transferencia de material genético aislamiento de plásmidos
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Transferencia de material genético
Aislamiento de plásmidos
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Conformaciones de un plásmido
• Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez.
• Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas
• DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado.• Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy
empacado• Superenrollado desnaturalizado. Parecido al
anterior pero un poco menos empacado
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Superenrollamiento del DNA plasmídico
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Factores que afectan la estructura del DNA
• Calor• pH• Concentración de iones
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Temperatura de fusión: Tm
• Temperatura a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.
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Método de purificación
G= Glucosa (evitar stress)T=Tris (Amortiguador)E= EDTA (Quelante de Mg)
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• Determinación de concentración de DNA
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Pureza del DNA• Determinación de pureza
A260/A280
• Relación de 1.9-2.0 alta pureza
Determinación de contaminantes de DNA
Absorbancia a 230 contaminación por fenol o urea
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Enzimas de restricción Tipo IUna sola enzima que posee 3 subunidades reconoce el sitio de ADN Esta enzima metila y restringe. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.
Tipo IIEnzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos.
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Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.
Pueden generar dos tipos de cortes
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Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda)
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Mapa de restricción
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A PCR-amplified DNA fragment has been digested with three different restriction endonucleases (EcoRI, Bgl II, & MboI), singly (lanes 1-3) and in pairwise combination (lanes 4-6). Comparison with a molecular weight standard (lane 7) allows a determination of the sizes of the fragments in the digests, which in turn permit an inference of the order and distances among restriction sites in the DNA fragment