transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecnos) mediates the...

10
Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury Dan Levy, 1 Michael Tal, 2 Ahmet Ho Èke 1 and Douglas W. Zochodne 1 1 Department of Clinical Neurosciences and the Neuroscience Research Group, University of Calgary, 3330 Hospital Drive, N.W Calgary, Alberta T2N 4N1 Canada 2 Department of Anatomy and Cell Biology, Hebrew University, PO Box 1172, Jerusalem, Israel Keywords: axonal endbulb, ectopic mechanosensitivity, neuropathic pain, nitric oxide, pain Abstract Neuropathic pain is a disabling feature of peripheral nerve injury. Following injury, local in¯ammation and the release of mediators may contribute to ectopic mechanosensitivity of the nerve-trunk and pain hypersensitivity. In the present study we investigated whether nitric oxide (NO) action and local nitric oxide synthase (NOS) expression play a role in pain hypersensitivity and A ®bre- mediated ectopic hyperexcitability following a chronic constriction injury to a rat sciatic nerve. Using immunohistochemical methods we provide evidence for a unique endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) immunoreactivity localized in early axonal endbulb-like structures of injured peripheral nerve axons. Moreover, we show that following nerve injury there is increased ecNOS- mRNA expression within the lumbar sympathetic ganglia, and that axoplasmic transport in sympathetic and other axons rather than local non-neural synthesis accounts for its accumulation in nerve ®bres. We also demonstrate here that local inhibition of NOS action with the broad-spectrum inhibitor N G -nitro-L-arginine-methyl ester (L-NAME), but not more speci®c inhibitors of other NOS isoforms, has stereospeci®c, dose- and time-dependent analgesic effects that were reversed by local administration of L-arginine, the natural precursor of NO. In further work, using a teased ®bre preparation, we show that administration of L-NAME, but not D-NAME, to the injury site also blocks ectopic mechanosensitivity of injured A-®bres. Our results indicate that an early and transient local ecNOS expression within early axonal endbulb-like structures, some arising from sympathetic axons, plays a critical role in the development of neuropathic pain. Introduction Peripheral nerve injury may generate pain hypersensitivity, character- ized by enhanced nociceptive responses to noxious stimuli and decreased thresholds to innocuous stimuli. Subsequent to peripheral nerve damage, afferent ®bres and axonal sprouts trapped at the lesion site develop ectopic hyperexcitability thought to contribute to the development of the behavioural manifestations of neuropathic pain (Michaelis et al., 1995; Devor & Seltzer, 1999). While the exact mechanisms underlying hyperexcitability and enhanced nociception remain elusive, local changes in the milieu of an injured nerve trunk may play a role (Asbury & Fields, 1984; Zochodne, 1993). Release of in¯ammatory mediators capable of sensitizing injured primary afferents (Michaelis et al., 1998) and continuous transport of mechano- sensitive ion channels (Devor & Seltzer, 1999) or other molecules (Koschorke et al., 1994) to the injury site may contribute to ectopic mechanosensitivity and associated hypersensitivity or tenderness. We have previously demonstrated that local expression of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) following peripheral nerve injury generates nitric oxide (NO) and produces local changes in adjacent microvessels (hyperemia) (Levy & Zochodne, 1998; Zochodne et al., 1999). In addition to its local action on the nerve microcirculation, a number of studies have suggested that local NOS±NO action promotes pain hypersensitivity associated with in¯ammation (Kawabata et al., 1994; Aley et al., 1998) and nerve injury (Thomas et al., 1996; Khalil et al., 1999). Furthermore, it has been shown that perivascular NO injections evoke pain in humans, probably by exciting nociceptors (Holthusen & Arndt, 1995). In this work we investigated the source of ecNOS protein accumulation. We further tested whether local NOS action directly in¯uences the development and maintenance of pain hypersensitivity in the chronic constriction injury (CCI) model of neuropathic pain (Bennett & Xie, 1988). NO has been suggested to promote ectopic hyperexcitability of axotomized dorsal root ganglion (DRG) neurons (Wiesenfeld-Hallin et al., 1993). We therefore also studied whether local blockade of NOS activity in¯uences ectopic hyperexcitability, especially mechanosensitivity, associated with nerve injury (Govrin- Lippmann & Devor, 1978; Michaelis et al., 1995; Tal & Eliav, 1996; Tal et al., 1999). Our ®ndings suggest that local ecNOS actions mediate thermal hypersensitivity and ectopic mechanosensitivity of the nerve trunk probably through its unique localization in axonal endbulb-like structures. Correspondence: Dr D. W. Zochodne, as above. Email: [email protected] *Present address: Department of Anesthesia, Harvard Medical School and Beth Israel Deaconess Medical Center, 330 Brookline Avenue, Boston, MA 02215, USA Received 11 October 1999, revised 13 March 2000, accepted 30 March 2000 European Journal of Neuroscience, Vol. 12, pp. 2323±2332, 2000 ã Federation of European Neuroscience Societies

Upload: dan-levy

Post on 06-Jul-2016

216 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

Page 1: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

��������� ���� � ��� �� ������� ���������� ����� �� ��������� ������ �� ����� ��� ��������� � ����������������������� ������� ���������� ����� ������

��� ����� !����� ����" #���� $%&� ��� ������ '( )� �� �������� �� ������� ������������� ��� �� ������������ �������� ������ ��������� �� ������� ���� ������� �������� ������� !�"��� #$� %�� �����$������� �� !���� ��� ��� &������� ��"��' ���������� () &�* ��+$� ,�������� -�����

��������. �*���� ���"��"� ������ ���������������� ���������� ����� ����� �*���� ����

#*�����

��������� ���� �� � ���*���� ������� � ���������� ����� ������( +������ ������� ��� ��,������� �� ��� ������� � �� �������� ����*��� � ���� ���������������� � ��� �����-����& �� ���� ����������������( .� ��� ������� ��� � �� ����������� ������� ����� �� � ���� ���� �� ��� ����� �� � �������� ����� ��������� ���� � ��� �� ���� ���������������� �� # /*��-�� ���� ���� ����������*����� ������� � ���� �������� ������ � � ��� ����� �����( 0���� ��������������� ���� ��� ���� � ��� ��� �� � ���1�� �� ������� ���������� ����� �� � �������� ������ �������������� ����2� �� ����� ������� *��*-��&� ��������� � ������ ���������� ����� ����( !������ �� ��� ���� ������� ����� ������ ����� �� ������� ����-�3�# ��������� ������ ��� ���*�� ���������� �������� �� ���� �������� �������� �� ���������� �� ���� ���� ������ ������� ��-������ ��������� ����� �� ��� ��������� �� ����� /*���( '� ��� ��������� ���� ���� ��� ����*���� � ��� �������� ��� *�� -������� ����*��� �4-����-�-��������-������ ����� ��-�#!5�� *�� �� ��� ����/ ����*���� � ���� ��� ���������� ���������/� ��- �� ����- ���� ��� �������� ������ ���� ���� ������� *� ��� � ����������� � �-��������� ��� �������������� � ��( .� ������� ��&� ����� � ����� /*�� ����������� �� ��� ���� � ����������� � �-�#!5� *�� �� �-�#!5� � ��������� ���� ��� *�&� ���� ���������������� � ������ #-/*���( ��� ������� �� ���� ���� �� ����� �� ��������� ��� ������������� ������ ����� ����� �� *��*-��&� ���������� ��� ������� ��� ���������� ����� ����� � ������ ��� �� ��� ���������� ��������� ����(

.��� ����

���������� ��� ���� �� ������� ��� � ����������� � ����������

���� � ������ ��������� �������� �� ������ ������� ��

��������� ���������� �� ������� �������� ��������� �� ����������

��� ������� ������� ����� �� ����� ������� ������� �� ��� �����

���� ������ ������� � �������������� ������� �� ��������� �� ���

��������� �� ��� ���������� ������������ �� ���������� ���

� �������� �� ���� !""#$ %��� & �������� !"""'� (���� ��� �����

��������� ����� �� � �������������� �� ������ ���������

����� ������� ����� ������ � ��� ������ �� � ������ ��� ���)

�� ��� � ���� �*���� & +������ !",-$ .������� !""/'� 0������ ��

�1������� ��������� ������� �� ��������� ������ ������

�������� � �������� �� ���� !"",' �� �������� �������� �� �������

������� �� ������ �%��� & �������� !"""' �� ����� ���������

�2������)� �� ���� !""-' �� ��� ���� ���� �� ��������� �� �������

�������������� �� ���������� � ����������� �� ���������

(� ��� �������� ����������� ���� ����� ��������� �� ���

���������� ���������� ����� ����� � ����� ���34�' �����5��

���������� ��� ���� �������� ����� ����� �34' �� ��������

����� ������ � ������� ����������� �� �������' �6� &

.������� !"",$ .������ �� ���� !"""'� 7 ������� �� ��� �����

����� � ��� ��� ���������������� � ����� �� ������� ���

��������� ���� ����� 34�834 ����� �������� ��� � �����������

���������� 5��� �1������� �2�5����� �� ���� !""-$ *�� �� ����

!"",' �� ��� ���� �9����� �� ���� !"":$ 2����� �� ���� !"""'�

+����������� �� ��� ��� ���5 ���� ����������� 34 �������� ��)�

��� � ������ ������� � ������� ���������� �;������� &

*���� !""#'�

7 ���� 5��) 5� ���������� ��� ������ �� ��34� ������

������������ (� ������� ������ 5������ ����� 34� ����� �������

�1����� ��� ��������� �� �������� �� ��� � �����������

� ��� ������ ���������� ���� �<<7' ����� �� ���������� ���

�=���� & >��� !",,'� 34 ��� ��� ��������� �� ������� �������

� �������������� �� ���������� ������ ���� ������ �%0?' �����

�(���������;���� �� ���� !""/'� (� ��������� ���� ������� 5������

����� ����)��� �� 34� ������ �1����� ������� � �������������� �

��������� �������������� � ���������� 5��� ��� ���� �?����

6����� & %���� !"@,$ �������� �� ���� !""#$ 9�� & A���� !"":$

9�� �� ���� !"""'� 4�� ����� ������� ���� ����� ��34� ������

������� ������� � ����������� �� ������� �������������� ��

��� ��� ���) ������� ������� ��� ����� ����������� � �����

���������)� �����������

�����������B %� %� (� .������� �� �����A����B �������C������� ���

������ �������B %�������� �� *��������� ;����� ������ ������ ��=��� 7����� %������� ������ <����� //D =���)��� *���� =����� *DEE!#� F�*

�������� �� ������� ����� ������� �� ����� ����� ������� �� ����� ����

������ ������ �� ����������� !��" ��� " ����#����� ���� � $�������� �� ������ ���������� %��������

Page 2: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

!�������� �� ���� �

*�� ����������� ��������� 5��� ����5�� �� ������� � ���

F������ �� <����� ����� ���� ��������� �����5�� ��� <�����

<����� �� *���� <��� ���������� ��� ����� ��������%�5�� ����

�E#D8/DD �'� ������ 5��� � !E�� ����� B !E�� ���) � ��� 5��� ������ ��

���� �� 5���� �� ������& 5��� ���� ���������� ��� ���� "

��� �������

<<7 5�� ������� �� �������� ��������� �=���� & >��� !",,'�

=���1 � ��� ����� ������� ��� 5�� ������� �� ��� ��������� ���� ��

���� ��������� �-8D ������� ���� A������ ������������� 439' 5���

������ ���� ����� ��� ��� ���� �������� �� ��� ������������ +�� ���

����������� ������ ��� 098�<0 ������� �� ����������� ��������

���� ��� ������������ ������� ��� ���� ����5�� � ���� ������

5��� �������� �� ��� ������� ��� ��� 5������ ��������

���� ������ ����

F��� ���� ���������� ������ �� ���� �������� ���� 5���

�������� �� -, � �G #'� @ �� � � G -' �� !- �� � � G #' �����

������ � ����� �� ����������� �� ��������� �������� �6� &

.������� !"",$ .������ �� ���� !"""'� ������ ��������� �������

��� ����� �� �������� ����� �������� ��������� �� ��34��

34� �� �������� 34� ��34�'� ������� �� ! B #DD8!DDD

�9��������� 6������������ 6������� 2H'� +�� ��������������

����� �������� ��������� �� �����������; �3+�EDD� ! B #DD'�

��!DD �� ���5� ����� ���)��$ ! B #DD'� ����� �� ���)�� ���

���������� �� ���������� �����$ ! B /DD'� � ����� � ���� ���� �9;$ �

���)�� ��� � ��������� �����$ ! B #DD' �� A%�! ���� �����������I

���� ���$ ! B #DD' 5��� ����� *�� ��������� 5��� ������� ����

������ 4�)����� 43� ������� ��������� 5��� ��� �����������

7�?� ��������� �� +79< �7������ �����5����� 3$ ! B #D' �� < /

������$ ! B EDD'� *�� ��������� 5��� ������� � D�! ����������

�������� ����� ������� D�!J =�* �� D�!J 9�����> !DD�

������� 5��� ��5�� �� ������������ ���� � 1��������

���������� 5��� ��� ����������� ������ �.����� *��������'� 9�

������� 5������ ��34� �� ������� ���������� �� ����������� �

����� ���������)� ���������� �����5�� <<7 � ��������� ����� ��

���� �G -' ����5�� <<7 ������ ��������� 5��� � ���������

��� ��������� ! �� �������� �� ��� ���� ������� 3��� ��������

5��� ��� ������ ��� ��34� �� 3+�; �� ����� 7 ��� ����������

������ ������� ������� ������ ���������� *� � ������� ���� ��

<<7 �������� ���� ������� 5��� ������� � ��� ���� ����� ��

������ ������ �����������

������ ���� ����� �

9� ���� ��� �������������� ��������� �� ��34�� -, �� #�� "� �� !-�

�� <<7 �� ���� �������� ���� ����� G -' 5��� ������

��������� ��������� ������ �� ������ ������� ���� <<7 ����

�� ����������� ������� ���� ���� �������� ���� 5��� ����)�

����� �� ��������� � �� ���� *�������� ������� �������

�������� �� ������ <<7 ������� ��)� -, � ����� � ���������

�������� �������� ������ ����� G -'� +��� ���������� �� ������

��������� K�������� � !J 9���� >�!DD� D�!J �%�� !� ��������

�������� ���)���� ������'� � !D� 9����;<�� �; @�,L 5���

��������������� � !DJ �%���*?A �� ������� �� � �������������

������� � 9���8�� ���8������� ������ ������� �� - �<� *��������)�� �@�#J ���� �� ���) �� D�D#J 95���ED � 9������������

�����'� �������� 5��� �������� ��� E � �� ���� ����������� 5���

�������� ��������� �� ��� 34� �������� ��� ����� �� ������� ��

! B !#DD' � ��� ���� ����)�� �������� ����� �������� 5��

��������� � � ! � �������� 5��� ����������� ��������������������

������� ������ ����� <��� =���������� � ���� <���� <*$

! B E#DD' �� �������������� ������� �A<6� *������� 4�)�����

43� <����'�

����� ��� ������� �

9� ���� ������ � ��34� �03* ��������� 5���� ���� ������

��������� �� ��� ������� ���� �� �� ������� ��� ���������� ���� �����

5�� � ����� � ������ �� ��34� ������ �� ����� ��������� 5� ������

������ � ��� �03* ��������� ���� � �������������� 09��<0

5��� ������� ������� ������� �� �������� ��34�� %0? �6-8:' ��

������ � ��������� ���� �G !E' 5��� ������ �������� ������������

�� ����)� ����� � �� ����������� ��������� 9�� ����� ���� ��<$

6-8:� G "' 5�� ���� �������� �� ������ � ��� ������ 5��� ��

��� ����������� ���� ���������� 7����� �� ���� �������� ����

���)� �������� �� ���5�� ��� �������' 5��� ���� ��������� ��

����� 9������ 5��� ������ �������� �� ����� ����� �� ����� �� �����

������� ���� �������� �� ������ ��)� ���� ����� �� ���� ������'�

+�� ��� �<0 �������� ���� �������� ������ ����� �� �������� 9����

03* 5�� �������� 5��� 9����� ������ �6��� 9�����������

=�������� 43'� +���� ����� �%3* 5�� ������ ���������� �09'

5��� ����������� 77 ��� ������ �6��� 9����������' � �����

������ �� -E �< ��� @D��� �� ��������� � ������ �� "# �<��� !D��� 09 �������� 5��� �������� � ��� M������ �������N

������ �(�� �� ���� !""-' ���� ������� ������� ��� ��34� ��

�� �������� �� /���������� ��� �������� �?*�%;' �� � ������

�������� ������ �������� ��� ��34� 5��� ���� #��9<<*?9**<�*<*?*<*?9?<*�/� �� ������� #��<*??**?9**?9?*?�*?<�/� ������ � :"/��� ������� ���)� �� ���� !"":'� +�� ?*�%;������ �������� 5��� ���� #��<??*?9<**<??*999??9<?�

+7?� !� 6���� ����������� �� ���������� ������� ������� <<7 �� ������������ ������� ��� ����������� ����� ��34��������������� � �*' 6������34� ������������� 5�� ����� ���� -, � ���� �������� ���� ���������� EDD��' ��� 5�� ������ ��������� �������� �� ��� ���� ���� �������������� �����5�� <<7 �='� * �������� ���� ���� �� ��� ���� ���� �� ��� <<7��� ������� �� -, � ��������� ��34��������������� ��������� �<'�

E/E- %� 6� �� ���

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E

Page 3: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

9*9�/� �� ������� #��*?<<99<9<<*9??9??9?**?*<�/� ������ � /D:��� ������� �(�� �� ���� !""-'� �%3* ��� ��34� ��

?*�%; 5��� ���������� ��� /- �� E: � ����� ���������� � 5���

���������� �� "- �< ��� !��� ������ �� :D �< ��� !��� ��������� �� @E �< ��� !�� ���� ������� 5�� ��������� �� @E �<��� !D��'� *�� ���������� 5��� ��������� � ���������� ��

������� ������ 09 ������� 5���� ����������� 77 5�� ������� ��

����� ���� ������ %3* 5�� �� ��������� *���� ������������

�<0 �������� 5��� ��������� � � EJ ������� ��� ������� ��������

�������� <����� � ��34� �03* ��������� ���� ���� 5���

��� ��� ���� � 1�������� ?�� 7����� � ���� �?�� %��!DDD� =���

0��� ����������� 43' �� � ����� ��� ��� ����5��� �*����

��������� #�D'� 9�� ������ �� ��34� �03* 5�� ��������� �� �

����� �� ������������ ����������� ������ ���� ��� ������ �������

�� ��� ������ ������� �?*�%;'� <����� � ��34� �03*

��������� � <<7 ������ 5��� ���������� �� ������ � ��� ���

����� ���5�� ������ �� ���� �������� �������

���� ���� ���� �� �� �� ���� �� ���� �

F��� � ����� �������� ���������� �EJ� !��' ������ 5���

������� 5��� -D�6 �� ��� ���� ������� ���� ����5' �� ��� ���� �������� � ;������ � ���� �� � E-������ ����� �� ��������

��������� ������� �� ���� !""@'� <����� �������� 5��� �����������

� ��� ���� 5� �� ��� ������������ ���� �������� ���� <����� �

������� �������� �� ��������� ������� 5��� �������� �� -, � ��

!- �� � � �������� ���� ��� ����� �� ��� ��5 5������5��

������� �� ��� ������� �� 1����� �� ���)�� ���������

�����5�� ��� 5������5�� ���� � ������ ���� ������ ����� �� ���

����� ������ �� ��� ��5 ��� �������� ��������� � ;��������

�� ���� !",,'� 9��� �������� 5�� ������� ������ �� 5�� ��5� �

�������� �� ������ �� ��� �����������N� ���� *�� ����������

5��� �������� �����5�� �� ����� �� ���� ������� �� ������ �

5���� ��� ���� 5��� ������������ 5��� ��� ����������� �� ��� ������

�������� %��������� � ��� ��������� �������� �� ���

������������ ��5 �����5�� <<7 �������� 5��� �������� � ����

5��� � ������ 5��� �� ��� � ��� ������ �������� �6� &

.������� !"",'� 7 ��� ����� �� ����� ������ 5� ����� �� �

��������� ����� �� ��������� ��� ��������� � �������� ���5��

���� ��5� 9��� ����5�� �� �� ������� ��� �1���� �� ����� 34�

����)��� � ����������� ��� � ����������� � <����� � 5������5��

�������� 5��� ���������� �� ��� ����� �� ��� ����������� ����� ����

���� �� ��� ������������ ����� ���� ��������� �� ��� ��������� ��

��� ����� � ��� ����� ����� 5��� ������ ������ �������� ���

� ����������� � ������� & =������� !"",'� * ��������� ����� �

������ ������������8������������' 5�� ���� ������� ��� ��� �������

�� 1����� �� ���)�� ���������� ������� ������ � ����� �����

�������� �������� � ��� ������������ <����� � ����� ��

������� 5��� �������� ���� ������� �� /D� :D� !ED �� !,D��

�����5�� ������� ������� �� ��� ���� �������� *�� ����� ������

5��� ��������� ���� ����� �� ������ �������� � D�"J ������

+7?� E� ;������5�� ���������� �� �������������� ������������������ �����������34� �� 3+�EDD -, � ���� <<7 ������ ���34��������������� �� ������� ����������)� ���������� �������� �� ��� ��������� ����� ����� ���� -D��'� 7 ��� ���������� ��� ���� ���� �����5� � ����� �� �������� �������� ��� ���� ����' ������������� 5��� � ����3+�EDD ������ ��������� ����� 9��� ���� 5�� �����������5��� ��34� �������' �������� �������������� � ������ ����� �� ������ ���������

9������ ����� �� ��34� E/E#

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E

Page 4: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

������ @������������� �@�37' 5���� 5�� ���� �������� � �������

�� ������� ������� � ������ %��� ����� 5��� �� �����5�B 3?������6�

������ ���� � ����� �6�3* A$ �!� /� !D� /D �� !DD� � G @ �������'$ 6�3* AO 6������� �6����$!DD O /DD� � ���������� $

G ,'$ 3?������%������� ���� � ����� �%�3* A$ !DD� � G @'$�� @�37 �� ����������� �*?' �!DD� � G @ � ���� �����'�%��� ����������� 5��� ����� � ������� 5��) ��������� � ����

��������� �6� & .������� !"",'�

����������� �����

9���� �� ������ ���� �������� 34� ����)��� �� ������

��������� ������ �� ���������� ��������� ����� � �������

������� ����� �(���������;���� �� ���� !""/$ ��5���� ���� ���

;����� �� ���� !"",'� *����� ������� �� ������ ���������� ��� ��

�������������� � ���� ����� 34� ����)��� ��� ��� � ��������

������ � ��� <<7 ����� ������� � ������ �9����� �� ���� !"":' ��

��� ��������� � �� ���� �� �1���� ������� ������ ����� 5�

���������� ��� ������� � * ������������� ��� ���) ������

��������� � ���� ������� �� ��������� �� ���������� ��� �9�� &

A���� !"":$ %��� & �������� !"""'� ���� ��� �������� ������ ��

34� ����)��� � ������ ���������� ��������� ������ ���� ��� ����

��� �� ��� ���� ��� ������ ����������� �;����� �� ���� !"",'�

5� ���������� 6�3* AN� ������ �� ������ ������ ����������

��������� �� ��� <<7 ����� 9�� ������ �� ����� ���������� �� 6�3* A

�� %�3* A � ����� ���� �������� �������� �� ��� <<7 ���� 5��

������� �� �������� ��������� �9�� & A���� !"":'� =���1 � -, � ��

!- �� � �����<<7 ������ ���� 5��� ������������ �� ������ ����

� � ������ A<? �� ����� ���� 5��� ��������� �� ������

����������� 5�� �������� �� /@ �< ���� � �������) ��������������� ���� 9�� ������� ��� �� ��� ������ ������� 5��� �������

5��� ��� <<7 ���� � ��� ������� 9�� ��� 5�� ���� ������� ��

��������� �� ��������� ���� �������� �� ���� ������� ������

��������� ���� ��� ����� ����� ������ ���� ������ �� � ���������

������� 4���� ������� 5��� ���� ��� ������ � 9�� ���������� 5��

��� ��� �� �� ��� ������������ 5��� ������ ���� ��� ���

���� � ������ ���� P# ��5�����N� �������� 9�� ������� 5���

���������� ������� �� ������ � � ����� *�I*�<� ��������

��������� ��������� �� � ���� ��������� ���������� (� ������ ����

* ����� ������ �� ��������� ���������� �� ����� ���� �5��� �

��������� ������ ' ���� �������� �� � ��������� ������ �� ���

��� ���) �������� �� ��� <<7 ���� �9�� & A���� !"":'� *�������

���������� <������ ���� ������ ������� ����� ���������� ��

�������������� � �������� �� ���� !""#' ���� �� ���� ���� �����

������ � �������������� �� -, � �� ��������� ������ ������ ����

�� ������ ���� ������ 5��)� �����5�� ��� ������ � ��������

�� ���� !""#$ %��� & �������� !"""'� +�� ���� ������� ����� 5�

������� � ������ �� *������� 7 �������� *������ ���� ��������

��� ������� �� ������������� �������� ���� �� -, � �����5��

��� ���� � �������� �� ���� !""#'� � ���� 5�� ��34� �� ������

���������� A��� ������ 5�� ������� ������� ��� #�� �� ������

���� ���� 5��� ����� �� 5��� ���������� ������ ������������

���� 5��� �������� ���� � ����� D�/�� ����� ������� ���� ���

��� ���) ��������� ���5��� �� ������ �� ��� �������� 4�� �

������������� ��� 5�� ����� ��� ������ 5�� ������� ������ �

����� �� ������� ��� ����� �� ���� ������ +������� ���� ��� ����

��� �� ������������� ��� 5��� ���������� =������ ��� �������

���5�� ��� ���� �������� <<7 �������� �� ��� �������� ���������

5�� ������ ����� �ED8-D��' ����������� �� �������� ������

5�� �� ��������� ;�5���� ���� � ���� ��� � 5���5 ���������

������������ �� � ������� ������� *������ 5��� �������� ����� �

���)� 5������ �������� � ����� & %���� !",@' ���� �� ���)�

��������� ��� �� E�Q ��� *������' �� ���)� 5���� �D�/8D�@�� ���

*������'� 9� ���� ��� ������ �� 34� ����)��� � ����� ����� �� �����

5���� ������� !D8ED�6 �� ������ 6�3* A �� %�3* A �!DD� ��������� �� ����' 5�� ������ � ��� <<7 ����� �������� � ��������

� ��������� ���� ����� ��� ���� <����� � ��� ������� �� ��

���� ���������� �� �������������� 5��� ��� �������� ��� /D8

-#��� 7 ����� �� �� ���������� ��� ������������� ����� ���

5��� ������ ��� #��� 9� ���� ������� ������� �� ��� ������ ��

�� ��� � ���� ����� 5�� �������

���� �� ��� ����� �

*�� ���� ��� �������� �� ���� �A � <����� � ��34� �03*

��������� 5��� �������� 5��� �� 5� *34Q* 5��� ��� ���

������N� ������� *������� ������� �� 34� ��������� 5��� ��� ��� �

�������� �������� *34Q* �����5�� � �5� ������ ������N� ������� 9��

�1���� �� ��������������� ����� � ���� � �������������� 5��

������ ���� +�����N� ����� ������ Q����� 5��� ��������� ��������

5�� �R D�D#�

3������

���� ��� ������ ����

������� �� ��34� ������������� ���34��70' 5��� ���� �� ��

-, � �������� ��� �� ���5�� ��� ���� ����� ��������' �� ����� ��

��� ���� ������� ������ �� ������ ��� <<7 ���� �+��� !='� ��� ��

������� �� ��� ������� �� ��� ����� ������� 9���� ������� 5���

���������� 5��� ����� �� �������� � ����� ������ �������� 5��� ���

������������� ������ 3+�; �+��� E'� ���� �� ��� ��34��70

5�� ���� ����������� 5��� 9;�70 ������� ��������� � � ���������

����� �+��� /'� ��34��70 5�� ��� ���������� 5��� ��!DD��

������� �� A%�!�70 ����� �������� �� 5�� �� ��������� �

���5� ����� ���!DD'� ���������� ������'� ���������� �����

������' �� ����������� �A%�!'� ��34��70 5�� ���� �� �������

� ���� �������� ����� ���� �+��� !*' �� � <<7 ���� �������� ��

@ �� !- �� � ���� ������ � 6���� ������������ �������� �� ������

34� �34�' �� �������� �34� ��34�' 5��� ���� �� ������� ��

-, �� 9� �������� 5������ ����� ��34� ����������� 5��

�������� ��� � ���������� ����� �������� 5� ��������

��34��70 5�� � ���� �������� ������� ��������� 5�� ����

��������� 5��� <<7 ������ � 9��� ��������� ��������� ��34��70

�+��� !<'� 7 �������� 5��� ��� ������������������ �������

������ ��� ������� ��)� �������� ��� �� ���5�� ��� ����

�������� �5� ������� 5��� ���� �� ������� � S!-D )%� ����

����������� �� ��34�� �� -, � �����5�� ������ � 3� ����������

����� �� ��34� ������ 5��� ���� � ���� �������� ���� �� �

<<7 ���� ������� �� ����� ����� �+��� -*'� 4���� 34� ��������

5��� ���� �� �������� ������ �� -, � �� � ���� �������� ����

�������� ��34� �� ��� �� ������� ������ � <<7 ���� �� -, �� *

�������� �������� ��� ���� ��������� ��� S!-D )%� ��� �+��� -='�

�� ������� 5��� ������������������ �� -, ��

���� ��������� ������� �

*�� ��� �� ������ � ��34���03* ��������� ���� 09��<0

�������� � �������� ������� �� !,@� #�!J 5���� ��� ����������������� � ��������� ����� 9��� ����� 5�� ����� �� �� -, �� ���

�� �� !- �� � �����<<7 ������ 5�� �������� 5��� ������� ��)�

���� ���� �������� ������ �+��� #'� 3� �������� ������ 5���

���� � ������� ��)� ���� %0? �� �< �������� � ������� �

��34� �03* ��������� 5���� ����� ������ �� ����� �����

����� �� ��� ������� ���� +����������� ������� ��� ����� ������� ��

��34� ������ 5���� <<7 ���� �� -, � ����� 5�� � ������� ��

��34� �03* ��� ����� ������ 5�� �������� 5��� ���� ��������

�����

E/E: %� 6� �� ���

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E

Page 5: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

�!!��� �! ����� ��� ����"��� � �� ���� �

6���� ������� �������� �� 34� ��������� 5��� �������� ��������

��� ��� ����� 34� �������� 5��� ���� �� ���� �5� ������ ��

���������� ��� �� -, � �� !- �� � ����������� � ����� ��

��������������� �������� ���� ��������� ������� ��5 5������5��

������ ���� 8E!� EJ� ��� �������'� �������� ������� � ������������ �� �������� � ��� <<7 ������ *� ����������� � +��� :*�

����� ���������� �� 6�3* A� � ����� �������� 34� ���������

������� �� ��� ���� ���� �������� � � �������� ������

������ G OE�!� -�-J$ ������ �� ������ �R D�D!'� *����������� ��6����� ��� ������ ��������� �� 34 ��������� 5��� 6�3* A

������� ��� �������� ������ ������ G 8!#� -J$ � T D�D#'� 6�3* A������� ������ �� ��� ������������ ���� �������� ���� 5�� 5������

� ������� 6���� ������������ �� %�3* A� ��� ������ ��������

�� 6�3* A 5�� ���� 5������ ������� 7������ �� @�37� � ��������

�������� �������� �� ��� ������ 34� �34�' �� *?� � ��������

�������� �� ��� �������� �� ������������ 34� ��34�' ���� ��� ��

�1���� ��� ����� ������ *�� ����� 5��� ���� ��������� 5��

������� ������ �� ��� ���� ���� !- � ������������� ����� ��

���5'� 6�3* A �������� ��� ������� �������� �� /D�� ����

������� �+��� :=' �� 5�� ���� ������� �+��� :<'�

(� ��� ������ ��� ������ �� ����� 34� �������� � ��� ������� ��

��� ���������� ������� �� ������ ������� ��������� +��� ������

���� <<7 ���� ��������� � ������� ������� �� ��5 1����� ��

���)�� �� ��� ����������� �������� 5��� ��� ���� �������� ��5 5��� �

��� ������� ��������� �� O!�"#� D�E � ��R D�D!'� *� ���5 �+��� @*� ����� ������������ �� 6�3* A �� ��� ���� ���� �������

��� ������� ��������� �� � ��� �� D�/� D�E � ������� �� ������� R D�D!'� 6���� ������� ��������� 5��� 6�3* A ����)�� ���

�������� ������ �� 6�3* A �!�@� D�E �$ ������ �� ����� �T D�D#'�*��������� �� 6�3* A �� ��� ������������ ���� �������� ����

5�� 5������ ������� �� 5��� %�3* A� @�37 �� *?� 9��

���� ���������� ������ �� 6�3* A ��� � ������� ������� ��

/D�� ���� ������� �+��� @=' �� 5�� ���� ���� �������

�+��� @<'� 3�� �� ��� 34� ��������� ��� � �������� ������ �� ���

!-��� ���� ���� ����� �� ���5'�

�!!��� �! ����� ��� ����"��� � ����� � �������� � � ��

4�� �� /"@ ������������ ������� �������� �� ��� <<7 ����� ����

!@ ���� �� -, � ���� <<7 ������ � !@E ���� 5��� ���������� �����

��*' �����I����������� ����� D�-/' 5��� ������ ���� ���� ��

E/�!� #�:;� ����� !D8-#;� 5��� � ����� �� !D;�'� 4�� �� ����* ����� "# �S##J' ���� �������� �� ��������� ������ �� ���

��� ���)� * ��������� !,! ����� *������ 5��� �������� ��

������������� �����I����������� ����� D�-:'� 4�� �� E,@

������������ ������ � !D ������ !- � ���� <<7 ������ !"! 5���

�* �����I����������� ����� D�::' 5��� � ������ ���� ���� ��

!#�#� "�/;� ����� !D8!@;�$ ��� !@;�'� 4�� �� ��� �* ���� -/�EE�#J' 5��� ���� �������������� * ��������� !E- ����� *�

����� �����I����������� ����� D�-/' 5��� ���� �������� ��

�������������� ������������ ��������� 5��� ������ �������

+7?� /� ;������5�� ���������� �� ������ �������� ������������������ ��������� ��34� �� 9; � � ���������)� ��������� �� -, � �����<<7������ � 9�� ����� ���5� ����������� ��� ��34� �����5�' 5���� �� ��������� ��� ���� ���� �� ������ 5��� � ������ ��������� 9; �����5�'������ ���� #D���

+7?� -� (����� ���� ��� ��� �� ����� ��34� ��������� � �������� ���������� ��)� �������� �����'� ���5�� ����' �� ������ �����' �� ��� ����������� ���� ���� �������� ����� 9�� ����� ���5� � ������� �� ���������� ���������� ��� �������������� ����� ��������� �� � !-D�)%���� ����������� �� ��34� �����5�� <<7� 3��� ��� �������� ��������� ��� ������� ��� �� -, � ��' � ��� �������� �� ������ �������� ��� �� ������� �� �� # �� � ��' �� !- �� � ��8�'� 9�� ������ ���� ���5� � ��� ��� ����34� ������ ��������� �����5�� <<7 ��' 5��� � ��������� �������� ������� ��������� ��' �� ����) ����� ��������� 3��� ��� ��������� ����34� ������ � ���� 5����� ���� ���� �� ������� �� ��� ������������������� ������� �+��� !'�

9������ ����� �� ��34� E/E@

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E

Page 6: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

������ �������� ��� �� ���5�� ��� ������� �� -, � �� ������� �� !- �

�� �������� �������� �9�� & A���� !"":'� 9���� ! ���������� ���

�������� �� ������������� �� ���������� ����� ���� �� 6�

3* A �� %�3* A �� ���� ����� ������� *� -, � ����� ����������

�� 6�3* A �G !!'� ��� �� %�3* A �G !D' ��� � �������� ��

������� �������� ������ �� � ��� �������������� � ��� ��

��������� ������ � ���� ��5� ��� ��� �� ��� ����� ������

�������� ���� ������ 5��� 6�3* A �� ���� ���� ���� �����

��������� ����������� !#�� �����5�� ����� ����������� %�

3* A 5�� ��������� � ��� ���� ������� �9���� !� � R D�D# +�����N�

����� ���� �������� 5��� %�3* A'� * ������� �� ��� ����������

�� �������������� �� ����������� � +��� ,� 3������ 6�3* A

� G !D'� �� %�3* A �G !!' �1����� ��� ��������� ���� � ���

���� ������� *� !- �� � ���� <<7 ����� 34� �������� 5��� 6�3* A

5�� 5������ ������ � ���� ������������� ���� �6�3* A� G ,'

�� ���������� ����� ���� � G @'� %�3* A 5�� ��������� ��

5����

��������

9�� ����� ����� �� ���� ���� 5��� ���� ���� �� ������� �����

34 ��������� ���������� 5��� ����� ����� ��������� �� ��34� �

����� ���������)� ���������� �����5�� ���������� ��� ����

�������� ���� ��� � ����������� �� * ������������� ��� ���)

�������������� � 9���� ����� ������ � ��� ���� ��� ���

����� ������ �+���� & +����� !""D$ +���� �� ���� !""!' �� ���

���������� ��34��34 � ���� �����5�� ���������� ��� ���� �

<����� � 34� ��������� 5���� ����� ����� �����5�� ���

���� ��� ��� ��������� �������� �Q���� �� ���� !""E$ .���

�� ���� !""/$ U�� �� ���� !"":$ 6�� �� ���� !"""'� 9���� ��5����

��1��� ������ �� � �� 34� ����������� ������ � ��� �������

������� �� ��� ������� �� 34 � ������ ��������� �����5��

��� ���� ��� ������� ���� � 34 ������ ������ �� ��� �����

���� ����� � ����� ��������� ���������' � ����� �� ���� !""E$ ��

�� ���� !""@$ 7��� �� ���� !"",'� 4�� ���� ������� ��� ����

��������� ������ ����� ��34�834 ������� �� ��� ���� �����

4�� ���� ������� ���� ����� ��34� ��������� � <<7 ���� ��

�������� � � ���������� ����� �������� �������� �� �� � �

����� ������� � ��� � ������� =��� ��� ������������� 5��� ��������

��� �� 9;�70 ������� �� � ����� �������� �� ��� ���� ���� ���

�� � ����� ������� ���������� �� ���5� ����� �� ��� ���������

� � �������� �������� ��� �������� ���� ����� * ���������������

��������� �� ������� � ���� 5��)� 5���� �� ����� �� ������ 5���

���� ������� ������� ��34�� (������ ��������� �� ��34� 5��

�������� ���� ��������� � ���������� ����� ����� �� �5

������ ��� ��� ������� � ����� ���� �� � ��� �����������

�%����� �� ���� !""-'� ����� ���� �(������ �� ���� !"":' �� ����

������������ � ��������� ����� �2� � �� ���� !""@'� 4�� ����

���� ����� 5�� � ������� � ��34� �03* ��������� 5���� ���

������ � ��������� ���� �� ��� ������������� �� ��34� 5��� 9;�

70 ����� �� ������� ���� ������ ���� �� � �������� ������ �� ��

����� ���� �� ��� ��34� 5� �������� � ��� ���������� ����

*���������� �� ��34� ������ � ������� 5������ � ����������

���� � ��� � ������ ���� ����� ����� 5�� ���� � ���������� �

*������� �� 5�� ��������� ���� ����� �������� �� � ��������

������� �� ����������� ����� ��34� � ������ �� ��� ��������

��� ��34� ������ ����������� ���� �� ���)�� ������� ����� 5�� �

����� ������� � ��� �03* ����������

9� �������� 5������ ����� ��34��34 �1����� ��� � ������

������ ���������� 5��� ��� ���� 5� ��������� ��� ������ ��������

�5� �������� ������ �� ���������B ��� 5������5�� ������ ������

������ �� ������ � ������� ��������� � ������� & =�������

!"",' �� ��� ������� �� ������� ���������� 5��� ��� ������

�������� � ��� ����� �;�������� �� ���� !",,'� (� ������ �������

�� ����� ������ �� ��������������� ��������� �� 34� ��

������� � ������ ������ 6�3* A ��� � ������ 5�� ������� ��

��� ������������ ����� �������� ����� 5�� � � ������ ����� �� ���

����� =��� ��� ������� �� ���� ������ � �������������� �� 6����

� ��� ���� � ����� �� ��� ������� �� %�3* A ���� � ������ ��

������������� �������� �� 34� � 6�3* A� 9�� ���� ���� ����

������� ��������� �� ��� ������ �� �������� 34� ��������

�?������� �� ���� !""/' ��� �� �1���� ��������� 5�� �������

������ � �� ���) �� ��������� �� ����� 34� �������� �� ��� ����

���� ������� ��� � �������� �� ����� ��34�834� ������� � ���

��������� �� ��� � ����������� � *� ���� ���� ��5���� 5� ��

�� ������� ����� �������� ������ �� 6�3* A� ���� ��

������������� �� ������� ��� ����� 1�5 �6� & .�������

!"",'� 9����� ��5���� ��� ���)�� �� ������� ��������� ��

����)��� �� ���������� ����� ����� � %0? ���� ��� ��� ���5 ��

�� ��������� �� ������ �������� �;����� �� ���� !"",'�

A������ *����� �������������� �� ������ ���� ����������

5��� ��� ���� �� ��)�� �� ������� ���� �� ��� ����������

������������ �� ���������� ���� ����������� ��� � ������� 7�

�� ���������� ���� ��� ���� �� ���������� ����� ��� ��� ������ �� ����

+7?� #� 09��<0 ��� ��� �� ��34� �03*��������� ���� ������� ������� �����������' � ������� ������� ���� ������ ���������� �%0?'� ����� ���� ��<'� ��� ������� ��������� ���� ���?3' �� ������ ������ ������� ���� ��3' -, � �� !- �� ������<<7 ������ � 9���� 5�� � ��������������� � ��� ���� �� ��34� �03*��������� �� 5���� ��� ������������ ��������� ������� 3� ����� 5�� ���� �������� ��)� ���� %0? �� �< �� ���� ��������� �����5�� ������ � 7 ������� �� �������� ��34� ������������� ����� 5�� ��������� ������� � ����� ��34� �03*��������� � <<7 ����� V �R D�D!� �� 5� *34Q* 5��� ��� ��� ������N� �������

E/E, %� 6� �� ���

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E

Page 7: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

�������������� � ������� ��� �� ����������� �� �����������

��� ������ �%��� & �������� !"""' �� ����� �������� ��������

���� ������� ����������������� ���������� �2������)� �� ����

!""-'� ���������������� ������ ��� ������ ���������� 5��� ���

+7?� :� A����� �� ����� 34� �������� � ������5 ��� � ����������� ��-, � �����5�� <<7 ������ � 6�3* A ��� � ������������� �������� �������������� ��5 5������5�� �������� �����5�� � ������� �������� �� ��� �����5 5�� �� 5�� ������� ������ �� ��� ������ ����� <����������� ���������� ��6�3* A �� ����� 34� ��������� ��� �� ��� � �������� ������ �*'� 6�3* A �������� 5�� ���� ������� �=' 5��� � ������� ������ ��������/D�� ������������� �����'� 9�� ������� �������� ������� �� 6�3* A ������ ���� 5�� ���� ���� ������� �<'� V �R D�D! �������� �������� *34Q*5��� ��� ��� ������N� �������

+7?� @� A����� �� ����� 34� �������� � 5������5�� ������� ������������5�� � ������� �������� � -, � <<7 ����� 6�3* A ��� � ��������������������� ������ 5�� ������� ������ �� ��� ���� ����� 4���� 34� ��������5��� 5������ ������ �*'� 6�3* A ����� 5�� ���� ������� 5��� ������������� �� /D�� ���� �������� �����' �� ������ :D�� �='� 6�3* A �����5�� ���� ���� ������� �<'� V �R D�D!� �������� �������� *34Q* 5��� ������ ������N� �������

9������ ����� �� ��34� E/E"

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E

Page 8: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

� ���)����� ����)�� !""#'� %���� ��������� �� ���� ������� �

34 �6�� �� ���� !""@' ����� ��������� ������� ����� �������

�������� �?����� & ������ !",-' �������� � � ��������������

������ 348<�EO ������������ �?����5���� & =������ !""#' �� ����

��� � �������� ���� �����5�� ���������� ��� ���� ���� �������

������������� ������ ��� ���� ������� �� �� ��������� � <�EO

������� �6�� & >��� !"":'� 7 �������� ����� �1������� 5����

��� ������ ��� ���)� �������� � 34��������� ����� � ���

����� 1�5 �6� & .������� !"",' �� ���������� �� ���������

��������� ���� �� ���� )�� �6� & .������� EDDD' ��

������������ �������� �� ���� !""/' ����� ������ ���� ������

��������� � �������� �� ���� !""@$ �������� �� ���� !"",'� 9�� ���)

�� ����������� �� ������������� *������ �� 34� �������� ��

!- � �������� ���� �������� ��������� �� ������ ��� �������

� �������������� �� ���� �� ����� ���� ����� �����5�� ��� ���� �

6���� ��34�834 ����� �� ��� ���� ���� �� ��������� �� ���

���� � ������ �� ��� � ����������� ������� � ���� ����� �

�5� �������� ��������� �� ������ +����� � 34� � ������ ���

����������� �� ���������� ��5���������� *� �������� ������� ����� ����� ���� �� ������� �������� �� ��� <<7 ���� �� �������

������� ��� � ������� ����������� ����� ��� 5������5��

�������� 9��� �� ��)�� �� ������� ��� �������� ����������

��������� ������� �����5�� ��� 5������5��� ��������� ��������

�� ������������� *������ ����� ������ �� ���� �������

������ ����������� �3���� �� ���� !"":' ����� �� �������

���������� �� ��� � ����������� � ������ � 34 ��� �� ��� ����

������������ �� ���� �� ����� � ������� �� ����� ����������

������� ����� ����� � ������� �������� ���� � �������� ���������)

�� ������� � ����� ����������� �� ��� ������� ����� ����������

�� � ������� � ��������� �%��� & �������� !"""'�

� ��������������� ������� �����5�� ��� ���� ��� ���

��������� �� ��� � ���� � ��� ��������� �� ���������� ��� ��

���� � ���������� �� ���������� �� ������E ������� �� ������

����������� ����� �������� ���� �� ��� ���������� ���� ��� �

���������� ��� ������ �2�� �� ���� !""@$ ��� ���� ��5���� 2��

�� ���� !"",$ 0��)��� �� ���� !"""�� �'� (���� ��� ����� ���������

��� �� ��������� ��������� ����� �������� �� � ��������� �����

��� ������ ���� ������ � �6����� �� ���� !""/$ 0���� & =��� �

!""@' �� ��������� �������� �� ������ ����)�� � �%��� & W����

!",!$ <�� �� ���� !"":' �� ����� ���� �%��� & W���� !",!$

2����� & %���� !",!' �� �� ������ 4�� ���� ���� ��34�

�� �������� ��������� �� ������������ � ��������� ������ ��

���������� �� ��� ���� ���� �� ���� �� ���� � ������ �����

������ �������� � ��������������� ������� ������� 34 ������

(���� ��� � ����������� � ��� <<7 ����� ����� �� �� -, ��

��������� �� �� E! �� � �� �� ��)�� ���� ����� ��������� ������ ���

��� �������� �� ���������� ��� �� �� -, �� 4� ��������

������� ����� �� (������� ���������� ������ �� ��� ���� ����

� ��� �� ���� !"":$ 0���� �� ���� !""@$ 6� & .������� !"""'�

%��� �� (������� ����������� ���� ������� �������� ����

����� 5�� ���������� 5��� � ������ �������� �� ���������� ��� ���

��� ����� ��������� �� ����� 5�� (������� ���������� 5��

���� �� � ��� �� ���� !"":$ 6� & .������� !"""'� 9���� �����

���� ������� ��� � �������� ���� �1������� ���������� �������

������� �� 34 � ��34� ������� ��� ���� ������ �� ����������

���� *�������� �������� ������� (������� ����������� �������

� ����������� �� ������ ������� ����)�� � �%��� & ��������

!"""' �� ������ ��������� �� ������ ��� ����� �(���� &

<������� !"""'� ��������� �� ��� �������� �� ��� ����������

������������ ��� �� ����� ���� ������

#&���� �������

=���� =��)� ������� ������ ����������� ���������� %� ;� .5���� ������������ ��� ��� 5����� ����������� %(. �� � ������� ������� ��� *������;������� +������� ��� ������ 0�������� *; 5�� � ������� �����5 �� ���*������ ;������� +������� ��� ������ 0�������� 9�� 5��) 5�� ���������� ��� ������� % ������ *��������� �� <����� ��� ������ 0�������<����� �� <���� �� ��� ;����5 F������ <���� ��� 0������� � ����

#**���������

*?� �����������$ <<7� ������ ���������� ���� $ %�3* A� 3������%������������ � �����$ %0?� ������ ���� ������$ ��34�� �������������������� ����� ����� � �����$ ?*�%; �� �������� �� /������������� ��������$ 70� ������������� $ 6�3* A� 3������6������������ ������$ �� �������������� $ 3+�;� ���������� ���� ����'$ 34� ����������$ 34�� ����� ����� � �����$ 09��<0� ������ ����������� ��� ���������� �������$ �*� ��������� ������ $ 9;� � ����� � ���� ����$ @�37� @�������������

3��������

*�� � 2�4�� �<������ ?� & 6���� W�%� �!"",' 3����� ����� ������� � ����� ��������� ����������� � ��� ���� �" �������"� ��� @DD,8@D!-�

*���� � *�2� & +������ ;�6� �!",-' ��� ��� �� ���������� ��� ������B �� ��������� ������'(� ��� !#,@8!#"D�

=����� ?�W� & >��� H�2� �!",,' * ���������� ����������� � ��� ������������ ��������� �� ��� ������� ��)� ����� ��� � ��� ���� ��� ,@8!D@�

<��� H�� ��������� �� W���� (� & %���� � �!"":' *���������������� �� �������� � ��������������� ������� � ������ ����� ������ �" �����(����"� ��� /@E!8/@/D�

+7?� ,� * ������ �������� �� ��� ������ �� ����� ���������� �� 6�3* A � �������������� *������ =����� �������� ����' ���� 5��� ��������������� � ����� ��������� ������ �� ��� ��� ���) �����5� �������� ������� ����� �����' �������� �� ���5�� ��� �������� +����� ������ �����5������� ���������� �� 6�3* A �������' �������������� 5�� ����������

9*=6A !� 9�� ������ �� 6�3* A �� %�3* A � ��������� ������ ��*'�� ��������� �������� � �' �����5�� <<7

F��� 5���� ��������I���� ������

6�3* A %�3* A

-, � ����� <<7 � ,I!! �@EJ'V DI!D�* DI!! DI!D

!- �� � ����� <<7 � DI, DI@�* DI!D DI"

V�R D�D#� +�����N� ����� ���� �������� 5��� %�3* A�

E//D %� 6� �� ���

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E

Page 9: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

%���� � & W���� (� �!",!' *������� �� � ������� �������� ���� � ������� � ���������� �� ��� � ��������� ����� � ��� ���� �������" )���"���� -/8-@�

%���� � & �������� *� �!"""' ������� ������ �� ������� ���� � ��������� ������ ���� 7 (���� ��%� & �����)� 0� ����'� *�+����, �� ���"<�������� 6�������� A�������� ��� !E"8!:-�

%������ W�6�� %�5��� 9� �� ������� �W�� ��5��� *� & � ���� ��;��!""-' A��������� ����� ����� � ����� ��������� �� ������������ ������� �����B ����������� ��� � ����� ��������� � ����" ��� -���" %��".%-� �� -E!-8-E!,�

+����� 2� & +����� W� �!""D' A� ��������� �� ����������� ������������� �� ���� � ������� ������� �����5�� ��� ������ � ������ ����� �+" �����"� �� E,:8E"/�

+����� 2�� ?����6������ 0�� 0�������� +�� A������� �;� & %���� ��!""!' F������������� �� ������� ��� ����� � � ������� �" �����(���"��� :,E8@D!�

?����5����� W� & =������ <�6� �!""#' 3����� ����� ������� � ��� ����������� � ����� -�" ���" ��(����"� ��� :,/8@D:�

?����6������ 0� & %���� � �!"@,' 4���� ������ � ������ ����B������ �� ������� 5��� ����� /��� ���"� ��� -D:8-!D�

?�������� �W�� ������ �� ��*�������� 0�W� & A��� 9�(� �!""/'*���������� ��������� ������� �������� ����� ����� � ������ /�" �"����&����"� ��� ":/8":,�

?����� � +� & ������ +� �!",-' ���������������� ����� �� ����� ������� ���������������� ���� ��� ����) �)������ ������� �" ��(����"� ���� :,#8@D!�

;������ ;�W�� 6��� >�� A����������� �� & W���� (� �!"",' 0������� ������������ �������� �� ����)��� �� ����� ����� � ������ ����� ����� �������� � ��� ���� �������" )���"� ���� //8/:�

;��������� 2�� %����� 0�� =��5� +�� +������ <� & W����� W� �!",,' * �5 ��������� ������ ��� �������� ������� ��������� � ��������� ����������� ���� ��� @@8,,�

;�������� ;� & *���� W�4� �!""#'� 3����� ����� ��)�� ��� �� ���������� ����� ����������� ������ �� ��� � ������ �" ��(����"� ���� E#/8E#,�

7���� 9�� ������� 9�� �������� �� �������� �� & H���� �� 7� �!"",' 0������������� �� ����� ������������ � ���������� ������ � � �������� ����� �? ���������� ����5� � ��� ��� ���������� ��� ������ /���" ���"���� E:/8E@D�

2�5������ *�� ����� ��� ����� H� & 9�)���� ;� �!""-' A����� �� ������������������� �� 6������� � �������������� ��������� � ��� �����B� ���� ���� �� ����������� ������ 34 � ��� ���������� /�" �"����&����"� ���� #-@8##D�

2� �� %� �� (������ ��%�� 2����)� 6�� 2��� � 0�*� & ������ 9�(� �!""@' �������������� ������ ������ ����������� ��������� -&" �" ��(����"� ����;,@#8;,,/�

2������ .�� 6��� 9� & ;����� 0�%� �!"""' +��� �������� ��������� �� ����������� � ���������� ������� �������� �� ��� �������� �� �������� ���������� � ���� 5��� ������ ���������� ���� � ���� �� /!8/@�

2��� ;�W�� 3�� ;���� ���� =� & ;��� ��2� �!"",' *���� �� � ����������������� � ��� ������ ���� ������ �� �� ���������� �� ��� ���� ��� ��������� �������� �� ���������� ��� � � ��� ������ �������" )���"����� E!8E-�

2��� 2�W�� H��� H�(� & <���� W� � �!""@' <�������� �� ����� ��������������� ��� ������� �+" /��� ���"� ���� EDD8ED:�

2������ A� � & %���� � �!",!'� A������ ��������� �������� �������� ���������� ��� ���� � ��� ���� �+" �����"� ��� :/8,!�

2������)�� ?� �� � ��� 0�*� & <�������� W�3� �!""-' <������� ��������������� ��� ���������������� ���������� ��� ��� �� �� ������ ������� �������� � ���� ����� ��������� /��� ���"� ���� ""8!D-�

6��� W�;�� 0 �� ;�� ;�� �2�� 2��� F�;� & <���� ;�9� �!""@' 3����� ������������ ������ � ;6�:D ������ /�����&" /���(�" ���" ��&&�"� ����,E@8,/!�

6� � %� & .������� %�(� �!"",' 6���� ����� ����� � ����� ������ � ������ �� ���������� ���� ���" �" �������"� �� !,-:8!,##�

6� � %� & .������� %�(� �!"""' %��� �� 5������� ��������� ������������ ��� � ���� ���)�� �������� ����� ����� � ����� ��34�'�*�� ��� 0���� ��'���� �� ���� 7*�� ������ E:, �*�������'�

6� � %� & .������� %�(� �EDDD' 7������� �03* ��������� �� ��� =!�� =E ���� )�� ��������� �� ������������ ������� �� ����� ���������� � ����� ����� �� ���������� ���� ���� ��� E:#8E@!�

6��� H� & >��� H� �!"":' % ���� ������ �� ���������� �������������� �� 2O ������ �� ���� ���� �� ���������� ��� � ���� %��" �����" )��� %��"� �� @!8@"�

6��� .�%�� <������ ��0�� ������ =���� <��)��� %�� <������� 3�*� & H�)���9�6� �!"""' 3������ ����� ����� � ����� �03* ����������� � ���

����� ����� ����� ����� ��� �������B ���) �� � ���� � ����� ������������ �" �������"� �� "ED!8"ED,�

�������� *�=� & =������� *�7� �!"",' ������� ������� ��� ���� � �������� �� � ����� �� ���������� ���B ��������� �� ������������������������ ���� ��� E!#8EEE�

��� W�� ������ %�%�� .��� W�� 6�� W� & � ��� %�W� �!""@' 9�� �������� ������� �������������� ��� �*%��������' � ������� ��������� ����� �������������� �� ����� ���� ������ ��� ����� �� ���������� ��� � ��� �������� ��� /##8/::�

������ 4� & %���� � �!",@' <�������� ������� �������� ������������ ����� *� �� <������ � ����������� �������������� ���� �� /@/8/,-�

�6������ A� �� W���� (�� %���� � & ��������� � �!""/' ������������� ���� �������� ����������� �������� 5���� ������ ���� ������� ������ ���� #-/8#-:�

������ ��9�� ������� ����� ?������� ?�+� & ���� 9�W� �!""E' 3����� ������������� ��� ������� � ���������� �������� � � ����� �� ���������� ���� ��� ���� ����������� �� @8!D�

��������� �� =��)� 2�;�� W���� (� & Q����� <� �!""#'� %�������� ������������ ������ �� �������������� � ���������� ������� �������� ����� ��� ���� ����� ����� ��� ��������� � ����� �" �����(����"���� !DED8!DE@�

��������� �� Q����� <�� =��)� 2�;�� *������ *� & W���� (� �!"",'71������� ��������� �������� ������ ���������� ��� ����� ����������� ���������� � ��� ���� �" �������"� ��� @#,!8@#,@�

��������� �� Q����� <�� =��)� 2�;� & W���� (� �!""@' *������� ���������������� ������� ��� ����� 5���� ��� ���� ����� �����5�� ������������ � ����� ���� ��� /-@8/#-�

���� 0�0�� ;��)��� ;� � & 0��������� � �!"":' 0������ � ����������� ���������� (6% ����B ����������� �� ��� ���� ������ ������ ���������������� �� ���������� � ����� ����� �+" �����"� ���� "-8!D!�

3����� ��� %������� 9���� 6������ 9� & (����� <�W� �!"":' 71������� ��� � ����������� �������� � ����� ��� �5���� � � ������� ������ ����� ������ ������ ���� /:D8/:-�

U��� H�� <���� %���� ��������� %�0�� <��5���� 9�6�� 3���� *�<��?�������� ��� 6����� 9� � & =����� %��� �!"":' �? ��������������� )���� � ������ ���� ������B ����������� 5��� ����� ������ ����� �� ��������� ������ �" �������"� ��� /!/D8/!/,�

0����� ��� & =��� � �*� �!""@' 0���� �������� �� � ��������� ���� ������� ���� ������ �� ���� 5��� � ������ ���������� ���� � ���� �� E/@8E--�

0����� ���� +����� ?�%� & =��� � �*� �!""@' (������� ���������� ���������� ��� ���� ���������� ��� �� � ��������� �������� ��� ��� %0?����� ��� @!8@,�

0��)���� �� A����������� ��� ?������� A�W�� ;������ ;�W�� � ��� 0�*��W���� (� & 0���� ��3� �!"""�' 6����� � ���������� ������ �� ��������������� ����� ��� �� � �������������)� ������� � ���� 5��� 6# �������� ���� � ���� �� !-/8!#/�

0��)���� �� ?������� A�W�� <���� H�� � ��� 0�*� & 0���� ��3� �!"""�' �������� � ���������� ����� ����� ��� ������� � ��� �� �� ������� � ���������� �� � ������ ������������ �� ��������� ���������� ���� ��!/#8!-!�

���)�� ;� �!""#'� ���������������� �� ������� 1���(" 2�"� ��� !!/-8!!-@��������� %�� ��)�� 9���� ��������� W�6�� �������� 2�� <������ �?� &3�������� �� �!""/' 3����� ����� �������� � ����� ����� �� ��������" ��� -���" %��" .%-� � @E-D8@E--�

��)�� 9�� ;���5���� ;�� 3������ 2�� 2���5�)�� �� 2����5���� �� %������;�� ;������ �� & 3������ � �!"":' 7 ���� ����������� �� �������� 03*�� ���������� � �� ����� ����� � ����� � ��� ������� � �� ���� /�����&"/���(�" ���" ��&&�"� ���� :D!8:D#�

������� *�� <���� <�� ��� ;� & .������� %�(� �!""@' 3��� ��� ���������� ������ �������� ���5�� � ����������� ��������� /��� ���"����� ED"8E!-�

9��� � & A���� A� �!"":' *������ ��������� ��������� �� ��� ���� �� ������� � ����������� ���������� �������� �<<7' � ��� ���� ���� ���#!!8#!,�

9��� �� (���� ��%� & %���� � �!"""' ������� ������� ���� � ��� ���������� ���������� ����� �� ������������� �����5�� ������������ � ��� ���� /��� ���"� ���� E!,8EE/�

9������ %�*�� 0�� 2�� =����� %�� 0���� �*� & %����� 0� �!"":'*��������� �� ����� ����� � ����� ��������� 3 �����������6����������� � ������ � ������ ��� ��������� �������� ������� �������� ���������� � ����� �������" )���"� ��� !E-8!E:�

Q����� Q� �2�� >�� .�� >�� >�W�� (���������;����� .� & ;�)����� 9� �!""E' ��)�� ������� � ����� ����� � ����� �03* � ��� ������ ���� ������

9������ ����� �� ��34� E//!

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E

Page 10: Transient action of the endothelial constitutive nitric oxide synthase (ecNOS) mediates the development of thermal hypersensitivity following peripheral nerve injury

����� ���������� ������ B � ���� � ���������� �� �������� �������� ����" ��� -���" %��" ." %" -"� �� !!:!@8!!:E!�

(������� �� ��)����� �� *��� 2�� *�)�� �� ��������� �� 9��� ����� 2��4)������ 2�� ������ � & 7�� ���� H� �!"":' 7������� �� <�I.���������� ���������� �� ����� ����� � ��������)� ���������������� ������� ����� ���� ����� ������� ��������� /��� ���"� ���� :"8@-�

(���������;����� .�� ;��� W�>�� >�� >�W� & ;�)����� 9� �!""/' 3����� ������������� ����� ���������� � ������ ���� ������ ����� ����� ������������� ���� � �" �����(����"� �� E/#D8E/#/�

(��� ;�� *������ (�%�� <���� 9� & 0����5��� 2�9� �!""-' ��������03* ��������� � ��� ������ ���� �������B ��� M��������������N������� -��" /�����&"� ���� E#!8E#,�

(����� <�W� & <������� � �!"""' 9������������ �� ���������������

��������� �� ��� �������� �� �1������� ���� ����" ��� -���" %��".%-� �� @@E/8@@/D�

.���� >�� Q����� Q� �2�� (���������;����� .�� W�� ?�� =����� %�� � ������;� & ;�)����� 9� �!""/' 3����� ����� � ��������)� ������������� ������� ������ ���� ������ �� ����� ���� �� ��� �� ��)� �� ������ ������������ ������ � �" ��&" �����"� ���� #:/8#@#�

.������� %�(� �!""/' A�������� ��������B � ���� � ���������� ���X ��"�" �����" %��"� �� :"8@E�

.������� %�(�� 6� � %�� .5����� ;�� ��� ;�� 0���� 7�� <���� <� &6�������� � �!"""' A����� ��� ����� ����� �� ����� ����� � ����������� � �������� ������ �� ��������� ���������� ����� ������������� !#!#8!#E@�

E//E %� 6� �� ���

� EDDD +�������� �� A������ 3���������� ���������� ������ ������ �� ����������� ��� E/E/8E//E