Polhemsgymnasiet Anna PhanBioteknik17/4-2015Ola NordqvistMULLIS

Transformation av bakterier med Pglo

SYFTESyftet med laborationen var att transformera bakterien E. Coli med pGLO och se om bakterierna uppvisar de egenskaper som generna hos pGLO kodar fr.TEORIPlasmider r cirkulra konstruktioner med genetiskt material som upptcktes av William Hayes och Lederberg. De har en viktig roll inom biotekniken och den s.k. hybrid-DNA-tekniken, eftersom de kan anvndas fr att verfra och f gener frn en organism att komma till uttryck i en annan. Utver de naturligt frekommande plasmiderna har plasmider framtagits i labb fr att svara mot speciella behov. Plasmider har ptrffats i celler hos bakterier, svampar och vxter i omrden som ligger utanfr kromosomerna.[3] De har frmgan att reproducera sig sjlva i cytosolen om de har ett stlle fr replikationens brjan, origin of replication eller bara ori. DNA polymeraset fster till igenknningsbara stllen p ori och kopierar plasmiden tills det att antalet per bakteriecell som kan utlsas i ori har bildats. D bakterien reproducerar sig delas plasmiderna mellan de nya, dottercellerna. Plasmider innehller gener, mnga som ger antibiotikaresistens. Fr att en gen ska uttryckas krvs en promotor, en DNA-sekvens som finns framfr genen och fungerar som en markr fr var RNA polymeras sak fsta s att gener ska kunna transkriberas och proteinet framstllas. Det finns p motsvarande stt en markr fr var RNA-polymeraset ska sluta transkribera och denna kallas terminator. Hur mycket av ett protein som ska bildas och nr regleras av cellen, vilket ocks gr att transkriptionen styrs av cellen, till viss del. P grund av att processerna r energikrvande sker de enbart fr de proteiner som behvs fr stunden. Konstitutiva gener kallas sdana som alltid r ndvndiga medan fakultativa gener transkriberas vid behov. Operon r en kontrollenhet i kromosomalt DNA hos prokaryoter som innehller en promoter, en eller multipla gener och en terminator. Det r en reglerande del Frn denna kan en mRNA molekyl, som kodar flera likadana proteiner samtidigt, bildas. Det gr att bakterier snabbt kan producera proteiner i stort omfng och till exempel effektivisera nringsupptaget frn nya nringskllor.[2] Lac operon r ett operon som reglerar produktionen av tre av de enzymer som r involverade i metabolismen av laktos i E. Coli och araBad operon reglerar produktionen av enzymer involverade i metabolismen av sockret arabinos. Operons kontrolleras i sin tur av repressor proteiner. Dessa fungerar genom att de binder nra operon och blockerar RNA polymeraset som inte kan transkribera. Fr att operonet ter ska transkriberas mste laktos eller arabinos, vilket beror p vilken typ operonet r av, fsta till repressorn. Nr laktoset binder till repressor proteinet Lacl lyfter proteinet och lter RNA polymeraset fsta till promotorn. Nr arabinoset fster till repressor proteinet AraC ndrar proteinet form och flyttar lngre bort frn operonet vilket leder till att RNA polymeraset kan fsta framfr araBAD operonet och transkribera. Laktos och arabinos kallas inducer (frammanare p svenska). [2] pGLO r en plasmid som tagits fram genom kloning av promotorn araBAD och genen fr AraC, repressor proteinet, och innehller bland annat en ori och den antibiotikaresistenta genen bla. Den har utvecklats fr att uttrycka green flourescent protein, som regleras av arabinos. [2]Green flourescent protein, GFP, kodas av en gen frn manetslktet Aequorea victoria som genom genetisk modifiering omformats till en plasmid, pGLO. [2] Frn genen bildas flourescerande proteiner, 238 aminosyror lnga och till formen av en lburk, som flourescerar i grnt d den absorberar bltt och ultraviolett ljus. Detta har bland annat inneburit praktiska frdelar fr biologiska studier eftersom processer enklare har kunnat fljas upp. De har ocks kat mnniskans frstelse fr bland annat lokalisering och reglering av genuttryck, cellfrflyttning i en organism och utveckling av olika organ. [1] Plasmiden pGLO bildades d genen fr GFP klonades framfr (i avlsningens riktning) araBAD promotorn och repressorn AraC i en pBAD18 plasmid. pGLO r allts ett modifierat araBAD operon som uttrycker GFP och regleringen av GFP styrs av AraC proteinet. GFP kommer att uttryckas frst d arabinos medverkar i transkriptionen. [2]Vid naturlig transformation tar bakterien upp fritt DNA via ett proteinkomplex som korsar cellmembranet. Denna frmga kallas naturlig kompetens. Fr att genetiskt modifiera celler mste frmmande DNA introduceras till cellen p artificiell vg. Detta kan gras p lite olika stt, beroende p vad det r man vill stadkomma och vilken celltyp det handlar om. En vanlig metod som anvnds vid transformation av bakterier r kalciumkloridtranformationen. D inkuberas cellerna i en lsning innehllande tvvrda katjoner, vanligast kalciumkloridlsning. Plasmider som blandats med bakterier i transformationslsningen kan komma frbi cellvggen i bakterierna d de utstts fr ett 42 gradigt vattenbad under 50 sekunder, efter att ha legat i is. Efter 50 sekunder stts de ter igen p isen. Vrmechocken gr att cellmembranet temporrt blir permeabelt, dels fr att den termiska obalansen p vardera sidan om cellmembranet tvingar DNA in i cellen genom proteinkanaler eller genom den skadade cellvggen. Elektroporation r en annan, vanligt frekommande metod vilken utnyttjar elektricitet fr att stra cellmembranet. De celler som utstts fr det frmmande DNAt sgs vara transformerade. [1][2] Escherichia Coli, E. Coli, r en stavformad, gramnegativ bakterie. Bakteriens yttersta yta r negativt laddad p grund av de fosfolipider och lipopolysackarider som utgr en gramnegativ bakteries yttersta lager och eftersom DNA har en negativ laddning bildas repellerande krafter mellan dem . De tvvrda katjonerna kan gra cellytan mer positivt laddad och d har DNA lttare att nrma sig cellytan. Katjoner i kallt tillstnd kan ven frndra eller frsvaga strukturen i cellytan som gr det mer permeabelt fr DNA. [1] Hur pass framgngsrik tranformationen r kan mtas genom bestmning av tranformationseffekten. De bakterier som tagit upp plasmiden kommer att visa sig genom ett andra, selektivt odlande. Detta grs genom att man rknar antalet bakterierkolonier som bildas d bakterierna sprids p en agarplatta och berknar mngden bakterier per mikrogram DNA som transformerats. [2]

RESULTATLB/amp +pGLO | LB/amp/ara +pGLO | LB/amp pGLO | LB -pGLO

||

LB/amp + pGLO + tillsatt arabinos och LB/amp p arabinosplattaDISKUSSIONLB pGLO innehller endast E. Coli bakterier p en LB platta. Hypotetiskt sett ska den inte fluorescera eftersom plasmiden pGLO inte tillfrts (det sker ingen transformation) och tillvxten av bakterierna br dessutom vara stor. Resultatet frn vrt frsk r bra och stmmer verens med vr hypotes.LB/amp pGLO innehller E.Coli bakterier p en LB platta med ampicillin. E. Coli bakterien har normalt inte gener som kodar fr antiobiotikaresistens i sitt genom. Eftersom vi inte heller hr tillfr pGLO till bakterierna br det allts inte ske ngon tillvxt verhuvudtaget. ven hr stmmer vra resultat bra med teorin.LB/amp + pGLO innehller E.Coli bakterier med pGLO p en LB platta som innehller ampicillin. Om tranformationen har lyckats br det vxa kolonier p plattan eftersom pGLO innehller genen bla fr antibiotikaresitens. Hur mnga beror p tranformationseffektiviteten men det br vara frre kolonier p denna platta jmfrt med PB - pGLO eftersom att alla bakterier inte kan ha upptagit plasmiden. De kommer inte att fluorescera eftersom att arabinos saknas. Vra resultat visar sig vara goda eftersom vi har ett antal bakteriekolonier p plattan men dessa fluorescerar inte i uv-ljus.

LB/amp/ara + pGLO innehller E.Coli bakterier med pGLO p en LB platta som innehller ampicillin och arabinos. Om tranformationen har lyckats br det vxa kolonier p plattan eftersom pGLO innehller genen bla. Kolonierna br dessutom flourescera (vid belysning av uv-ljus) eftersom arabinosen fster till AraC och gr att proteinet lmnar utrymme fr RNA polymeraset att fsta till promotorn och utfra transkription av GFP, som i sin tur ger bakterien egenskapen att den flourescerar i grnt. Resultaten har utfallit enligt teorin.Bakterier som vxer p ampicillinplattorna r transformerade eftersom de kan uttrycka genen som ger antibiotikaresistens. P den platta som innehller arabinos aktiveras bildandet av GFP och drfr flourescerar bakterierna som finns p denna platta.Det r viktigt att kalciumkloridtransformationen har utfrts korrekt. Vid ett felaktigt utfrande, t.ex. vid verhettning kan cellerna lysera och inget resultat visas.Efter vra odlingsfrsk testade vi att hlla p arabinos p LB/amp + pGLO och stryka ut dessa bakterier p en ny arabinos platta fr att se om dessa skulle fluoroscera. Det visade sig att s var fallet och av detta kan vi dra slutsatsen att bakterierna kan producera GFP bara arabinos finns nrvarande. P vr LB/amp + pGLO platta brjade bakterierna att producera GFP som syntes efter ett tag. P vrt nya utrsyk r det troligt att kolonierna flouroscerade redan frn brjan.

KLLOR1. PGLO TRANSFORMATION - PROTEIN (GFP) Ola Nordqvist & Bosse Widerberg Polhemsgymnasiet 2015-03-252. Kirk-Brown, J.(2011) Biotechnology: A Laboratory Skills Course 3. http://www.ne.se/uppslagsverk/encyklopedi/l%C3%A5ng/plasmider 4. Jouper-Joan,. Lidesten,B. Strmberg,E. (2004). Helix: i bioteknikens tjnst. Lund: Narayana Press