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Transitoires calciques et différenciation neuronale
• Neuroblastes de la moelle épinière d’embryon de xénope (HOLLIDAY and SPITZER 1990).
• Précurseurs neuraux de la zone ventriculaire de néocortex d’embryons de rat (OWENS and KRIEGSTEIN 1998).
• Cellules de crêtes neurales troncales d’embryons de souris (CAREY and MATSUMOTO 1999).
• Précurseurs de neurones GABAergiques d’embryons de drosophile (KUPPERS et al. 2003).
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Transitoires calciques de neurones NT2N humains
A
B
Gao et al. 1998, EJN 10:2416-25
Control
Ca2+ 0
mM
Nif. 1
0 µM
GVIA 5
µM
MVIIC
5 µ
M
Ni 0.5
mM
Ni 5 m
M
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Canaux calciques voltage-dépendants et différenciation neuronale
• Les canaux de type L sont indispensables à l’induction neurale chez le xénope et sont régulés par noggin (Leclerc et al. 2000).
• Les canaux de type N déterminent le phénotype neurochimique GABAergique dans la moelle épinière d’embryons de xénope via une régulation de l’expression de la GAD67 (Watt et al. 2000).
• L’expression des canaux de type L est corrélée avec la maturation de l’excitabilité de neurones de Purkinje de rats néonataux (Liljelund et al. 2000).
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Codage fonctionnel des transitoires calciques chez le xénope
• Les « spike » calciques de 2-3/h au niveau du soma déterminent la différenciation des neurones GABAergiques (Gu et Spitzer 1995).
• Les ondes calciques d’environ 8/h au niveau du cône de croissance inhibent la pousse neuritique (Gomez et Spitzer 1999)
• Les transitoires calciques, d’environ 10/min, des filopodes régulent le guidage axonal (Gomez et al. 2001).
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Rôle des canaux calciquesdans la différenciation
neuronale Méthodologie:
– Pharmacologie et électrophysiologie in vitro.
– Transgenèse– Clonage in silico de canaux– Modulation in vivo des courants– Microscopie multiphotonique in vivo
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Modèle animal : Xenopus laevis et tropicalis
Xenopus laevis
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Advantages du modèle
•Modèle d’ embryologistes•Milliers d’oeufs de grandes tailles.•Chorion transparents et développement externe des embryons.•Table de développement embryonnaire établie.
•Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser.•Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin.• Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires.
•Modèle de génétique:•Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2007 par le “Joint Genome Institute » au NIH.
F. TIAHO
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Advantages du modèle
•Modèle d’ embryologistes•Milliers d’oeufs de grandes tailles.•Chorion transparents et développement externe des embryons.•Table de développement embryonnaire établie.
•Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser.•Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin.• Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires.
•Modèle de génétique:•Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2004 par le “Joint Genome Institute » au NIH.
F. TIAHOF. TIAHO
METHODES: solutions
Dissection
Mark’s Modified Medium
•NaCl100 mM•KCl 2 mM•CaCl2 0.2 mM•MgCl2 1 mM•Hepes 5 mM•pH 7.8
Dissociation
Barth Medium•NaCl 88 mM•KCl 1 mM•NaHCO3 2.4 mM•Na2HPO4 2 mM•KH2PO4 0.1 mM•EGTA 0.5 mM•pH 8.1
Culture
Mark’s Modified Medium
•NaCl100 mM•KCl 2 mM•MgCl2 1 mM•Hepes 5 mM•CaCl2 ±0.5 mM •EGTA ± 1 mM•pH 7.8
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Fil de platine
Fil de platine
Pointe de pipette Pasteur
Pointe de pipette Pasteur
1. Couteau
2. Raquette
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METHODES in vitro: dissection et culture des cellules neurectodermiques
1. Dissection 2. Culture
B
DC
A
1 mmNeurone
C.I.
C.E.
20 µm
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Exemples de neurones
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Advantages du modèle
•Modèle d’ embryologistes•Milliers d’oeufs de grandes tailles.•Chorion transparents et développement externe des embryons.•Table de développement embryonnaire établie.
•Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser.•Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin.• Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires.
•Modèle de génétique:•Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2004 par le “Joint Genome Institute » au NIH.
F. TIAHOF. TIAHO
METHODES: solutions
Dissection
Mark’s Modified Medium
•NaCl100 mM•KCl 2 mM•CaCl2 0.2 mM•MgCl2 1 mM•Hepes 5 mM•pH 7.8
Dissociation
Barth Medium•NaCl 88 mM•KCl 1 mM•NaHCO3 2.4 mM•Na2HPO4 2 mM•KH2PO4 0.1 mM•EGTA 0.5 mM•pH 8.1
Culture
Mark’s Modified Medium
•NaCl100 mM•KCl 2 mM•MgCl2 1 mM•Hepes 5 mM•CaCl2 ±0.5 mM •EGTA ± 1 mM•pH 7.8
F. TIAHO
Propriétés des neurones différenciés
•ImmunologieIls sont tous 3A10 positifs.
•Electrophysiologie Ils sont tous excitables lorsque le milieu de culture ne contient pas de calcium.
•Morphologie Taille des neurites > deux fois le diamètre du soma.
Dans les expériences suivantes les neurones sont définis par des critères morphologiques uniquement.
F. TIAHO
Analyses des neurones différenciés
•La calcein-AM et le propidium iodide sont utilisés pour distinguer les cellules vivantes et mortes.•Les neurones sont identifiés par le critère morphologique.•Le nombre de neurones ou leur pourcentage dans chaque boîte de Petri sont déterminés.•Pour les statistiques, les tests de ou t-test de student sont utilisés. •Les cellules sont observées à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Olympus IX70).
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-350 pA
-20 mV
0 mV
A Current clamp
B Voltage clamp
I (nA)
Vm (mV)
Vm (mV)
I (nA)
METHODES in vitro:
2. Electrophysiologie
50 µm 50µm
Neurone
Anti-islet1Anti-myosin
1. Immunocytofluorescence
3A10A1 A2
20 µm
3A10
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F. TIAHO
Propriétés des neurones différenciés
•ImmunologieIls sont tous 3A10 positifs.
•Electrophysiologie
Ils sont tous excitables lorsque le milieu de culture ne contient pas de calcium.
•Morphologie Taille des neurites > deux fois le diamètre du soma.
Pour dénombrer en routine les neurones dans les cultures nous utilisons le critère morphologique
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ATP AchIGF BTX
Dépolarisation
GVI-A
Ni
Ca2+
Différen
ciation
neu
ron
ale
??TRP
Bilan des résultats
Ca2+
Ca2+Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
F. TIAHO
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Groupe1 Groupe2
Groupe 1A Groupe 1B Groupe 2A Groupe 2B
Mercredi AM Prép. solutionsObservation cultureDissection
Prép. solutionsDissectionObservation culture
Mercredi PM DissectionCulture
DissectionCulture
Jeudi AM Comptage Comptage Prép. solutionsObservation cultureDissection
Prép. solutionsDissectionObservation culture
Jeudi PM DissectionCulture
DissectionCulture
Vendredi AM Comptage Comptage
Vendredi PM
Planification de la culture cellulaire
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GROUPE 1A GROUPE 1B
Nombre NOM PRENOM NOM PRENOM
1
2
3
4
5
GROUPE 2A GROUPE 2B
6
7
8
9
10
FICHE-GROUPES