentaires ont permis de mieux comprendre ce
phénomène. L'incorporation conjointe du HLA-II et du CD86 par les virions permettent au
CD86 d'interagir directement avec les cellules T CD4+ et d'induire soit, leur activation, soit
leurs apoptose [467]. De plus, suite à cette interaction, les T CD4+ libèrent des facteurs
solubles qui induisent des effets comparables sur les T CD8+. En résumé, la présence
d'HLA-II sur les virions contribue à l'anergie et à l'apoptose des cellules T en mimant la
signalisation classique HLA-II/TCR [443,468,469].
3.3.3. Autres molécules de surface
Tout comme ICAM-1, d'autres molécules de surface du VIH-1 peuvent augmenter
l'infectiosité virale, généralement en favorisant l'attachement du virus à la cellule cible.
Nous pouvons citer parmi ces molécules, CD80 [470] et CD86 [470]. Les virus LFA-1
positifs facilitent l'infection des cellules dendritiques immatures, lesquelles sont capables
par la suite d'infecter les lymphocytes T CD4+ qu'elles vont rencontrer [471]. D'autres
64
molécules de surface vont avoir un rôle dans la prévention de la lyse des virions par
l'action du complément. Ces molécules comprennent, CD46, CD55 et CD59. Elles
protègent le virus en contrôlant les facteurs lytiques du complément [472].
3.3.4. La protéine de choc thermique 70 (Hsp70)
Hsp70 est une protéine chaperonne qui est présente dans le virion à un ratio de 1:20 par
rapport à Gag [473]. Elle est spécifiquement incorporée par Gag, même si la séquence
responsable de son incorporation n'est toujours pas connue [473,474]. L'inhibition d'Hsp70
par un analogue non hydrolysable de l'ATP diminue à la fois l'infectiosité des virions et des
VLPs. Nous savons que, dans le virion, Hsp70 est associé avec la capside mature. Le
traitement avec l'ATPγS altère la morphologie de la coque virale, suggérant que Hsp70 est
impliqué dans le réarrangement et le maintien de la coque virale ou dans la décapsidation
de celle-ci lors de l'entrée du virus [474]. En résumé, le VIH-1 incorpore Hsp70 dans le but
de maintenir la structure du virus mature et Hsp70 aurait un rôle à jouer dans les étapes post
assemblage du VIH-1
3.3.5. INI1/HSNF5
Cette protéine est membre du complexe SWI/SNF qui est impliqué dans le remodelage de
la chromatine et est important pour la transactivation de Tat [475]. INI1 se lie directement à
l'intégrase puis est incorporé dans le virion à un ratio de 1:2 molécule d'intégrase soit 1:40
molécules de Gag [476,477]. INI1 a un rôle dans l'assemblage et l'infectiosité du VIH-1. La
production du VIH-1 dans des cellules déficientes en INI1 entraîne un blocage au niveau de
la synthèse des produits de la transcription inverse [478].
65
3.3.6. APOBEC3G
A3G appartient à la super famille de cytidine deaminase, c'est-à-dire d'enzymes de
modification de l'ARN et/ou de l'ADN (editing). L'activité antivirale d'A3G serait liée à sa
capacité d'être incorporée dans la particule virale en formation puis à engendrer de
nombreuses mutations au sein du génome viral qui devient non fonctionnel [479]. Cette
activité peut être contrecarrée par Vif qui empêche l'incorporation d'A3G en favorisant sa
dégradation par le protéasome. L'importance de la restriction imputable à A3G est variable
en fonction du type cellulaire ainsi que de l'environnement cellulaire. Il a été montré que
l'expression d'A3G est induit par l'interféron-alpha (IFN-α), variable d'un sous-type de
lymphocytes T à l'autre et modulable en fonction de l'état d'activation de la cellule [479].
3.3.7. Cyclophiline A (CypA)
CypA est une peptidyl prolyl isomérase impliquée dans le repliement des protéines. Elle est
incorporée par le virion à un ratio de 1:10 molécules de Gag [345]. L'action catalytique de
cette enzyme cellulaire induirait un changement conformationnel de CA, mais son rôle le
plus significatif est la modulation de la sensibilité du virus aux restrictions espèce-
spécifiques du facteur TRIM5α (Tripartite motif 5 alpha) au moment de la décapsidation et
de la transcription inverse [78,80,345,480].
3.3.8. Le cytosquelette d'actine
Les membres du cytosquelette d'actine et les protéines de liaison à l'actine comme eEF1-α,
ezrine, moésine, cofiline et HS1 sont présentes à l'intérieur du virion [345]. Le(s)
mécanisme(s) responsable(s) de leur incorporation ne sont pas clair. Notons quand même le
rôle de la NC qui interagit avec l'actine et dirige son incorporation. Cependant, l'actine une
fois incorporée, ne semble pas avoir de rôle à jouer dans les étapes suivant la libération des
virions. Toutefois, un cytosquelette intact est nécessaire pour le transport de Gag à la
membrane et un bourgeonnement efficace des particules [345,481,482,483].
66
3.3.9. Les tétraspanines
Cette grande famille de protéine intégrale membranaire est présente aussi bien à la
membrane plasmique qu'à la surface des endosomes tardifs ou des MVB. D'un point de vue
physiologique, elles participent aux transports et à la mobilité cellulaire [42,484]. À la
membrane cytoplasmique, les tétraspanines s'organisent en microdomaine (TEMs). Il est
envisageable que le VIH-1 bourgeonne à partir de TEM, car on a retrouvé des nombreuses
tétraspanines à la surface du VIH-1, comme par exemple le CD9, tétraspanine-14, CD53,
CD63 CD81 et le CD82 [345,347,484]. De plus, les TEMs contiennent Tsg101 et Vps28,
qui sont aussi acquis par le VIH-1 [345,347]. Des observations de microscopie et de
fractionnement cellulaire ont montré que le VIH-1 s'assemble et bourgeonne au niveau des
TEMs chez les cellules T et HeLa [445].
67
Chapitre 4 : L'interaction entre ICAM-1 et LFA-1
4.1. Les Intégrines
La famille des intégrines est constituée d'hétérodimères glycosylés transmembranaires
composés d'une sous-unité alpha (α) et d'une sous-unité bêta (β). Chaque sous-unité est
constituée d'un large domaine extracellulaire en position N-terminale, un seul domaine
transmembranaire et d'un court domaine cytoplasmique en position C-terminale. Chez les
vertébrés, 18 sous-unités α et huit sous-unités β ont été découvertes jusqu'à présent. Ces
sous-unités peuvent former différentes combinaisons, formant un minimum de 24 différents
récepteurs. Chaque combinaison présente des affinités spécifiques pour différents ligands.
Contrairement à l'intégrine LFA-1, toujours exprimée en surface, les intégrines Mac-1
(CD11b/CD18) et CD11c/CD18 sont accumulées principalement à l'intérieur des granules,
lesquelles migrent à la membrane plasmique des cellules myéloïdes lors de leur activation
cellulaire. Les chaînes α et β sont produites séparément et s'assemblent dans le réticulum
endoplasmique. Les intégrines sont activées par une voie de signalisation de l'intérieur vers
l'extérieur ou «inside-out». Différents stimuli activent des voies de signalisation qui
agissent sur la portion intracellulaire des intégrines. Ces voies de signalisation modifient
l'affinité de la portion extracellulaire pour le ligand [485]. De plus, la liaison des intégrines
à leurs ligands induit une signalisation intracellulaire ou «outside-in» qui mène à
l'activation de diverses voies de signalisation cytoplasmiques [486].
4.1.1. Les gènes de LFA-1
Les gènes des chaînes α (CD11a, b et c) se situent sur le chromosome 16, alors que le gène
codant pour le CD18 se situe sur le chromosome 21. Chez les individus atteints du
syndrome de Down (trisomie 21), les leucocytes expriment une quantité plus élevée de β2-
intégrines, l’adhésion étant donc plus forte chez ces personnes.
68
4.1.2. Structure de LFA-1
Le CD11a ou chaîne α est une protéine transmembranaire de 180 kDa qui renferme à son
extrémité N-terminale le domaine αI essentiel pour la liaison avec ses ligands (ex. ICAM-
1). En effet, il a été démontré que le domaine αI à lui seul est suffisant pour produire
l'adhésion de LFA-1. La structure du domaine αI a été obtenue par cristallographie à rayon
X avec ou sans ligand [487,488]. Cette structure révèle un repliement de deux résidus
provenant d'un feuillet-β central entouré par 7 hélices-α. Ce domaine est organisé en
structure «β-propeller» c'est-à-dire 7 sous-structures de feuillet-β organisées en forme des
pâles d'hélice [489,490]. Le domaine αI et le β-propeller sont reliés par une région
charnière articulée qui permet à ces structures de prendre différentes positions.
Le CD18 ou chaîne β2 est également une protéine transmembranaire de 95 kDa qui est
aussi nécessaire à la fonction du LFA-1 lors de l'activation des leucocytes dans la réponse
immunitaire. Les patients souffrant de Leukocyte adhesion deficiency (LAD) ont des
leucocytes qui n'expriment pas la forme fonctionnelle de la sous-unité β2 [491]. Ces
patients sont susceptibles à des infections sévères car leurs cellules T ne peuvent pas
adhérer aux cellules présentatrices d'antigènes (CPA) ou bien migrer au site d'infection. La
sous-unité β2 a également une séquence de type βI localisée en N-terminal. Cette structure
est homologue au domaine αI. De plus, le domaine βI est capable d'interagir avec le
domaine β-propeller de la chaine α. Comme le domaine αI et βI sont tous les deux associés
avec le β-propeller, il est suggéré que ces deux domaines vont être en étroite relation à
l'interface des deux sous-unités de LFA-1 [492].
Le CD11a et le CD18 contiennent tous les deux un site de liaison aux cations divalents
appelés MIDAS (metal ion-dependent adhesion site) intervenant dans la liaison avec
ICAM-1. A noter que la liaison d'ICAM-1 à LFA-1 est dépendante de cations divalents
(Mg2+ et Mn2+) [493,494,495,496], alors que les cations Ca2+ vont avoir un effet contraire
en se liant à une région AMIDAS accolée au site MIDAS. Une série de résidus acides
présente dans le domaine αI favorise directement le lien entre LFA-1 d'un côté et ICAM-1
de l'autre. Ces acides aminés sont S139, S141, A237, T206 et A239 qui coordonnent les
69
ions Mg2+et Mn2+ [490]. Un résidu glutamate (E34) présent sur la région extracellulaire
d'ICAM-1 est également reconnu comme participant à l'interaction avec LFA-1 (figure 20)
[490,496].
Figure 20. Les trois états conformationnels des intégrines.
a) Conformation fermée. b) Conformation intermédiaire. c) Conformation ouverte. Modifiée de [497].
4.2. La superfamille des Immunoglobulines ICAM-1 appartient à la super famille des immunoglobulines (IgSF), qui inclut VCAM-1
(vascular cell adhesion molecule-1), PECAM-1 (platelet-endothelial cell adhesion
molecule-1), MadCAM-1 (mucosal addressin cell adhesion molecule-1) et JAM
(Junctional adhesion molecule) [498]. La famille des molécules d'adhésion intercellulaire
comporte 5 membres, ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102), ICAM-3 (CD50), ICAM-4
(LW) et ICAM-5 (TLN), chacun présentant un certain nombre de domaines extracellulaires
homologues aux immunoglobulines. Les membres de cette famille peuvent lier différentes
intégrines et leur expression varie également en fonction du type cellulaire. Par exemple,
bien que tous les membres puissent se lier à LFA-1 (αLβ2), seulement ICAM-1, ICAM-2 et
ICAM-4 peuvent se lier à MAC-1 (αMβ2). Chaque membre présente donc des
caractéristiques qui lui sont propres avec une expression cellulaire différentielle. Par
exemple, ICAM-1 est présent à la surface des cellules endothéliales, épithéliales,
70
leucocytes, fibroblastes, mélanocytes et dans plusieurs types cellulaires associés à des
carcinomes. Les cytokines telles que l'IFN-γ, IL-1 et le TNF-α sont connues pour
augmenter l'expression d'ICAM-1 et faciliter ainsi le recrutement de leucocytes lors de
différentes pathologies [499,500].
4.2.1. Gène ICAM-1
Le gène codant pour la protéine ICAM-1 se trouve sur le chromosome 19 et est composé de
sept exons séparés par six introns. Chacun des cinq domaines extracellulaires d'ICAM-1 est
codé par son propre exon. Il existe deux différents sites d'initiation de transcription situés à
319 et 123 paires de base en amont de AUG. Dépendamment du site utilisé, le transcrit peut
faire 3.3 ou 3.5 kb [501].
4.2.2. Structure ICAM-1
Figure 21. Représentation schématique d'ICAM-1.
Adaptée de [502].
71
ICAM-1 est une glycoprotéine transmembranaire constituée de 505 acides aminés, dont
453 en position N-terminale qui forment la portion extracellulaire composée de 5 domaines
de type immunoglobulines (D1-D5), une région transmembranaire et un court domaine
cytoplasmique de 28 acides aminés (figure 21) [503,504]. ICAM-1 est glycosylée à
différents degrés selon le type cellulaire. Dépendamment du taux de glycosylation, son
poids moléculaire peut varier entre 80 et 114 kDa. A cause d'un angle à 90° entre D3 et D4,
les monomères d'ICAM-1 prennent une forme en L [505,506,507,508,509]. Des études
mutationnelles ont mis en évidence que le D1 est essentiel à la liaison avec LFA-1
[503,504]. À la surface cellulaire, ICAM-1 est présent principalement sous forme
dimérique, ce qui lui permet de se lier efficacement avec le LFA-1 qui est quant à lui sous
forme monomérique [508]. Cependant, la forme monomérique contient tout ce qu'il faut à
ICAM-1 pour se lier à la surface de LFA-1 [510]. L'analyse structurale des trois domaines
d'ICAM-1 (D3-D5) confirme le fait que la molécule peut se lier de façon non covalente et
former des dimères via des interactions entre les domaines D4-D4 adjacents [511]. Il est
suggéré que la dimérisation des domaines D4 est favorisée de part des interactions non
covalentes avec les domaines D1-D1 menant en une conformation en W (figure 22)
[503,512]. De plus, les résidus qui se lient au LFA-1 sont orientés en fonction du glutamate
en position 34 (Glu-34) qui est présent de part et d'autre des dimères d'ICAM-1.
Figure 22. Modèle d'oligomérisation d'ICAM-1.
Adaptée de [513].
72
4.2.3. ICAM-1 en tant que molécule de co-stimulation
Le signal reçu par les cellules T via la liaison du TCR sur le CMH est le premier signal,
alors que le signal reçu via des molécules accessoires ou de co-stimulation forme le second
signal. Le second signal est très souvent du à des molécules de co-stimulation comme les
CD28 [514,515,516,517], mais il peut aussi être induit par des molécules d'adhésion
comme le CD2 [397,518]. A son tour, les CPA peuvent recevoir des signaux qui ont
d'importantes fonctions immunorégulatrices comme CD80 (B7-1) et CD86 (B7-2), les
ligands de CD28, CD154 (CD40L), CD58 (CD2L) et ICAM-1. ICAM-1 est exprimé à la
fois chez les cellules T et les CPA et peut jouer le rôle de récepteur de co-stimulation
(CPA) ou de signal de co-stimulation (cellules T). Par conséquent, ce système d'adhésion
versatile pourrait envoyer des signaux à la fois aux cellules T et aux CPA, ce qui faciliterait
la réponse immune au CMH.
La restriction du CMH-II qui présente des antigènes est limitée aux CPA professionnelles
qui expriment les molécules de la famille B7. Donc, les cellules T CD4+ doivent toujours
rencontrer l'antigène en présence du ligand du B7, et des variations du niveau d'expression
de B7 pourraient réguler la réponse des cellules T. En contraste, les cellules qui présentent
un antigène via le CMH-I souvent n'expriment pas les molécules de la famille B7 et la
présentation survient en absence de la co-stimulation au CD28. Dans ces conditions,
l'expression d'ICAM-1 sur les CPA ou sur les cellules cibles fournit une importante source
de co-stimulations pour le T CD8+ de par leur engagement avec LFA-1 [519].
4.2.4. La signalisation dépendante d'ICAM-1
Une variété de récepteurs membranaires sont connus pour faire de la signalisation par
dimérisation. D'une manière similaire, ICAM-1 est capable de se dimériser et même de
s'oligomériser suite à sa liaison avec LFA-1 ou avec d'autres ligands (ex. fibrinogène) pour
générer une signalisation intracellulaire (figure 23). La queue cytoplasmique d'ICAM-1 n'a
pas d'activité enzymatique intrinsèque. La séquence IKKY(485)RLQ présente certaines
similarités avec des motifs ITIM (immunoreceptor tyrosine inhibition motifs) qui
73
fournissent un site d'ancrage aux protéines phosphatases de type SH2 (src homology). Les
conséquences physiologiques de l'activité enzymatique dépendante d'ICAM-1 incluent
l'augmentation de la production de cytokines et de protéines de surface telles que CMH-II,
le récepteur de l'IL-1, VCAM-1 et ICAM-1 lui-même. Ces molécules sont toutes capables
de faciliter la présentation antigénique par les cellules cibles [520].
Figure 23. ICAM-1 et signalisation.
Adaptée de [513].
74
4.2.5. ICAM-1 et les radeaux lipidiques
Les lipides constituant la membrane plasmique peuvent s'organiser de manière hautement
ordonné en microdomaines spécialisés, communément appelés radeaux lipidiques (RL)
(figure 24) [521,522]. L'analyse de la fonction des RL a confirmé qu'ils sont des acteurs
importants des membranes plasmiques, pouvant servir de sites actifs de réplication à
certains virus (ex. VIH-1), de tri de protéines et de plateforme de signalisation [523,524].
Les RL sont aussi capables de sélectionner ou d'exclure certaines protéines membranaires.
ICAM-1, lorsqu'il est à faible densité membranaire, est dans un premier temps exclu des
RL, alors qu’après la dimérisation ou l'oligomérisation de la molécule, ICAM-1 se
retrouvera principalement dans les RL [525,526]. Cette présence dans les RL renforce
l'hypothèse qu'ICAM-1 est spécifiquement recruté dans les RL pour initier une
signalisation intracellulaire et renforcer la présentation antigénique. De plus, la stimulation
d'ICAM-1 par certains anticorps permet le recrutement des kinases Src, du CMH-I et de
GM1 (marqueur des RL) formant une zone de contact entre la cellule cible et les CTL
[527].
Figure 24. Structure simplifiée des radeaux lipidiques. Adaptée de [43].
75
4.3. Mécanisme et fonction de l'interaction ICAM-1/LFA-1 Le mécanisme d'interaction entre ICAM-1 et LFA-1 implique un changement
conformationnel dans la structure de LFA-1 [528,529]. Normalement, LFA-1 est exprimé
sous forme de faible affinité pour son ligand, ce qui permet à la cellule de ne pas faire des
contacts adhésifs entre elles lorsqu'elles sont en circulation [529]. L'affinité de LFA-1 pour
ICAM-1 est modulée par un changement de conformation du domaine αI qui passe d'une
forme fermée de faible affinité (repliée) à ouverte (étendue) suite à l'intervention des
cations qui vont réorganiser les résidus de la région MIDAS [489]. Ce changement, dans un
premier temps subtil se propage et va entraîner un changement profond où les domaines αI
(β-propeller) et βI vont rompre le contact en s'écartant. Une étude suggère que l'interaction
cation-dépendante entre les domaines αI et βI survient lorsque le récepteur est activé et est
absente lorsqu'il est sous forme inactivée [528]. De plus, l'équipe du T.A Springer a mis en
évidence un troisième état de LFA-1, un état intermédiaire. Bien que cet état soit en mesure
de se lier à ICAM-1, seul l'état ouvert (haute affinité) à la capacité de lier de façon stable à
ICAM-1
Contrairement à la conformation ouverte, la forme fermée du domaine αI n'est pas capable
de se lier à ICAM-1. La raison est la suivante : l'hélice-α 7 qui relie les domaines I et le β-
propeller subit un basculement vers le bas de 10Å, lorsque il y a liaison avec ICAM-1, ce
qui entraîne une réorganisation du motif MIDAS et la forme de haute affinité de LFA-1.
Cette région fait partie de l'IDAS (I-domain allosteric site) qui régule l'activation de LFA-1
sous sa forme de haute affinité [528]. Il est possible d'exprimer de façon constitutive la
forme ouverte ou fermée du domaine αI. Pour la forme ouverte, il faut muter les résidus
K287 et K294 en cystéine et un pont disulfure va se former entre les C287 et C294. Les
mutations de L289 et K294 en cystéine produisent un pont disulfure qui va forcer la
conformation fermée du domaine αI [530]. Dans la configuration fermée, le domaine βI
établit des contacts avec les feuillets-β 2 et 3 du domaine β-propeller, ce qui fait que le
domaine αI va adopter une configuration fermée en entrant en contact avec le β-propeller
[488].
76
L'activation du LFA-1 peut être divisée selon deux événements de signalisation: «outside-
in» et «inside-out». Le signal «outside-in» est principalement fourni par la liaison d'ICAM-
1 à LFA-1 et produit une cascade de signalisation au niveau du cytosquelette cellulaire.
Cette cascade de signalisation inclut l'activation de ZAP-70 (tyrosine kinase ζ-associated
protein-70), qui va initier l'activation d'autres molécules LFA-1 et induire leurs
regroupements. L'agrégation de LFA-1 sous la forme de haute avidité pour ICAM-1 est
sous le contrôle d'une signalisation activant la polymérisation de l'actine F. L'agrégation de
LFA-1 est également impliquée dans la «communication» avec les récepteurs des facteurs
de croissance de part l'activation de la signalisation des MAP kinase (mitogen-associated
protein kinase). A noter que LFA-1 est à l'interface du milieu extracellulaire et
intracellulaire. LFA-1 n'agit pas uniquement comme une molécule d'adhésion mais aussi
comme un récepteur de signalisation pour la réorganisation des filaments d'actine F. Bien
que le domaine cytoplasmique de LFA-1 soit court et dépourvu de site de liaison à des
protéines enzymatiques, la transduction du signal est associée à des protéines adaptatrices
couplées elles aussi au cytosquelette, kinases cellulaires et aux récepteurs couplés aux
protéines G. L'augmentation de l'avidité favorise aussi le recrutement d'autres composants
de signalisation, telle que la cytohésine-1 qui interagit avec la queue cytoplasmique de β2.
La signalisation «inside-out» peut être générée suite à l'activation d'autres molécules de
surface tel que le TCR et le CD2 qui vont induire des seconds messagers qui vont modifier
l'état d'activation de LFA-1. Le mécanisme exact par lequel ces seconds messagers opèrent
est toujours en cours d'investigation. Cependant, la phosphorylation de certains résidus de
la chaîne β2 et l'interaction avec des protéines adaptatrices comme la cohésine-1 et la
paxilline au niveau de la queue cytoplasmique semblent jouer un rôle important. Ces
changements auraient des répercussions au niveau de l'interaction entre le β-propeller et le
domaine βI qui aboutiraient à un changement d'affinité de LFA-1 pour ICAM-1. De plus, il
a été démontré que la séparation des régions proximales de la membrane par les sous-unités
αL et β2 de LFA-1 favorise l'activation de l'intégrine, alors que l'association des ces régions
entraine l'inactivation de LFA-1.
77
4.4. Les pathologies associées aux molécules de surface LFA-1 et à ICAM-1
ICAM-1 et LFA-1 sont associés à de nombreuses pathologies auto-immunes telles que la
sclérose en plaques, l'arthrite rhumatoïde et le diabète de type I [531,532,533]. Dans
l'arthrite rhumatoïde, une expression élevée de Mac-1, LFA-1 et ICAM-1 ainsi que des
nombreuses cytokines favorisent l'infiltration par des cellules inflammatoires du tissu
synovial [499]. Dans la sclérose en plaques, on a démontré que les leucocytes expriment un
niveau élevé de LFA-1 et ont des propriétés adhésives supérieures à la normale, ce qui
suggère que l'interaction entre ICAM-1 et LFA-1 pourrait permettre l'adhésion des
leucocytes aux cellules endothéliales microvasculaires lors la progression de la maladie.
L'interaction entre les lymphocytes et les cellules tumorales est médiée par ICAM-1 et
LFA-1. Cette interaction induit la libération de cytokines pro-inflammatoires nécessaires à
la croissance tumorale. Les cellules tumorales qui expriment un niveau élevé de molécules
d'adhésion sont mêmes sélectionnées et forment les cellules métastatiques. Par exemple,
l'expression d'ICAM-1 est augmentée chez les patients atteints de cancer pancréatique ou
souffrant d’adénocarcinome pulmonaire. Cette augmentation est associée avec la
progression de la maladie [534,535]. D'un autre côté, les cellules cancéreuses gastriques
primaires et secondaires expriment moins d'ICAM-1 que les cellules saines et cette sous-
expression d'ICAM-1 suppriment la réponse immune dépendante de LFA-1 [536].
79
Chapitre 5 : Hypothèses et objectifs
Bien que la plupart des protéines acquises par le VIH-1 ne soient pas essentielles au cycle
réplicatif viral, ces protéines peuvent moduler son infectiosité. Notons, entre autre, les
protéines suivantes i.e. ICAM-1, HLA-DR, et CD44 qui modulent le cycle du VIH-1. En
outre, la présence d’autres protéines, telles que CD55 et CD59, apporte aux virus une
protection contre l’action du complément. Généralement, les molécules de l’hôte
incorporées par le VIH-1 conservent leur structure tridimensionnelle. En effet, l’activité
enzymatique de la protéine cellulaire est conservée, une fois cette dernière retrouvée sur le
VIH-1.
Pendant mon doctorat, je me suis intéressé tout particulièrement à la compréhension du
mécanisme moléculaire d’incorporation d’ICAM-1 par le VIH-1.
ICAM-1 a été identifié à la surface du VIH-1 pour la première fois en 1993 [537]. Notons
qu’en dehors du HLA-DR, ICAM-1 est la molécule de l’hôte retrouvée en plus forte
concentration à la surface des virions. En proportion, la concentration en ICAM-1 avoisine
le 1/7 de la concentration en p24. La molécule d’adhésion est retrouvée en surface d’isolats
cliniques et d’isolats de laboratoire provenant de cellules primaires et d’amygdales. Il a été
démontré qu’un virus portant ICAM-1 à sa surface a une infectiosité accrue de 2-10 fois
celle d’un virus déficient en ICAM-1. Cette induction de l’infectiosité virale passe de 6-95
fois en présence d’un LFA-1 de haute affinité/avidité. Cette augmentation du pouvoir
infectieux par la présence d’ICAM-1 en surface du VIH-1 est également observée à l’aide
de cultures d’amygdales en conditions ex vivo. Plusieurs hypothèses ont été suggérées afin
d’expliquer le mécanisme d’acquisition d’ICAM-1 utilisé par le VIH-1 (voir la section
précédente sur les mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte). Cependant, il est
clair qu’ICAM-1 augmente l’attachement à la surface de la cellule du virus qui le porte.
Ainsi, il est plus qu’évident que le VIH-1 tire avantage de la présence d’ICAM-1 à sa
surface.
80
Concernant son mécanisme d’acquisition, jusqu’à ce jour, seulement une étude effectuée
dans notre laboratoire a décrit l’importance de la queue intracytoplasmique d’ICAM-1 dans
son processus d’incorporation ainsi que de la mise en évidence d’une potentielle interaction
entre Pr55Gag et ICAM-1 dans les particules virales.
Nous avons émis les hypothèses suivantes :
- Pr55Gag interagit avec ICAM-1 au sein des particules virales, nous voulons savoir dans un
premier temps, quel domaine de Pr55Gag est impliqué dans ce processus ? Est-ce que ce
domaine dirige l’incorporation sélective d’ICAM-1 ? Si oui, nous souhaitons identifier
précisément quels acides aminés de Pr55Gag sont essentiels à l’interaction ?
- Parallèlement à l’étude de Pr55Gag, nous voulons également identifier quel(s) résidu(s)
présents dans la portion intracellulaire d’ICAM-1 est fondamental à la fois à l’interaction
avec Pr55Gag ainsi qu’à son acquisition par le VIH-1.
Mon objectif principal de doctorat a été de comprendre le mécanisme moléculaire
d’incorporation de la molécule de l’hôte ICAM-1 lors du bourgeonnement du VIH-1.
La caractérisation de ce phénomène est fondamentale à la pleine compréhension du rôle
joué par ICAM-1 sur le cycle réplicatif du virus, surtout si l’on souhaite développer à terme
de nouveaux inhibiteurs rétroviraux ciblant spécifiquement l’incorporation d’ICAM-1.
1er objectif : Caractériser les différents domaines de Pr55Gag permettant une production
efficace de pseudo-particules virales (VLPs) d'un point de vue biochimique et
morphologique. Dans le but d'identifier des candidats potentiels pour l'étude de
l'incorporation d'ICAM-1. Cet objectif a fait l'objet d'une publication et est présenté dans le
Chapitre 6.
2ème objectif : Une fois les mutants de matrice, nucléocapside et p6 caractérisés, nous
avons évalué leur capacité à incorporer ICAM-1dans un modèle de VLPs. Il s'est avéré que
c'est la région N-terminale de Pr55Gag, plus précisément le domaine de matrice qui est
81
responsable de l'acquisition d'ICAM-1 dans les modèles de VLPs. Nous avons par la suite
confirmé ce résultat dans un contexte plus physiologique de clone moléculaire. Finalement,
cette étude nous a permis d'approfondir nos connaissances sur la région et les acides aminés
de la matrice impliqués dans cette interaction avec ICAM-1 par le développement de
nouveaux modèles in silico et de mutagénèse dirigée. Cet objectif fait l'objet d'une demande
de brevet ainsi que d’un article présenté dans le chapitre 7.
3ème objectif : Sachant que le domaine cytoplasmique d'ICAM-1 est nécessaire à son
incorporation nous nous sommes attelés à définir la région et les acides aminés qui sont
responsables de l'interaction avec la matrice virale. Pour ce faire, nous nous sommes basés
sur la modélisation de novo du présent domaine et sur des expériences de mutagénèse
dirigée. Cet objectif fait parti de la demande de brevet ainsi que d’un article présenté dans
le chapitre 7.
83
Chapitre 6 : La production efficace de pseudo particules virales du VIH-1 à partir d'un vecteur d'expression de mammifère nécessite la présence du domaine N-terminal de la capside
Ce chapitre a fait l'objet d'une publication dans la revue PLOS One (2011;6(11):e28314) et
est constitué du manuscrit tel que publié.
Résumé
La production de VLPs chez le VIH-1 est orchestrée par Pr55Gag. La protéine est constituée
de différents domaines comprenant: matrice, capside, SP1, nucléocapside, SP2 et p6. Nous
avons voulu identifier par mutagénèse quels domaines s’avèrent essentiels à la production
de VLPs. Pour ce faire, nous nous sommes inspirés d’une séquence minimale de Pr55Gag
précédemment décrite «Gag min». Tous les mutants ainsi générés ont été clonés dans un
vecteur d’expression afin d’étudier exclusivement la protéine d’intérêt en combinant les
approches biochimique et microscopique. Premièrement, nous avons trouvé que Gag min
échoue à produire des VLPs. Cet échec survient précocement dans la cellule au niveau de
l’assemblage des protéines virales. Deuxièmement, la matrice n’est pas nécessaire mais
l’efficacité de production du mutant dépend fortement de la présence de sa région basique.
De plus, la nucléocapside, SP2 et p6 sont facultatifs lorsqu’ils sont substitués par des
séquences hétérologues comme hCREB et p2b. Fait marquant, nous avons mis en exergue
que la présence du domaine N-terminal de capside est fondamentale. À la vue de ces
résultats, nous espérons qu’une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires
permettant de contrôler la production des VLPs aidera la communauté scientifique dans la
conception de nouveaux vaccins ciblant le VIH-1.
84
Efficient Production of HIV-1 Virus-Like Particles
from a Mammalian Expression Vector Requires
the N-Terminal Capsid Domain
Pascal Jalaguier1, Karine Turcotte1, Alexis Danylo1,
Réjean Cantin1 and Michel J. Tremblay1,2*
1Centre de Recherche en Infectiologie, Centre Hospitalier Universitaire de Québec –
CHUL and 2Département de Microbiologie-Infectiologie et Immunologie, Faculté de
médecine, Université Laval, Québec, Canada
*Corresponding author
E-mail: MJT: [email protected]
85
Abstract
It is now well accepted that the structural protein Pr55Gag is sufficient by itself to produce
HIV-1 virus-like particles (VLPs). This polyprotein precursor contains different domains
including: matrix, capsid, SP1, nucleocapsid, SP2 and p6. In the present study, we wanted
to determine by mutagenesis which region(s) is essential to the production of VLPs when
Pr55Gag is inserted in a mammalian expression vector, which allows studying the protein of
interest in the absence of other viral proteins. To do so, we first studied a minimal Pr55Gag
sequence called Gag min that was used previously. We found that Gag min fails to produce
VLPs when expressed in an expression vector instead of within a molecular clone. This
failure occurs early in the cell at the assembly of viral proteins. We then generated a series
of deletion and substitution mutants, and examined their ability to produce VLPs by
combining biochemical and microscopic approaches. We demonstrate that the matrix
region is not necessary, but that the efficiency of VLP production depends strongly on the
presence of its basic region. Moreover, the presence of the N-terminal domain of capsid is
required for VLP production when Gag is expressed alone. These findings, combined with
previous observations indicating that HIV-1 Pr55Gag-derived VLPs act as potent stimulators
of innate and acquired immunity, make the use of this strategy worth considering for
vaccine development.
86
Introduction Virus-like particles (VLPs) have sparked an increasing interest over the last decade [1,2].
These viral entities cannot perform a full replication cycle and therefore cannot produce
new progeny virus. This property has allowed them to be used and studied in different
contexts. They serve notably in gene therapy investigations, as they can enter target cells
and deliver a specific gene [3]. They are also employed for the study of chemical
compounds that can block particle assembly and could prove to be useful in antiviral
therapies. Finally, VLPs have recently been used with success as a tool for vaccination
against human papillomavirus [4,5,6]. These recent successes underline the value of
deepening our understanding of the mechanisms involved in VLP formation for many
viruses, including human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1).
HIV-1 can form VLPs by sole virtue of its Gag polyprotein precursor, also known as
Pr55Gag. This structural viral constituent is indeed the main actor in HIV-1 particle
formation as it drives assembly through protein-protein, protein-RNA, and protein-lipid
interactions, orchestrating the incorporation of each of the major virus-encoded components
into assembled particles [7,8,9,10]. Pr55Gag is translated from unspliced viral mRNA on
free ribosomes in the cytoplasm and encodes the internal structural components of the
virion, i.e. matrix (MA), capsid (CA) and nucleocapsid (NC) along with the C-terminal p6
domain and two spacer peptides SP1 and SP2 [11]. In the absence of any other viral
proteins, Pr55Gag can self-assemble into VLPs [12] by ordered multimerization of
monomers and/or oligomers to produce a spherical shell, which forms the structural
framework of the immature virus particle [10,13]. It is noteworthy that HIV-1 Pr55Gag-
based VLPs elicit strong cellular and humoral responses in non-human primate research
models for AIDS [1,14,15].
Several regions of the Pr55Gag polyprotein have been reported to be crucial for particle
formation. Notably, previous structural and genetic analyses have demonstrated that the
regions responsible for membrane binding are located at the N-terminal region of MA,
which encompasses a cluster of basic residues and a myristyl group interacting with acidic
phospholipids of the membrane [16,17]. However, several studies have shown that MA can
be largely deleted or even entirely replaced by a heterologous myristyl anchor without
compromising the formation of extracellular viruses [18,19,20,21]. This suggests that the
87
role of MA in assembly is not as important as its role in Pr55Gag trafficking [22,23] and in
the incorporation of virus-encoded envelope glycoproteins (ENV) [24,25].
CA provides structural stability to HIV-1 particles and also plays a key role in the
formation of protein-protein contacts required for a productive particle assembly. CA
comprises two globular domains: an N-terminal domain (NTD) and a C-terminal domain
(CTD) linked by a short flexible sequence [10,26,27]. The NTD consists of five long
helices forming a stable coiled-coil structure, two more short helices, two hairpins, and a
proline-rich loop. NTD is considered to play a structural role in core formation rather than
actively driving particle production [18,19]. Indeed, Gag lacking this entire domain was
shown to assemble and bud from the host cell [18,19]. However, previous studies have
shown that Gag constructs bearing certain specific mutations or in-frame insertions in the
N-terminal domain gave rise to a dramatically reduced particle production even in the
absence of the other viral components, such as genomic RNA, envelope glycoproteins,
enzymes and auxillary proteins [28,29,30,31]. The authors identified a previously
unrecognized contiguous CA domain located beneath the cyclophilin-A binding loop that
participates in Gag assembly. In contrast, CTD is recognized as being fundamental for VLP
formation. This specific region contains four conserved helices and a highly conserved
sequence among retroviruses known as the major homology region (MHR) [11]. The MHR
determines the Gag conformation required for efficient protein-protein and protein-
membrane interactions during virus assembly [31,32,33]. Moreover, the hypothetical α-
helix formed by the last residues of CTD and SP1 participates in the assembly process [34].
Mutations within the 14-amino acid peptide that separates CA from NC or SP1 have been
reported to induce strongly aberrant budding structures and reduce the number of released
extracellular particles [31,35,36,37].
NC contains two zinc finger domains that bind RNA, and an interaction domain (I domain),
consisting in a stretch of basic residues, that mediates Gag-Gag interactions [7,38].
Interestingly, the zinc fingers are not absolutely necessary for the function of the I domain
[38,39,40]. Nevertheless, the role of RNA in assembly is so vital that HIV-1 will recruit
other cellular RNAs by default if viral RNA is not available [41]. As far as the assembly
process is concerned though, NC can be efficiently replaced by a heterologous leucine
88
zipper (LZ) domain (i.e. a coiled-coil sequence capable of forming parallel homodimers)
[18,42,43].
The p6 domain contains two late domains (LDs), which are required for pinching off the
newly assembled virions from the host membrane. The first one, located in N-terminal
position, is the principal LD. It contains a proline-rich PTAP motif, which appears to play a
critical role in exocytosis of assembled particles [44]. PTAP interacts directly with Tsg101
[45], which is a host component of the endosomal sorting complex required for transport
type-I (ESCRT-I) [46]. The second LD region located in C-terminal contains a YPLTSL
motif that interacts with another cellular machinery molecule, i.e. AIP-1/ALIX (link
between ESCRT-I, and –II) [47]. It is well established that, in some conditions, p6 can be
replaced with a heterologous LD sequence, notably with p2b, a small spacer peptide from
another retrovirus, i.e. Rous Sarcoma Virus (RSV), containing the PPPY motif [18,48,49].
Although there are numerous bacterial, yeast and insect systems to produce HIV-1-based
VLP [1,2,15], the vast majority of VLP studies using a mammalian system have been
performed in a provirus context [19,21,43]. Very few studies used solely the Pr55Gag
polyprotein under the control of another promoter than LTR, and obviously in the absence
of virus auxiliary proteins. The latter conditions moreover correspond to the common setup
for vaccine studies. Now, Accola and colleagues previously described a minimal sequence
of Pr55Gag able to produce VLPs as efficiently as wild type virus [18]. This chimera protein,
expressed as part of a molecular clone of HIV-1, was shown to be efficiently released from
host cells. In the present study, we show that a similar minimal sequence can result in
different experimental observations when inserted in a mammalian expression vector
instead of being part of a molecular clone. Given this discrepancy, we investigated further
and, to do so, designed a series of Pr55Gag mutants with the aim of identifying which
region(s) of Pr55Gag are necessary to VLP formation in our experimental approach. We
examined expression and VLP formation of these mutants by biochemical and electron
microscopy approaches and, in agreement with Accola and co-workers, we demonstrate
that MA is not necessary, and that NC and p6 are dispensable when heterologous sequences
like hCREB and p2b are used. However, we observed that, in the context of a mammalian
expression vector, VLP formation requires the presence of the NTD of the CA domain
89
(amino acids 133 to 277) for assembly, budding and release in human human embryonic
kidney 293T (HEK293T) cells.
90
Results We tested in this study the VLP-producing ability of a minimal Pr55Gag sequence inserted
in a strong mammalian expression vector, namely pcDNA3.1 (+). One of the major
advantages of a plasmid over a molecular clone for producing VLPs is that, most evidently,
the particles produced do not replicate, cannot revert to an infectious virus, and are thus
much safer. We decided to evaluate a minimal Gag construct (called Gag min hereinafter)
that had already been reported in the literature by Accola and colleagues [18]. This mutant
was derived from the HXBH10-PR- molecular clone, which is identical to HXBH10, a
Vpu-positive variant of the HXB2 HIV-1 molecular clone, except for a point mutation that
inactivates the protease (PR) [18]. The chimera protein was shown to be efficiently released
from cells. It comprises only 6 amino acids of the myristoylation signal in MA, only
residues 146 to 231 of CA, the 14 amino acids of SP1, and heterologous sequences that
replace NC and p6.
As illustrated in Fig. 1 (bottom line), our Gag min construct is identical to the one
previously described [18], except for the heterologous NC sequence, which in our case
consists in the hCREB-1 sequence. This sequence forms a coiled-coil structure capable of
forming parallel homodimers. We decided to use this basic LZ domain (bZIP) sequence
instead of the yeast-derived GNC4 sequence used previously [18] because, when
formulating a vaccine, one should avoid including foreign sequences in order not to induce
non-specific cross-immune reactions. Moreover, the hCREB-1 sequence was successfully
used in the past for the same purpose [43]. Finally, to improve the efficiency of protein
translation in HEK293T cells, codons were humanized [50].
Gag min fails to produce VLPs
To determine how Gag min behaves in our VLP experimental model system, this vector
was first transiently transfected in HEK293T cells as well Gag WT (used as a positive
control). At 48 h post-transfection, cell-free supernatants containing VLPs were harvested
and transfected cells were collected as well, and prepared as described in Methods section.
Both VLPs and cell lysates were analyzed on a gradient SDS-PAGE, and the gel was next
stained with Coomassie blue. As depicted in Fig. 2A, a major band at a molecular weight
(MW) of 55 kDa was observed for Gag WT and, as expected, no similar protein signal
91
appeared in the cell-free supernatant from cells transfected with an empty control vector
(called mock). However, we failed to detect a band at the predicted MW of Gag min
(theoretical MW (MWth ) = 18.2 kDa) in the cell-free supernatant. Too many bands were
present in cell lysis samples to allow identifying the different proteins of interest. To
achieve better sensibility and specificity, we performed immunoprecipitation (IP) assays on
the same samples with an anti-p24 antibody, followed by western blot detection. With this
technical strategy, we obtained for Gag min a specific signal at the predicted 18.2 kDa in
the cell lysate (Fig. 2B). However, we were still unable to detect a signal in the cell-free
supernatant, whereas we detected a distinctive band for the positive Gag WT control.
At this point, we hypothesized that the Gag min protein was being expressed by the
transfected cell, but could not give rise to VLP production due, for example, to a
malfunction in the assembly process. To explore this possibility, we analyzed our
transiently-transfected HEK293T cells by transmission electron microscopy (TEM). For
Gag min, we did not observe any VLP in the process of budding through the cell
membrane, or in the supernatant close to the cell, in accordance with our previous
biochemical experiments (Fig. 2C). Moreover, there was no VLP, whether incomplete or
fully formed, in the cytoplasm of the transiently transfected cells. This is in sharp contrast
to Gag WT that showed a characteristic VLP spherical morphology (average size around
100 nm), similar to that of immature HIV-1 particles [51].
To further investigate the intracellular location of the Gag min proteins within the
transfected cells, indirect immunofluorescence studies were performed with an anti-p24
antibody. As illustrated in Fig. 3 (upper panel), Gag WT proteins were detected throughout
the cytoplasm of transfected cells, organized in dotted structures suggesting they were
undergoing VLP assembly. In contrast, cells transfected with the Gag min vector showed a
more diffuse distribution pattern of proteins within the cytoplasm (middle panels). Thus,
both biochemical and microscopy studies clearly show that proteins expressed upon
transfection of the Gag min construct do not assemble properly when inserted within an
expression vector.
We next determine why this Gag min construct fails to form VLPs in our experimental
setting. Considering that it was designed through investigations that almost always used
full-length molecular clones [18,19,21], we hypothesized that different sequence stretches
92
may be required for proper assembly of Gag in the absence of all other viral proteins. We
thus produced a series of deletion mutants (Fig. 1), to re-examine the necessity of the
various Gag domains for producing VLPs, in the context of an expression vector.
MA is not required for VLP production, but the basic region allows a more efficient
particle release
It is now well established that the MA region plays both structural and targeting roles in the
virus assembly process, but appears to be somewhat less important in Gag multimerization.
The latter phenomenon relies largely on two key sequences. First, the N-terminal myristyl
acid has been demonstrated to interact with the inner leaflet of the plasma membrane by
hydrophobic interactions [16,52,53,54]. Its absence prevents particle release [22,23,55].
Second, the basic region (BR) (amino acids 18 to 33), which is also located in the N-
terminal position, plays a pleiotropic role in the assembly process, notably in plasma
membrane targeting and binding. We thus produced two MA mutants differing by the
presence (MAΔ44-132) or the absence of BR (MAΔ8-132) in order to investigate whether
BR is required to allow formation of VLPs. We detected the MA deletant proteins in both
the cell lysates and cell-free supernatants. Those proteins were detected either with SDS-
PAGE (Fig. 4A) or following immunoprecipitation with an anti-p24 antibody (Fig. 4B).
The bands detected at 41 and 46 kDa respectively match the expected molecular weight of
MAΔ8-132 (Mwth = 41.72 kDa) and MAΔ44-132 (Mwth = 46.02 kDa). However, the
efficiency of particle release proved to be different between these two mutants. Indeed,
MAΔ8-132 released about half as many particles as Gag WT, whereas MAΔ44-132
released around 40 % more than Gag WT (Fig. 5). In other words, there is approximately a
3-fold difference between these two mutants. Please note that, for comparison purposes,
Fig. 5 shows the relative efficiency of release of VLPs for all mutants assayed in this study.
Subsequently, to visually confirm the results described above and to examine the site of
intracellular particle formation of the two MA mutants, we performed TEM on HEK293T
cells expressing Gag WT, MAΔ8-132 and MAΔ44-132. An empty control vector was also
tested as well (data not shown). First, morphological analysis of the two MA mutants
confirmed their typical VLP shape with spherical-like morphology and electron-dense ENV
(Fig. 6). In addition, for the MAΔ8-132 VLPs we observed many points of intracellular
93
assembly inside the cytoplasm (bottom right). We however could not see this phenomenon
with the MAΔ44-132 VLPs, but rather more numerous particles in the extracellular space
(bottom left). These observations confirm the discrepancy in particle release between these
two MA mutants. Globally, the results above show that the MA domain can be dispensable
for VLP formation, although the basic region seems to promote particle production
efficiency.
NC and p6 regions are required for VLP release, although they can be replaced with
heterologous sequences hCREB and p2b
We next investigated the possible contribution of NC and p6 domains in VLP formation.
According to the literature, the p6 domain is important in the final release process from
infected cells, whereas NC participates in Gag-Gag interactions [46,56]. We thus designed
the deletion mutants Δp6 and ΔNCp6 as illustrated in Fig. 1. As with VLPs produced from
molecular clones [42,43], the NC and p6 deletion constructs were unable to produce VLPs.
Indeed, cell-free supernatant analysis of transfected HEK293T cells did not permit to detect
any protein signal, be it with SDS-PAGE (Fig. 7A) or following an IP/western blot assay
(Fig. 7B). However, the two deletion mutants were clearly expressed because we were able
to detect protein signals in cell lysate fractions. Respective molecular weights of 41 and 50
kDa were detected for ΔNCp6 (Mwth= 41.91 kDa) and Δp6 (Mwth = 50.14 kDa). Results
from TEM analyses allowed us to confirm a default in VLP release for those two different
constructs (Fig. 7C) (data not shown for the Gag WT control). The Δp6 mutant shows a
pinching-off default, as VLPs remain tethered to the cell plasma membrane. On the other
hand, ΔNCp6 showed an intriguing morphology. Indeed, VLP formation and assembly
occur close to the inner leaflet of the plasma membrane, but the particles seem to
accumulate at the membrane in large quantities, while showing no sign of pinching-off
(Fig. 7C, bottom left).
The above results confirm that p6 and NC are necessary for our VLP model. Moreover, we
evaluated if heterologous sequences were able to efficiently substitute NC and p6 domains,
like they can when Gag is expressed in a molecular clone [18]. We designed 2 substitution
mutants, p6449LD and NCp6378LZLD. Concerning p6449LD, this construct differs from the
Gag WT only by the substitution of the p6 domain with the RSV p2b sequence (see
94
introduction section for more details). Overall, p6449LD was expressed intracellularly and
produced VLPs to a similar extent as the Gag WT (release efficiency of about 1.4 fold
compared to Gag WT) (Fig. 5). The p6449LD protein signal was detected both by SDS-
PAGE and western blot assays (Figs. 7A and 7B) with a 50 kDa molecular weight (Mwth =
51.18 kDa). TEM data showed that the morphology of p6449LD VLPs (Fig. 7C, upper right
panel) is comparable to that of the Gag WT (data not shown).
Next, to get closer to the structure of the Gag min construct, we performed a double
substitution where, in addition to replacing p6 with p2b, we replaced NC and SP2 by
hCREB-1. As expected, the resulting NCp6378LZLD mutant was able to generate VLPs,
which were released efficiently from cells (Figs. 7A and 7 B). This was confirmed by TEM
(Fig. 7C, bottom right) (1.4 fold compared to Gag WT) (Fig. 5). Taken together, the above
substitutions and deletions in our VLP model confirm that both NC and p6 are required for
particle release. In addition, their substitution with heterologous sequences does not
diminish the efficiency of the Gag plasmid.
N-terminal domain of CA is necessary for VLP formation
The last domain remaining to be investigated was the CA protein. We focused our attention
on the NTD because the CTD has been recognized as essential to the particle assembly
process. On the other hand, controversial results have been obtained with NTD, as
explained in the introduction section. Thus, we designed a CA NTD mutant where the
complete NTD region (amino acids 133 to 277) was deleted like in the Gag min mutant.
This new mutant named CAΔNTD at first sight appeared to be able to produce VLPs
efficiently as shown both by SDS-PAGE and IP/western blot (Figs. 8A and 8B). However,
in contrast to previous studies, the morphological characterization failed to confirm that our
protein gel results correspond to bona fide VLP. In fact, this mutant showed a severe
default in the assembly and budding process (Fig. 8C). Nevertheless, this finding is
consistent with previous observations made in baculovirus-infected cells by Chazal and
colleagues where a Gag insertion mutant at position 209 resulted in a very similar cellular
membrane phenotype [28]. Our CAΔNTD mutant actually shows very large electron-dense
patches of the Gag mutant protein at deformed areas of the plasma membrane.
95
In conclusion, the CAΔNTD mutant was unable to form VLPs in our hands. We
hypothesize that the supernatant protein signals detected biochemically may correspond
partially to cell-free patches of cell plasma membrane containing densely-aggregated Gag
mutant proteins.
96
Discussion In the present work, we designed a series of Pr55Gag mutants with the aim of defining, in
the context of a mammalian expression vector, the intrinsic role of the Gag protein in the
assembly and release of immature VLPs from human producer cells. Past investigations
almost always used full-length molecular clones in which a point mutation inactivated the
viral protease gene in order to produce immature HIV-1 particles [18,19,21]. However,
using these molecular constructs, one cannot exclude the influence on the assembly process
of other viral gene components like ENV or accessory molecules. Those viral accessory
proteins are not desirable when investigating Gag auto-assembly. Also, working with
mammalian expression plasmids presents a number of other advantages, as compared to a
full-length molecular clone. For example, smaller plasmids are easier to handle. More
importantly, the particles produced have no possibility of replication and cannot revert to
an infectious virus. We thus studied VLP formation in the complete absence of the other
viral proteins, in the perspective of gathering valuable information for future vaccine
design.
To achieve this goal, we expressed the precursor Pr55Gag polyprotein under a promoter
different from the HIV-1 LTR in a mammalian expression vector. On the basis of
biochemical and microscopical data, we found that, in contrast to previous published
observations [18], the minimal Gag chimera protein failed to produce VLPs. In fact, we
were unable to detect viral protein in the supernatant, nor any budding structures in TEM
studies. Nevertheless, the chimera protein is expressed inside the cells, because we were
able to detect a signal by western blot and indirect immunofluorescence microscopy (Figs.
2 and 3). In addition, we detected the mRNA by RT-PCR in cell extracts (data not shown).
The failure seems to happen early in the assembly process, as illustrated by the very diffuse
signal appearing in microphotographs (Fig. 3). It could consist in a major preassembly
default. This sharply contrasts with the Gag WT proteins that display a punctate staining
pattern, a phenotype in accordance with previous studies [57,58,59,60]. These sites of
intense Gag localization presumably represent active centers of virus assembly.
Characterization of such sites will provide additional insights into the mechanism of Gag
trafficking and virus assembly.
97
Our results though do not necessarily contradict those of Accola and colleagues [18], as the
noted discrepancies can be explained by numerous factors. First, the authors worked with a
different expression system, which was based on the HXBH10-PR- molecular clone, and, as
stated above, the presence of all virus proteins may influence the action of the Gag protein
during VLP production. Second, we used a different dimerization domain since we
substituted the previously used GCN4 sequence by the hCREB leucine zipper domain.
Although this sequence had already proven to efficiently replace NC in a previous work
[43], we cannot rule out the possibility that hCREB and GCN4 differently affect VLP
formation. However, it must be noted that the substitution of NC by hCREB did not modify VLP
production in our assays. Third, Accola and co-workers used only biochemical approaches in
their study. They did not provide any electron microscopic studies in their work. Therefore,
a direct visual comparison with our observations is lacking. Most importantly, it is our
TEM studies that allowed us to detect a default in assembly and budding of the CAΔNTD
mutant, whereas biochemical approaches indicated VLP production. Fourth, the authors
used different methods for detecting VLPs in cell lysates and in supernatants; for the latter,
they used 35[S] methionine metabolic labelling, a method well-known for its sensitivity,
whereas they performed a classical WB on cell lysates. On the other hand, we revealed the
Gag protein with a biotinylated monoclonal antibody against p24 and the primary antibody
was detected with Cy-3-conjugated streptavidin technology both for cell lysates and VLP
with the aim of keeping the same detection method for the two types of samples.
In our quest to determine the reason(s) why Gag min does not produce VLPs, we designed
a series of mutants/deletants derived from Gag WT and Gag min in order to find out which
domain(s) appears to be essential to produce VLPs in our conditions. We confirmed that, at
least under our experimental conditions, the MA domain is dispensable for VLP formation
as long as two fundamental elements are present: (1) the myristyl acid in the MA N-
terminal position that interacts with the inner leaflet of the plasma membrane by
hydrophobic interactions [16,52,53,61]. The absence of this myristyl acid prevents particle
release [22,23,55]; (2) the basic region (BR: 18-33) in the MA N-terminal position, that
fulfills multiple functions in assembly process, like plasma membrane targeting and
binding [54,59,61,62]. Indeed, MAΔ44-132 is efficiently produced like depicted in Fig. 4
and is as efficiently released as Gag WT.
98
In comparison, the MAΔ8-132 mutant, in which almost the totality of MA was deleted, is
still able to produce VLPs, but less efficiently than Gag WT or MAΔ44-132. We observed
through microscopy that this mutant lacking the BR region presents partial virus assembly
and that assembly is redirected from the plasma membrane to intracellular membranes (Fig.
6) [54,61,63]. More precisely, we can suggest here that, like Ono et al. have already
reported [33], assembly of BR-deficient mutant partially takes place in Golgi or post Golgi
vesicles.
Concerning the NC and p6 substitutions, we are in agreement with previous studies that
demonstrated the importance of these two domains for VLP production. It seems clear that
the deletion of p6 results in severe defaults in VLP release, which is in agreement with the
literature [44]. Although the Δp6 mutant displays a classical VLP morphology, assembling
at the plasma membrane, the particles appear unable to pinch off the cell membrane. They
seem to remain tethered to the cell surface, which implies the necessity of a late domain
that is able to interact with ESCRT complexes for efficiently budding out of the cells
[8,9,46]. On the other hand, we obtained for the ΔNCp6 mutant results somewhat different
from previously published ones. As depicted in Fig. 7C, Gag seems to assemble directly
underneath the plasma membrane, in contrast to the formation of large patches of Gag
already described [42]. Considering that the ΔNCp6 mutant consists in MA, CA and SP1, it
is not surprising that the targeting of the protein to the plasma membrane is occurring. The
CA region, along with the adjoining SP1 14 amino acids, may adopt a hypothetical α-helix
conformation. This region is well known to mediate strong Gag-Gag interactions, leading
to higher-order multimerization critical for particle assembly. Therefore, the morphology
observed in this TEM study for the ΔNCp6 mutant agrees with its expected properties.
Now, concerning the double substitution mutant NCp6378LZLD, it is released efficiently
from HEK293T cells as confirmed by the TEM results. This agrees with previous
substitutions of p6 with the RSV p2b region [48], and of NC with a heterologous LZ
domain [43]. It is noteworthy that for replacing NC, instead of the GCN4 yeast sequence
used in Gag min by Accola et al. we selected the hCREB sequence, a sequence successfully
used previously for the same purpose [43]. Indeed, in the perspective of the VLPs being
used in vaccine preparations, we preferred to avoid including an exogenous domain, which
can interfere with the immune VLP specific response. Moreover, to the best of our
99
knowledge, this is the first such double substitution of NC and p6, in an otherwise intact
Gag.
Finally, the most noteworthy mutant in this study is CAΔNTD, in which the N-terminal
domain is entirely deleted. With biochemical methods, we were able to detect, as expected,
a protein signal for CAΔNTD, both in the cell lysate and supernatant, indicating that this
mutant was able to produce VLPs. Remarkably however, electron microscopy showed a total
absence of VLP formation, either intracellularly or extracellularly (Fig. 8C). We suggest that the
supernatant protein signals detected biochemically may correspond partially to cell-free
patches of cell plasma membrane containing densely-aggregated Gag mutant proteins and
not bona fide VLPs. However the cellular release of microvesicles and/or exosomes cannot
be totally excluded even though this scenario is not supported by our TEM data. Additional
studies are warranted to validate this postulate. This discovery disagrees with the
commonly accepted notion that NTD is dispensable for VLP production [18,19], but rather
plays a role in the rearrangement of different Gag components during the maturation
process. We are currently investigating the reasons why the CA NTD appears to be
important in VLP production at least under our experimental settings. It may be that the
NTD region allows weak interactions with the CTD during virus assembly as suggested by
a previous study [31]. The authors clearly demonstrated that point mutations in helices 4-6
greatly reduce viral production. It is also possible that these mutations disrupt the overall
folding of CA. The structure of full-length HIV-1 CA has been previously depicted by
Ganser-Pornillos and colleagues [10,64] and it was shown that NTD-NTD forms the
hexamerisation interface, whilst CTD-CTD forms the dimerization interface, and that an
additional interface exists between NTD and CTD in a mature CA context. This might help
to explain why deletion of the CA NTD prevents VLP formation.
In conclusion, the observed requirement of NTD for Gag-Gag interaction and consequently
for Gag assembly may explain the failure of Gag min to lead to VLP formation in our
experimental setting. Therefore, we believe that a better understanding of mechanisms
underlying VLP production will help the scientific community in future design of VLP-
based HIV-1 vaccines.
100
Methods Pr55Gag molecular constructs
Gag sequences were derived from the hGag-TAP construct (i.e. HXB2-based vector)
(GenBank K03455) in which codons were humanized [65]. Gag fragments were PCR
amplified with Taq Hi-Fi (Invitrogen, Burlington, Canada) from the hGag-TAP construct
and cloned into the pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen, Burlington, Canada) using HindIII
(forward) and EcoRI (reverse) restriction sites present in respective PCR primers
(restriction sites are underlined in the following primer sequences). We constructed a series
of mutant Pr55Gag expression plasmids as depicted in Fig. 1. In brief, the Gag wild-type
(Gag WT) sequence was amplified using forward primer 5'-CCC AAG CTT ATG GGC
GCC CGC GCC AGC and reverse primer 5'-CCG GAA TTC TCA TTG TGA CGA GGG
GTC GCT GC. The MAΔ8-132 construct involved deletion of the MA domain except for
the myristylation signal sequence included in the forward primer (shown in italic): 5'- CCC
AAG CTT ATG GGC GCC CGC GCC AGC GTG CCC ATC GTG CAG AAC ATC CAG.
The reverse primer was the same one as for the Gag WT construct. In the p6449LD
construct, the p6 domain was replaced by a LD sequence derived from the RSV p2b
domain [48], which consists of a TASAPPPPYVG motif in the expressed protein. The
corresponding motif sequence was introduced in the reverse primer (shown in italic). The
forward primer used was the same as for Gag WT construct, and the reverse primer was 5'-
CCG GAA TTC TCA GCC CAC GTA GGG AGG TGG AGG GGC GCT GGC GGT AAA
ATT CCC TGG CCT TCC CTT G. For the MAΔ44-132 construct, fragment 1 was
amplified using the forward primer used for the Gag WT construct. The reverse primer
contained the sequences corresponding to the beginning of the CA domain (underlined in
the text) and to the end of the basic region sequence (shown in italic): 5'- CTG GAT GTT
CTG CAC GAT GGG GCG CTC CAG CTC GCG GCT G. For fragment 2, the forward
primer contained the end of the basic region domain sequence (shown in italic) and the
beginning of the CA domain sequence (underlined in the text): 5'- C AGC CGC GAG CTG
GAG CGC CCC ATC GTG CAG AAC ATC CAG. The reverse primer was the same one
as for the Gag WT construct. The two fragments were combined in a fusion PCR reaction
(see Δp6 construct below) using forward and reverse primers used for the Gag WT
construct. For the NCp6378LZLD construct, fragment 1 was PCR amplified with the
101
forward primer used for Gag WT construct. The reverse primer contained the sequence
corresponding to the beginning of the LZ domain (underlined in text) from the CREB gene
and the end of the SP1 spacer (shown in italic): 5'- TTT CTT CTT TCT ACG ACA CTC
TCG CAT GAT GGT GGC GCT GTT GGT C. For fragment 2, the DNA template used was
the plasmid KCREB1 provided generously by Dr. R. H. Goodman (Vollum Institute,
Portland, USA). The forward primer contained the end of the SP1 sequence (shown in
italic) and the beginning of the LZ sequence (underlined in the text): 5'- G ACC AAC AGC
GCC ACC ATC ATG CGA GAG TGT CGT AGA AAG AAG AAA. The reverse primer
contained the sequence corresponding to the end of LZ region (underlined in the text), a
sequence coding for LD (shown in italic) humanized according to a previously published
code [50] and the restriction site for EcoRI (underlined in the text): 5'- CCG GAA TTC
TCA GCC CAC GTA GGG AGG TGG AGG GGC GCT GGC GGT ATC TGA TTT GTG
GCA GTA AAG G. The two fragments were combined in a fusion PCR (see Δp6 construct
below) using the forward primer used for fragment 1 amplification and the reverse primer
used for fragment 2 amplification. For the CAΔNTD construct, fragment 1 was amplified
using the forward primer used for the Gag WT construct. The reverse primer contained the
sequences corresponding to the beginning of the CA MHR domain (underlined in the text)
and to the end of the MA domain (shown in italic): 5'- GTC CAG GAT GCT GGT GGG
GCT GTA GTT CTG GCT CAC CTG GTT G. For fragment 2, the forward primer contained
the end of the MA domain (shown in italic) and the beginning of the CA MHR domain
(underlined in the text): 5'- C AAC CAG GTG AGC CAG AAC TAC AGC CCC ACC AGC
ATC CTG GAC. The reverse primer was the one used for the Gag WT construct. The 2
fragments were combined in a fusion PCR reaction (see Δp6 construct below) using
forward and reverse primers used for the Gag WT construct.
The Gag min construct was based on published work describing the minimal Gag sequence
required to generate VLPs [18]. Fragment 1 was amplified with a forward primer
containing a HindIII restriction site (underlined in the text), a myristylation site (shown in
italic) and the beginning of the CA MHR domain (underlined in the text): 5'- CCC AAG
CTT ATG GGC GCC CGC GCC AGC GTG AGC CCC ACC AGC ATC CTG GAC. The
reverse primer contained the sequences corresponding to the beginning of LZ domain
(underlined in the text) and to the end of the SP1 sequence (shown in italic): 5'- TTT CTT
102
CTT TCT ACG ACA CTC TCG CAT GAT GGT GGC GCT GTT GGT C. For fragment 2,
the template DNA used was the KCREB1 plasmid. The forward primer contained
sequences corresponding to the end of SP1 (underlined in the text) and to the beginning of
the LZ domain (shown in italic): 5'- G ACC AAC AGC GCC ACC ATC ATG CGA GAG
TGT CGT AGA AAG AAG AAA. The reverse primer was the same one as for the
NCp6378LZLD construct. The 2 fragments were combined in a fusion PCR using the
forward primer used for fragment 1 and the reverse primer used for fragment 2.
For both Δp6 and ΔNCp6 constructs, the forward primer was the same one as for the Gag
WT construct. The reverse primer used for the Δp6 construct was 5'- CCG GAA TTC TCA
AAA ATT CCC TGG CCT TCC CTT G. The reverse primer used for the ΔNCp6 construct
was 5'- CCG GAA TTC TCA CAT GAT GGT GGC GCT GTT GG. Chimeric sequences
were generated by fusion PCR. Briefly, two fragments were PCR amplified using Taq Hi-
Fi. The reverse primer of fragment 1 contained a sequence for future annealing to the
beginning of fragment 2 and the forward primer of fragment 2 contained a sequence for
future annealing to the end of fragment 1. Both PCR products were purified on DNA-
binding columns (Qiagen, Mississauga, Canada). Then, 2.5 µl of each purified fragment
were combined with a master mix containing Taq Hi-Fi buffer, MgSO4, dNTPs and Taq
Hi-Fi. Five cycles of PCR amplification were completed under these conditions. During the
denaturation step of cycle 5, primers were added: a forward primer containing the HindIII
restriction site annealing to the beginning of fragment 1, and a reverse primer containing
the EcoRI restriction site annealing with the end of fragment 2. Next, 25-30 additional
cycles were completed. The fusion PCR product was purified on agarose gel, then digested
with HindIII and EcoRI and cloned into vector pcDNA3.1 (+).
Cell culture and transfection
The HEK293T cell line was used to produce VLP stocks. This cell line was obtained from
the American Type Culture Collection (Manassas, VA) and maintained in Dulbecco’s
modified Eagle medium (DMEM) (Invitrogen, Burlington, Canada) supplemented with
10% heat-inactived foetal bovine serum (Invitrogen, Burlington, Canada), penicillin G
(100 U/ml), and streptomycin (100 µg/ml) at 37°C in 5% CO2. For calcium phosphate
transfection, the various plasmids were transfected in 40-50% confluent HEK293T cells in
103
T75 cm2 flasks (BD, Oakville, Canada), as described previously [66,67]. Briefly, fifteen
micrograms of plasmid were used to transfect HEK293T cells and at 6 h post-transfection,
the medium was discarded and cells washed twice with phosphate-buffered saline (PBS).
Finally, 10 ml of fresh medium was added and the cells were incubated for an additional 48
hours.
Preparation of cell lysates and VLP supernatants
Cell supernatants were collected 48 h post-transfection, centrifuged at 4°C for 5 min at 300
× g, and filtered through a 0.22 µM pore-size cellulose acetate membrane to remove
cellular debris (ThermoFisher Scientific, Ottawa, Canada). For virus release assays, the
cell-free supernatants were centrifuged through a 2 ml 20% sucrose cushions in TSE (10
mM Tris hydrochloride [pH 7.5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) at 4°C for 45 min at
274,000 × g (SW41 rotor at 40,000 rpm; 2 ml of cushion for 10 ml of supernatant from
each T75 cm2 flask) [21]. The pellets were then resuspended in 150 µl of
immunoprecipitation buffer (IPB) (20 mM Tris hydrochloride [pH 7.4], 50 mM NaCl, 1%
Triton X-100) containing a protease inhibitor cocktail (ThermoFisher Scientific, Ottawa,
Canada). The samples were aliquoted and stored at -80°C. As for the transfected cells, they
were washed once with 10 ml of room temperature PBS, detached with 10 ml of ice-cold
PBS, and pelleted with a brief centrifugation at 4°C for 5 min at 300 × g. The cell pellets
were lysed in 1 ml of IPB containing protease inhibitors, followed by a brief vortexing and
microcentrifugation at 4°C for 5 min at 13,000 × g to remove insoluble materials. Cell
lysates were aliquoted and stored at –80°C. All cell lysate samples were normalized with
BCA protein quantification assays (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, Canada).
Gradient SDS-PAGE and Coomassie blue staining
Normalized quantities of cell lysates or VLP supernatants were mixed with an equal
volume of 2X sample buffer (125 mM Tris hydrochloride [pH 6.8], 4 % sodium dodecyl
sulfate (SDS), 20 % glycerol, 3.1 % dithiothreitol (DTT), 0.25 % bromophenol blue), and
boiled for 5 min at 100°C. Samples were left to migrate on a 7.5-20% gradient SDS-
polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Thereafter, the gels were incubated for 15 min
in Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad laboratories, Mississauga, Canada) (0.4% R250, 10%
104
acetic acid, 30% methanol), and then discoloured in a mixture of 10% acetic acid and 30%
methanol. Gels were digitized with a scanner (SnapScan e20, AGFA). Benchmark Standard
ladder protein was used (Invitrogen, Burlington, Canada).
Immunoprecipitation (IP) and Western blots analyses
To precipitate the Gag protein, we used the monoclonal antibody specific for the major core
capsid protein p24 purified from the 183-H12-5C hybridoma (AIDS Repository Reagent
Program, Germantown, USA). Briefly, 5 µg of 183-H12-5C antibody were added to cell
lysates or cell-free supernatants at 4°C for at least 30 min on a rotary shaker (Labquake,
Thermo scientific, Ottawa, Canada). Next, 30 µl of protein A/G plus-Agarose (Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, USA) were added, and agitated at 4°C for 1 h on a rotary
shaker. Next, four washes were done with IPB, followed by microcentrifugation at 4°C for
30 sec at 13,200 × g. Finally, pellets were resuspended with an equal volume of 2× sample
buffer (125 mM Tris hydrochloride [pH 6.8], 4 % sodium dodecyl sulfate (SDS), 20 %
glycerol, 3.1 % dithiothreitol (DTT), 0.25 % bromophenol blue). After boiling for 5 min,
the samples were microcentrifuged for 1 min at 13,000 × g and transferred to a new tube in
order to eliminate beads. Samples were left to migrate on gradient SDS-polyacrylamide gel
as described above.
After SDS-PAGE migration, proteins were transferred onto Immobilon-P PVDF 0.45 µM
membranes (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, Canada) by standard blotting technique.
Proteins were revealed with a biotinylated anti-p24 antibody (183-H12-5C hybridoma)
(EZ-link sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific, Ottawa, Canada). Primary
biotinylated antibodies were detected with Cy-3-conjugated streptavidin (Jackson
ImmunoResearch Lab, Inc) at a working concentration of 0.5 µg/ml. Fluorescent signal
detection was achieved by scanning the membrane with a fluorescent laser scanner
Typhoon 9200 (GE Healthcare Canada, Mississauga, Canada). In order to determine the
protein’s molecular weight, the standard protein ladder used was the ECL Plex Fluorescent
Rainbow markers (GE Healthcare Canada, Mississauga, Canada). HIV-1 Gag proteins
immunodetected on membranes were quantitated with ImageQuant version 5.2 software,
and background correction (local average) was applied for all conditions tested. Graphic
105
was normalized with Pr55Gag wild-type proteins (WT) and expressed as a percentage of
WT.
Electron microscopy
HEK293T cells were transfected with the studied VLP constructs as described above. The
cells were harvested 48 h post-transfection, fixed in a solution of 0.1 M cacodylate buffer
containing 8 % sucrose and 2.5 % glutaraldehyde, washed in the same buffer overnight, and
then post-fixed with 1 % osmium tetroxide at 4°C for 90 min. Dehydration with graded
ethanol was then performed, and the cell samples were embedded in Eponate resin
(Poly/Bed 812; Polysciences, Burlington, Canada). Sections of 60-80 nm were stained with
uranyl acetate and lead citrate, and observed under a JEOL 1010 TEM at a magnification of
50,000, Digital images were processed with the Gatan digital micrograph software version
3.10.1.
Indirect immunofluorescence assays
Prior to transfection, cells (1 x 104) were plated in 24-well plates (BD, Oakville, Canada)
containing German Glass coverslips coated with poly-L-Lysine. Cells were transfected
using the calcium phosphate protocol described above; 48 h post-transfection, cells were
washed twice with PBS, fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) at room temperature for 20
min, and washed four times with PBS. Cells were incubated for 30 min with
blocking/permeabilization buffer (1 % bovine serum albumin (BSA), 0.1% Triton X-100,
and 10% human heat inactivated serum (HHIS)). After four additional washes with PBS,
cells were stained with the anti-p24 183-H12-5C antibody. Following washes with PBS,
cells were incubated with an Alexa 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody
(Invitrogen, Burlington, Canada) and, finally, the nuclei were stained with 4',6-diamidino-
2-phenylindole (DAPI) provided by Invitrogen (Burlington, Canada). After several washes,
slides were mounted in Fluoromount G (Invitrogen, Burlington, Canada). The samples
were visualized using a Nikon eclipse TE 300 inverted microscope at a 1000X
magnification. Digital images were processed with ImageJ software, version 1.42q
(NIH, rsbweb.nih.gov/ij).
106
Acknowledgements The authors wish to thank Sylvie Méthot for her excellent technical assistance in writing
this manuscript and the Bioimaging Platform from Infectious Disease Research Center.
This study was performed by P.J. in partial fulfillment of his PhD degree in the
Microbiology-Immunology Program, Faculty of Medicine, Laval University.
107
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111
Figure Legends Figure 1. Schematic representation of the different HIV-1 Pr55Gag-derived constructs used in this study. The various molecular constructs, derived from the HXB2 Pr55Gag sequence (designated
here as Gag WT), were made by PCR as described under the Materials and Methods
section. All constructs contain the wild-type myristic acid post-translational sequence in the
N-terminal position and all were subcloned into the pcDNA3.1 (+) eukaryotic expression
vector. Wild-type HIV-1 sequences are denoted in black, and deleted virus sequences
correspond to the dotted line. Numbers above correspond to amino acids in the wild-type
sequence. BR, basic region of MA; NTD, N-terminal domain; CTD, C-terminal domain.
Figure 2. Gag min in the context of an expression vector fails to produce VLPs. (A) 293T cells were transfected with vectors expressing either Gag WT or Gag min. The
mock represents 293T cells transfected with the empty pcDNA3.1 (+) vector (used as a
negative control). At 48 h post-transfection, cell lysates (Cl) and cell-free supernatants
(Sup) were analyzed on a gradient SDS-PAGE and the protein stained with Coomassie
Brilliant Blue. (B) In parallel, an IP assay was performed using an anti-p24 antibody on the
same samples (Cl and Sup). Precipitated proteins were run on a gradient SDS-PAGE and
Gag proteins were analyzed by western blotting (WB) with a biotinylated anti-p24
antibody. (C) 293T cells expressing Gag WT or Gag min construct were analyzed by TEM
(magnification: × 50,000). The Biochemical experiments shown are representative of at
least three independent experiments and two for the microphotographs.
Figure 3. Gag min proteins show a diffuse distribution pattern. 293T cells were transfected either with Gag WT (upper panels), Gag min (middle panels)
or pcDNA3.1 (+) vector (bottom panels). At 48 h post-transfection, cells were fixed and
permeabilized for immunofluorescence assays as described in Materials and Methods.
Nuclei were stained with DAPI. White arrows indicate a punctiform distribution of Gag
proteins. The samples were visualized with a Nikon eclipse TE 300 inverted microscope
(magnification: x 1,000). The experiment shown is representative of 3 independent
experiments.
112
Figure 4. MA region is not required for VLP production. (A) 293T cells were transfected either with Gag WT, MA mutants (i.e. MAΔ8-132 and
MAΔ44-132) or pcDNA3.1 (+) vector. At 48 h post-transfection, both the cell lysates and
cell-free supernatants were analyzed on a gradient SDS-PAGE with Coomassie Brilliant
Blue staining. (B) In parallel, an IP assay was performed using the anti-p24 antibody on the
same samples. Precipitated proteins were run on gradient SDS-PAGE and Gag proteins
were analyzed by Western Blotting (WB). The Biochemical experiments shown are
representative of at least three independent experiments.
Figure 5. Quantitative analysis of VLP formation. Gag protein signals from cell-free supernatants and cell lysates following transfection with
the studied HIV-1 Pr55Gag-derived plasmids were quantified by scanning the band densities
on the WB membranes using a Typhoon 9200 fluorescent laser scanner. Ratios of total Gag
protein levels in the cell-free supernatants to those in cells extracts were determined for
each construct, and compared with the same ratio for Gag WT. Results shown were
obtained by dividing the release ratio for each mutant by the ratio for the Gag WT and
multiplying by 100. Data shown represent at least three independent experiments for each
mutant. Error bars indicate standard deviations.
Figure 6. The Basic Region of MA allows a more efficient particle release. 293T cells expressing either Gag WT or MA mutants (i.e. MAΔ8-132 and MAΔ44-132)
were examined by TEM (magnification: × 50,000). The microphotographs shown are
representative of 2 independent experiments.
Figure 7. Domains NC and p6 are required for VLP release, although they can be replaced with heterologous hCREB and p2b sequences. (A) 293T cells were transfected either with Gag WT or expression vectors encoding for
NC or P6 mutants (i.e. Δp6, ΔNCp6, p6449LD and NCp6378LZLD). At 48 h post-
transfection, cell lysates and cell-free supernatants were analyzed on gradient SDS-PAGE
and protein stained with Coomassie Brilliant Blue. (B) In parallel, an IP assay was
performed using the anti-p24 antibody on the same samples. Precipitated proteins were run
on SDS-PAGE and Gag proteins were analyzed by WB. (C) Transfected 293T cells were
113
analyzed by TEM (magnification: × 50,000). The Biochemical experiments shown are
representative of at least three independent experiments and two for the microphotographs.
Figure 8. Domains NC and p6 are required for VLP release, although they can be replaced with heterologous hCREB and p2b sequences. (A) 293T cells were transfected either with Gag WT or expression vectors encoding for
NC or P6 mutants (i.e. Δp6, ΔNCp6, p6449LD and NCp6378LZLD). At 48 h post-
transfection, cell lysates and cell-free supernatants were analyzed on gradient SDS-PAGE
and protein stained with Coomassie Brilliant Blue. (B) In parallel, an IP assay was
performed using the anti-p24 antibody on the same samples. Precipitated proteins were run
on SDS-PAGE and Gag proteins were analyzed by WB. (C) Transfected 293T cells were
analyzed by TEM (magnification: × 50,000). The Biochemical experiments shown are
representative of at least three independent experiments and two for the microphotographs.
114
Figure 1.
115
Figure 2.
116
Figure 3.
117
Figure 4.
118
Figure 5.
119
Figure 6.
120
Figure7.
121
Figure 8.
123
Chapitre 7 : L'acquisition sélective d'ICAM-1 par le VIH-1 est dépendante du domaine de matrice
Ce chapitre a fait l'objet d'une demande de brevet ainsi que d’une soumission éventuelle à
la revue PLOS Pathogens.
Résumé
Le VIH-1 acquiert un nombre impressionnant de molécules cellulaires durant sa formation
et son bourgeonnement. En dépit de tous les efforts consacrés à étudier les molécules
incorporées par le virus, le(s) mécanisme(s) exact par lequel toutes ces molécules sont
acquises n'est toujours pas connu. Cependant, dans le cas d'ICAM-1, une des molécules
transmembranaires les plus étudiées, il apparaît que le précurseur Pr55Gag est un candidat
potentiel d'interaction avec ICAM-1. Par conséquent, nous avons étudié et caractérisé au
niveau moléculaire le processus d'incorporation d'ICAM-1 en utilisant dans un premier
temps un modèle de pseudo particule virale (VLPs) dérivé de Pr55Gag. La substitution de
plusieurs domaines de Pr55Gag tels que la nucléocapside, SP2 et p6 n'ont pas d'effet sur
l'acquisition d'ICAM-1. Toutefois, nous avons démontré que la protéine de matrice (MA)
est nécessaire pour son incorporation dans les VLPs. Nous avons confirmé ces résultats
préliminaires en générant le mutant de matrice dans un clone moléculaire couramment
utilisé en laboratoire (NL4.3). Des études complémentaires suggèrent que les deux tiers C-
terminal de MA sont importants et en particulier treize acides aminés présents dans l'hélice-
α 5. De plus, en se basant sur la modélisation 3D des interactions protéines-protéines et en
validant par la suite ces prédictions par immunocapture, nous avons trouvé qu'une série
d'acides aminés acides de MA interagit avec des acides aminés basiques de la queue
intracytoplasmique d'ICAM-1 et sont responsables de son incorporation. En résumé nos
résultats apportent de nouvelles connaissances dans le mécanisme moléculaire régissant
l'acquisition d'ICAM-1, une molécule de l'hôte connu pour renforcer l'infectiosité virale et
par conséquent moduler la pathogénèse du VIH-1.
124
Selective acquisition of host-derived ICAM-1 by HIV-1 is a matrix-dependent process:
consequences for subsequent course of infection and therapeutic approaches
Pascal Jalaguier1, Réjean Cantin1, Halim Maaroufi2, and Michel J. Tremblay1,3,* 1Axe des Maladies Infectieuses et Immunitaires, Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de
Québec-pavillon CHUL, Québec, Canada,2Plate-forme de Bio-informatique and Institut de
Biologie Intégrative et des Systèmes, Pavillon Charles-Eugène-Marchand, Université
Laval, Québec, Canada and 3Département de Microbiologie-Infectiologie et Immunologie,
Faculté de médecine, Université Laval, Québec, Canada
*Corresponding author. Mailing address:
Dr. Michel J. Tremblay
Axe des Maladies Infectieuses et Immunitaires, RC709
Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Québec-pavillon CHUL
2705 boul. Laurier, Québec (QC), Canada, G1V 4G2
Tel.: 1-418-525-4444 local 48274; Electronic address: [email protected]
125
Abstract
HIV-1 acquires an impressive number of foreign components during its formation.
Despite all the previous efforts spent studying the nature and functionality of virus-
anchored host molecules, the exact mechanism(s) through which such constituents are
inserted within emerging HIV-1 particles still remain(s) elusive. However, in the case of
ICAM-1, one of the most extensively studied transmembrane protein found associated with
mature virions, it has already been proposed that the Pr55Gag precursor polyprotein appears
as a potential interaction partner. We therefore investigated and characterized at the
molecular level the process of ICAM-1 incorporation using initially a Pr55Gag-based virus-
like particle (VLP) model. Substitution of various domains of Pr55Gag such as the
nucleocapsid, SP2, or p6 had no effect on the acquisition of ICAM-1. However, we found
that the structural Matrix protein (MA) is mandatory for ICAM-1 incorporation within
VLPs, and we confirmed this novel observation with the replication-competent HIV-1
molecular clone NL4.3. Additional studies suggest that the C-terminal two thirds of MA is
important and especially thirteen amino acids positioned inside the fifth α-helix. Moreover,
based on 3D modeling of protein-protein interactions (protein-protein docking) and further
validation by a virus capture assay, we found that a series of acidic residues in MA domain
interact with basic amino acids located in the ICAM-1 cytoplasmic tail. Altogether our
findings provide new insight on the molecular mechanism governing the acquisition of
ICAM-1, a host molecule known to enhance virus infectivity and thus possibly modulate
HIV-1 pathogenesis.
126
Author Summary
Intercellular adhesion molecule I (ICAM-1) is a cell surface host component known
to be efficiently inserted within emerging HIV-1 particles. It has been demonstrated that
host-derived ICAM-1 molecules act as a strong attachment factor and increase substantially
HIV-1 infectivity. Despite all the previous efforts spent studying virus-anchored host
molecules, the exact mechanism(s) through which such constituents are inserted within
emerging HIV-1 particles still remain(s) elusive. However, it has already been proposed
that the Pr55Gag precursor polyprotein appears as a potential interaction partner with ICAM-
1. In the present study, results from 3D modelling, protein-peptide docking and capture
assay with wild-type and mutated virus indicate that the ICAM-1 incorporation process
relies on interactions between some acidic residues in HIV-1 matrix domain and basic
residues in the cytoplasmic tail of ICAM-1. Importantly, some observations were
confirmed in whole virus preparations amplified in primary human cells, thereby providing
physiological significance to our data.
127
Introduction
Nascent HIV-1 particles incorporate a large spectrum of proteins from host origin
during assembly and budding processes [344,446,538]. Such host-derived molecules have
been found either located inside viral particles or embedded in the virus envelope
depending on their natural location in target cells [446]. For example, different cytoplasmic
constituents have been found to be acquired by HIV-1 such actin, actin-binding proteins
and EF-1α [442,538]. Several other intracellular host proteins have been also detected
within virions such as Tsg101, Staufen, INI1 and cyclophilin A, each of them participating
in distinct steps of the viral life cycle [344,538]. HIV-1 also incorporates different
transmembrane proteins that are found anchored in the viral envelope, of which ICAM-1 is
probably the most extensively studied [539]. Despite numerous studies aimed at the
identification of virus-anchored host molecules, the exact mechanism(s) through which
such cellular constituents are acquired by emerging HIV-1 particles remains obscure. It has
already been postulated that insertion of a given host-derived molecule in newly formed
viruses is due to three non-mutually exclusive phenomena [538]: i) a host protein is
passively acquired by emerging virions due to its presence in microdomains also used by
the virus to assemble and bud (e.g. lipid rafts, tetraspanin web), ii) a direct interaction
between host- and virus-encoded proteins, and/or iii) a host component is indirectly
interacting with a viral constituent (i.e. requires at least a third partner).
ICAM-1 is a heavily glycosylated transmembrane protein that contains five (5)
distinct extracellular domains, a transmembrane region and a short cytoplasmic tail of 28
amino acids. The intracellular region interacts with cytoskeletal proteins such as α-actinin,
ezrin and actin [540,541]. Moreover, it has been demonstrated that the cytoplasmic tail of
ICAM-1 associates with phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PI(4,5)P2) through a basic
region resembling the PI(4,5)P2 binding site. This results in an electrostatic interaction
which facilitates the association between ICAM-1 and the actin-binding protein ezrin [541].
The major biological role of ICAM-1 is to mediate cell-to-cell adhesion via interactions
with cell surface β2 integrins such as LFA-1 and Mac-1. This type of association is
essential for leukocyte transmigration and immunological synapse formation, two
phenomena associated with inflammation and the establishment of the immune response.
128
ICAM-1 is continuously expressed on endothelial cells and leukocytes, particularly on
CD4+ T cells and macrophages, the two major target cell types of HIV-1.
The efficient incorporation of ICAM-1 within HIV-1 has been demonstrated in
different clinical and field isolates of HIV-1 that were produced in established cell lines,
primary human cells (i.e. peripheral blood mononuclear cells/PBMCs) and human
lymphoid tissue cultured ex vivo [458,542,543,544]. Interestingly, it has been firmly
established that insertion of host-derived ICAM-1 within the virus envelope will lead to an
increase in both HIV-1 attachment and entry within CD4+ T cells [456,545]. It has been
reported that interactions between virus-associated host ICAM-1 and cell surface LFA-1
allows such virions to attach more firmly and fuse more rapidly with target cell than
isogenic viruses lacking the adhesion molecule [456,458,542,543]. The higher
permissiveness of both memory and activated CD4+ T cells to productive infection with
ICAM-1-bearing virions is mostly attributable to surface expression of an activated form of
LFA-1 [546]. Moreover, it was reported that cluster formation by LFA-1 also represents an
important event since these clusters are enriched in HIV-1 primary receptor (i.e. CD4) and
co-receptors (i.e. CXCR4) [546], two cell surface constituents known to be essential for the
creation of the fusion pore. The ICAM-1-mediated increase in HIV-1 infectivity is due to a
more productive entry process in primary human CD4+ T cells [456,545]. The replicative
advantage provided by the presence of host-derived ICAM-1 on HIV-1 should not be
underestimated since the sensitivity of ICAM-1-bearing virions to the fusion inhibitor T-20
is half that of the virus lacking ICAM-1 [547]. Moreover, an increase of the affinity/avidity
of LFA-1 for ICAM-1 through a conformational change further reduces the sensitivity of
ICAM-1-bearing virions to T-20 by another 4-fold. Similarly, the acquisition of ICAM-1
by emerging virions confers a resistance to antibody-dependent neutralization [548].
Interestingly, a productive infection is still taking place when using ICAM-1-bearing
viruses that carry suboptimal levels of gp120/41 [539]. Altogether these observations
clearly indicate that the virus-anchored host ICAM-1 is still functional when found
embedded within HIV-1 and can promote the early events in the virus life cycle (i.e.
attachment and entry). Therefore, given that virus-anchored host ICAM-1 increases virus
infectivity up to 100 fold, it seems legitimate to shed light on the structural determinants
responsible for ICAM-1 incorporation because this information can serve to develop new
129
classes of compounds that can abolish insertion of host-derived ICAM-1 in emerging HIV-
1 particles.
Pr55Gag is the structural viral constituent acting as the main actor in HIV-1 particle
formation as it drives assembly through protein-protein, protein-RNA, and protein-lipid
interactions, orchestrating the incorporation of each of the major virus-encoded components
into the assembled particle [48,51,549,550]. Pr55Gag is translated from unspliced viral
mRNA on free ribosomes in the cytoplasm and encodes the internal structural components
of the virion, i.e. matrix (MA), capsid (CA) and nucleocapsid (NC) along with the
C-terminal p6 domain and two spacer peptides SP1 and SP2 [253]. In the absence of any
other viral proteins, Pr55Gag can self-assemble into virus-like particles (VLPs) by ordered
multimerization of monomers and/or oligomers to produce a spherical shell [226], which
forms the structural framework of the immature virus particle [51,224].
Several regions of the Pr55Gag polyprotein have been reported to be crucial for
particle formation. Notably, previous genetic and structural analyses have demonstrated
that the regions responsible for membrane binding are located at the N-terminal region of
MA, which encompasses a cluster of basic residues and a myristyl group interacting with
acidic phospholipids of the membrane PI(4,5)P2 [316,551]. However, several studies have
shown that MA can be largely deleted or even entirely replaced by a heterologous myristyl
anchor without compromising the formation of extracellular viruses [243,245,246]. This
suggests that the role of MA in assembly is not as important as its role in Pr55Gag
trafficking and in the incorporation of virus-encoded envelope glycoproteins (ENV)
[240,315].
In the current work, we first show that Pr55Gag is sufficient by itself to lead to
insertion of host-derived ICAM-1 molecules in a VLP model devoid of any other HIV-1
constituents. Data from a virus capture assay indicate that functional VLP mutants carrying
substitutions of either NC, SP2 or p6 can still acquire host ICAM-1. Experiments with
additional mutants suggest that a two-third portion of MA is responsible for ICAM-1
incorporation using VLPs (i.e. MA∆44-132) as well as a molecular clone of HIV-1 (i.e.
NL4.3∆44-132) model. We further demonstrate using a protein structure modeling
approach to engineer additional mutants that insertion of host-derived ICAM-1 molecules
130
in emerging virions requires interactions between some acidic amino acids in HIV-1 MA
domain and basic residues within ICAM-1 cytoplasmic tail.
131
Results
Nucleocapsid, SP2 and P6 Gag domains are dispensable for ICAM-1 incorporation in
nascent HIV-1 particles.
It has been established previously that the Pr55Gag precursor polyprotein, which codes for
all the structural proteins of HIV-1 [37,226,310,313,552], acts as a dominant actor in the
process of acquisition of ICAM-1 [553]. Therefore, our initial series of investigations were
aimed at corroborating this observation through the use of a simple and pertinent model of
VLPs mimicking the immature virion state. For that purpose, only the full-length Gag gene
or different deletion and substitution Gag mutants were cloned into the pCDNA3.1+
expression vector. Based on a previous publication by our group where we characterized
different VLP mutants [227], we only selected deletion and substitution mutants giving rise
to functional VLPs able to form spherical particles that can be excreted in the extracellular
milieu. Initial experiments were conducted with the following three molecular constructs:
P6449LD, which carries a substitution of the P6 gene by the late p2b domain from the Rous
sarcoma virus (RSV); NCP6378LZLD, which bears a double substitution of the NC-SP2
and p6 regions by a heterologous leucine zipper domain (bZIP) and LD form RSV
respectively [554,555,556,557]; and, finally, MA∆44-132 that carries a deletion of 89
amino acids in the MA gene. The studied VLP-encoding mammalian expression vectors
were transiently transfected in a 293T cellular clone stably expressing a constant level of
ICAM-1 on its surface [544]. As depicted in Fig. 1, the virus producer cell line expresses a
surface level of ICAM-1 that is slightly higher than in primary human cells acutely infected
with HIV-1 (i.e peripheral blood mononuclear cells/PBMCs) (Fig. 1), which provides
physiological relevance to our studies. Next, the cell-free supernatants were harvested at 48
hours following transfection and VLPs concentrated by ultracentrifugation. Finally, a virus
capture assay based on an immunomagnetic isolation of ICAM-1-bearing VLPs was
executed before lysis of the isolated material in hot SDS sample buffer prior to a western
blot analysis. As depicted in Fig. 2A, the expressing vector coding for the complete Pr55Gag
precursor polyprotein (called Gag WT), which is free of any other HIV-1 constituent,
produces VLPs that can efficiently acquire host-derived ICAM-1. A comparable ICAM-1
incorporation process was seen also in VLPs obtained after transfection of P6449LD and
132
NCP6378LZLD molecular constructs. Virus capture assays with an irrelevant isotype-
matched control antibody gave no signal. It can be concluded that NC, SP2 and p6 domains
are dispensable for ICAM-1 incorporation in this VLP model. In fact, Gag density
quantification of the protein bands confirmed that the levels of captured VLPs are
comparable for all the conditions tested (Fig. 2B). Those data are in complete agreement
with our previously published results incriminating Pr55Gag in the ICAM-1 incorporation
process [553].
The C-terminal region of MA is required for ICAM-1 incorporation.
The third VLP mutant called MA∆44-132 was subjected to the same experimental
procedure and, in sharp contrast to the two other mutants, we could barely isolate any
ICAM-1-bearing VLPs (Fig. 3A). Indeed, only a very faint signal at 46 kDa corresponding
to the MA mutant could be observed compared to the strong band detected for Gag WT.
This result was confirmed by densitometry analysis, where less than 10% of the MA signal
could be detected as compared to the WT Gag (Fig. 3B). To our knowledge, this is the first
demonstration that a defined domain in Gag is involved in the acquisition of host ICAM-1
molecules by HIV-1, at least in a VLP experimental model system. To further characterize
and confirm this finding with a fully competent HIV-1, we reproduced the exact
corresponding Gag deletion in the prototype laboratory proviral clone pNL4.3. Transposing
that matrix 44-132 deletion to the protease positive NL4.3 provirus, we then faced a
constraint with regard to the virus assembly process [240,558]. Obviously, a deletion of 89
amino acids from the C-terminal end of MA strongly affects its capacity to produce
spherical functional virions, which might be essential for ICAM-1 incorporation. So to
circumvent this issue, the virus producer cell line was pretreated with a potent protease
inhibitor (i.e. indinavir) and this strategy allowed the formation of immature virus particles
(data not shown). Similar observations were made with the NL4.3∆44-132 mutant when
compared to the MA∆44-132 construct (Fig. 4A). Bands migrating at the 55, 41 and 24
kDa levels corresponding to Pr55Gag, maturation intermediate p41 and capsid p24,
respectively, were detected for NL4.3 WT, while no signals were seen for the MA deletant.
Quantification of the bands revealed a virtually complete loss of ICAM-1 incorporation
(Fig. 4B). In this context, we were able to confirm that the MA region is really involved in
133
the process of ICAM-1 incorporation in both immature and mature HIV-1 particles. For the
ensuing experiments using MA mutants bearing either a short deletion or point mutations,
which imply less structural and morphological consequences for emerging viruses, a
classical virus production system was used based on p24 quantification by ELISA of
pelleted viral particles.
Protein-protein docking reveals a putative direct interaction between HIV-1 MA and
human ICAM-1.
Thereafter, we aimed at refining the molecular relationship between those two proteins of
distinct origins (i.e. viral and cellular). For that purpose, we investigated any potential
interactions between HIV-1 MA and ICAM-1 by a protein-protein docking approach. This
method highlighted areas of interest in each molecule (Fig. 5, panels A and B). The
putative interacting region in the HIV-1 MA appears to be localized in the fifth α-helix and
encompasses the following amino acids 96-DTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAAD-
121 (Fig. 5C). On the other hand, de novo 3D modeling revealed a stretch of amino acids
contained inside the predicted α-helix in the intracytoplasmic tail of ICAM-1 that appears
to potentially interact with the HIV-1 MA, i.e. 504-NRQRKIKKYRLQQAQKGTP-523
(Fig. 5C). First, to experimentally confirm the computational protein modeling and
demonstrate the contribution of these two domains in ICAM-1 incorporation, we
engineered the respective deleted mutants in both HIV-1 MA (i.e. NL4.3 Del 102-114) and
human ICAM-1 (i.e. CD54 Del 505-514) genes. As depicted in Fig. 6A we observed a
significant diminution of ICAM-1 incorporation (75-90%) when using NL4.3 Del 102-114
compared to NL4.3 WT. A substantial reduction in the level of ICAM-1 incorporation (65-
75%) was also detected when testing the ICAM-1 deleted mutant called CD54 Del 505-514
(Fig. 6B). The slight discrepancy in ICAM-1 incorporation between these two deleted
mutants is most likely associated with different ICAM-1 expression levels in cells
producing the NL4.3 Del 102-114 (Fig. 6C) and CD54 Del 505-514 mutant viruses (Fig.
6D). Indeed, a 4-fold increase in ICAM-1 expression was seen in cells producing CD54 Del
505-514 compared to those generating NL4.3 Del 102-114 viral entities. This is perfectly in
line with a previous work showing a liner correlation between the degree of ICAM-1
incorporation and the surface expression level of ICAM-1 in virus producer cells [544].
134
The negative charges in HIV-1 MA interact with basic residues within cytoplasmic tail
of ICAM-1 and drive its incorporation.
Having demonstrated that the two predicted domains within HIV-1 MA and human ICAM-
1 are clearly involved in the insertion of this host adhesion molecule in virions, we intended
to refine our observation by trying to identify the specific amino acids involved in this
process. Based on our predictive model (Fig. 5), we concentrated our efforts on a series of
negatively charged amino acids in the HIV-1 MA 102-114 domain that can potentially
associate with positive charges in the cytoplasmic end of ICAM-1. We first tried to
substitute the aspartate 102 and the two glutamates 105 and 106 for alanine because theses
residues should engage ionic interactions with corresponding ICAM-1 amino acids. We
then evaluated by the virus capture assay the ability of this mutant to acquire ICAM-1. We
found that such changes resulted in a diminution of 35 to 40 % of ICAM-1 incorporation
compared to WT NL4.3 (Fig. 7). This decrease in ICAM-1 incorporation is less important
than the data obtained with the Del 102-114 mutant (i.e. 75-90%). So we hypothesized that
the rest of negatives amino acids of the MA 102-114 region are implicated in the
interaction and/or a structural rearrangement involves the other negatives residues in the
interaction (amino acids compensation) and that we needed to completely remove all other
negatives charges present in the vicinity of this domain [559]. So we included the glutamate
107 which is right after E105 and E106 in our substitution mutant and observed a decrease
in ICAM-1 incorporation up to 55-59%. Although close to the Del 102-114 deletant, the
diminution is still weaker and other amino acid might also be involved in the ICAM-1
incorporation phenomenom. Analysis of the sequence illustrated the presence of a serine
residue at position 111. After phospho-prediction with the NetPhos 2.0 server we observed
that this serine is potentially phosphorlyated at 99%. So we also substituted this serine in
order to totally abrogate all potential negatives charges in the region (Fig. 8). Remarkably,
this cumulative new substitution mutant called D102A/E105A/E106A/E107A/S111A
diminished ICAM-1 incorporation up to 88% (75-88%), which is comparable to what is
seen with NL4.3 Del 102-114. It can be concluded that incorporation of host-derived
ICAM-1 by nascent HIV-1 particles relies heavily on the participation of only five
negatively charged amino acids in the complete HIV-1 MA domain.
135
Basic residues in the intracellular helix of ICAM-1 account for its incorporation
within HIV-1.
Concerning ICAM-1, there are six basic residues present within its cytoplasmic end, among
which three of them are arginine at positions 505, 507 and 513 and three lysines found at
positions 508, 510 and 511. Unfortunately for each of those amino acids mutated
individually or altogether, we could not detect a significant modulation in ICAM-1
incorporation compared to the WT protein (data not shown). We thought that this could be
due to the conformational rearrangement in the predicted α-helix within the cytoplasmic
part of ICAM-1 and the remaining basic amino acids compensate for mutated amino acids.
An alternative strategy was used by substituting all basic amino acid with an alanine in the
hypothetic α-helix of ICAM-1. The corresponding substitution mutant called CD54 R505,
507, 513A/K508, 510, 511A was made and tested for the insertion of host ICAM-1 in
progeny virus. Using this molecular construct, we are able to detect a significant decrease
in ICAM-1 incorporation (65-70%) (Fig. 9). Therefore, it can be concluded that these six
basic residues in the cytoplasmic tail of ICAM-1 are important for the selective acquisition
of this host constituent by HIV-1.
ICAM-1 incorporation is significantly reduced in HIV-1 MA mutant viruses grown in
primary human cells.
Finally we sought to investigate if the previous findings made with the HIV-1 MA mutant
D102A/E105A/E106A/E107A/S111A remain similar for virus preparations made in a more
physiological cell system. To this end, mitogen-treated PBMCs from three different donors
were inoculated with NL4.3 WT and NL4.3 D102A/E105A/E106A/E107A/S111A and
progeny virus was monitored for the extent of ICAM-1 incorporation. First of all, we
observed that the HIV-1 MA mutant D102A/E105A/E106A/E107A/S111A can still
replicate in PBMCs but to a lower level (i.e. 28-45%) compared to NL4.3 WT (data not
shown). More importantly, a significant decrease in ICAM-1 incorporation was seen in
each instance (Fig. 10). This experiment illustrates that the intimate link between HIV-1
MA and ICAM-1 is not cell type specific and can occur also in progeny virus produced in
natural target cells.
136
Discussion
Previous observations have revealed that the cell surface adhesion molecule ICAM-
1 is selectively acquired by HIV-1. This incorporation process involves mainly the Pr55Gag
polyprotein precursor as shown previously [553] and as confirmed in the current
experiments using VLPs. Pr55Gag seems to be sufficient per se for the insertion of host-
derived ICAM-1 in emerging virions, whereas the ENV and likewise other
regulatory/accessory HIV-1 proteins seem to be dispensable in this regard. Studies
performed with a series of Pr55Gag-derived VLP mutants revealed that we could easily
substitute NC, SP2 and P6 regions by heterologous sequences without affecting the ability
of ICAM-1 to be efficiently inserted within nascent viruses. We thus conclude that these
Pr55Gag domains are dispensable for ICAM-1 incorporation. Moreover, we found that a
large deletion in the MA gene give rise to VLPs lacking ICAM-1 and this crucial
observation was confirmed when using the laboratory strain NL4.3 (NL4.3∆44-132).
Refining this hotspot in MA by molecular protein-protein docking and point mutations, we
could come down to only a couple of negatively charged relevant residues (i.e. D102,
E105, E106 and E107) and the phosphorylated serine 111, to account for about 90% of
ICAM-1 incorporation.
On the other side, the cytoplasmic tail of ICAM-1 was also shown to be a key player
in the process of acquisition of this host constituent by HIV-1 [553]. Unfortunately the
crystal structure of the cytoplasmic domain of ICAM-1 has never been elucidated due to
the well-known difficulty of transmembrane proteins to crystallize. De novo modeling
allowed us to generate a new and accurate 3D model of the ICAM-1 intracellular tail. We
found a predicted α-helix proximal to the plasma membrane, composed of 19 amino acids
(i.e. 504-NRQRKIKKYRLQQAQKGTP-522), followed by a flexible tail (i.e. 523-
MKPNTQATPP-532). Within the α-helix, basic residues potentially interact with the acidic
residues of the MA ligand (highlighted in black). The nature of this interaction is mainly
due to engaged electrostatic forces. We found a series of ionic interactions within less than
10 Å, enough to generate a strong binding of the two molecules within such proximity
[560].
137
The intracellular domain 507-RKIKK-512 of ICAM-1 has already been described to
be critical for its spatial and dynamics localization with functional implication for
leukocyte adhesion and transmigration in the fibroblast cell line COS-7 [561]. Based on
this notion, one could hypothesize that this domain might have a similar role in the HIV-1
context, directing ICAM-1 in specific areas of the membrane where the virus is emerging.
However, we removed initially amino acids 507-RKIKK-512 from the intracellular tail, but
ICAM-1 incorporation was not affected as monitored by a virus capture assay (data not
shown). In light of this result, we then tested whether the two basic residues surrounding
this motif, namely R505 and R513, might compensate for the lost of positives charges
required for ICAM-1 interaction with MA. For that reason, we decided to substitute all
those positively charged residues with a neutral alanine. Our results revealed that this
domain is deeply involved in the association between host-derived ICAM-1 and virus-
encoded MA region, reducing ICAM-1 incorporation up to 70%. According to our
experimental model, it is clear that a region rich in basic residues present in the
intracytoplasmic tail drives ICAM-1 incorporation. We demonstrate for the first time that a
cellular transmembrane molecule interacts in very close proximity with Pr55Gag. Although
our results cannot confirm a direct interaction between MA and ICAM-1, our experimental
model strongly suggests that such an interaction occurs, given the theoretical very intimate
charged interactions encountered between residues on both sides.
The MA protein has been associated with important processes in HIV-1 biology.
Those functions have been so far almost exclusively mapped in the globular N-terminal
portion of the protein, through helices 1 to 4 [562]. The most studied and understood of
those is its association with the internal leaflet of the cellular membrane for Gag trafficking
and particle formation [563,564]. The N-terminal myristoylated residue in conjunction with
a group of conserved basic residues form a bipartite domain have been demonstrated to
target the Pr55Gag protein to membranes [316,565]. The basic residues interact with acidic
phospholipids, such as PI (4,5)P2. The N-terminal myristoyl moiety is well buried inside
the p17 protein, and interaction of MA with PI (4,5)P2 induces the anchorage of the
myristate inside the lipid membrane, especially within the lipid rafts. Residues in the basic
region of MA are also involved in the recruitment of the ENV proteins within the virion via
the cytoplasmic tail of gp41. However, the exact mechanisms and necessity of this
138
interaction remain poorly understood and need to be defined in more details. Finally other
interactions have been described with calmodulin, AP-3, TIP47, SOCS1, Lyric, EF1-α and
HO3 [564,566,567]. To our knowledge, we are the first to report a transmembrane cellular
factor interacting with MA, and also to report an interaction with a cellular factor inside the
fifth helix of the MA globular head. In a crystal model in which trimeric MA is bound to a
lipid leaflet, as first demonstrated by Hill and colleagues [56,241], the helix 5 extends away
from the globular head in a way that it is in an opposite direction to the plasma membrane.
We thus believe that it is highly plausible that in this configuration the helix 5 would be
accessible to interact with the putative intracellular helix of the ICAM-1 intracellular tail to
allow its eventual recruitment in nascent HIV-1 particles.
Our proposed model brings out new insights for the incorporation process of
transmembrane molecules acquired by HIV-1. A large part of the MA fifth α-helix appears
to be directly involved in the case of cell surface ICAM-1. Interestingly, sequence
alignment of >1600 HIV‐1 Group M subtype B for MA proteins in the Los Alamos HIV
database reveals a remarkably high degree of conservation at position 102-
DKIEEEQNKSKKK-114. Around 89 to 99% of the sequence is perfectly conserved,
except for residue D102 which is conserved at about 65 %. Nevertheless in this case,
aspartate is exchanged for a glutamate residue which retains the same negative charge at
this position, therefore not substantially affecting the overall negative charge of this region.
Most importantly, we should mention that all the relevant negatively charged residues (i.e.
D102, E105, E106 and E107) and the serine residue at position 111 are all highly
conserved. It is tempting to speculate that those key conserved residues might have evolved
to maintain ICAM-1 incorporation within the envelope of HIV-1. Nonetheless, no clear
function to the MA fifth α-helix has been illustrated yet, although a role in interacting with
CA p24 has been suggested [55]. In that sense, we cannot rule out that this highly
conserved region might play a crucial role in another aspect of the HIV-1
biology/pathology. A broader evaluation of the conservation of these residues in other HIV-
1 subtypes and variants is needed to draw any further conclusions.
The promising results obtained in primary human cells (i.e. PBMCs), achieving an
overall incorporation decrease of 66.4 %, goes in the same line as our observations made in
293T cells. This experiment illustrates that the intimate link between HIV-1 MA and
139
ICAM-1 is not cell type specific and can be reproduced in cells that more closely mimic
natural targets of HIV-1. It has now been clearly established that ICAM-1 incorporation
increases virus infectivity, presumably by offering a superior virus adherence onto target
cells, and improved fusion kinetics and a cytosolic entry leading to a more productive virus
infection [456,542,543]. This enhancement is even more amplified when its LFA-1
counter-ligand on susceptible cells is in a high affinity/avidity state, reaching up to almost 2
logs in some in vitro experiments. Our present study shed light on the intimate molecular
interactions between cellular ICAM-1 and viral Gag proteins. This opens a new avenue in
designing short peptide inhibitors that would circumvent the acquisition of ICAM-1 by
HIV-1 and weaken its replicative capacity. Having deeper knowledge on this interaction
will help to design short peptides possessing the necessary qualities such as a high affinity
for the targeted sequence, a great stability, an ability to cross the cell membrane and reach
the cytosol, no immunogenicity, a weak toxicity, an easy synthesis and a relatively low
cost.
From a clinical point of view, such weakened circulating viruses would become
more vulnerable and handicapped. As such, those viral particles would be more susceptible
to neutralizing antibodies and thus more vulnerable to the immune system. More
interestingly, as previously illustrated with the T-20 fusion inhibitor, viruses lacking
ICAM-1 would become also more susceptible to the action of some drugs used in HAART,
especially those intended to abrogate attachment and fusion events [547]. This has been
highlighted by our group by showing that using LFA-1 antagonists to block the interaction
LFA-1/ICAM-1 between the virus and the cell, the fusion inhibitor T20 is more potent in
blocking infection [568]. In addition, inhibition of ICAM-1 incorporation within HIV-1
might allow the administration of lower doses of some antiviral drugs and fewer side
effects for the patients. An approach targeting a virus-anchored host cell surface protein
might permit to circumvent problems due to the great genetic variability displayed by HIV-
1. We have previously reported that viruses bearing host-derived ICAM-1 specifically
target memory CD4+ T cells [545]. The current problematic in curing HIV-1 infection
remains at eliminating the viral reservoir pool that is mainly residing within quiescent
memory CD4+ T cells [569,570,571]. It can thus be postulated that by reducing ICAM-1
incorporation in circulating virions one might reduce the size of this stable reservoir which
140
is known to be established early in HIV-1 infection. Overall, the present study uncovers the
specific and selective incorporation of ICAM-1 within the envelope of HIV-1. Given the
virological and biological impact of this association, it offers the opportunity to develop
new and innovative therapeutic tools to fight this debilitating disease.
141
Materials and Methods Cell culture and transfection.
The human embryonic kidney cell line 293T was used to produce our virus preparations
(i.e. VLPs and complete NL4.3-derived mutant viruses). This cell line was maintained in
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) (Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada)
supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Invitrogen, Burlington,
Ontario, Canada) at 37°C under a 5% CO2 atmosphere. A cell line stably expressing
ICAM-1 was obtained by cotransfecting 293T cells with a pCDNA-3.1+ ICAM-1-
expression vector containing the human ICAM-1 cDNA and pCMV-Hygro at a 10 to 1
ratio. Such transfected 293T cells were maintained under selective pressure with
hygromycin B (400 mg/ml; Calbiochem) for 3 weeks and were next isolated by
fluorescence-activated cell sorter analysis with the use of a PE-labeled anti-ICAM-1
monoclonal antibody (BD Biosciences, Mississauga, Ontario, Canada) [544]. For calcium
phosphate transfection, 40 to 50% confluent 293T cells in T75 flasks (BD, Oakville,
Ontario, Canada) were transfected as described previously [542,572]. Briefly, fifteen
micrograms of the different plasmids weres used to transfect 293T cells. At 6h post
transfection (p.t.) medium was discarded and cells washed two times with phosphate-
buffered saline (PBS) and 10 ml of fresh medium was added. Immature HIV-1 particles
were produced by treating the virus producer cell lines with indinavir (20 µM) during
transfection experiments [553]. Primary peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from
healthy donors were isolated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation and
cultured in the presence of phytohemagglutinin-P (PHA-P; Sigma, St. Louis, Mo.)( 3
µg/ml) and recombinant human interleukin-2 (30 Units/ml) for 3 days at 37°C under a 5%
CO2 atmosphere prior to virus infection.
Flow cytometry.
For staining, cells were washed twice with PBS and centrifuged at 300 x g for 5 min at 4°C.
Pelleted cells were incubated for 30 min on ice with a saturated concentration of the PE
coupled ICAM-1 antibody as recommended by the manufacturer (BD Biosciences,
Mississauga, Ontario, Canada). Finally, cells were washed twice in PBS and resuspended in
142
500µl of PBS containing 1% paraformaldehyde prior to flow cytometry analysis
(FACSCanto II, BD Biosciences, Mississauga, Ontario, Canada).
Molecular constructs.
The VLP constructs P6449LD, NCP6378LZLD and MA∆44-132 were already described in
a previous publication [227]. The entire HIV-1 mutants were derived from the well-known
pNL4.3 molecular clone. Matrix regions were first PCR-amplified from the proviral DNAs.
Specifically, we amplified a region of gag extending from the BssHII to SphI unique
restriction sites which includes the MA coding region. The PCR products were TA cloned
into the pGEMT-easy vector (Promega, Madisson, Wisconsin, USA) and the BssHII–SphI
gag fragments were subsequently excised by restriction enzyme digestion [573]. The Gag
mutant cassettes were subcloned into the pNL4.3 proviral backbone with the desired
deletion or alanine substitution. Primers used for mutagenesis are summarized in the table
below. Underlined nucleotides correspond to the mutated codon for alanine substitution.
Mutants Forward Reverse NL4.3∆44-132 CCTATAGTGCAGAACCTCCAG TCGTTCTAGCTCCCTGCTTGC
NL4.3 del 102-114 GCACAGCAAGCAGCAGCT TAAGGCTTCCTTGGTGTCTTT
D102A/E105A/E106A AAGGAAGCCTTAGCTAAGATAGC
AGCAGAGCAAAACAAAAGT
GGTGTCTTTTACATCTATCCTTTG
ATGCACACAATAGAG
D102A/E105A/E106A/
E107A
AAGGAAGCCTTAGCTAAGATAGC
AGCAGCACAAAACAAAAGT
GGTGTCTTTTACATCTATCCTTTG
ATGCACACAATAGAG
D102A/E105A/E106A/
E107A/S111A
GCAGCACAAAACAAAGCTAAGAA
AAAGGCACAGCAAGCA
TGCTATCTTAGCTAAGGCTTCCTT
GGTGTCTTTTACATC
143
Preparation of virus stocks.
VLP and NL4.3-derived mutants that bear host-derived ICAM-1 were produced by calcium
phosphate transfection in 293T stably expressing ICAM-1, while isogenic virus
preparations lacking ICAM-1 were prepared in the parent 293T cell line (ICAM-1-
negative). At 48 h post-transfection, supernatants were collected and centrifuged at 4°C for
5 min at 1000 × g and filtered through 0.22 µM pore-size cellulose acetate membranes
(ThermoFisher Scientific, Ottawa, Ontario, Canada) to remove cells debris. The cell-free
supernatants were then ultracentrifuged through a 2 ml cushion of 20% sucrose in TSE
(10mM Tris hydrochloride [pH7.5], 100mM NaCl, 1 mM EDTA) at 4°C for 45 min at
28,000 rpm (Beckman Ti70 rotor; 2 ml of cushion for 10 ml of supernatants) [227,246].
The pellets were finally resuspended in PBS. VLP preparations were normalized by
western blot quantification while NL4.3-derived mutants were normalized for virion
content by using a sensitive in-house sandwich enzyme-linked immunosorbent assay that
can detect both p24 and the Pr55Gag precursor. Finally, samples were aliquoted before
storage at -85°C.
Immunocapture.
The presence of host-derived ICAM-1 within VLP and HIV-1 was monitored by capturing
viruses with immunomagnetic beads using a previously reported procedure with slight
modifications [553]. In brief, streptavidin-coated magnetic beads (7.5 x 106) (Dynabeads
M280, Invitrogen, Burlington, ON, Canada) were washed once with PBS supplemented
with 5 % bovine serum albumin (BSA) (binding medium) by using a vertical magnetic
plate. Next, beads were incubated with a biotinylated anti-ICAM-1 antibody (clone R6.5,
IgG2a) for 1 h at room temperature and then washed three times with PBS before use. The
immunomagnetic beads were next incubated for 16 h at 4°C with the virus preparations (2
and 40 ng of p24 for 293T and PBMCs, respectively) under gentle agitation. The beads
were washed four times with 1 volume of binding medium. Finally, the amount of
immunocaptured VLPs particles was determined by SDS-PAGE and western blot
experiments against the Gag protein, while, the amount of immunocaptured HIV-1 particles
was determined by measuring the viral p24 protein by ELISA. Beads coated with
biotinylated isotype-matched irrelevant antibodies were used as negative controls.
144
Western blots analyses.
After SDS-PAGE migration, proteins were transferred onto ImmobilonP-PVDF 0.45 µM
membranes (ThermoFisher Scientific, Ottawa, Ontario, Canada) by standard blotting
technique. Proteins were revealed with an anti-p24 antibody (183-H12-5C). Primary
antibodies were detected with horseradish peroxidase-conjugated, (Jackson
ImmunoResearch Lab, Inc). HIV-1 Gag proteins immunodetected on membranes were
quantitated with the ImageQuant software version 5.2, and background correction (local
average) was applied for all conditions tested. Graphic was normalized with Gag wild-type
proteins (WT) and expressed as a percentage of WT or express as total Gag density.
3D modeling and protein-peptide docking.
3D model of the cytoplasmic C-terminal of ICAM-1 (peptide 504-532) was modeled de
novo using PepFold [574]. The model quality was assessed by analysis of Ramachandran
plot through PROCHECK [575]. The peptide 504-532 was docked into the structure of the
N-terminal 283-residue fragment of the HIV-1 Gag polyprotein (PDB: 1L6N) using
PatchDock software [576]. The latter is based on shape complementarity principles. The
3D complex HIV-1 MA and peptide 504-532 was refined using FlexPepDock [577], which
allows full flexibility to the peptide and side-chain flexibility to the receptor. Interactions
between peptide 504-532 and MA were computed by PIC [578]. The pics were generated
by PyMol (http://www.pymol.org/).
Statistical analysis.
All experiments were repeated at least three times and each figure combines the results of
all the different donors unless otherwise specified. Statistical significance between different
groups were determined using the Student t-test when only two groups are evaluated, or
One way ANOVA with multiple comparison using Bonferroni's. Calculations were made
with Prism version 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). P values of <0.05 were
considered statistically significant.
145
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64. Tina KG, Bhadra R, Srinivasan N (2007) PIC: Protein Interactions Calculator. Nucleic Acids Res 35: W473-476.
149
Figure legends
Figure 1. Surface expression levels of ICAM-1.
The stable ICAM-1-expressing 293T cell line (A) and PBMCs from three healthy donors
(B) were incubated either with a R-Phycoerythrin-conjugated mouse anti-human ICAM-1
antibody (black lines) or an isotype-matched irrelevant control antibody (used as a control)
(grey areas). The results shown are representative of one out of a total of 3 independent
experiments. Mean fluorescence intensities (MFI) are depicted in each panel.
Figure 2. Immunocapture of VLPs carrying mutations in NC, SP2 and p6 domains.
(A) VLPs produced by 293T cells stably expressing ICAM-1 were captured using magnetic
beads coated either with an anti-ICAM-1 (R6.5) or isotype-matched irrelevant biotinylated
antibody. Next, VLPs were estimated by western blotting using an anti-p24 monoclonal
antibody (183-H12-5C) recognizing both Pr55Gag precursor polyprotein and p24. The
primary antibody was revealed by an HRP-conjugated anti-mouse secondary antibody. (B)
The Pr55Gag precursor polyprotein signals were determined by densitometry analyses of
western blot films using the ImageQuant software (version 5.2). Area density for each band
was defined and compared to the area density for Gag WT. Finally we expressed the results
as percentage of the Gag WT. Data shown represent three independent experiments for
each mutant and error bars indicate standard deviations.
Figure 3. Immunocapture of VLPs carrying mutations in MA∆44-132 region.
(A) VLPs produced by 293T cells stably expressing ICAM-1 were captured using magnetic
beads coated either with an anti-ICAM-1 (R6.5) or isotype-matched irrelevant biotinylated
antibody. Next, VLPs were estimated by western blotting using an anti-p24 monoclonal
antibody (183-H12-5C) recognizing both Pr55Gag precursor polyprotein and p24. The
primary antibody was revealed by an HRP-conjugated anti-mouse secondary antibody. (B)
The Pr55Gag precursor polyprotein signals were determined by densitometry analyses of
western blot films using the ImageQuant softwarw (version 5.2). Area density for each
band was defined and compared to the area density for Gag WT. Finally we expressed the
150
results as percentage of the Gag WT. Data shown represent three independent experiments
for each mutant and error bars indicate standard deviations.
Figure 4. Immunocapture of NL4.3-derived virus carrying mutations in MA∆44-132
region.
A) Complete NL4.3-derived virus particles produced by 293T cells stably expressing
ICAM-1 were captured using magnetic beads coated either with an anti-ICAM-1 (R6.5) or
isotype-matched irrelevant biotinylated antibody. Next, immunocaptured viruses were
estimated by western blot using an anti-p24 monoclonal antibody (183-H12-5C)
recognizing both Pr55Gag precursor polyprotein and p24. The primary antibody was
revealed by an HRP-conjugated anti-mouse secondary antibody. B) The Pr55Gag precursor
polyprotein signals were determined by densitometry analyses of western blot films using
the ImageQuant softwarw (version 5.2). Area density for each band was defined and
compared to the area density for Gag WT. Finally we expressed the results as percentage of
the Gag WT. Data shown represent three independent experiments for each mutant and
error bars indicate standard deviations.
Fig. 5. Molecular docking of putative interactions between HIV-1 MA and host-
derived ICAM-1.
(A) Schematic representation of 3D model of HIV-1 MA (PDB: 1L6N) docked to 3D
model of human ICAM-1 anchored in the cytoplasmic membrane (blue and red). The
colors used for model are the same as in (A). (B) Close-up view of negative residues (HIV-
1 MA) and positive residues (cytoplasmic region of ICAM-1) that participate in the
interaction. Negative and positive residues are shown as sticks. In this 3D model D102
forms ionic bonds with R507-K508, E105 with R507-K508-K510-K511, and E106 with
R507-K510. (C) Diagram representation of HIV-1 Pr55Gag precursor polyprotein (top) and
ICAM-1 (bottom). Matrix is shown in cyan, CA in blue, NC in yellow, p6 in green, and
SP1 and SP2 regions are depicted in pink. For ICAM-1, signal peptide (SP) is illustrated in
green, the five immunoglubulin-like domain are in cyan, hydrophobic transmembrane
domain (TMH) is in purple and finally cytoplasmic domain is in orange.
151
Figure 6. Immunocapture of NL4.3-derived del 102-114 mutant virus and NL4.3-
derived virus carrying Del 505-514 mutant ICAM-1.
(A) NL4.3-derived WT and mutant virus particles were prepared in 293T cells stably
expressing wild-type ICAM-1. (B) NL4.3-derived WT viruses were produced in 293T cells
transiently expressing either wild-type ICAM-1 or Del 505-514 mutant ICAM-1. Next,
virus stocks were captured by using magnetic beads coated with an anti-ICAM-1 (R6.5) or
an isotype-matched irrelevant biotinylated antibody (used as a control). Precipitated viral
entities were quantified with a homemade p24 ELISA test. Data shown represent the means
± standard deviations of triplicate samples (i.e. total amounts of virus captured with anti-
ICAM-1 divided by total amounts of virus captured with the control antibody) and are
representative of three independent experiments. Flow cytometry analyses of ICAM-1
surface expression in 293T cells either stably (C) or transiently expressing ICAM-1 (D).
Wild-type ICAM-1 is depicted as a solid black line, Del 505-514 mutant ICAM-1 is shown
as a solid red line, and control is presented as a grey filled histogram. Data shown represent
cell surface ICAM-1 expression after one month of selective drug pressure for stable
transfectants and 2 days after transfection for transient tranfectants.
Figure 7. Immunocapture of NL4.3-derived WT and mutant virus into which MA
acidic residues were substituted by alanine.
NL4.3-derived WT virions and mutant virus particles carrying the listed alanine
substitutions were prepared in 293T cells stably expressing wild-type ICAM-1. Next, virus
stocks were captured by using magnetic beads coated with an anti-ICAM-1 (R6.5) or an
isotype-matched irrelevant biotinylated antibody (used as a control). Precipitated viral
entities were quantified with a homemade p24 ELISA test. Data shown represent the means
± standard deviations of triplicate samples (i.e. total amounts of virus captured with anti-
ICAM-1 divided by total amounts of virus captured with the control antibody) and are
representative of three independent experiments.
152
Figure 8. Immunocapture of NL4.3-derived WT and mutant virus into which MA
acidic residues were substituted by alanine.
NL4.3-derived WT virions and mutant virus particles carrying the listed alanine
substitutions were prepared in 293T cells stably expressing wild-type ICAM-1. Next, virus
stocks were captured by using magnetic beads coated with an anti-ICAM-1 (R6.5) or an
isotype-matched irrelevant biotinylated antibody (used as a control). Precipitated viral
entities were quantified with a homemade p24 ELISA test. Data shown represent the means
± standard deviations of triplicate samples (i.e. total amounts of virus captured with anti-
ICAM-1 divided by total amounts of virus captured with the control antibody) and are
representative of three independent experiments.
Figure 9. Immunocapture of NL4.3 WT virus produced in 293T cells transiently
expressing wild-type or mutated ICAM-1.
NL4.3 WT virus particles were produced in 293T cells transiently expressing either WT or
mutated ICAM-1. Next, virus stocks were captured by using magnetic beads coated with an
anti-ICAM-1 (R6.5) or an isotype-matched irrelevant biotinylated antibody (used as a
control). Precipitated viral entities were quantified with a homemade p24 ELISA test. Data
shown represent the means ± standard deviations of triplicate samples (i.e. total amounts of
virus captured with anti-ICAM-1 divided by total amounts of virus captured with the
control antibody) and are representative of three independent experiments.
Figure 10. Immunocapture of NL4.3-derived WT and mutant virus produced primary
human cells.
NL4.3-derived WT virions and mutant virus particles carrying the listed alanine
substitutions were prepared in PBMCs from three different healthy donors. Next, virus
stocks were captured by using magnetic beads coated with an anti-ICAM-1 (R6.5) or an
isotype-matched irrelevant biotinylated antibody (used as a control). Precipitated viral
entities were quantified with a homemade p24 ELISA test. Data shown represent the means
± standard deviations of triplicate samples (i.e. total amounts of virus captured with anti-
ICAM-1 divided by total amounts of virus captured with the control antibody) and are
153
representative of three independent experiments. The percentage of ICAM-1 incorporation
for each individual donor is denoted on each corresponding graphic.
154
Figure 1.
155
Figure 2.
156
Figure 3.
157
Figure 4.
158
Figure 5.
159
Figure 6.
160
Figure 7.
161
Figure 8.
162
Figure 9.
163
Figure 10.
.
165
Chapitre 8 : Discussion, perspectives et conclusion
L'étude de l'incorporation d'ICAM-1 par le VIH-1 s'est avérée tout aussi passionnante que
complexe. Le projet sur lequel j'ai travaillé ces dernières années se situe à l'interface entre
la virologie (les protéines de structure) et la biologie cellulaire (ICAM-1). Il est apparu
d'emblée impossible d'étudier l'ensemble des molécules acquises par le VIH-1. Il a fallu
faire un choix. ICAM-1 est apparue comme une évidence, car elle a fait l'objet de 22
articles scientifiques au sein de l'équipe. Par conséquent, j'avais à ma disposition un bon
nombre d'outils me permettant de réaliser mes études doctorales. Dès le début, nous nous
sommes intéressés aux mécanismes moléculaires d'incorporation d'ICAM-1 dans le but in
fine de concevoir des peptides inhibiteurs empêchant ICAM-1 d'être acquise par le virion.
L'absence d'ICAM-1 à la surface du virion le rend moins infectieux et plus sensible aux
anticorps neutralisants [462] et à l'inhibiteur de fusion (T-20) [463]. Il existe à ce jour 4
mécanismes majeurs pouvant expliquer la présence de protéines étrangères chez le VIH-1
(voir la section sur les mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte). Néanmoins,
jusqu'à présent, aucun de ces mécanismes n'a été associé avec l'incorporation de protéine
transmembranaire comme c'est le cas pour ICAM-1. Nous savions, grâce au travail de Y.
Beauséjour, que le domaine cytoplasmique d'ICAM-1 est essentiel à son incorporation
[579]. Ce dernier suggérait que le précurseur protéique Pr55Gag avait potentiellement un
rôle à jouer dans ce phénomène. En nous basant sur cette étude, nous avons procédé étape
par étape, en voulant à chaque fois apporter des nouvelles informations sur l'incorporation
d'ICAM-1. Durant cette discussion, je vais essayer de revenir sur les grandes étapes de mon
doctorat en commençant par : 1) la caractérisation fonctionnelle des VLPs ; 2) la capacité
des VLPs à incorporer ICAM-1 ; 3) le passage du modèle de VLPs au VIH-1 ; 4) les
différentes stratégies d’entrée des peptides de pénétration cellulaire ; et 5) la conception des
peptides inhibiteurs.
166
8.1. Caractérisation fonctionnelle des VLPs Sachant que l'expression de Pr55Gag a elle seule est suffisante pour former des VLPs, nous
avons voulu dans cette première étude définir les domaines de Pr55Gag nécessaires à la
formation de VLPs sous le contrôle d'un vecteur d'expression de mammifère (pcDNA3.1
+). Nous avons travaillé dans un premier temps uniquement avec des VLPs exprimant
Pr55Gag, car nous savions que l'incorporation d'ICAM-1 est indépendante des
glycoprotéines d'enveloppe. Il est reconnu que Pr55Gag, de par sa nature et son organisation
lors de l'assemblage, vient se loger au niveau du feuillet interne de la membrane
cytoplasmique (voir la section sur le cycle réplicatif du VIH-1: Assemblage,
bourgeonnement et maturation), ce qui fait de lui un candidat de choix pour interagir avec
le domaine cytoplasmique d'ICAM-1. Il existe depuis le début des années 90 de
nombreuses études sur l'assemblage. Celles-ci sont en général réalisées à partir de clones
moléculaires complets où la protéase virale est inactivée par mutation ponctuelle, forçant
ainsi le précurseur à rester dans un état immature. Bien que très efficace, ce procédé ne
permet pas, selon moi, d'étudier le rôle intrinsèque de Pr55Gag car l'ensemble des autres
protéines virales est exprimé et est susceptible d'influencer les étapes tardives du cycle
réplicatif du VIH-1 (Nef, Env). De plus, ces études se concentrent bien souvent soit sur la
caractérisation biochimique, soit sur la caractérisation morphologique. Nous avons préféré
combiner ces deux techniques pour obtenir une vision globale des différents domaines
nécessaires à la production de VLPs.
La première surprise est venue suite à l'étude du mutant «Gag min», nommé ainsi car il est
constitué uniquement des séquences supposées essentielles pour la formation de VLPs. Il
contient en N-terminal une ancre myristique, le domaine C-terminal de la capside, SP1 et
deux séquences hétérologues de types «leucine zipper» (LZ) et p2b pour la nucléocapside
et p6 respectivement. Lorsque l'on a transfecté ce mutant dans des lignées cellulaires
humaines (293T), nous avons été incapables, que ce soit par des expériences
d'immunobuvardage ou de microscopie électronique, de détecter des VLPs en cours de
formation ou bien libérés dans le milieu extracellulaire. En dépit de ça, nous étions capables
de détecter la protéine virale dans le lysat cellulaire par immunobuvardage. Nous avons
167
également observé une distribution diffuse du mutant par immunofluorescence indirecte
caractéristique d'un défaut d'assemblage. Par opposition, les VLPs sauvages produisaient
efficacement des VLPs d'un diamètre allant de 100 à 150 nm correspondant à la taille de
virions immatures standards. Les VLPs sauvages ont une distribution ponctiforme. Cette
première observation majeure nous a orienté vers une région de Pr55Gag absente de «Gag
min» mais qui se révèle essentielle aux VLPs pour permettre un assemblage correct et, par
conséquent, une production efficace. Nous avons démontré par la suite que la matrice
virale, du moment qu'elle possède son ancre myristique, n'est pas nécessaire à la production
de VLPs.
Les mutants MA∆8-132 et MA∆44-132 sont fonctionnels. Notons quand même qu'en
absence de la région basique (8-33), le mutant MA∆8-132 est partiellement relocalisé au
niveau intracellulaire, certainement au niveau de l'appareil de Golgi ou bien dans des
vésicules Golgiennes comme décrit précédemment par A. Ono [258]. Concernant les
domaines de NC et p6, nous avons confirmé dans notre modèle ce que d'autres chercheurs
avaient démontré précédemment, à savoir que l'on peut tout à fait substituer la NC par un
domaine hétérologue de type LZ et p6 par une séquence de domaine tardif provenant d'un
autre rétrovirus RSV (p2b). Finalement, ce que nous avons trouvé dans cette étude c'est
que le domaine NTD de CA s'avère important pour l'assemblage des VLPs. Les expériences
de microscopie électronique nous ont permis de mettre en évidence un défaut majeur
d'assemblage du précurseur protéique suite à sa délétion.
Cette découverte permettait de comprendre de manière indirecte pourquoi le mutant «Gag
min» n'est pas fonctionnel. Précédemment, le NTD de CA a été reporté comme étant
facultatif dans la production de VLPs jouant plutôt un rôle dans le réarrangement des
protéines virales durant le processus de maturation. Ce que nous pensons, c'est que d'un
point de vue structurel, le NTD est capable d'interagir avec le CTD durant l'assemblage
viral, ce qui stabilise les protéines de CA au sein d’un même hexamère (ou pentamère). Des
chercheurs ont clairement démontré que des mutations ponctuelles dans les hélices 4-6
réduisaient fortement la production virale. Nous pensons que la délétion de ce domaine
perturbe le repliement global de CA. La structure tridimensionnelle de CA décrite
168
précédemment par Ganser-Pornillos a montré que les domaines NTD adjacents forment une
interface en hexamère et que les interactions entre NTD-CTD sont importantes dans un
contexte de CA mature. En conclusion de ce premier article scientifique, le domaine NTD
apparaît comme fondamental dans les interactions Gag-Gag et bouleverse les étapes
d'assemblage subséquentes. Maintenant, nous disposons de différents mutants de Pr55Gag
fonctionnels qui sont MA∆44-132 et p6449LD et NCp6378LZLD qui servirons a évaluer
leurs capacités à incorporer la molécule de l’hôte ICAM-1.
8.2. Capacité des VLPs à incorporer ICAM-1 Pour étudier l'incorporation d'ICAM-1, nous avons dû au préalable modifier les cellules qui
nous ont servi de supports à la transfection de nos plasmides. Les 293T n'expriment pas de
manière endogène ICAM-1 à leur surface. Pour éviter la surexpression et réduire la
variabilité dans le temps, nous avons préféré opter pour des lignées stables 293T ICAM-1
plutôt que pour une surexpression transitoire par co-transfection. Pour ce faire, nous avons
co-transfecté le plasmide codant pour ICAM-1 sauvage (pcDNA3.1+-ICAM-1) avec le
plasmide codant pour le gène de résistance à l'hygromycine B (pCMV-Hygro) dans les
cellules d'intérêt. Puis, pendant trois semaines, nous les avons maintenues sous pression de
sélection (Hygromycine B). Finalement, nous les avons triées et nous avons gardé les 293T
qui exprimaient à la surface cellulaire un niveau comparable d'ICAM-1 à celui observé
dans des PBMCs activées.
Dans l’article, nous avons par la suite évalué la capacité des VLPs à incorporer ICAM-1 par
immunocapture. Cette technique est basée sur la détection des molécules d'ICAM-1
présentes dans le surnageant viral ultracentrifugé sur coussin de sucrose à l'aide d'un
anticorps monoclonal anti-ICAM-1 (R6.5) biotinylé. Cet anticorps est incubé au préalable
avec des billes magnétiques de 2.8µM de diamètre recouvertes d'une monocouche de
streptavidine. Après incubation du cocktail billes-anticorps avec le virus, nous avons
procédé à plusieurs lavages pour, par la suite, éluer la fraction positive dans un tampon
Laemmli. La fraction positive a ensuite été déposée sur gel SDS-PAGE pour subir un
169
immunobuvardage en présence de l'anticorps monoclonal anti-p24 (183H12-5C) qui est
capable de détecter nos différents mutants de Pr55Gag.
Nous avons montré, et ceci pour la première fois, que les VLPs sauvages sont capables
d'incorporer ICAM-1 aussi efficacement qu'un virus sauvage. En d'autre terme, cela signifie
que l'expression de Pr55Gag, à elle seule, est responsable de l'incorporation d'ICAM-1. Par
la suite, nous avons mis en évidence que les substitutions, que ce soit de la NC et de p6 par
des séquences hétérologues, n'affectent pas l'incorporation d'ICAM-1. Elles sont donc
facultatives. Par opposition, lorsque l'on a testé le mutant de MA où les deux tiers (44-132)
ont été enlevés, on élimine l'incorporation d'ICAM-1 dans les VLPs (90%). La MA apparaît
donc comme essentielle à l'incorporation d'ICAM-1 dans notre modèle in vitro de VLPs.
De par sa nature et sa localisation membranaire lors du bourgeonnement viral, la MA est un
candidat de choix pour interagir avec le domaine cytoplasmique d'ICAM-1. Déjà en 1995,
l'étude de Fais avait rapporté qu'ICAM-1 colocalisait avec la MA au site de contact cellule-
cellule [447].
8.3. Passage du modèle de VLPs au VIH-1 A la suite de cette découverte, nous avons voulu vérifier si une délétion similaire du
domaine de MA dans un virus complet (NL4.3) avait la même conséquence. Pour ce faire,
nous avons réalisé exactement le même mutant que nous avons nommé NL4.3∆44-132.
Cependant, ce virus complet exprime la protéase virale qui, lors du bourgeonnement, clive
le précurseur protéique en différentes protéines de structures matures. Le problème que
nous avons dû surmonter c'est qu'une délétion de 89 acides aminés n'affecte par la
production de VLPs dans un contexte immature mais se révèle délétère lors de la
maturation virale. Nous pouvons invoquer que l'absence du site de clivage entre la MA-CA
(...NY-PI...) entraîne un défaut de repliement de la CA et pourrait générer un défaut
structurel majeur. Pour contourner ce problème, nous avons prétraité les cellules
293TICAM-1+ avec un inhibiteur de la protéase virale, l'Indinavir. L'Indinavir se fixe de
façon réversible au niveau du site actif de la protéase et inhibe l'enzyme de façon
compétitive, empêchant ainsi le clivage du précurseur polyprotéique viral qui a lieu au
170
cours de la maturation des nouvelles particules virales. Grâce à ce traitement, nous avons
pu confirmer dans un modèle de virus que le domaine de MA est responsable de
l'acquisition d'ICAM-1. Les mutants présentés plus bas ne seront pas prétraités à l'Indinavir
car nous avons été en mesure de les quantifier par ELISA p24.
A partir de ce moment nous avons voulu raffiner la région de MA qui s'est révélée
importante. Pour ce faire, nous avons collaboré avec le Dr Halim Maaroufi pour modéliser
in silico nos deux protéines d'intérêt. Pour la MA virale, il existe depuis les années 1994-
1996 des études menées par l'équipe de Sundquist qui ont réussi, par des expériences de
RMN et de cristallographie, à représenter la structure tridimensionnelle de la MA. C'est
cette structure qui nous a servi de référence pour le projet. Cependant, concernant ICAM-1,
aucune structure complète n'était disponible car il s'agit d'une protéine transmembranaire,
ce qui la rend difficilement cristallisable. Mais, par chance, le domaine cytoplasmique
d'intérêt est constitué uniquement de 28 acides aminés. Ceci nous a permis de le modéliser
de novo avec une bonne précision via le serveur en ligne PEP-FOLD. PEP-FOLD est une
approche permettant la prédiction des structures peptidiques en fonction de la séquence
primaire. Cette méthode est basée sur l'alphabet structural et décrit la conformation prise
par quatre résidus consécutifs. Ces couples ainsi prédits sont soumis à un algorithme qui
permet d'obtenir une structure 3D. Une des exigences de ce logiciel est que l'on ne peut pas
rentrer des peptides de plus de 36 acides aminés de long. À la surprise générale, nous avons
découvert un domaine d'ICAM-1 plus organisé que ceux que l'on pensait. Ce domaine
formerait une hypothétique hélice-α des résidus (504-NRQRKIKKYRLQQAQKGTP-522)
puis une région flexible non structurée (523-MKPNTQATPP-532).
Suite à la prédiction, nous avons identifié une zone particulièrement intéressante
d'interaction entre la MA et ICAM-1. Pour la MA, il s'agit d'une région de 13 acides aminés
102-DKIEEEQNKSKKK-114 qui fait partie de l'hélice-α 5 (96-TKEALDKIEE-
EQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY-121) et pour ICAM-1 une région de 10
acides aminés présents dans l'hypothétique hélice-α (505-RQRKIKKYRL-514). Il s'agit
ici uniquement de prédictions. Nous avons dû les confirmer par mutagénèse. Nous avons
171
donc réalisé deux nouveaux mutants nommés NL4.3 Del 102-114 et ICAM-1 Del 505-514
que nous avons testé en immunocapture. Nous avons obtenu une diminution de
l'incorporation du mutant NL4.3 Del 102-114 comparable au NL4.3∆44.132, à savoir une
baisse de l'incorporation d'ICAM-1 de l'ordre de 75% à 90%. Pour le mutant ICAM Del
505-514, nous avons obtenu une baisse significative de 65% à 75%. Cette légère différence
peut s'expliquer par le fait que le niveau d'expression d'ICAM-1 à la surface des cellules est
différent en fonction des deux types d'expériences. Pour les mutants spécifiques d'ICAM-1,
nous avons utilisé des 293T standards et nous avons procédé par co-transfection avec le
plasmide codant pour NL4.3 WT et les mutants d'ICAM-1, ce qui fait que l'expression
d'ICAM-1 est quatre fois plus forte dans ces expériences par rapport aux cellules stables.
Toujours d'après notre modèle, ce serait une interaction de type électrostatique entre la MA
et ICAM-1 qui serait responsable de l'incorporation. Nous avons identifié des résidus
acides, de la MA d'une part et basiques d'ICAM-1 d'autre part, qui établissent des
interactions ioniques de moins de 10Å suffisantes pour générer une liaison ferme entre
deux molécules. En se basant sur la modélisation 3D, D102 formerait des liaisons avec
R507 et K508, E105 avec R507, K508, K510 et K511 et finalement E106 avec R507 et
K510. C'est pour cela que nous avons fait des substitutions alanine sur ces résidus en
priorité. Nous avons obtenu de bons résultats préliminaires pour les mutants de MA, à
savoir une diminution de l'ordre de 30% à 40% de l'incorporation. Seulement, ces résultats
sont assez éloignés des 75% à 90% observés précédemment. Ceci met en avant les limites
de la prédiction des interactions peptide-peptide. En regardant de plus près la séquence
cible de la MA, les deux résidus E105 et E106 sont suivis d'un autre résidu glutamate en
position 107. Les systèmes de prédictions ne sont pas encore capables de distinguer les
acides aminés importants lorsqu'un même résidu est associé en triplet ou en plus grand
nombre. C'est pour cela que nous avons inclus dans l'étude la substitution du E107. Cette
substitution nous a permis de se rapprocher de l'effet recherché avec ses 55% à 59 %
d'incorporation en moins. Cependant, après avoir éliminé l'ensemble des acides aminés
acides, nous ne sommes pas encore exactement au niveau du mutant NL4.3 Del 102-114.
En regardant les charges négatives potentielles de notre séquence, nous avons identifié une
172
sérine en position 111. Celle-ci, après vérification de la phosphorylation potentielle en ligne
sur le logiciel Netphos 2.0, apparaît comme étant phosphorylée à plus de 99%. Nous avons
donc décidé de la substituer par une alanine pour abroger l'ensemble des charges négatives
avec le mutant D102A/E105A/E106A-E107A/S111A. Ce mutant qui ne présente que 5
substitutions par rapport au virus sauvage, enregistre une diminution comparable (88%) à
notre mutant de référence. En s'appuyant sur la prédiction, la S111 serait en mesure
d'interagir avec les lysines 510 et 511.
Concernant la partie ICAM-1, la délétion de la région basique nous a donné une réduction
de près de 65 à 75 % comme décrit précédemment. Nous avons voulu enlever dans un
premier temps la région 507-RKIKK-511 car celle-ci a déjà fait l'objet d'une étude et est
impliquée dans la localisation spatiale et dynamique d'ICAM-1 à la surface de lignées
fibroblastique (COS-7) avec une implication fonctionnelle pour l'adhésion des leucocytes
[561]. Malheureusement, cette délétion n'a pas eu d'effet sur l'incorporation d'ICAM-1, tout
comme les mutants de délétion suivants : 503-YNRQ-506 et 512-YRL-514, ce qui nous a
laissé penser que ces acides aminés basiques sont capables de se compenser. Ce n'est pas un
résidu en particulier qui interagit avec la MA mais une combinaison de charges négatives
qui, en fonction des délétions, se compensent les uns des autres. En effet, lorsque nous
avons substitué par des alanines les résidus R507, K508 et K511, nous n'avions observé
qu'une diminution partielle de l'incorporation d'ICAM-1 (36%), alors qu'avec l'abrogation
de l'ensemble des résidus basique d'ICAM-1 (à savoir R505, 507, 513 et K508, 510, 511)
nous retrouvons un niveau comparable au mutant d505-514 (70%).
En accord avec la modélisation 3D et les expériences de mutagénèse, nous avons démontré
que ce sont les charges négatives et positives qui participent à l'incorporation d'ICAM-1 par
le VIH-1. Nous avons même confirmé ces résultats lors de l'infection de cellules primaires
humaines (PBMCs) activées avec une moyenne d'incorporation d'ICAM-1 réduite à 33%.
Malgré le fait que la modélisation ait été effectuée uniquement avec 2 peptides, les
interactions ainsi caractérisées sont censées être directes. Cependant, nous ne pouvons pas
exclure l'intervention d'une ou de plusieurs molécules intracytoplasmique faisant le lien
entre la MA et ICAM-1. Au cours des dernières années, il a été démontré qu'ICAM-1 et
173
Gag interagissent tous deux avec le cytosquelette d’actine. La preuve de l’existence d’une
interaction entre Gag et les filaments d’actine a été obtenue suivant l’utilisation
d’inhibiteurs de la polymérisation de l’actine tel que la cytochalasine D. Le traitement de
cellules infectées par le VIH-1 à l’aide de cet inhibiteur conduit à une chute de la
production virale. Le cytosquelette d’actine permet le déplacement d'ICAM-1 en surface
des cellules productrices. Durant le bourgeonnement du VIH-1, ICAM-1 est recruté à des
sites co-localisant avec la gp120. Ces résultats suggèrent que les précurseurs immatures
Gag retrouvés en forte concentration aux sites d’assemblage du VIH-1 et nécessitant le
cytosquelette pourraient recruter indirectement ICAM-1, formant un complexe «ICAM-1-
Actine et (ezrine)-Gag» au site d’assemblage. La présence d’ezrine et d’actine au sein de
particules virales infectieuses a été démontrée. Néanmoins, il demeure probable que
l’acquisition d'ICAM-1 provienne d’une interaction directe entre la portion cytoplasmique
de cette dernière et le constituant viral Gag.
Nous avons aligné plus de 1600 séquences cibles de MA appartenant au groupe M et au
sous-type B dans la base de données Los Alamos. La séquence 102-DKIEEEQNKSKKK-
114 est vraiment bien conservée (89% - 99%), notamment en ce qui concerne les charges
négatives. Par exemple, lorsque le D102 est substitué dans certaines séquences, l'acide
aminé qui le remplace est essentiellement un glutamate conservant ainsi la charge négative.
Cette observation est à mettre en perspective avec le Blast-p sur NCBI de notre séquence
qui est homologue exclusivement avec la MA du VIH-1. Même des virus apparentés
comme le VIH-2 ou le VIS ne possèdent pas cette signature de 13 acides aminés. C'est pour
cela que nous émettons l'hypothèse que la conservation au cours de l'évolution de cette
séquence chez le VIH-1 lui apporte un gain sélectif. Le VIH-1 pourrait avoir évolué ainsi
pour pouvoir interagir avec et incorporer ICAM-1. Au meilleur de notre connaissance,
toutes les souches virales de VIH-1 infectant des cellules primaires (cellules T CD4+,
macrophages, amygdales, etc.) incorporent ICAM-1 à leurs surfaces. De plus, le VIH-1 est
le seul virus décrit dans la littérature comme étant capable d'acquérir ICAM-1 sur son
enveloppe virale. D'un autre côté, la séquence 505-RQRKIKKYRL-514 est une signature
principalement retrouvée chez ICAM-1 absente des autres membres de la même famille
174
(ICAM-2, 3, 4 et 5) mais conservée chez ICAM-1 provenant d'autres espèces (singe, bovin,
tupaia, etc.).
Les résultats encourageant que nous avons obtenus avec les cellules primaires illustrent que
le lien entre la MA et ICAM-1 n'est pas spécifique à un type cellulaire et peut être reproduit
sur des cibles cellulaires physiologiques du VIH-1. Il est maintenant clairement établi que
l'incorporation d'ICAM-1 par le VIH-1 augmente l'infectiosité virale, en offrant une plus
grande adhésion aux cellules cibles, ce qui améliore la cinétique de fusion et la libération
du virus dans le cytoplasme. Ce phénomène est amplifié lorsque le ligand d'ICAM-1, le
LFA-1, est sous forme de haute affinité. De ce fait, les virus qui n'incorporeraient pas
ICAM-1 seraient, d'un point de vue immunologique, plus vulnérables à certains anticorps
neutralisants. De surcroit, l'inhibiteur de fusion (T-20) serait plus efficace vis-à-vis de ces
virus. L'inhibition de l'incorporation d'ICAM-1 par le VIH-1 pourrait entraîner une
réduction des doses des médicaments anti-rétroviraux, ce qui permettrait de diminuer les
effets secondaires de ces composés (cytotoxicité, etc.). Une approche ciblant une molécule
transmembranaire devrait aussi contourner les problèmes liés à la grande variabilité
génétique du VIH-1 (taux de mutation élevé). Le blocage de ce facteur d'attachement peut
avoir d'autres conséquences dans la biologie du virus. Nous avons précédemment démontré
que les virus incorporant ICAM-1 ciblaient préférentiellement les cellules T CD4+
mémoires. Actuellement, un des défis majeur dans l'élimination de l'infection au VIH-1 est
la présence de réservoir viral contenu dans les lymphocytes T CD4+ mémoires. Nous
pourrions envisager qu'en bloquant la présence d'ICAM-1 par le virus, nous aurions moins
de cellules T CD4+ mémoires infectés, ce qui diminuerait la taille du réservoir.
175
8.4. Stratégies d'entrée des peptides de pénétration cellulaire (CPP) Un des principaux obstacles dans l'administration de molécules actives dans l'organisme
vient du blocage qu'oppose la membrane plasmique à l'entrée des cellules des molécules
hydrophiles. L'identification et l'utilisation de peptides de pénétration cellulaire (CPP - cell
penetrating peptide) depuis deux décennies par les chercheurs, représentent un espoir pour
contourner ce problème. A partir des années 1988, des études ont rapporté que l'ajout de la
protéine Tat du VIH-1 sur des cultures cellulaires entraînait la transactivation du promoteur
viral, suite à la pénétration de la protéine au travers de la membrane cellulaire [580,581]. La
protéine de Drosophila antennapedia a été par la suite caractérisée et présente les mêmes
propriétés de transduction [582]. Depuis, la séquence peptidique minimale responsable de
la transduction de ces facteurs de transcriptions (Tat [583] et pénétratine [584]) a été
identifiée et ces séquences sont capables de transporter d'autres macromolécules comme,
par exemple, des protéines dans les cellules [585]. Après cette découverte, de nombreux
CPP ont été répertoriés [586,587] (voir tableau 2).
Tableau 2. Liste non exhaustive des CPP
peptides Séquences Références 1 PFVYLI PFVYLI [588] 2 Kaposi FGF AAVALLPAVLLALLAP [589] 3 CADY GLWRALWRLLRSLWRLLWRA [590] 4 Mastoparan INLKALAALAKKIL [591] 5 MAP KLALKLALKALKAALKLA [592] 6 TP10 AGYLLGKINLKALAALAKKIL [593] 7 Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL [594] 8 GALA WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA [595] 9 pHLIP AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT [596] 10 KALA WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA [597] 11 Mellittin GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ [598] 12 MPG GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKS [599] 13 pVec LLIILRRRIRKQAHAHSK [600] 14 Penetratin RQIKIWFQNRRMKWKK [584] 15 Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV [601] 16 PasR8 FFLIPKGRRRRRRRR [602] 17 R9F2 RRRRRRRRRFFC [603] 18 Maurocalcine GDCLPHLKLCKENKDCCSKKCKRRGTNIEKRCR [604] 19 SAP(E) VELPPPVELPPPVELPPP [605] 20 R7W RRRRRRRW [606] 21 HIV-1 Rev TRQARRNRRRRWRERQR [607] 22 HIV-Tat GRKKRRQRRRQ [583] 23 R8 RRRRRRRR [608] Modifiée de [609].
176
Ces peptides se sont tout d'abord appelés cheval de Troie ou protéine à domaine de
transduction PTD (protein transduction domain) mais finalement c'est le nom de CPP qui a
été retenu [610]. De nombreuses études complémentaires sont venues renforcer l'idée
faisant penser que les CPP sont d'excellents «cargo» pour l'administration de molécules in
vitro mais également in vivo. La première étude in vivo réalisée par Schwarzse a démontré
que la fusion de la β-galactosidase au domaine Tat permettait une délivrance ubiquitaire de
la molécule suite à son administration intrapéritonéale chez des souris [611]. Les CPP sont
constitués de peptides d'une grande hétérogénéité. Pour les distinguer entre eux, ces
molécules sont sous-divisées en différentes classes comme les peptides riches en arginine
ou polycationique (Tat, pénétratine, R8 [octaarginine]) [612], les peptides amphipathiques
(transportan) ou bien les peptides synthétiques (MPG [594], R8, Pep-1 [613], YTA2 [614])
ou encore les chimères telles que le transportan. En général, tous les CPP sont de courtes
séquences peptidiques de 7-16 acides aminés. Il ne semble pas avoir d'homologie de
structures (Iaire et IIaire) entre eux. Cependant, on retrouve le plus souvent dans ces
composés des résidus basiques qui peuvent interagir avec les molécules cellulaires de
surface chargées négativement. Les CPP sont en général très peu toxiques et agissent à de
faibles concentrations, même lorsqu'ils servent de «cargo» pour l'administration de
macromolécules [615].
Le mécanisme d'accumulation des CPP dans le cytoplasme des cellules n'est pas encore
clairement identifié. Il semble acquis que deux types d'internalisation cellulaire coexistent
mais diffèrent drastiquement en terme d'efficacité d'accumulation cytoplasmique des CPP
et donc d’applications possibles : d’une part, la translocation directe au travers de la
bicouche lipidique, qui présente l’avantage d’un accès direct et rapide des CPP au
cytoplasme des cellules ; d’autre part, l’endocytose qui, en revanche, présente
l’inconvénient d’une accumulation cytoplasmique lente et limitée des CPP. La translocation
peut suivre plusieurs schémas, les modèles de Barrel-Stave et Carpet étant les plus connus
[616,617]. Ces deux modèles ont été empruntés à l’étude des interactions des peptides
antimicrobiens avec les bicouches lipidiques et la translocation des peptides est basée sur le
concept de perturbation locale de la bicouche lipidique par des agrégats peptidiques. Il est
utile de mentionner l’existence de trois modèles supplémentaires (figure 25) : (1) le modèle
177
de pore transitoire dans lequel les CPP intégrés dans la bicouche lipidique génèrent un
courant ionique par formation de pore transmembranaire [618] ; (2) le modèle de fusion
membranaire dans lequel les CPP, en s’insérant dans le feuillet externe de la bicouche
lipidique, promeuvent une fusion locale et transitoire de deux régions membranaires,
rapprochant ainsi les surfaces cationiques des CPP du feuillet interne anionique de la
membrane et facilitant le transfert intracellulaire du CPP [619] ; et (3) un modèle
d’électroporation dans lequel la fixation des CPP cationiques aux lipides anioniques de
surface de la membrane plasmique crée un champ électrique transmembranaire. Ceci altère
les tensions latérales et de courbure de la membrane et crée les conditions favorables à une
électroporation membranaire permettant l’internalisation des peptides par la formation de
structures membranaires atypiques et transitoires [620].
Figure 25. Mécanismes d'entrée des CPP dans la cellule.
Adaptée de [621].
Le terme endocytose représente la phagocytose pour les grosses particules et la pinocytose
pour les solutés. Quatre types de pinocytose existent : la macropinocytose, l’endocytose
178
dépendante de la cavéoline ou de la clathrine et l’endocytose indépendante de la clathrine et
de la cavéoline [622]. Selon le type de CPP et de «cargo» utilisés, chacun de ces
mécanismes d’endocytose a été impliqué dans l’internalisation des CPP. La contribution
respective des mécanismes d’entrée des CPP (translocation versus endocytose) varie selon
la nature du CPP utilisé, sa concentration ainsi qu’en fonction du «cargo» transporté.
8.5. Conception d’un peptide inhibiteur d'ICAM-1 couplé à des CCP Des peptides correspondant à la queue cytoplasmique d'ICAM-1, ou une partie de ce
domaine, ont été rapportés dans la littérature. Ces peptides ont été utilisés pour analyser le
rôle d'ICAM-1 dans la migration et la signalisation de cellules non infectées. Dans ces
articles, les peptides exprimant le domaine cytoplasmique d'ICAM-1 sont liés à la
pénétratine. Par exemple, les travaux de Greenwood rapportent que les peptides
pénétratine/cyt-ICAM-1 inhibaient la migration transendothéliale des lymphocytes T in
vitro mais pas leur adhésion aux cellules endothéliales exprimant ICAM-1. Le papier
suggère que le domaine cytoplasmique d'ICAM-1 pourrait être une cible pour des thérapies
anti-inflammatoires. Notre approche sera basée sur du peptidomimétisme, c'est-à-dire que
nous avons utilisé la séquence d'ICAM-1 correspondante aux 10 résidus identifiés 505-
RQRKIKKYRL-514. Ce peptide est naturellement hydrophile et possède une charge nette
(+6), ce qui en fait un bon candidat pour traverser la membrane. On peut néanmoins
améliorer son coefficient de pénétration en substituant par exemple un seul résidu I509 par
une arginine, le rendant ainsi plus hydrophile. Toujours dans le but d'améliorer la
pénétration de la membrane cytoplasmique, nous pouvons associer notre séquence avec un
autre.
En conclusion, bien que l'étude d'une seule molécule de l'hôte ne nous permette pas de
généraliser sur le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) d'incorporation, nos résultats apportent de
nouvelles connaissances sur le lien intime établi avec les protéines virales et la molécule
ICAM-1. Il ne s'agit pas, comme nous pourrions l'imaginer, d'une simple incorporation
passive due au fait qu'ICAM-1 se trouve au site de bourgeonnement. Pour la première fois,
nous avons démontré l'existence d'une incorporation spécifique concernant une protéine
179
transmembranaire. Cette thèse ouvre la voie à l'étude d'autres molécules de l'hôte. Nous
pensons un jour être en mesure d'inhiber cette relation MA/ICAM-1, ce qui faciliterait la
prise en charge des patients séropositifs. L'utilisation de peptides inhibiteurs efficaces
pourrait, à terme, faire partie intégrante d'une nouvelle génération de trithérapie.
181
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213
Annexe : L'expression de la forme activée du LFA-1 à la surface des cellules cibles permet l'infection des virus ICAM-1 positifs par un mécanisme indépendant du CCR5
Cette annexe se présente sous la forme d'une note qui est actuellement en correction dans la
revue journal of virology et est constitué du manuscrit tel que soumis.
Résumé
L'infection par le VIH-1 est initiée par son interaction avec le récepteur cellulaire CD4 et
ses corécepteurs le CCR5 ou CXCR4. Cependant, il est maintenant bien accepté que le
VIH-1 incorpore une grande quantité de molécule de l'hôte durant le bourgeonnement et
certaines d'entres elles favorisent l'entrée du virus (ICAM-1). Dans cette étude, nous avons
évalué si l'interaction entre ICAM-1 et son ligand le LFA-1 présent à la surface des cellules
cibles pouvaient influencer la dépendance du virus vis-à-vis de ses corécepteurs. Nous
avons démontré que l'interaction ICAM-1/LFA-1 permettait l'infection de lignées
cellulaires T ainsi que de lymphocytes T CD4+ primaires humains par des virus R5-
tropique d'une façon indépendante du CCR5. En conclusion, les facteurs d'attachement bien
que non essentiels à l'infection peuvent dans certaines conditions modifier le processus
d'entrée du VIH-1 en le détournant des corécepteurs classiques (CCR5 et CXCR4).
214
Surface expression of an activated form of LFA-1 on target cells allows
HIV-1 carrying host-derived ICAM-1 to bypass CCR5 usage
Pascal Jalaguier1, Réjean Cantin1, and Michel J. Tremblay1,2*
1Centre de Recherche en Infectiologie, Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Québec-
pavillon CHUL, Québec, Canada and 2Département de Microbiologie-Infectiologie et
Immunologie, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, Canada
Running title: ICAM-1/LFA-1 interactions modulate HIV-1 tropism
Key words: HIV-1, ICAM-1, LFA-1 and tropism.
*Corresponding author, Mailing address:
Dr. Michel J. Tremblay
Centre de Recherche en Infectiologie, RC709
Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Québec-pavillon CHUL
2705 boul. Laurier, Québec (QC), Canada, G1V 4G2Tel.: 1-418-525-4444 local 48274;
Electronic address: [email protected]
215
Abstract
HIV-1 replicates efficiently in activated CD4+ T cells interacting mainly with its primary
receptor CD4 and most commonly used coreceptors CCR5 or CXCR4 to initiate viral
infection. However, it is now well accepted that HIV-1 incorporates a plethora of host-
derived cell surface molecules such as ICAM-1 during the budding process which could be
involved in virus entry. In this present report, we assessed whether ICAM-1/LFA-1
interactions can modulate HIV-1 coreceptor usage. We report here that the ICAM-1/LFA-1
partnership allows infection of an established T cell line and primary human CD4+ T cells
by R5-tropic virus in a CCR5-independent fashion. It can be concluded that additional
interactions between HIV-1 and susceptible cells can allow the natural infection process to
circumvent the classical coreceptors.
216
Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) replicates predominantly in activated
CD4+ T cells through an association between the external envelope viral glycoproteins and
CD4 along with some specific chemokine coreceptors (primarily CCR5 and CXCR4) (1).
However, it has been recognized that other interactions between the virus entity and
susceptible cells can promote the initial events in HIV-1 replication (2-6). HIV-1 acquires
numerous host-derived cell surface molecules during the budding process including the
intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) (7-9). Virus-associated ICAM-1 influences
HIV-1 biology by binding its natural counter ligand LFA-1 on target cells, leading to
several fold increase in virus infectivity notably, when LFA-1 is under an activated form
(i.e. high affinity/avidity state) (8, 10-11). Such a significant enhancement of virus
infectivity is due to a more efficient virus adsorption onto target cells and a preferential
entry process by fusion rather than through endocytosis (12). We investigated the ability of
the ICAM-1/LFA partnership to promote HIV-1 infection in refractory target cells due to
an absence of expression of the appropriate coreceptor.
The Jurkat cell line is the classical model expressing a relatively high level of the HIV-1
primary receptor CD4 and coreceptor CXCR4, but is negative for CCR5 (13). We initially
wanted to assess if an ICAM-1-bearing R5 virus (namely JR-CSF) could achieve infection
in these cells, despite the lack of CCR5. First, we wished to confirm the complete absence
of cell surface CCR5 in our Jurkat model both by real-time PCR and flow cytometry
analyses. Data confirmed that our Jurkat cell line is indeed free of CCR5 (data not shown).
Isogenic virus preparations either lacking (called ICAM-1 NEG) or bearing host-derived
ICAM-1 (called ICAM-1 POS) were produced by cotransfection in 293T cells as
previously reported (14-15). Following virus incubation with Jurkat cells, we chose initially
217
to monitor virus gene expression by measuring the early viral Tat transcript by real-time
PCR. Tat is encoded for by two exons and detection of the multiply spliced RNA indicates
infection and reverse transcription of the virus (16). Briefly, total RNA from Jurkat cells
(1× 106) was isolated using the Illustra RNAspin Mini Isolation Kit (Ge, Heathcare,
Mississauga, Ontario, CA). RNA was reverse transcribed using M-MLV reverse
transcriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) and quantification of viral transcripts
was made by using the Perfecta Sybr SMX L-ROX 2000R (VWR, Mississauga, Ontario,
CA) with primers designed for multiply spliced HIV-1 RNAs encoding for Tat (Tat-splice
F [GAAGCATCCAGGAAGTCAGC] Tat-splice R [ATTCCTTCGGGCCTGTC]) and 18S
as an internal control (18S-F [TAGAGGGACAAGTGGCGTTC] and 18S-R
[CGCTGAGCCAGTCAGTGT]). Normalization on 18S mRNA levels was performed to
obtain final values and the ∆∆Ct method (17) was applied to analyse the data over a kinetic
experiment where the level of Tat mRNA was quantified. As shown in Fig. 1, viruses
lacking host ICAM-1 are inefficient to induce production of Tat mRNA over the time
course experiment (i.e. 2 to 6 days), while the ICAM-1-bearing virus could induce an
increase of 5 to 6 fold compared to control. Virus gene production is observed exclusively
when target cells are exogenously induced to express the high affinity/avidity form of LFA-
1 with the monoclonal anti-LFA-1 antibody MEM-83 (Exbio antibodies, CZ). Importantly,
no such virus gene expression was detected when using an anti-LFA-1 antibody that blocks
ICAM-1/LFA-1 interactions (i.e. MEM-25). To make sure that a faint undetectable level of
CCR5 could not be the cause of the observed infection, cells were pre-treated with the
CCR5 receptor antagonist Maraviroc (MVC) (AIDS Reagent Program, Division of AIDS,
NIAID, cat. #11580). MVC had no effect on Tat mRNA levels whether LFA-1 is activated
or not by MEM-83. The above results clearly show that virus infection seen with ICAM-1-
218
bearing R5 virus in Jurkat cells expressing an active form of LFA-1 production is
independent of CCR5 usage.
To rule out the possible involvement of the second major HIV-1 coreceptor CXCR4, we
took advantage of the potent CXCR4 inhibitor AMD-3100 (AIDS Reagent Program,
Division of AIDS, NIAID, cat. #8128). As shown in Fig. 2, treatment with the CXCR4
antagonist was unable to abrogate infection with ICAM-1-bearing virus in Jurkat cells
expressing an active LFA-1 form.
We next evaluated whether the noticed HIV-1 gene expression at the Tat mRNA level can
lead to a productive virus infection by measuring the p24 content in the supernatant. To this
end, Jurkat cells were infected with fully infectious R5-using virus stocks either lacking or
bearing host-derived ICAM-1 (i.e. NL4-3 BAL) (18). In accordance with our previous
observations, data shown in Fig. 3A indicate that exposure of Jurkat cells expressing an
active form of LFA-1 to ICAM-1-bearing NL4-3 BAL leads to productive infection that is
again not relying on CCR5. Interestingly, we found that infection is independent of a virus
entry process through endocytosis since treatment with the broad-spectrum endocytosis
inhibitor chlorpromazine (CPZ) (Calbiochem EMD Millipore, Toronto, ON, Canada) had
no impact on p24 levels. Furthermore, we demonstrate that this p24 production is not due to
residual virus input as it is dependent on viral reverse transcriptase activity since it is
inhibited by a pre-treatment with the reverse transcriptase inhibitor Efavirenz (EFV) (AIDS
Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, cat. #4624). Finally, we confirmed that the
p24 signal is related to functional de novo virus production in a second experimental model
system. Indeed, incubation of collected cell-free supernatants with the indicator cell line
TZM-bl confirmed that ICAM-1-bearing R5 virus can productively infect target cells
lacking CCR5 but expressing an activated LFA-1 form (Fig. 3B).
219
Activated CD4+ T cells are known to support productive infection with HIV-1 under both
in vitro and in vivo conditions. To mimic the above-described experiments with more
physiological target cells, we performed similar studies with primary human activated
CD4+ T cells. Again, virus gene expression was also seen in cells treated with MEM-83 and
inoculated with ICAM-1-bearing virus (Fig. 4). This set of experiments confirms our
previous observations made in an established human cell line and illustrates that the
intimate link between virus-associated host ICAM-1 and cell surface LFA-1 can allow to
bypass one of the most common coreceptor utilization (i.e. CCR5) even in HIV-1
physiological target cells.
In summary, we provide evidence that interactions between virus-anchored host ICAM-1
molecules and its natural cognate ligand LFA-1 on the surface of target cells allow the
normal process of HIV-1 infection to circumvent usage of one of the most common
coreceptors, CCR5. We are currently assessing whether another less common coreceptor
might be involved in the observed phenomenon. The possible usage of minor coreceptors
may play a role in the virus biology especially in subtype C (19-20) and, in this context,
host-derived ICAM-1 once inserted within emerging HIV-1 particles could prove to be a
determining factor for example in MVC-treated patients showing virological failure (21).
220
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222
Figure Legends
Fig. 1. Kinetics of HIV-1 gene expression in Jurkat cells infected with JR-CSF virus
either lacking or bearing host-derived ICAM-1 in presence of a CCR5 blocker.
Jurkat cells (1 x 106) were either left untreated or pretreated with anti-LFA-1 antibodies
(MEM-25 or MEM-83) (3 µg) and/or Maraviroc (MVC) (200 nM). Next, cells were put in
contact with isogenic virus stocks (JR-CSF strain) (100 ng of p24 per 106 target cells),
washed extensively, and incubated for 2 (panel A), 4 (panel B) and 6 days (panel C). Total
RNA (1 x 106 cells) was isolated, reverse transcribed and viral transcripts were quantified
by real-time PCR. Normalization on 18S mRNA levels was performed to obtain final
expression values. The ∆∆Ct calculation was performed to analyse the data over a kinetic
experiment where the level of Tat mRNA was quantified. Data shown represent three
independent experiments and error bars indicate standard deviations. Statistical analyses
were made by Two-way Anova and Dunnett for multiple comparisons (****: p<0.0001).
Fig. 2. Effect of a CXCR4 receptor antagonist on HIV-1 gene expression in Jurkat
cells infected with JR-CSF virus either lacking or bearing host-derived ICAM-1.
Jurkat cells (1 x 106) were either left untreated or pretreated with MEM-83 in combination
or not with AMD-3100 (5 µM). After 4 days, Tat mRNA levels were quantified as
described in Fig. 1. Data shown represent three independent experiments and error bars
indicate standard deviations. Statistical analyses were made by Two-way Anova and
Dunnett for multiple comparisons (****: p<0.0001).
223
Fig. 3. Monitoring productive virus infection in Jurkat cells inoculated with BAL
virus either lacking or bearing host-derived ICAM-1.
Jurkat cells (1 x 106) were either left untreated or pretreated with MEM-83 alone or MEM-
83 used in combination with MVC, chlorpromazine (CPZ) (30 nM), or Efavirenz (EFV)
(50 nM), and next infected for 3 days with BAL virus either lacking or bearing host-derived
ICAM-1. Thereafter, cell-free supernatants were harvested to quantify the p24 content
using a homemade ELISA test (panel A) and the release of infectious virus particles using
the TZM-bl reporter cell line (panel B). Data shown represent three independent
experiments and error bars indicate standard deviations. Statistical analyses were made by
Two-way Anova and Dunnett for multiple comparisons when more than 2 means were
considered (panel A) or Bonferroni (panel B) (****: p<0.0001).
Fig. 4. HIV-1 gene expression in primary human CD4+ T cells infected with JR-CSF
virus either lacking or bearing host-derived ICAM-1 in presence of a CCR5
antagonist.
Primary human CD4+ T cells were isolated using an immunomagnetic negative selection
procedure as indicated by the manufacturer (EasySep, STEMCELL Technologies Inc.,
Vancouver, B.C., Canada). Target cells were next activated with phytohemagglutinin-L (1
µg/ml) and recombinant human interleukin-2 (50 U/ml) for 48 hours. Thereafter, cells were
maintained under drug pressure with MVC either used alone (Ctrl) or in combination with
one of the listed anti-LFA-1 antibody (MEM-83 or MEM-25). Finally, cells were put in
contact with isogenic virus stocks (JR-CSF strain) (100 ng of p24 per 106 target cells),
washed extensively, and incubated for 2 days. Finally, we performed a real-time PCR
experiment as described in Fig. 1. Data shown represent three independent experiments and
224
error bars indicate standard deviations. Statistical analyses were made by Two-way Anova
and Dunnett for multiple comparisons (****: p<0.0001).
225
Figure 1.
226
Figure 2.
227
Figure 3.
228
Figure 4.