Trattamento dei campioni biologiciper

l’analisi degli acidi nucleici

Biologia Molecolare Clinicaaa 2007/2008

Renata PaleariUniversità degli Studi di Milano

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Fase pre-analiticaLa rigorosa applicazione delle corrette modalità di prelievo, trasporto, trattamento e conservazione del campione è condi-zione preliminare ed essenziale per garantire l’attendibilità dei risultati ottenuti con le tecniche di biologia molecolare.

Percorso pre-analitico del campione - prelievo - conservazione (temperatura, tempo) - trasporto - trattamento del campione (estrazione acidi nucleici) - conservazione acidi nucleici

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• Errore introdotto:- contaminazione crociata (falsi positivi)- frammentazione DNA per errata manipolazione

• Errore non eliminato:- inibitori della reazione di amplificazione

Errore pre-analitico

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Prevenzione contaminazione (1/2)

• Suddivisione fisica aree di lavoro 1. Area di preparazione del campione (isolamento cellule, estrazione a. nucleici)

2. Area di preparazione della reazione della PCR (preparazione soluzioni, aliquote, mix reazione)

3. Area di amplificazione e analisi degli amplificati (PCR, EF, tecniche ibridazione, sequenziamento)

• Comportamenti operatore - muoversi secondo il flusso area1--->area2--->area3 - mai entrare nell’area 1 o 2 con prodotti amplificati - lavorare con i guanti (che vanno cambiati quando si cambia area)

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• Organizzazione del lavoro

- distribuzione materiale in funzione del tipo di lavoro (pipette, puntali, accessori differenti per ogni area)

- strumentazione dedicata per ogni area - vetreria sterilizzata, materiale usa e getta - puntali con filtro (contaminazione canale pipette con aerosol contenenti a. nucleici)

- soluzioni suddivise in piccole aliquote - pulizia superfici lavoro e apparecchiature con soluzioni decontaminanti (ipoclorito 2%)

Prevenzione contaminazione (2/2)

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Frammentazione del DNA• Danneggiamento a causa sollecitazioni meccaniche

- maneggiare con delicatezza- no vortex a velocità elevata- no pipettamento eccessivo e vigoroso

• Digestione da parte di nucleasi cellulari- lavorare con i guanti- soluzioni e materiali sterili- soluzioni contenenti EDTA

• Azione metalli pesanti (rottura legami fosfodiesterici) - soluzioni contenenti EDTA

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Inibitori della reazione della PCR

• Hb e suoi prodotti di degradazione• Metalli pesanti (Fe++)• Proteine• Lactoferrina• Complessi polisaccaridici• Eparina

In quasi tutti i campioni biologi sono presenti sostanze con azione inibitoria sulla PCR che devono essere eliminate nella fase di preparazione del campione.

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TIPO DI CAMPIONE

• Sangue (leucociti)

• Tessuti (biopsie, in paraffina, villi coriali)

• Liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL)

• Liquidi biologici: - urina - liquor - saliva - liquido amniotico - liquidi cavitari

• Bulbo di capello

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Fase di preparazione del campione

• Scopo: ottenere materiale in condizioni ottimali per indagini di tipo molecolare

• Requisiti: - Non danneggiare: non introdurre errori

- Rilasciare ac. nucleici

- Concentrare: ottenere una quantità adeguata di a. nucleici

- Eliminare inibitori PCR

- Stabilizzare: tempo, temperatura, luce deteriorano

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Separazione dei leucociti da sangue (buffy coat)

- Sangue in EDTA (5 mL)

- Centrifugazione (1000 g, 10 min, temp ambiente)

- Prelievo buffy coat

- Lisi RBC (1 mL ammonio cloruro, K bicarbonato, EDTA, pH 7.4)

- Centrifugazione, scartare il surnatante

- Lavaggi con PBS

- Pellet di leucociti

- Conservare a -20 °C

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Separazione dei linfociti da sangue

- Diluizione sangue (1:2 con PBS)

- Stratificazione sangue su FICOLL (d=1.077 g/mL)

- Centrifugazione (1000 g, 30-40 min, 20°C) - 4 strati: - plasma

- anello di linfociti

- FICOLL

- RBC sul fondo

- Raccolta linfociti

- Lavaggi, conservare a –20°C

Centrifugazione in gradiente di densità di FICOLL

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•Urina, liquidi cavitari:- centrifugazione (separazione componente cellulare

e frazione liquida)•Liquor:

- concentrazione (molecole PM>100 dalton)

•Campioni delle vie respiratorie (BAL, espettorato):

- fluidificazione con enzimi mucolitici- concentrazione delle cellule (centrifugazione)

•Campioni da biopsie:- disgregazione tessuto (bisturi, omogenizzatore)- eventuale lisi RBC presenti

Preparazione altri tipi di campione

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Conservazione campioni• Per estrazione DNA - Sangue: +4°C (24-48 ore)

“ -20°C (anni) - Leucociti: -20°C - Pellet: -20°C - Liquor : +4°C trattato: -20°C - Tessuti: N2 liquido

• Per estrazione RNA - Tutti i campioni a -80°C

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Estrazione del DNA• Scelta del metodo - tipo di campione - grado di purificazione richiesto - tecnica impiegata per l’identificazione - tempo richiesto - numero di campioni da processare

• Metodo ideale - elevata purezza - elevato recupero - sicuro: no reagenti pericolosi - economico - rapida esecuzione

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Estrazione del DNA: fasi

1. Lisi cellulare ed inativazione delle nucleasi

2. Purificazione del DNA

3. Precipitazione DNA

4. Valutazione quantitativa DNA estratto

5. Conservazione

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1. Lisi cellulare

- Disgregazione meccanica: - lisi ipotonica- omogenizzazione

- Trattamento con agenti chimici:- detergenti (SDS, Sarcosyl, Nonidet P40)- agenti caotropici (urea, ioduro di sodio, guanidina tiocianato)

- Digestione enzimatica:- proteinasi K

Lo scopo di questa fase è di liberare il DNA dai nuclei edalle proteine istoniche ed inoltre di inattivare le proteasi

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2. Purificazione DNALo scopo di questa fase è la separazione del DNA dalle componenticellulari (proteine, lipidi, polisaccaridi) e sostanze interferenti

- Utilizzo di solventi organiciFenolo (denatura le proteine) Cloroformio (solubilizza i lipidi) Isobutanolo

- Metodo del salting outUtilizza alte concentrazioni saline per rimuovere leproteine (NaCl 6M)

- CromatografiaA scambio anionico (matrice carica positivamente)

Per adsorbimento (matrice di silice)

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3. Precipitazione DNALo scopo di questa fase è di concentrare, desalificare e recuperare il DNA in forma solida permettendone il successivo ridiscioglimento nella soluzione desiderata

- Trattamento con alcooli - etanolo: in presenza di alte concentrazioni di sali monovalenti (sodio acetato, ammonio acetato)

- isopropanolo: non richiede alte concentrazioni

saline ma è meno facilmente eliminabile dell’etanolo

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Purificazione DNA con fenolo-cloroformioMetodo di estrazione classico basato sulla diversa solubilità dellemolecole in soluzione (DNA/contaminanti) tra due fasi non miscibili

- Lisi campione - 1-10 milioni cellule (si ottengono da 1.0 mL sangue)

- Tampone contenente SDS, EDTA, proteinasi K (500L)

- Overnight 55°C

- Estrazione DNA- Trattamento 1:1 con fenolo-cloroformio alcool isoamilico pH 8.0

( a pH 7.5-8.0 il DNA è nella fase acquosa; a pH 5.0-6.0 il DNA è nella fase organica)

- Centrifugazione

- 3 fasi: - fase acquosa contenente DNA - interfaccia contenente proteine denaturate - fase organica contenente i lipidi

- Prelevare la fase acquosa superiore

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- Precipitazione DNA - Aggiunta etanolo assoluto (1 mL) e tampone ad alta forza ionica (50 L) (Na acetato 3 M pH 5.2)

- Precipitazione DNA (formazione gomitolo)

- Centrifugazione a velocità alta (12.000 rpm)

- Lavaggio pellet con etanolo 70 %(1 mL) per rimuovere sali in eccesso

- Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno 15 min a provetta aperta

- Il DNA precipitato e asciutto può essere conservato a -20°C.

- Risospensione DNA precipitato - Il DNA viene risospeso in H2O o nel tampone previsto dalla metodica. - Può essere conservato a +4°C per qualche settimana o a - 80°C per molti anni (evitare i congelamenti e scongelamenti ripetuti che danneggiano il DNA)

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Purificazione DNA su gel di siliceIl metodo è basato sulla proprietà degli a. nucleici di adsorbirsi alla silice, a differenza delle proteine e di altri composti organici

- Lisi campione: - con tampone contenente detergenti, proteinasi K, sali coatropici - 56°C per 10 min.

- Adsorbimento DNA al gel di silice contenuto in una colonnina - in presenza di etanolo e sali cautropici il DNA si lega alla silice - lavaggi con soluzioni contenenti alcool in grado di rimuovere le proteine denaturate e gli altri componenti cellulari e lasciare il DNA legato alla silice

- Eluizione DNA: con H2O o soluzioni a bassa concentrazione salina

Nota: il DNA ottenuto è molto puro ma la resa è inferiore rispetto al metodo classico con solventi

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4. Valutazione quantitativa DNA estratto

• Concentrazione DNA- Diluizione in tampone alcalino

- Assorbanza 260 nm

- DNA, g/mL= A260 x f.dil x 50

• Purezza (contaminazione da proteine)- Rapporto A260/A280

- Purezza ottimale, A260/A280 1.7 - 1.9

dsDNA: 1.0 A = 50 g/mLssDNA: 1.0 A = 33 g/mL RNA: 1.0 A = 40 g/mL oligo: 1.0 A = 33 g/mL

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1.0 mL sangue intero (5-10 milioni leucociti)

25 - 50 g di DNA

• PCR: 0.1 - 2 g DNA

Una cellula eucariota contiene: 6 pg DNA, 10-30 pg RNA

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5. Conservazione del DNAIl Dna estratto e purificato è in genere risospeso in H2O distillata sterile ultrapura o in soluzioni a bassa concentrazione salina a pH 7.4.

+4°C: stabile per alcune settimane

-20°C: stabile più a lungo (evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento che possono danneggiare il DNA)

-80°C: stabile per molti anni

• RNA sempre a -80°CRNA sempre a -80°C

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Manipolazione RNA: precauzioni (1/2)

• Molecola instabile - presenza ossidrile libero in posizione 2’ sul ribosio

- idrolisi in soluzione acquosa alcalina

• Particolarmente suscettibile azione RNasi • RNasi estremamente attive - non necessitano di alcun cofattore

- molto resistenti alle alte temerature (autoclavaggio)

- presenti ovunque (operatore, ambiente lavoro, soluzioni)

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Manipolazione RNA: precauzioni (2/2)

• Inattivazione RNasi endogene (utilizzo inibitori, denaturanti) - Sali di vanadio complessati con ribonucleosidi: inibitore - Rnasina: inibitore specifico - Guanidina isotiocianato: agente denaturante

• Prevenzione contaminazione RNasi endogene (ambiente Rnasi-free) - Aree lavoro separate con materiali, soluzioni, pipette dedicate - Materiale plastico monouso RNasi-free - Vetreria: - temperatura > 180°C - trattamento con dietil-pirocarbonato (DEPC) 0.1% - autoclavaggio - prodotti commerciali per decontaminazione - Soluzioni: - DEPC 1 mL/L e autoclavaggio - Soluzioni e Kit pronto uso

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Estrazione e purificazione RNA

• Lisi cellulare - In presenza di guanidina isotiocianato (agente caotropico) e -mercaptoetanolo (agente riducente)

• Purificazione - Trattamento con fenolo-cloroformio pH 5-6 - 3 fasi:- fase acquosa contenente RNA - interfaccia contenente proteine denaturate - fase organica contenente DNA e lipidi

• Precipitazione - Con isopropanolo, lavaggi con etanolo 75%

• Risospensione

- Con H2O o tampone a bassa forza ionica, conservare a -80°C

L’RNA deve essere estratto il più rapidamente possibile subito dopo la raccolta del campione

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Controllo di Qualità Interno

•Procedure per la realizzazione della qualità - Organizzazione del lab (aree pre- e post-amplificazione separate)

- Controllo delle contaminazioni (guanti, materiali monouso)

- Strumentazione (manutenzione periodica)

- Reagenti (per biologia molecolare, piccole aliquote, data scadenza)

- Metodiche (protocollo di lavoro scritto e dettagliato)

•Strumenti per la verifica della qualità (controlli) - Controlli positivi - Controlli negativi - Bianco di PCR - Controlli di estrazione (campione da paziente noto) - Controlli di amplificazione (a. nucleico già estratto)

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Valutazione Esterna di Qualità (VEQ)

Diagnostica virologicaDisponibili VEQ per alcuni patogeni di rilevanza clinica e larga diffusione e per i quali sono disponibili kit commerciali e parziale automazione, ad es.HBV, HCV, HIV, CMV.

Diagnostica geneticaLimitati a poche patologie di rilevante impatto clinico e diffusione (es. fibrosi cistica).Più praticabili VEQ che valutino l’accuratezza e l’efficienza delle diverse fasi di un esperimento di PCR (dall’estrazione alla rivelazione). Queste fasi sonocomuni a tutte le applicazioni della PCR e possono interessare laboratoricon diverse specializzazioni e interessi clinici.

•Tappe essenziali - Ente organizzatore che predispone la VEQ - Partecipanti (laboratori che aderiscono alla VEQ) - Spedizione di materiali e programma ai partecipanti - Analisi dei materiali da parte dei lab - Invio dei risultati - Elaborazione dei dati

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Esempio di un programma di VEQ per l’amplificazione del DNA mediante PCR

Materiale inviato - 3 campioni di DNA estratti da leucociti - 1 campione di sangue - 1 coppia di primers - Protocollo di amplificazione da allestire con reagenti e strumenti per PCR del laboratorio

Partecipanti 39 laboratori italiani

Programma1. Determinazione della concentrazione e della purezza dei 3 campioni di DNA.

2. Estrazione del DNA dal campione di sangue con la procedura in uso nel lab e stima della quantità e qualità del DNA estratto.

3. Amplificazione mediante PCR del DNA estratto dal campione di sangue e analisi dei risultati mediante eletttroforesi.

Raggi, 2003

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1. Valutazione della quantificazione del DNA

CV, %DNA,g/L A 260/280

DNA 1 128 51

DNA 2 72 15

DNA 3 211 30

Valori di CV calcolati dai risultati inviati dai laboratori per quantoriguarda la concentrazione di DNA e la purezza, misurata sui trecampioni di DNA.

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2. Valutazione della metodica di estrazione

Concentrazione DNA Purezza DNA

Labs Labs

Mediana: 0.1 g/LMin: 0.012g/LMax: 0.54 g/LCV: 82 %

Mediana: 1.69Min: 0.8Max: 2.5CV: 21 %

Rat

io 2

60/2

80 n

m

DN

A, g

/L

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3. Valutazione della reazione di amplificazione

Analisi dei prodotti di amplificazione (elettrofforesi su gel di agarosio 2 %)

Atteso: 1 banda di 280 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 11 12 13 14 15 16 9 10

Labs