G~NTHER : Trennungen yon Proteinen und deren Peptiden aus Rindermuskel 609

2. HA~C~XG, K. : Habilitationsschrfft, Med. Fakultiit, Univ. Mfinchen 1964. 3. Pl~Z, W. : diese Z. 155, 423 (1957). 4. -- Z. Ges. Exp. Med. 182, 310 (1959). 5. -- Z. Physiol. Chem. 828, 1 (1962). 6. -- Z. Physiol. Chem. 828, 247 (1962). 7. -- Z. Physiol. Chem. 888, 238 (1964). 8. -- Z. Physiol. Chem. 845, 80 (1966); 6th International Congress of Clinical

Chemistry, Vol. 2, p. 121. S. Karger 1968. 9. -- J. Biol. Chem. (ira Druck).

10. -- Science (ira Druek). 11. -- Z. Xlin. Chem. Klin. Biochem. 6, 337 (1968). 12. -- Publikation in Vorbereitung. 13. -- , u. A. E]~s.N: Z. Physiol. Chem. 848, 625 (1967). 14. -- , u. H. H6~L]~I~: Z. Physiol. Chem. 885, 221 (1964). 15. -- -- u. E. STELZL: Z. Physiol. Chem. 845, 65 (1966). 16. -- u. I. Jo~zcN: diese Z. 215, 105 (1966). 17. -- in Handbuch der enzymatischen Analyse von It. U. BE~G~r~YV,~ (Heraus-

geber, 2. Aufl., im Druek. Weinheim: Verlag Chemie.

Dr. W. PILZ Leiter des physiologiseh-chemisehen u. anaIytischen Labors der grztliehen Abteflung 5090 Leverkusen-Bayerwerk

Trennungen yon einigen Proteinen und deren Peptiden aus Rindermuskel mit Hilfe der Diinnschicht-Fingerprint-Technik

HERBERT Gt~NTH]~

Bundesanstalt ffir Fleischforsehung, Insti tut fiir Chemie und Physik, Kulmbach und Staatl. Chemisehe Untersuchungsanstalt Augsburg

Eingegangen am 25. Mai 1968

Separations o/some Proteins and their Peptides /rom Bee/Muscle. A report is given on the application of the thin-layer fingerprint technique with cellulose powder MRT 300 to the separation of peptides isolated from beef muscle proteins and on free peptides and amino-acids of egg powders. The method allows a separation of substance with relative small and sharp limited spots.

Be i de r U n t e r s u c h u n g y o n p o s t m o r t e m Ver /~nderungen i m R i n d e r m u s k e l

w u r d e n d ie mi~ P u f f e r ge lSs t en P r o t e i n e zun/~chst f iber S e p h a d e x G 200 ge l f i l t r i e r t 1. V o n d e n d a b e i a b g e t r e n n t e n P r o t e i n e n w n r d e M y o s i n n a c h

1 Die Gelfiltrationen wurden im Physiologisch-Chemischen Insti tut der Universitgt Wiirzburg durchgefiihrt.

39 Z. Anal. Chem., Bd. 243

610 It. GONT/tER :

vorheriger Reduktion der S--S-Briicken und Verschlul] mit Jodessigs/~ure [t, 3] tryptisch verdaut und die erhaltenen Peptide mit Hilfe der Finger- print-Teehnik aufgetrennt, t t ierzu wurden versehiedene Tr/igermateria- lien verwandt. Da mit einer grogen Zahl yon S10altstiieken zu rechnen war, war eine gute Trennung mit relativ kleinen Fleeken Voraussetzung fiir die Anwendung eines Tr/tgers, um auf diese Weise Vorfraktionierun- gen auf einer Sgule zu vermeiden [6]. Nachdem sieh Papier infolge seines mangelnden Trennverm6gens als ungeeignet erwiesen hatte, wurde Kieselgel [5] und Cellulosepulver allein und in Mischungen angewandt.

Bei der tterstellung der 320 • 320 mm grogen Platten wurde mit einem Glasstab ein Brei yon Cellulosepulver MN 300 I-IR (Maeherey und Nagel, Dfiren) fiber die Flgche gleiehmggig verstrichen; ffir eine gleiehe Sehiehtdicke sorgten zwei an beiden Seiten aufgeklebte Tesa-Filmstreifen. In manehen F~llen wirkte sieh ein Zusatz yon 20~ Kieselgel unter 0,08 mm (Merck, Darmstadt) gfinstig auf die Fleekengr6ge aus. Das Misehungsverhgltnis yon Cellulosepulver zu Wasser muB infolge der nicht immer gleiehartigen Chargen geringffigig variiert werden. Naeh dem Abtroeknen an der Luft wurden 12--14 cm vom Rand der Anodenseite und 4 cm vom unteren Rand entfernt eine Menge yon 2 mg des Peptidgemisehes auf- getragen und mit Pyridin-Aeetat-Puffer pill 6,5 60--70 min bei einer Spalmung yon 60--70 V/em der Hochspaimungselektrophorese unterworfen. Dabei wurde das Modell Frankfurt (Mini 65) naeh WIEL~N~) und PFLEID]~V,~ benutzt. In der zweiten Riehtung wurde im System Butanol-Eisessig-Pyridin-Wasser (30: 6 : 20: 24) 8 h aufsteigend ehromatographiert.

Naeh Besprfihen mit Ninhydrinl6sung und Liegenlassen an der Luft werden nach einigen Stunden beim Rindermyosin 73--75 Peptide sicht- bar, die mit Ausnahme einiger schnellaufender neutrater Peptide alle voneinander getrennt sind. Bei einem bei der Lagerung des Muskels ent- stehenden Protein mit geringem Molgewicht, bei dem neben einigen sauren Peptiden diese sehnellaufenden Peptide fehlen, sind s~mtliehe Peptide, auch die neuauftretenden basisehen getrennt. Auffallend ist ein gelb gefgrbtes Prolinpelotid (naeh S~EOv,~A~ [7] yon I lydroxyprol in untersehiedtieh anf/irbbar), alas auf der Pept idkarte yon Kaninchenmyo- sin nicht vorkommt. Abb. 1 zeigt als Beispiel fiir die Trennung yon Pepti- den auf Cellulosepulver die Peptidkarte yon H-Meromyosin vom Kanin- chen (Pr/~parat Dr. G. Z I M ~ , Ins t i tu t fiir Vegetative Physiologie Frankfurt). NAST u. FASOL]) [5] haben Peptide vom Myoglobin auf Kiesel- gel-Diinnschichten mit I{ochspannungselektrophorese in 15 rain bei 5000--6000 V (etwa 150--190 V/cm) im gekiihlten Benzinbad getrennt und ansehlieBend 1,5--2 h absteigend chromatographiert. Es wurden dabei einwandfreie Trennungen erzielt.

Wir haben diese Elektro-ChromatogTaphie mit Cellulosesehiehten auf Probleme der Lebensmittelchemie angewandt, u.a. auf die Untersuchung yon Trockeneipulvern. Bei diesen Produkten treten oft Geruchs- und Geschmacksabweiehungen auf, die sowohl bei der Lagerung als auch bei

Trennungen yon Proteinen und deren Peptiden aus Rindermuskel 611

hygienisch nicht einw~n4freien Herstellungsbedingungen entstehen k6nnen. Die Elektro-Chromatogramme der Diffusate ergeben bei einw~nd- freien Eipulvern nach Art nnd Menge nur wenige Aminoss und Pep- tide, hingegen fanden sich bei importierten Waren mit sehr abweiehen- dem Geschmack und Geruch 28 Flecke im Fingerprint. Bei diesen Ver- suchen lassen sich auch kleine Plat ten 200 • 200 m m verwenden. Bei Abmessungen yon 180 • 200ram kSnnen 4 Plat ten zugleich elektrophori- siert werden. Die Zeit yon 25 rain (davon die ersten 10 rain bei niedriger Spannung) sollte aber nicht iiberschritten werden, da sonst die Amino-

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Abb. 1. Diinnschicht-Fingerprint der tryptischen Peptide von Kaninchen-H-Mero- myosin

s~uren teilweise in die Pufferstreffen l~ufen. KLOOS u. R6DEIr [4] hat ten einen Anstieg yon Aminos~uren wiihrend der Lagerung auch bei niedri- gen Temperaturen in Eipulvern beobachtet. Eine Gelfiltration fiber eine Ss yon Sephadex G 10 ergab auch die Anwesenheit yon Peptiden [2].

Zusammenfassung Es wird fiber die Anwendung der Dfinnschicht-Fingerprint-Technik mit Cellulosepulver MN 300 H R bei der Trennung yon Peptiden aus isolier- ten Proteinen des Rindermuskels und bei freien Peptiden und Amino- s/~uren aus Trockeneipulvern berichtet. Die Methode erlaubt eine Tren- hung der Substanzen mit relativ kleinen und seharf umgrenzten Flecken.

Literatur 1. CHtCESTFIELD, A., S. STEIN, and W. MOORE: J. Biol. Chem. 219, 623 (1956). 2. G~IVT~E!a, H. : unver6ffentlicht. 3. JONES, R. : Cold Spring ttarbour Sympos. 29, 297 (1964).

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612 PS, RL u. VoGo~.: Celluloseacetat-Membranen fiir elektrophoret. Trennungen

4. I~oos, G., u. I-I. R6Dv, g: Arch. Lebensmibtelhyg. 18, 180 (1967). 5. NAST, It., u. H. FXSOLD: J. Chromatog. 27, 499 (1967). 6. Sc~oBv, g, 1~., W. NICLAVS u. W. Cm~IsT: iVIflchwissenschaft 16, 140 (1961); 19,

69 (1964). 7. ST]~GE~r162 H., u. H. GgIrFm: Naturwissenschaften 45, 263 (1958); vgl. diese

Z. 167, 232 (1959).

Dr. H. G t j ~ Staafl. Chem. Untersuchungsanstalt 8900 Augsburg, Annastralle 16

Methoden zur Beurteilung von Celluloseacetat-Membranen fiir elektrophoretische Trennverfahren

H. P ~ L und K. VOGGV, L

Sartorius Membranfilter G6ttingen

In den verg~ngenen zwei Jahren wurde die Papierelektrophorese durch Celluloseaee~at-Membranen als neues Tragermaterial weitgehend ersetzt [3]. Die mit der neuen Teehnik verbundenen Vorteile erm6glichten nicht nut eine wesentliehe Verbesserung der routinemaBigen SerumeiweiB- elektrophorese, sondern fiihr~en auch zum neuen Verfahren der Immuno- diffusion, der Enzymdiagnostik und der Trennung versehiedener bio- logiseher Substanzen. Die Durchfiihrung empfindlieher bioehemischer Analysen auf Cellulose- ace~at-Membranen setzt sorgf~ltige und den vielseitigen Anwendungs- methoden angepaBte Kontrollverfahren der Tr~tgerfolie voraus. Zur Beurteilung der einwandfreien Besehaffenheit der Membran wurden folgende Methoden herangezogen: 1. Auf Grund ihres eharakteristisehen mikroschaumahnliehen S~ruktur- aufbaus sind Celluloseace~a~-Membrane als Membranfilter zu definieren. Es warden daher zun~chst die zur Kennzeichnung solcher Fil~er fiblichen Methoden herangezogen (Messung der Porenver~eilung, der Durch- l~ssigkei~ und anderes). 2. Die Trennung der Standardseren (l~a. Goedecke, Dade) und die direkt- photometrische Auswertung der Elektropherogramme zur Beur~eflung der Trennschi~rfe und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. 3. Die Immunoelektrophorese [2] gegenfiber verschiedenen Antiseren und die anschlieBende Auswertung der einzelnen Pri~zipitationslinien stellt einen im Hinblick auf die Homogenits des Triggers auBerordentlich empfindlichen Test dar.