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Trucos y consejos en el desarrollo de metodos multicomponentes por GCMSMS

José Juan Rivero Marabé

Especialista de producto GC y GCMS

Agilent Technologies, Spain

6 de marzo de 2013

Indice

Introducción

Preparación de la muestra

Uso de patrones internos

Consideraciones cromatografía

Consideraciones detección

Optimizacion y desarrollo método GCMSMS

Rutina y mantenimiento

Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes

Situación actual

Reto analítico

Niveles:

0,001-10

mg/Kg

Residuos:

>1000 Pesticidas

>300 Drogas veterinarias

Contaminantes naturales:

>500 Micotoxinas

>500 Toxinas de plantas

>100 Biotoxinas marinas

>1000 Contaminanates: Medioambientales:

Dioxinas, PCBs, HPAs, Retardantes de llama, PFCs, Biocidas, Disruptores endocrinos, Metales pesados

>>Cientos de contaminantes de procesos y adulterantes:

Acrilamida, Aminas heterocíclicas, Furanos, desinfectantes, Melamina…

Documento SANCODirectrices de la comision Europea

Establecer un sistema armonizado y “cost-effective” de

aseguramiento de la calidad en la UE

Asegurar la calidad y comparabilidad de los resultados

analíticos

Asegurar una aceptable exactitud de los resultados

analíticos

Asegurar la ausencia de falsos positivos/negativos en los

reports

Servir de apoyo para la acreditación ISO 17025

Documento SANCO/12571/2013

El documento es integral y complementario a los

requisitos de 17025Inicialmente está dirigido a los laboratorios de control oficial pero se ha popularizado a todos

laboratorios de analisis de residuos

http://www.eurl-pesticides.eu/library/docs/allcrl/AqcGuidance_Sanco_2013_12571.pdf

Tendencias en las estrategias del análisis de trazas de residuos en alimentación

• Desarrollo de estrategias eficaces mediante análisis conjunto por GC/MS/MS y LC/MS/MS y que

superen las limitaciones actuales de muchas normativas(FDA/EPA/EU)

• Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas

• Aumentar el número de residuos analizados

• Acortar los tiempos de analisis

• Mayor productividad, sensibilidad y calidad de resultados INCLUSO ENTRE MATRICES

• Desarrollo de estrategias eficaces para determinacion de residuos no target o desconocidos

mediante análisis por GC/Q-TOF y LC/Q-TOF

• Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas

• Aumentar el número de residuos analizados más allá de los conocidos.

• Aumentar la productividad con un software MS intuitivo y potente

• Revisión rápida y atomática de resultados e informes: Más datos con menos recursos

• Cumplimiento de las normativas Comunitaritas e Internacionales

¿ Por qué MS/MS ?

Hoy día, MS/MS es una técnica de rutina y representa una poderosa herramienta

analítica para la determinación de ultratrazas en matrices incluso complejas.

Gran

selectividad

eliminación

del fondo de

la matriz.

Inigualable

sensibilidad

Buena

calidad

espectral

confirmación

más fiable

Preparación

de muestra

más sencilla

¿Cuándo usar MS/MS?

Cuando la Matriz es compleja se pueden producir

Interferencias por coincidencia de los iones de

cuantificación del analito con los de la matriz

Permite la cuantificación selectiva de compuestos

CONOCIDOS en muestras que presentan un elevado fondo

químico

Mejor S/N en matrices complejas que el que puede

obtenerse por tecnologías que

trabajan en Scan o SIM.

Las exigencias de las normativas más actuales resultan

más fáciles de cumplir gracias al

poder de la confirmación

MS/MS

El MS/MS es la solución donde el MS no llega

GC/MS Triple Quad SRM

GC/MS Single Quad SIM

El sueño de todo

cromatografista:

Un pico con linea base

limpia

Interf de matriz = Ruido Químico

Indice

Introducción








Preparacion de la muestra

•Extracción L-L (Disolv inmiscible)

•Extracción fase sólida (SPE, Luke, Quechers, etc…)

El método QuEChERS

•Consiste en una microextracción líquido-líquido

•El MgSO4 ayuda a la partición de los pesticidas en la capa orgánica, gracias a queretiene el agua

•El solvente preferido es acetonitrilo

•El Acetonitrilo proporciona la extracción del más amplio rango de compuestosorgánicos sin la co-extracción de grandes cantidades de material lipofílico y escompatible con la mayoría de aplicaciones de GC/MS y LC/MS mostrando muy pocasinteracciones.

•Seguida de un clean-up de muestra por una SPE dispersiva para eliminar lamatriz no deseada con PSA

•Procedimiento rápido y económico en comparación con los métodostradicionales de preparación de muestra en plaguicidas. Proceso terminadoen menos de 20 minutos

Quechers. Historia y modificaciones

Metodo original

Anastassiades 2002


Problemas de estabilidad:

Sensibilidad al pH (incluso de matriz)

Inestabilidad en el propio disolvente.


Metodo tamponado

AOAC oficial 2007


Metodo tamponado con citrato

EU Estándar method EN 15662/2008

Proceso de Clean up

MgSO4 • Secado (reducir la cantidad de agua en el acetonitrilo)

PSA • Sorbente (reduce la cantidad de grasa, acidos orgánicos y azúcares)

C18 • Reduce la cantidad de compuestos lipofílicos (esteroles, ceras)

GCB• Absorbe compuestos con estructura planar (pigmentos,

carotenoides)

Ej.- Muestras de frutas y vegetales

150mg MgSO4 anh + 50 mg PSA + 50 mg C18

Consideraciones especiales

Indice

Introducción









1. Buena practica para mejorar la precisión y la exactitud.

2. Normaliza errores volumétricos o de inyección, procesos de

evaporación de extractos.

3. Se suele añadir al final del proceso de extracción inicial.

El buen patrón interno debe:

o Buena estabilidad y recuperación independiente de la

matriz.

o No presente en la muestra

o Disponible puro y económico

o Represente a la mayoría de los analitos presentes

Uso de patrones internos: QC

Uso de patrones QC (controles de calidad)

ISTD añadidos al principio del proceso de extracción

Control de las recuperaciones de todos los pasos del proceso de extracción de

compuestos problemáticos.

Ojo no usar patrones planares si se usa GCB en el proceso de cleanup (TPP)

Uso de patrones internos: Selección

Indice

Introducción








Selección de la columna

- Convencionalmente HP5 (5% phenyl)

- Cyanopropyl, cyanopropylphenyl, phenyl…..50%

- 30m x 0,25mm x 0,25um

- 20 m (i.d.<0,2mm) 20 min análisis y pérdida de

robustez

Coelucciones de componentes de la matriz

Afectan a todos los etapas de la cromatografía

Efecto matriz

• Aumento de la señal (GC)

• Supresion de señal o mejora de señal (LC/MS)

Efecto principal: Coelucción

• Puntos activos en el sistema GC

• Estructura química de los compuestos

• Concentracion del analito

• Tipo de muestra y concentración

• Tiempo de residencia

• Temperatura de inyección.

Factores que afectan

Tecnicas de inyección (S/SL)

•Inyeccion splitless en caliente

•Inyeccion splitless pulsado (mejora compuestos lábiles, discriminacion)

Split abierto

Tecnicas de inyección (MMI)

•Cold splitless o solvent vent

oMayores volúmenes de inyección, sin dañar columna por exceso

de disolvente

oIntroduccion de los analitos en columna a la temperatura

adecuada.

Temp

Split cerrado Split abierto

Optimizacion del solvent vent

Excesiva cantidad de acetonitrilo

Condiciones correctas de venteo

Backflush. Optimizacion.

MS-TeeQQQ

EPCMMIPres Alta

1.0 ml/min

Flujo Constante

Pres = 0 Presión RESIDUALPresión ALTA

Backflush y análisis simultáneos: Funcionamiento

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Run se para a 42 min y el

retroflujo se realiza a 280oC

durante 7 min

Necesita 33 min adicionales y

poner a 320oC la columna

para eliminar estos picos.

Blanco run despues de limpieza

min

Una vez instalado, el tiempo de retroflujo

trabajará para TODOS los compuestos

pesados.

- Los compuestos de menor peso eluyen primero

Backflush. Ventajas

Uso de analitos protectores (AP): Sin Backflush

Mezclas de compuestos añadidos a los extractos para desactivacion en

cada inyeccion del Sistema cromatográfico

Fuerte Interaccion con puntos activos (grupos silanoles libres o depósitos

de compuestos no volátiles de la matriz) en la columna y en el inyector

Protege analitos susceptibles de adsorberse sobre puntos activos

Mezclas de AP selecionadas para cubrir amplio rango de volatilidad,

minimizer el efecto matriz, y mejorar la robustez

Compuestos como acido L-gulonico, γ-lactona, D-sorbitol

Analitos baratos, no tóxicos, y seguros para uso en sistemas de GC/MS

March 10, 2014

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March 10, 2014

35

Uso de los protectans: Sin Backflush

Indice

Introducción








Optimizacion de las condiciones del MS

-Temperatura de la fuente de ionización

280ºC compromiso entre buena respuesta de los últimos

compuestos eluidos

-Factor de ganancia vs EMV (+200v)

Ganancia 10-20

-Optimizacion condiciones MS/MS

Condiciones seleccionando 2-4 iones precursores del Full Scan

con multiples energías de colision (0-60v) y seleccionando 2-3

transiciones de las mas abundantes.

-Programa de segmentos de tiempo

Siempre > 10 puntos por pico

Indice

Introducción








Bases de datos publicadas

Agilent: 7 transiciones; clasificaciones; 3 RTs y RIs

Optimizacion MSMS

March 10, 2014

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1. Realizar un Full Scan para elegir el mejor ion

2. Realizar un scan de iones producto a diferentes voltajes

3. Elegir las mejores condiciones de voltaje y abundancia

4. Comprobar numero de puntos por pico

5. Comprobar transiciones con matriz: Interferencias

Optimizacion MSMS

Ciclos por segundo

3,5 ciclos/seg generan 15 puntos por pico

Evaluación de 6 MRMs para Atrazine en diferentes matrices

Metodo MRM: Segmentos de tiempo

Trabajar en RTL

Metodo MRM: Condiciones MRM segmento

Indice

Introducción








Rutina de mantenimiento diario (Bacth 50 muestras)

-Cambio de liner.

-Cambio de septum.

-Realizar tune evaluation.

-Revisar estado de los filtros de gases.

-Revisar nivel de presión de gases.

-Comprobar del primer pinchazo la resolución de picos

isomèricos (-HCH vs -HCH y/o p,p’-DDD vs o,p’-DDT)

-Comprobar perdida de sensibilidad o forma de pico.

-Comprobar el RTL

Requerimientos de controles de calidad

Durante proceso de validación

Recuperaciones, precisión al LOQ (5

replicas)

recuperaciones del 70-120%

repetibilidad 20% al LOQ

En rutina

Recuperaciones ± 2 veces RSD (SANCO 60-

140%)

Consideraciones respecto a la Calibracion

Sobre Matriz

Factores de correlación R2 > 0.990

% RSD ≤ 20%

Residuales < 20% (dif calc vs conc real) (80-120%)

Resumen

• Conocer bien la muestra y los compuestos a analizar

• Condiciones de extracción óptimas

Preparacion de muestra

• Buena introdución de la muestra

• Selección del uso de ISTD

• Selección correcta de las condiciones cromatografícas y de detección

Condiciones instrumentales y metodológicas

• Controles de calidad adecuados

• Planificacion de los mantenimientos diarios, semanales y mensuales

Mantenimiento en rutina

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MUCHAS GRACIAS

por su atención

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