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Travaux dirigés de Biologie Moléculaire
9semaine 11
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Exercice 25
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Exercice 25
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mRNA
Aintrons B C E FD G
exons
Exercice 25 : exon/intron
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Southern blot => Transfert d’ADN depuis un gel, puis immobilisation sur une membrane et hybridation avec une sonde
Hybridation : Formation de duplex entre séquences monocaténairescomplémentaires entre un acide nucléique à tester et une sonde
Dénaturation de l’ADN immobilisé : brins monocaténairesAprès migration, le gel d’agarose est trempé en bain alcalin (NaCl + NaOH)
Sonde : ARN ou ADN monocaténaire dont la séquence est complémentaire (totalement ou avec un très haut degré d’homologie) avec la séquence à identifier
Pour être repérable, la sonde doit être marquée• Elément radioactif : P32
• Marqueur biochimique : « sonde froide »couplage d’un fluorochrome => fluorescencecouplage d’une enzyme => addition substrat, couleur!
Exercice 26
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Southern blot
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Exercice 26, enzyme de restriction
Type d’enzyme utilisée au laboratoire
Endonucléase : reconnaît une séquence nucléotidique spécifique d’ADN double brin
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Figure 2 :Fragments obtenus par révélation au bromure d’éthidium après électrophorèse sur gel d’agarose et transfert sur nylon.
Figure 1 : les 3 sondes nucléotidiques 1, 2 et 3.A : expérience 1B : expérience 2
APstIII
EcoRI
BEcoRI
1 2 3
1 2 3
PstI EcoRI PstI + EcoRI
0,3
0,5
1,2
Taille des fragments (kb)
PstIII
Exercice 26
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S1 S2 S32 fragmentsPstI
2 fragmentsEcoRI
3 fragmentsPstI + EcoRI
0,3 1,7
1,5 0,5
0,3 1,2 0,5
Exercice n°26
PstI EcoRI
PstI EcoRI PstI + EcoRI
0,3
0,5
1,2
Taille des fragments (kb)
S1
S1
S1
S2
S2
S2
S3
S3
S3
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2 fragmentsPstI
2 fragmentsEcoRI
3 fragmentsPstI + EcoRI
0,3 1,7
1,5 0,5
0,3 1,2 0,5
Exercice n°26S’2 S’3
PstI EcoRI
PstI EcoRI PstI + EcoRI
0,3
0,5
1,2
Taille des fragments (kb)
S’2
S’2
S’2
S’3
S’3 S’3
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Exercice n°27
Gel sous UV Transfert
1 12 23 34 4
28S
18S
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Exercice n°27 : Chromatographie d’affinité
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Fig 1B, piste 4 : ARNm
les cellules eucaryotes renferment 3 types d’ARN polCes ARN Pol, toutes nucléaires, diffèrent selon les ARN qu’elles synthétisent.
Type d’ARN pol Localisation ARN synthétisés
Pol I Nucléole Précurseurs de la plupart des ARNr
Pol II Nucléoplasme Précurseurs des ARNm
Pol III Nucléoplasme Précurseurs de l’ARNr 5sARNt
Différents petits ARN nucléaires et cytosoliques
Il existe également des ARN Pol mitochondriales et (chez les plantes) chloroplastiques
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Complément : ARNr et Nucléole
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Mécanisme de synthèse : ARN polymérase
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Modifications post-transcriptionnelles
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Coiffe en 5’
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Epissage des introns : trans-esterification
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Type de mutations? La mutation X est une mutation ponctuelle au sein de l’exon 2
La mutation Y correspond à une insertion avec décalage du cadre de lecture au sein de l’exon 2
La mutation Z est une mutation ponctuelle
Exercice 28
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A
C
G
U
T
G
C
A
A
C
G
T
Séquence donnée :Brin ADN 5’->3’
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Hybridation de type Northern : transfert d’ARN
La taille d’un ARNm tel qu’il est observé sur le Northern blot est égale à la somme des exons + UTR(séquence codante + UTR)
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Les mutations ponctuelles et celle correspondant à l’insertion/délétion de pbn’affecteront pas l’ARNm sauf si ces mutations touchent les signaux d’épissage(cas Z).
Northern blot : autoradiogramme attendu
1000 nt
800 nt
X Y Z
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Hybridation de type Western : transfert de protéine
La taille d’une protéine telle qu’elle est observée sur le Western blot est égale à la somme des exons sans les UTR.
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X Y Z
Western blot
20kDa
15kDa
10kDa
La région codante sauvage comprend 600 pb ce qui correspond à un polypeptide de environ 200 acides aminés soit approximativement 20 kDa.
La région codante débute au codon d’initiation, et finit à un codon STOP
La mutation X est qualifiée de silencieuse : le produit protéique formé n’est pas affectéLa mutation Y crée un codon STOP => protéine raccourcie de 100 AA (soit 10 kDa)La mutation Y, qui affecte le site donneur d’épissage, crée plus loin un codon STOP (UAA) en PHASE dans l’intron 2 => protéine de + petite taille que la protéine sauvage.