trabalho de conclusÃo de curso ii -...
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TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO II
Redução de custos em análises de teor de ativos do produto
Opera®, pelo desenvolvimento de uma nova metodologia
analítica utilizando a técnica da Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência
Aluno: Vinícius Chiquetto Faria
Orientador: Prof. Dr. Antônio Carlos França
Lorena/2012
Agradecimentos e Dedicatória
Primeiramente, gostaria de dedicar este trabalho à minha família e namorada, e
agradecer por tudo que tenho e que conquistei em toda minha vida, sempre me
apoiando e dando o suporte necessário.
Sou grato à empresa BASF S.A. pela oportunidade de estagiar em sua
dependência, tendo um crescimento profissional e pessoal extremamente
importante. Aos profissionais que me auxiliaram diariamente no desenvolvimento de
qualquer trabalho, assim como meu gerente, meus agradecimentos.
Por fim, agradeço meu orientador Prof. Dr. Antônio Carlos França, que aceitou
prontamente meu pedido de orientação, e que me deu suporte muito importante
neste trabalho, e a Escola de Engenharia de Lorena, que me propicia esta
oportunidade.
Resumo
Análises por cromatografia podem ser feitas quantitativamente ou qualitativamente
para determinar os componentes de uma amostra. Dentre os vários tipos de
cromatografia, destacam-se a gasosa e a líquida. Este trabalho tem como objetivo a
redução de custos em análises de teor de ativos do produto OPERA®, da empresa
BASF S.A., utilizando a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Neste
projeto, será desenvolvido uma nova metodologia analítica que apresente economia
em relação à anterior, e posterior validação seguindo normas da Associação
Brasileira de Normas Técnicas.
Palavras chave: Cromatografia; BASF S.A.; Opera®; Custos
Sumário
1. Introdução 5
2. Revisão Bibliográfica 6
2.1 Cromatografia Líquida 6
2.2 Cromatografia Gasosa 10
3. Metodologia 11
4. Análise e Discussão dos Resultados 13
4.1 Testes com o preparo da amostra 14
4.2 Testes com o equipamento 14
4.2.1 Fase Estacionária 14
4.2.2 Fase Móvel 15
4.2.3 Fluxo 15
4.2.4 Temperatura da Fase Estacionária 16
4.2.5 Comprimento de Onda 16
4.2.6 Volume de injeção 16
4.2.7 Tempo de Análise 16
4.3 Validação do Método 17
4.3.1 Seletividade 17
4.3.2 Linearidade 18
4.3.3 Recuperação 20
4.3.4 Repetitividade 23
4.3.5 Precisão Intermediária 26
4.3.6 Robustez 29
4.4 Cálculos do Projeto 32
5. Conclusão 37
6. Referências 38
7. Anexos 39
7.1 Média Aritmética 39
7.2 Estimativa do Desvio Padrão 39
7.3 Teste de GRUBBS 39
7.4 Cálculo do Coeficiente de Correlação 40
7.5 Cálculo do Coeficiente de Variação 40
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1. Introdução
A técnica de cromatografia é utilizada para a separação dos componentes
de uma amostra, que se distribuem em duas fases, uma estacionária e a outra,
móvel. Baseia-se na análise de produtos formulados por diferença de polaridade
através de uma coluna de separação, quantificando por meio de um sistema de
integrador a comparação da área do padrão cuja pureza é conhecida, com a área
da amostra em questão. Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a fase
estacionária é um sólido e a fase móvel é líquida. Baseia-se na análise de produtos
formulados por diferença de polaridade através de uma coluna de separação,
quantificando por meio de um sistema de integrador a comparação da área do
padrão cuja pureza é conhecida, com a área da amostra em questão.
Na CLAE, os maiores gastos de uma análise são através de consumíveis do
equipamento, preparo da amostra e dos padrões, da coluna (fase estacionária), mas
principalmente com a fase móvel, pois ao contrário da fase estacionária, esta não é
reaproveitada (resíduo) e, dependendo das condições do método, utiliza-se em
bastante quantidade para a análise.
O objetivo deste projeto visa a redução de custos nas análises de teor de
ativos do produto Opera®, da empresa BASF S.A. de Guaratinguetá - SP, pelo
desenvolvimento de um novo método analítico utilizando a CLAE. O produto em
questão é de alto valor agregado e grande número de análises, portanto, é
necessário maior agilidade na obtenção dos resultados, além da economia. O
desenvolvimento de um método com tempo de análise mais curto para esse produto
diminuiria consideravelmente os custos, devido à utilização de menos solventes,
menor desgaste da coluna cromatográfica, além de gerar menor volume de resíduo,
gerando economia para o Laboratório Analítico.
6
2. Revisão Bibliográfica
2.1. Cromatografia Líquida
Principais características:
- Grande versatilidade, já que abrange vasta gama de aplicações, com
possibilidades de configurações diversas. [4]
- Possibilidade de separações de misturas complexas, incluindo isômeros e
homólogos, em virtude da disponibilidade no mercado de grande número de colunas
cromatográficas e detectores. [4]
- Rapidez com que os resultados são obtidos, processados e quantificados,
com precisão, através de softwares e processadores de dados. [4]
- Possibilidade de análises não destrutiva de quantidades reduzidas de
amostras. [4]
- Relativa facilidade de interpretar os resultados, com possibilidade de
realizar análises quantitativas, através de padrões internos ou externos. [4]
Todas estas vantagens permitem ampla utilização da técnica, tanto em
laboratórios de análise e de pesquisa, como nos complexos industriais, onde se
utilizam sistemas automáticos de controle qualitativo e quantitativo da produção.
Assim, a principal aplicação da cromatografia liquida de alta eficiência, tem sido
encontrada predominantemente nas áreas de química fina, síntese orgânica,
bioquímica, biologia, farmácia, biotecnologia, alimentos, pesticidas e outras. [4]
A CLAE utiliza pequenas colunas cheias de materiais especialmente
preparados e fase móvel submetida a altas pressões. [1]
Vantagens: rapidez de análise, alta eficiência, reprodutibilidade,
sensibilidade possibilidade de automação, praticamente não existe restrição quanto
ao tipo de substância a analisar, separa substâncias polares, iônicas, ionizáveis e
apolares, com uma mesma coluna modificando-se apenas a composição da fase
móvel. [1] – [3]
7
Limitações: custo do equipamento, necessidade de operador experiente,
ausência de detector universal, emprega solventes de alta pureza e materiais de
consumo de custo elevado. [1]
Aplicações: é utilizada principalmente para análises qualitativas e
quantitativas de ácidos nucléicos, pesticidas, aromáticos polinucleares, polímeros,
lipídeos, drogas e farmacêuticos, herbicidas, análises clínicas, aminoácidos, etc. [1]
Figura 1 – Sistema de um equipamento de CLAE
Reservatório da fase móvel
Como reservatório de fase móvel utiliza-se recipientes de vidro com
capacidade de 0,5 a 2 litros. Na maioria dos casos, para evitar contaminação ou
degradação dos solventes, prepara-se volume suficiente para um dia de operação.
A tomada de solvente se faz através de um filtro com malha de aço com 1-2 m de
porosidade; este filtro tem como finalidade remover partículas sólidas que possam
obstruir o sistema de bombeamento e a coluna. [2] – [5]
A fase móvel é uma das variáveis que mais influenciam numa separação
cromatográfica, e cumpre um papel fundamental, já que por si mesma pode
modificar completamente a seletividade das separações e é o verdadeiro propulsor
da separação. [2] – [5]
Suporte dos frascos
de fase móvel
Degaseificador
Bomba
Autosampler
Compartimento
de coluna
Detector
Micro (Sistema
Computacional)
Monitor
8
Os solventes da fase móvel podem ser de natureza aquosa ou orgânica e, para
serem usados na CLAE, devem cumprir alguns pré-requisitos como compatibilidade
com o detector utilizado, alto poder solubilizante da amostra, baixa viscosidade, não
alterar as características da coluna, ser comercialmente viável e seguro, ponto de
ebulição adequado, alto grau de pureza. [2] – [5]
Degaseificador
Permite a remoção dos gases das fases móveis de maneira contínua. Em
cromatografia líquida, todos os solventes devem se degaseificados e filtrados. O ar
dissolvido na fase móvel pode formar bolhas na cabeça da bomba o que
consequentemente, faz com que a pressão caia e não exista fluxo. A presença de
bolhas no detector pode gerar ruídos de linha de base tão altos que torna
impraticável a utilização do sistema. Em ambos os casos, há oscilações na linha de
base e influencia sobre tempos de retenção ou aparecimentos de picos adicionais.
Os métodos de degaseificação são, geralmente, por aquecimento (refluxo com
agitação), vácuo, aborbulhamento de gás inerte (hélio), ultrassom, etc. [2] – [5]
Bomba
A vazão da fase móvel líquida, essencial para qualquer separação em CLAE
é mantida por uma, ou mais bombas de alta pressão. A alta pressão é necessária
para que o fluxo possa sobrepor à resistência das micropartículas da fase
estacionária empacotadas na coluna, assim como impedir a formação de
microbolhas no sistema, oriundas da mistura de solventes. [2] – [5]
Injetor
Como o nome sugere, o injetor é a parte do equipamento por onde se
introduz a amostra, sem alterar a vazão do sistema. As principais características de
um injetor referem-se ao fato de não provocar alargamentos da banda do
cromatograma, devido à diluição da solução injetada não ser atacado por solventes,
apresentar reprodutibilidade e precisão, quando a quantidade injetada é operada a
altas pressões. [2] – [5]
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Compartimento de coluna
Local que se encontra a coluna estacionária. A coluna é o “curacao” de um
sistema cromatográfico. O sucesso de uma análise cromatográfica depende
fundamentalmente da coluna, na qual é escolhida conforme a natureza das
substâncias que se deseja determinar. Também no sistema de compartimento de
coluna, é onde se controla a temperatura da coluna durante a análise, fator
importante para o desenvolvimento de um método, visto que altera a viscosidade do
produto pela variação da temperatura, influenciando no tempo de retenção da
amostra na coluna. [2] – [5]
Detector
O detector cromatográfico é a parte do equipamento que recebe e fornece o
sinal que representa a quantidade do componente de interesse no eluente da
coluna. É o mais complexo e o mais caro dos módulos em CLAE. [2] – [5]
Não existe um detector ideal único ou universal para cromatografia líquida,
mas qualquer que seja, deve apresentar como características: alta sensibilidade,
baixo ruído (quanto maior o ruído pior será o valor de limite de detecção), resposta
a grande número de solutos, larga faixa de linearidade, não ser afetado pela
temperatura da fase móvel, ter resposta rápida (isto é, constante de tempo baixa) e
não ser destrutivo em relação à amostra. Alguns tipos de detectores são: UV ou
UV/Visível, Índice de refração, Condutividade elétrica, Fluorescência, Eletroquímico
e Amperométrico. [2] – [5]
Sistema computacional/ Monitor
Os computadores convertem os dados através de softwares específicos de
gerenciamento de sistemas de CLAE. Determinam a concentração da amostra em
questão através de cálculos de área dos picos cromatográficos ou também
utilizando a altura dos picos como base para fazer os cálculos. [2] – [5]
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2.2. Cromatografia Gasosa
Técnica de cromatografia que tem como característica principal a utilização
de amostras na fase vapor ou gasosa. [6]
É muito empregada na medição de eficiência de colunas de retificação (por
porcentagem da área do componente principal), determinação de contaminantes
orgânicos voláteis (solventes) em efluente. Outra aplicação utilizada é a análise
residual de pesticidas em produtos formulados, conhecida como contaminação
cruzada na troca de produto através de um detector de massa. [6]
Diverge da cromatografia líquida em vários aspectos, mas principalmente
pelo fato de que na fase móvel do processo utilizam-se gases, como Hélio e
Nitrogênio, analisando substâncias necessariamente voláteis. [6]
A amostra é vaporizada e introduzida em um fluxo de gás adequado,
denominado fase móvel ou gás de arraste. Este fluxo de gás com a amostra
vaporizada passa através da fase estacionária (coluna cromatográfica), onde ocorre
a separação dos componentes da amostra. Quanto mais volátil a substância, maior
a sua tendência de permanecer vaporizada e mais rapidamente caminha pelo
sistema. [6]
As substâncias separadas saem da coluna dissolvidas na fase móvel e
passam pelo detector, gerando sinal proporcional à quantidade de material em
eluição. Esse sinal é registrado, emitindo o cromatograma em função do tempo,
através do qual é possível fazer a análise quantitativa da amostra, calculando pela
área dos picos. [6]
Figura 2 – Cromatógrafo Gasoso
11
3. Metodologia
O desenvolvimento da metodologia será feito através de testes, tanto na
parte do preparo da amostra, como em testes para a otimização do método no
aparelho de CLAE.
No preparo da amostra, deve ser considerada a solubilidade do produto na
fase móvel escolhida, na qual deve ser totalmente solúvel para a extração do ativo
presente na formulação. Para a extração do ativo, será utilizado aparelho de
ultrassom, que agita as moléculas presentes no produto, auxiliando na solubilização.
No equipamento, serão testadas várias variáveis do processo, para a
obtenção da metodologia mais econômica, e também eficiente:
- Fase móvel: componente essencial e fundamental para a separação do ativo
presente na formulação dos interferentes. Normalmente, são utilizados
solventes como acetonitrila, metanol, hexano, água deionizada com baixo pH,
etc.
- Fase estacionária: a coluna cromatográfica, junto com a fase móvel, é que
efetivamente faz a separação do ativo de interferentes. Também, altera o
tempo de análise com a variação do diâmetro interno da coluna,
comprimento, diâmetro das partículas da coluna, etc.
- Fluxo: deve regulado para que tenha um tempo curto de análise, mas que
esteja com pressão interna no equipamento suportável.
- Temperatura da coluna: altera a viscosidade do produto e sua passagem pela
fase estacionária. Está diretamente ligada à separação do ativo.
- Comprimento de onda: cada ativo e também os interferentes possuem
absorção diferentes e, como o detector utilizado será o UV, deverá ser
escolhido um comprimento de onda ótimo para a quantificação do ativo.
- Volume de injeção: deve ser injetada uma quantidade suficiente para a
detecção do ativo, mas também não muito grande, pois pode saturar a cela
do detector (UV), prejudicando a quantificação.
- Tempo de análise: o tempo de análise é definido como o tempo total para que
o analito possa percorrer todo o equipamento, até o descarte final.
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Os dados coletados serão analisados e, após definidas as melhores
condições do método, é iniciado o processo de validação do método. A validação
será feita seguindo norma ABNT para Validação de Métodos.
Na validação, estão presentes os testes de seletividade, linearidade,
recuperação, repetitividade, precisão intermediária e robustez. Com esses testes,
pretende-se comprovar a eficácia, a separação total de ativos e interferentes, a
exatidão e precisão do método, entre outros.
Depois de validado, o novo método será comparado com o anterior, do
mesmo produto, para contabilizar a real economia do projeto, e a sua viabilidade.
Os cálculos deverão levar em consideração o gasto com solventes, o gasto de
padrões analíticos, além do tempo de cada análise.
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4. Análise e Discussão de Resultados
De acordo com a proposta inicial, o trabalho foi desenvolvido em etapas,
como testes em preparo de amostra, preparo do equipamento (CLAE), validação do
método, e cálculo comparativo com metodologia anterior. Foi necessária a divisão
em partes, uma vez que o processo consistia em várias variáveis citadas
anteriormente, e muito distintas entre si, dificultando assim a visualização e
conclusão dos resultados obtidos, caso ocorressem simultaneamente.
Somente ao final do projeto, foi possível obter algum resultado concreto e
significativo, pois a proposta do trabalho somente seria satisfatória se todos os
objetivos demonstrassem êxito. Isso devido ao fato de que não seria interessante
desenvolver um método extremamente rápido e com baixo custo, mas que não
tivesse sua validação concluída e dentro das normas ABNT, por exemplo.
4.1. Testes com o preparo da amostra
A primeira etapa consistia em definir uma boa relação entre quantidade de
amostra, padrões analíticos, solventes, e também os tipos de solventes a serem
utilizados para que a amostra do produto, junto com os padrões, fosse totalmente
solubilizada, para a extração do ativo no produto.
Por se tratar da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência, as
amostras em análise precisam apresentar-se na fase líquida e, além disso, ao ser
injetado no equipamento (CLAE), o analito (ativo) deve estar totalmente solubilizado,
para que se possam obter resultados mais confiáveis e próximos dos reais.
Primeiramente, foi definida a quantidade do produto Opera® a ser
quantificado em cada análise, buscando minimizar a quantidade de solventes,
padrões, entre outros consumíveis, ainda assim satisfazendo as normas de
validação de métodos da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT).
Através de vários testes com os solventes metanol, acetonitrila,
tetrahidrofurano (THF), hexano, e água deionizada (pH 2.5), os dados da tabela
foram obtidos:
14
Resultado da Solubilização
Acetonitrila muito solúvel
Água Deionizada parcialmente solúvel
Metanol parcialmente solúvel
Hexano pouco solúvel
THF parcialmente solúvel
Acetonitrila + Água Deionizada parcialmente solúvel
Acetonitrila + Metanol muito solúvel
Metanol + Água Deionizada parcialmente solúvel
Acetonitrila + Metanol + Água Deionizada
muito solúvel
Tabela 1 – Solubilidade do produto
Por se tratar de um solvente com características mais agressivas e tóxicas
tanto ao equipamento, quanto ao analista, e por não ter apresentado uma diferença
significativa na melhora da solubilização do produto e dos padrões, o THF foi
descartado.
Assim, com os resultados, a mistura escolhida para o restante do
desenvolvimento do método, foi a acetonitrila com água deionizada com pH 2.5
(acidificada com Ácido Sulfúrico 97.9%), na proporção de 50% para cada solvente.
Para auxiliar na extração do ativo e na sua completa solubilização, as amostras,
tanto do produto quanto dos padrões, foram submetidos ao equipamento de
ultrassom, que aperfeiçoa este processo.
4.2. Testes com o equipamento
4.2.1. Fase Estacionária
A coluna cromatográfica (fase estacionária), por se tratar de um dos
principais, ou até mesmo o principal componente para uma boa metodologia
analítica, com pico bem definido, separado dos outros componentes do produto,
maximizando a quantificação e confiabilidade, foi escolhida como a mesma do
método que já era utilizado na quantificação do produto.
Características da fase estacionária utilizada: tipo C18, com 4,6mm de
espessura e 250mm de comprimento, e diâmetro interno de 5μm. Sua utilização é
justificada por possuir boas características para o produto analisado, baixo preço
15
(comparada com outras mais modernas), e com bastante disponibilidade no
laboratório em que era desenvolvido o método.
4.2.2. Fase móvel
Após a definição dos solventes, iniciaram-se os testes para o
desenvolvimento do método analítico em equipamento CLAE. Esta foi a etapa mais
trabalhosa e que necessitou de mais tempo para sua definição, uma vez que o
CLAE é composto de vários módulos, que necessitam de ajustes individuais e
coletivos, e dentro dos limites do equipamento (pressão, fluxo, etc.).
Para a fase móvel do equipamento, foram feitos diversos testes com
solventes mais comumente utilizados, como água deionizada, acetonitrila e metanol.
Como, para as amostras e padrão, foi utilizada água deionizada acidificada em pH
2.5 com Ácido Sulfúrico 97.9%, a mesma foi utilizada para o equipamento, pois
assim reduziria o tempo de preparo de água em outro pH, podendo utilizar a mesma
usada no preparo das amostras.
Depois de muitos testes para a separação do ativo do restante da formulação
do produto, e também definição de pico, foi constatado que a utilização de água
deionizada pH 2.5, acetonitrila e metanol compuseram a melhor fase móvel para o
objetivo proposto.
Do tempo 6,0 – 7,0 minutos, o sistema permanece nas mesmas condições
iniciais, para garantir a composição original a cada injeção no equipamento.
Tabela 2 – Composição da fase móvel do equipamento
4.2.3. Fluxo
Como mostrado na tabela acima, foi necessário a criação de um gradiente de
fluxo de fase estacionária, para melhorar a definição do pico do ativo a ser
quantificado, melhorar a seletividade do analito, e também para controlar a
16
quantidade de cada solvente durante o processo de análise, sem aumentar muito a
pressão interna do sistema, principalmente da coluna.
4.2.4. Temperatura da Fase Estacionária
Foi controlada a temperatura de 25ºC da fase estacionária (coluna
cromatográfica), durante toda a análise. Assim, a pressão manteve-se controlada e
em um valor bem abaixo do limite do equipamento (400bar), visto que com a
variação da temperatura da coluna, varia também a viscosidade da amostra no
interior da coluna, alterando a pressão.
4.2.5. Comprimento de Onda
Com a característica de absorção de raios UV do ativo sendo observada no
equipamento (CLAE), foi definido o comprimento de onda que satisfizesse as
condições propostas, como boa absorção a raios UV, sem ultrapassar o limite de
detecção por parte do detector do CLAE, e sendo possível fazer a quantificação e
identificação do ativo.
Observou-se então que o comprimento de onda ideal seria de 230nm, durante todo
o processo de análise.
4.2.6. Volume de injeção
Também com os dados do comprimento de onda do equipamento, e através
de testes, obteve-se o volume de injeção para que o ativo pudesse ser qualificado e
quantificado, mas tomando o cuidado de não saturar o detector do equipamento.
Assim, o volume de injeção foi definido como 15μL.
4.2.7. Tempo da análise
Pelo cromatograma obtido na análise do Opera® e também dos padrões, foi
determinado o tempo total necessário para que a amostra percorresse todo o
equipamento, sendo quantificado, indo posteriormente para seu descarte. Ou seja, o
tempo total necessário para esta análise são 7 minutos. Assim, foi garantido que
toda a amostra injetada no equipamento fosse analisada.
17
4.3. Validação do Método
Por questões de acordo de confidencialidade empresarial entre o responsável
pelo projeto e a empresa BASF S.A., não foi possível demonstrar algumas
informações, como composição de produto.
Seguindo norma da Associação Brasileira de Normas Técnicas, NBR-14029,
para Agrotóxicos e afins – Validação de métodos analíticos, o método desenvolvido
foi validado, conforme os itens que seguem.
4.3.1. Seletividade
Com os testes de seletividade, foi possível determinar o pico cromatográfico
referente ao analito de interesse, separando-se de outros componentes da matriz da
amostra. Isso foi possível adicionando-se primeiro apenas o branco da amostra
(matriz dos componentes sem o ativo), e o branco dos solventes (injeção dos
solventes utilizados tanto na extração quanto na dissolução), e verificando o sinal
obtido no equipamento. Todos os testes foram feitos em triplicata, ou seja,
preparando-se três amostras diferentes dos brancos e do produto em questão.
Após, injetou-se o analito somente, para verificação do sinal de resposta,
sem preocupar-se na quantificação do mesmo. Com os sinais dos brancos (amostra
e solventes) e do ativo, puderam ser sobrepostos para analisar se haverá
interferência de algum componente no sinal do ativo analisado, quando estiverem
todos na mesma formulação (produto final).
Foi observado que não houve interferência de nenhum componente da
amostra no sinal obtido do analito e, portanto, o método foi considerado seletivo.
Caso houvesse alguma interferência, alteraria o sinal do elemento em análise,
alterando e dando um resultado diferente do real na quantificação do produto.
Pelo cromatograma do Opera® (Figura 3), é observada a seletividade do ativo
(analito) de interesse.
18
Minutes
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
mA
U
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
mA
U
-50
0
50
100
150
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250
300
350
400
450
500
5500
.79
0
0.8
97
1.0
80
1.8
20
Ep
oxi
con
azo
le
3.0
53
Pira
clo
stro
bin
3.4
30
3.5
30
5.0
37
5.6
03
DAD-A:230nm
QA_V_BAS512_04_F_SEL_PRODUTO_311011
Retention Time
Name
Figura 3 – Cromatograma obtido da análise do produto Opera®
4.3.2. Linearidade
Este teste tem como objetivo determinar a faixa linear de trabalho que será
utilizada na validação da metodologia.
Para se realizar uma quantificação, necessita-se conhecer a dependência
entre a resposta medida e a concentração do analito. A equação da reta que
relaciona as duas variáveis é:
y = a + bx
Sendo:
Y = resposta medida (Área do pico [mAU*s]);
X = massa [mg];
a = coeficiente linear;
b = inclinação da reta obtida.
A linearidade de um método pode ser observada pelo gráfico criado a partir
da área obtida na analise em função da massa nominal e verificada pela equação
da regressão linear, determinada pelo método dos mínimos quadrados.
Analito de
interesse
19
Calculou-se o modelo através da regressão linear, os resíduos e o coeficiente
de correlação linear (R). Este é frequentemente utilizado para indicar o quanto a reta
pode ser considerada adequada como modelo para o estudo de caso. O valor
esperado para o coeficiente de correlação (R) deve estar entre o intervalo 1 - 0.99,
provando desta forma a linearidade do modelo.
Foram preparados nove níveis de concentrações, para construir a curva
analítica. Cada nível foi analisado em triplicata.
Linearidade - Opera®
Padrão Massa Nominal
[mg]
Massa
Corrigida [mg] Área [mAu*s]
Área Média
[mA*s]
1 6.09 6.08 970992.0
973031.0 973031.0
973539.0
2 6.69 6.68 1080265.0
1081224.0 1081224.0
1082291.0
3 7.88 7.86 1263099.0
1263688.0 1263688.0
1264705.0
4 8.97 8.95 1435280.0
1435280.0 1434743.0
1436481.0
5 9.58 9.56 1518345.0
1519043.0 1519043.0
1519263.0
6 10.47 10.45 1672384.0
1673185.0 1673185.0
1673958.0
7 11.73 11.71 1872219.0
1873923.0 1873923.0
1874517.0
8 12.99 12.96 2071863.0
2074343.0 2074343.0
2075185.0
9 14.62 14.59 2318339.0
2319561.0 2319561.0
2321203.0
Tabela 3 - Resultados da linearidade
20
Gráfico 1 – Curva da linearidade
Coeficiente angular: 158129
Coeficiente linear: 18305
R²: 0.9998
Demonstra-se de acordo com o valor de correlação de 0,9998 que o método
desenvolvido produz uma resposta linear para o analito, na faixa de trabalho
desejado.
4.3.3. Recuperação
A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de amostras
fortificadas com quantidades conhecidas do mesmo. As amostras devem ser
fortificadas com o analito em pelo menos três diferentes concentrações: baixa,
média e alta, da faixa de uso do método.
A recuperação é calculada da seguinte forma:
Sendo:
M1 = Massa do analito encontrada pelo equipamento
M2 = Massa nominal
y = 158129x + 18305 R 2 = 0.9998
800000.0
1000000.0
1200000.0
1400000.0
1600000.0
1800000.0
2000000.0
2200000.0
2400000.0
2600000.0
5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 17.00 Massa [mg]
Área [mAu*s]
21
A porcentagem de recuperação para o ativo deve ser entre 97,0% – 103,0 %,
de acordo com sua concentração.
A curva de calibração foi montada com os padrões 1,5 e 9 da linearidade. Na
validação foi realizada uma recuperação utilizando-se o placebo (matriz de
composição) do Opera®, e tendo os analitos nas seguintes concentrações:
Componente Placebo Ativo
Massa teorica 173,99 7,11
%(m/m) 3,55
Massa teorica 165,3 9,48
%(m/m) 4,74
Massa teorica 156,63 11,85
%(m/m) 5,92
Tabela 4 - Valores Teóricos para Recuperação com Placebo
Para a realização do teste de recuperação, foi preparada outra curva de calibração.
Os resultados da calibração encontram-se na tabela 5 e no gráfico 2. Os resultados
da recuperação encontram-se na tabela 6.
Linearidade Recuperação
Padrão Massa Nominal
[mg]
Massa Corrigida
[mg]
Area
[mAu*s]
Area média
[mAu*s]
Padrão 1 6.09 6.08 977151.0
977474.3 977505.0
977767.0
Padrão 5 9.58 9.56 1537055.0
1537901.3 1538031.0
1538618.0
Padrão 9 14.62 14.59 2316134.0
2316298.7 2316903.0
2315859.0
Tabela 5 - Calibração - Recuperação
22
Gráfico 2 – Curva de calibração
Coeficiente angular: 157091.2055
Coeficiente linear: 27632.7675
R2: 0.9999
Recuperação - Opera® com placebo
Amostra Massa
Nominal [mg]
Massa
Corrigida [mg]
Área
[mAu*s]
Área Média
[mAu*s]
Massa
encontrada [mg]
Recuperação
[%]
Amostra 75
% 7.01 7.00
1126247.0 1126178.0 6.99 99.96%
1126178.0
1126132.0
Amostra
100 % 9.36 9.34
1501135.0 1500925.0 9.38 100.40%
1500714.0
1500925.0
Amostra
125 % 14.14 14.11
2256440.0 2256440.0 14.19 100.54%
2257143.0
2256146.0
Tabela 6 - Resultados da recuperação do produto
Como descrito na norma utilizada para o estudo da validação de metodologia
analítica, os limites de ensaio são de 97 – 103% de recuperação para o ativo
analisado e os resultados variaram de 99,96% – 100,54%, portanto foi verificada a
capacidade do método de recuperar a massa adicionada de padrão e verificou-se a
exatidão do método utilizado.
Linearidade - Padrão
y = 157091.2055x + 27632.7675 R 2 = 0.9999
700000.0
900000.0
1100000.0
1300000.0
1500000.0
1700000.0
1900000.0
2100000.0
2300000.0
2500000.0
5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 17.00 Massa [mg]
Área [mAu*s]
23
4.3.4. Repetitividade
As condições de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando-se:
- Mesmo procedimento de medição;
- Mesmo analista;
- Mesmo instrumento usado sob mesmas condições;
- Repetição no menor espaço de tempo possível.
Calculou-se a média, desvio-padrão, teste de Grubbs para verificar valores
dispersos e o coeficiente de variação, verificando os cálculos em Anexo.
Para o teste de Grubbs com 12 amostras, o valor critico (Gc) tabelado é de 2,412,
com nível de significância de 5%.
Os valores limites para os coeficientes de variação que a norma da ABNT
14029 estabelece devem ser menor que 2,0%.
Na validação foram realizadas 12 pesagens de amostra Opera® e cada
amostra foi analisada em triplicata. Pesou-se para cada amostra 200mg de Produto
Final e o preparo foi realizado de acordo com o desenvolvimento do método.
Para a realização do teste de repetitividade, foi preparada outra curva de
calibração. Os resultados da calibração encontram-se na tabela 7 e no gráfico 3. Os
resultados da repetitividade encontram-se na tabela 8.
Calibração
Padrão Massa
Corrigida (mg) Área [mAu*S]
Área Média
[mAu*S]
3 7.86 1264780.0
1266101.0 1264819.0 1268379.0 1266426.0
5 9.56 1530573.0
1532226.5 1532221.0 1533570.0 1532542.0
7 11.71 1872580.0
1875164.0 1875730.0 1876477.0 1875869.0
Tabela 7 - Calibração do Padrão – Repetitividade
24
Gráfico 3 – Curva de calibração da Repetitividade
Coeficiente angular: 158571.9693
Coeficiente linear: 18011,0490
R2: 1.0000
y = 158571.9693x + 18011.0490 R 2 = 1.0000
1100000.0
1200000.0
1300000.0
1400000.0
1500000.0
1600000.0
1700000.0
1800000.0
1900000.0
2000000.0
7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00
Massa [mg]
Área [mAu*s]
25
Repetividade Opera®
Solução Massa Nominal
(mg)
Área
[mAu*S]
Área Média
[mAu*S]
Concentração
[%mm]
Concentração
média [%mm]
AMOSTRA 1 204.59 1544337.0
1543220.7 4.70
4.71
1543300.0
1542025.0
AMOSTRA 2 193.24 1460686.0
1460199.3 4.71 1460225.0
1459687.0
AMOSTRA 3 203.28 1533405.0
1532125.7 4.70 1531909.0
1531063.0
AMOSTRA 4 197.33 1488998.0
1488828.7 4.70 1488895.0
1488593.0
AMOSTRA 5 196.62 1485696.0
1486223.0 4.71 1487031.0
1485942.0
AMOSTRA 6 207.56 1562183.0
1561366.3 4.69 1560312.0
1561604.0
AMOSTRA 7 188.22 1420313.0
1420400.3 4.70 1420188.0
1420700.0
AMOSTRA 8 189.08 1431246.0
1431709.7 4.72 1431889.0
1431994.0
AMOSTRA 9 193.19 1463518.0
1463349.7 4.72 1463190.0
1463341.0
AMOSTRA10 185.28 1405195.0
1404455.3 4.72 1403408.0
1404763.0
AMOSTRA11 192.64 1454828.0
1454911.3 4.70 1454760.0
1455146.0
AMOSTRA12 186.41 1410067.0
1409784.0 4.71 1409709.0
1409576.0
Tabela 8 - Resultados Repetitividade
Média (%m/m): 4.71
Desvio Padrão: 0.0089
Valor Máximo: 4.7190
Valor Mínimo: 4.6892
Grubbs - maior valor: 1.5013
Grubbs – menor valor: 1.8328
Grubbs – valor crítico: 2.4120
CV (%): 0.1900
26
Com os resultados apresentados verificou-se que o grau de concordância
entre as medições da amostra está de acordo com o esperado utilizado para o
estudo de validação da metologia analítica.
4.3.5. Precisão Intermediária
A precisão Intermediária refere-se à avaliação sobre a mesma amostra,
utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório, mas definindo exatamente quais
as condições a se variar tais como:
- Diferentes analistas;
- Diferentes equipamentos;
- Diferente tempo.
Os resultados obtidos no teste de precisão intermediária foram analisados em
conjunto com os resultados da repetitividade da mesma amostra. Para o teste de
Grubbs com 24 amostra, o valor critico (Gc) tabelado é de 2,802, com nível de
significância de 5%. O valor limite que os coeficientes de variação devem apresentar
para o analito deve ser menor que 0,2%.
Na validação foram realizadas 12 pesagens de amostra Opera® e cada
amostra analisada em triplicata. Foi pesada para cada amostra 200mg de produto
final e preparado de acordo com o desenvolvimento do método.
Para a realização do teste de precisão intermediária, foi preparada outra curva de
calibração. Os resultados da calibração encontram-se na tabela 9 e no gráfico 4. Os
resultados da precisão intermediaria encontram-se na tabela 10.
Curva de Calibração
Padrão Massa Corrigida (mg) Área [mAu*S] Área Média [mAu*S]
3 7.86
1268695.0
1270773.0 1269591.0 1271416.0 1273390.0
5 9.56
1539779.0
1542443.0 1541418.0 1544001.0 1544574.0
7 11.71
1875645.0
1879674.5 1879622.0 1881412.0 1882019.0
Tabela 9 – Calibração da Precisão Intermediária
27
Gráfico 4 – Curva de Calibração
Coeficiente angular: 158416.5645
Coeficiente linear: 25986.4472
R²: 1.000
Linearidade – Precisão Intermediária
y = 158416.5645x + 25986.4472 R 2 = 1.0000
1100000.0
1200000.0
1300000.0
1400000.0
1500000.0
1600000.0
1700000.0
1800000.0
1900000.0
2000000.0
7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00
Massa [mg]
Área [mAu*s]
28
Precisão Intermediaria
Solução Massa
Nominal (mg) Área [mAu*S]
Área Média
[mAu*S]
Concentração
[%mm]
Concentração
média [%mm]
AMOSTRA 1 189.72 1460909.0
1460815.0 4.77*
4.70
1461072.0
1460464.0
AMOSTRA 2 194.87 1474685.0
1474048.7 4.69 1473747.0
1473714.0
AMOSTRA 3 189.68 1436543.0
1435394.0 4.69 1434796.0
1434843.0
AMOSTRA 4 184.94 1396907.0
1395982.0 4.68 1396270.0
1394769.0
AMOSTRA 5 181.81 1372694.0
1372863.0 4.68 1373421.0
1372474.0
AMOSTRA 6 189.84 1436286.0
1436891.7 4.69 1437462.0
1436927.0
AMOSTRA 7 194.69 1472891.0
1473325.0 4.69 1473581.0
1473503.0
AMOSTRA 8 183.13 1386301.0
1385352.3 4.69 1384920.0
1384836.0
AMOSTRA 9 187.30 1420029.0
1419069.3 4.70 1418949.0
1418230.0
AMOSTRA 10 194.75 1474897.0
1475266.0 4.70 1475337.0
1475564.0
AMOSTRA 11 185.05 1404185.0
1403507.7 4.70 1403210.0
1403128.0
AMOSTRA 12 188.52 1428496.0
1428676.7 4.70 1428553.0
1428981.0
Tabela 10 – Resultados da Precisão Intermediaria
* Resultado descartado pelo teste de Grubbs.
Média (%m/m): 4.68
Desvio Padrão: 0.0114
Valor Máximo: 4.7190
Valor Mínimo: 4.6761
Grubbs - maior valor: 1.8246
Grubbs – menor valor: 1.9385
Grubbs – valor crítico: 2.7810
CV (%): 0.2423
29
Com os resultados apresentados verificou-se que em todos os testes de
precisão intermediaria, o grau de concordância entre as medições da amostra está
de acordo com o esperado utilizado para o estudo de validação de metologia
analítica.
4.3.6. Robustez
O objetivo deste teste é identificar variáveis no processo analítico que
possam ter efeito significativo no desempenho do método. Executar um novo teste
de precisão modificando-se um parâmetro significativo no método de analise, como
por exemplo: lote da coluna cromatográfica, temperatura do forno de coluna, pH da
fase móvel. Para o teste de Grubbs com 24 amostra, o valor critico (Gc) tabelado é
de 2,802, com nível de significância de 5%.
O valore limite que os coeficientes de variação devem apresentar para o
analito deve ser menor que 2,0%.
Robustez – Troca do Lote da Coluna
Trocou-se o lote da coluna cromatográfica e executou-se um teste de
precisão para a amostra testada na validação.
Na validação foram realizadas 12 pesagens de amostra Opera® e cada
amostra foi analisada em triplicata. Pesou-se 200 mg de produto final e o preparo foi
realizado de acordo com o desenvolvimento do método.
Para a realização do teste de robustez, foi preparada outra curva de
calibração. Os resultados da calibração encontram-se na tabela 11 e no gráfico 5.
Os resultados da robustez encontram-se na tabela 12.
30
Resultados - Calibração
Padrão Massa
Corrigida (mg) Área [mAu*S]
Área Média
[mAu*S]
3 7.86
1286564.0
1283546.3 1280451.0
1283525.0
1283645.0
5 9.56
1558727.0
1558456.0 1559736.0
1557173.0
1558188.0
7 11.71
1897664.0
1898766.0 1900927.0
1897819.0
1898654.0
Tabela 11 – Calibração – Robustez
Gráfico 5 – Curva de Calibração da Robustez
Coeficiente angular: 160051.8751
Coeficiente linear: 26065.9484
R²: 1.000
Linearidade - Robustez
y = 160051.8751x + 26065.9484 R 2 = 1.0000
1100000.0
1200000.0
1300000.0
1400000.0
1500000.0
1600000.0
1700000.0
1800000.0
1900000.0
2000000.0
7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00
Massa [mg]
Área [mAu*s]
31
Teste de Robustez
Solução Massa
Nominal (mg)
Área
[mAu*S]
Área Média
[mAu*S]
Concentração
[%mm]
Concentração
média [%mm]
AMOSTRA 1 196.04 1485073.0 1484497.7 4.65
4.69
1484772.0 1483648.0
AMOSTRA 2 210.02 1590110.0 1590551.7 4.65 1591145.0 1590400.0
AMOSTRA 3 182.71 1388641.0 1388801.0 4.66 1389107.0 1388655.0
AMOSTRA 4 213.71 1624227.0 1624430.3 4.67 1624210.0 1624854.0
AMOSTRA 5 212.46 1596171.0 1595510.3 4.62* 1595514.0 1594846.0
AMOSTRA 6 189.22 1444054.0 1444768.3 4.68 1445362.0 1444889.0
AMOSTRA 7 190.03 1449020.0 1448207.3 4.68 1447498.0 1448104.0
AMOSTRA 8 186.86 1421408.0 1421343.7 4.67 1421808.0 1420815.0
AMOSTRA 9 195.06 1483399.0 1484732.3 4.67 1486283.0 1484515.0
AMOSTRA
10 184.56 1403421.0 1403225.7 4.66
1404176.0 1402080.0
AMOSTRA
11 187.59 1430331.0 1430918.3 4.68
1430647.0 1431777.0
AMOSTRA
12 192.47 1468800.0 1468840.0 4.68
1468768.0 1468952.0
Tabela 12 – Resultados da Robustez
* Resultado descartado pelo teste de Grubbs.
Média (%m/m): 4.69
Desvio Padrão: 0.0213
Valor Máximo: 4.7190
Valor Mínimo: 4.6482
Grubbs - maior valor: 1.4512
Grubbs – menor valor: 1.4942
Grubbs – valor crítico: 1.8703
CV (%): 0.4548
32
No teste de robustez os dados foram tratados estatisticamente com os
respectivos testes de repetitividade previamente apresentados e o C.V. está abaixo
do limite previsto pela norma, portanto o método se mostra robusto para a variação
do equipamento.
4.4. Cálculos do projeto
Como proposto na apresentação do trabalho, foram feitos cálculos sobre a
vantagem do desenvolvimento e utilização de uma nova metodologia para a análise
do produto Opera®, da empresa BASF S.A.
Valores dos solventes utilizados:
Acetonitrila = R$125,00/4L
Metanol = R$60,00/4L
- Preparo da amostra
Como no laboratório em que o projeto foi desenvolvido havia o equipamento
para deionizar a água, e levando em conta o baixo custo do uso e preparação da
água deionizada pH 2.5, esta não será levada em consideração em todos os
cálculos de economia.
Comparação entre o método antigo, e o método desenvolvido durante o projeto:
Tabela 13 – valores e quantidades pelo método anterior
Quantidade Utilizada (L)
Valor Unitário (R$/L)
Valor Gasto (R$)
Acetonitrila 0,055 31,25 1,72
Água Deionizada pH 2.5 0,045 - -
Tabela 14 – valores e quantidades pelo método desenvolvido
Quantidade Utilizada (L)
Valor Unitário (R$/L)
Valor Gasto (R$)
Acetonitrila 0,0525 31,25 1,64
Água Deionizada pH 2.5 0,0475 - -
33
Para a análise de uma amostra, eram pesadas três concentrações de padrão,
mais a amostra em triplicata. Portanto, eram preparados seis balões de vidro de
100mL cada.
Assim: Gasto Total antigo = 1,72 x 6 = R$10,32
Gasto Total novo = 1,64 x 6 = R$9,84
Redução = 4,65%
Tendo em vista que o preparo da amostra teve uma mudança pequena na
quantidade de solventes utilizados, e também porque os solventes eram os mesmo,
não houve uma redução significativa de custos em pequena escala.
- Gastos com solventes no equipamento
Tabela 15 - Configuração do gradiente de solventes pelo método anterior
Tempo Frasco A (%) Frasco B (%) Frasco C (%) Fluxo
(mL/min)
0.0 41.0 22.0 37.0 1.400
11.0 41.0 22.0 37.0 1.400
14.5 53.0 22.0 25.0 1.400
17.0 53.0 22.0 25.0 1.400
18.0 41.0 22.0 37.0 1.400
18.5 100 0.00 0.00 2.000
19.0 100 0.00 0.00 2.000
20.0 100 0.00 0.00 2.000
30.0 41.0 22.0 37.0 1.400
Onde: A = 1000mL de Acetonitrila grau HPLC
B = 1000mL de Metanol grau HPLC
C= 1000mL de Água deionizada + 25mL de Ácido Sulfúrico 0,5M.
Calculando o gasto anterior com solventes para a análise de uma amostra:
Quantidade = % x tempo x fluxo
A = (0,41 x 11 x 1,4) + (0,53 x 6 x 1,4) + (0,41 x 1 x 1,4) + (1 x 2 x 2) + (0,41 x 10 x
1,4) = 21,08mL
B = (0,22 x 11 x 1,4) + (0,22 x 6 x 1,4) + (0,22 x 1 x 1,4) + (0 x 2 x 2) + (0,22 x 10 x
1,4) = 8,62mL
34
C = (0,37 x 11 x 1,4) + (0,25 x 6 x 1,4) + (0,37 x 1 x 1,4) + (0 x 2 x 2) + (0,37 x 10 x
1,4) = 13,50mL
Portanto:
Gasto anterior =(21,08mL x 0,03125R$/mL) + (8,62mL x 0,015R$/mL) =
R$0,79/análise
Como por produto são analisados três padrões (duas injeções) e uma amostra em
triplicata (três injeções cada):
Gasto Total anterior = 0,79R$/injeção x 15injeções = R$11,85
Tabela 16 - Configuração do gradiente de solventes pelo método desenvolvido
Tempo Frasco A (%) Frasco B (%) Frasco C (%) Fluxo (mL/min)
0.0 25.0 67.0 8.0 2,50
3.3 25.0 67.0 8.0 2,50
4.0 10.0 90.0 0.0 3,50
5.5 10.0 90.0 0.0 3,50
6.0 25.0 67.0 8.0 2,50
7.0 25.0 67.0 8.0 2,50
Onde: A = 1000mL de Água deionizada + 25mL de Ácido Sulfúrico 0,5M.
B = 1000mL de Acetonitrila grau HPLC
C= 1000mL de Metanol grau HPLC
Calculando o gasto anterior com solventes para a análise de uma amostra:
Quantidade = % x tempo x fluxo
A = (0,25 x 3,3 x 2,5) + (0,10 x 2,7 x 3,5) + (0,25 x 1 x 2,5) = 3,63mL
B = (0,67 x 3,3 x 2,5) + (0,90 x 2,7 x 3,5) + (0,67 x 1 x 2,5) = 15,71mL
C = (0,08 x 3,3 x 2,5) + (0,0 x 2,7 x 3,5) + (0,08 x 1 x 2,5) = 0,86mL
Portanto:
Gasto atual =(15,71mL x 0,03125R$/mL) + (0,86mL x 0,015R$/mL) = R$0,50/análise
35
Como por produto são analisados três padrões (duas injeções) e uma amostra em
triplicata (três injeções):
Gasto Total anterior = 0,50R$/injeção x 15injeções = R$7,5
REDUÇÃO TOTAL = R$4,35/análise = 36.71%
Gráfico 6: Redução de custo de solvente
- Tempo de análise
Fator importante em qualquer laboratório analítico, e na maioria dos setores
da economia, o tempo foi considerado como fator de alta importância nos objetivos
do projeto, junto com o custo.
Como visto, o método desenvolvido apresenta um tempo total muito inferior
ao gasto anteriormente na análise de uma amostra.
Tempo de análise anterior:
30 minutos/injeção x 15 injeções = 450 minutos
Pelo método novo:
7 minutos/injeção x 15 injeções = 105 minutos
REDUÇÃO = 76,67%
36
Total de tempo de análise (min)
Gráfico 7: Total de tempo por análise
Verificou-se que a redução de tempo foi bastante significativa, devido
principalmente à constante evolução de equipamentos, colunas cromatográficas
(apesar de se ter utilizado a mesma para ambos os métodos), consumíveis, entre
outros.
Redução de tempo
76,67%
37
5. Conclusão
O projeto apresentado consistia em reduzir custos de análise, propondo e
desenvolvendo uma nova metodologia, do produto Opera®, da empresa BASF
S.A., em equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência.
O desenvolvimento do método foi feito através de experimentação e, após
definidas as melhores condições do processo, a metodologia foi validada
seguindo normas da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT).
Durante o desenvolvimento do método, vários testes foram feitos, e vários
resultados foram descartados, buscando a excelência, necessitando assim de
muito tempo e com certo investimento por parte do Laboratório Analítico.
Com os resultados obtidos, a metodologia foi validada, realizando testes de
seletividade, linearidade, repetitividade, recuperação, precisão intermediária, e
robustez, com resultados dentro dos definidos pela ABNT. Após validação, foram
realizados os cálculos para estimar o real benefício do projeto, quantificando as
melhorias do processo.
Através dos cálculos, verificou-se que o projeto atingiu seu objetivo principal,
que era a redução de custos, e também de tempo, na análise do Opera®. A
redução de custos, mas também a economia de tempo é de alta importância
para um Laboratório de Análises, visto que qualquer laboratório necessita de
maior lucro (menos gasto), e maior rapidez na entrega de resultados, com
análises mais rápidas. As reduções do processo estão relacionadas ao consumo
de solventes utilizados no preparo da amostra, no equipamento, e também
grande redução de tempo de análise.
Como sugestão para projetos futuros, deve-se procurar o desenvolvimento de
novos métodos, aplicados a outros produtos da empresa, visto que se trata de
uma das maiores indústria do ramo de Agrotóxico, com muitos produtos, e os
métodos utilizados encontram-se em contínua desatualização, devido à melhoria
contínua de equipamentos, solventes, e produtos formulados. Proponho também
o uso de colunas cromatográficas de tamanhos menores, mais avançadas, que
permitem a análise de produtos em tempo reduzido.
38
6. Referências Bibliográficas
[1] VALENTE, A.L.P.; COLLINS, C.H.; MANFREDI, J.E. Conceitos básicos de cromatografia líquida de alta eficiência. Química Nova, São Paulo, 1983.
[2] SKOOG, K.A.; HOLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Cromatografia líquida de alta eficiência. Princípios de análise instrumental. 5.ed. Porto Alegre: Bookman, 2002, p. 641-677.
[3] MALDANER, L.; JARDIM, I.C.S.F. O estado da arte da cromatografia líquida de
ultra eficiência. Química Nova, São Paulo, 2009, v.32, n.1, p.214-222.
[4] CIOLA, R. Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho. 1.ed. São Paulo:Editora Edgard Blucher Ltda. 2000. 179p.
[5] AQUINO-NETO, F.R; NUNES, D.S.S. Cromatografia: princípios básicos e técnicas afins. Rio de Janeiro: Interciência, 2003, 187p.
[6] COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a métodos
cromatográficos. 5ªed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993.
ABNT NBR 14029:2005 – Agrotóxicos e afins – Validação de métodos analíticos Ed.
02
39
7. Anexos
7.1. Média aritmética ( x )
A média aritmética ( x ) é determinada pela seguinte equação:
n
xnxxx
...21=
n
xin
i
1
onde:
x é a média aritmética dos valores;
x é o valor obtido;
n é o número de resultados obtidos;
xi é o índice de valor de x
7.2. Estimativa do desvio padrão ( s )
A estimativa do desvio-padrão é determinada pela seguinte equação:
onde:
s é a estimativa do desvio padrão.
x é a média aritmética dos valores;
xi é o valor obtido;
n é o número de resultados obtidos;
7.3. Teste de GRUBBS
O teste de Grubbs é determinado pelas equações a seguir.
Teste para o maior valor:
40
Teste para o menor valor:
s
xxmG
)(
s
xxG
)1(
onde:
xm é o maior valor de resultado obtido
1x é o menor valor de resultado obtido
x é o valor médio do resultado obtido
Um valor observado será considerado disperso quando o valor de G calculado for
maior que o valor crítico Gc (tabelado).
7.4. Cálculo do coeficiente de correlação (r)
onde e são os valores medidos de ambas as
variáveis. Além disso:
e são as médias aritméticas de ambas as
variáveis.
7.5. Cálculo do coeficiente de variação (CV)
O coeficiente de variação é determinado pela seguinte equação:
CV = Coeficiente de Variação (%);
DP = é o desvio padrão absoluto entre os resultados;
med = é a média aritmética dos resultados.