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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA BIOLOGÍA
Trabajo de titulación previo a obtener el grado académico
de Bióloga
EFECTO DE LA SALINIDAD Y pH EN LA COMPOSICIÓN
BIOQUÍMICA DE LA MICROALGA Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009)
EN CULTIVOS DISCONTINUOS
AUTOR: DIANA MACÍAS CANDELARIO
TUTOR: PhD. EVER MOLARES AVENDAÑO
GUAYAQUIL-ECUADOR
2019
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
Guayaquil, 22 de febrero de 2019
Blga. Dhialhy Coello., MSc. DIRECTORA DE LA CARRERA DE BIOLOGÍA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL Ciudad.- Guayaquil De mis consideraciones: Envío a Ud. el Informe correspondiente a la tutoría realizada al Trabajo de Titulación Efecto de la
salinidad y pH en la composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en
cultivos discontinuos, de la estudiante Diana Yomaira Macías Candelario indicando ha cumplido con
todos los parámetros establecidos en la normativa vigente:
• El trabajo es el resultado de una investigación.
• El estudiante demuestra conocimiento profesional integral.
• El trabajo presenta una propuesta en el área de conocimiento.
• El nivel de argumentación es coherente con el campo de conocimiento. Adicionalmente, se adjunta el certificado de porcentaje de similitud y la valoración del trabajo de titulación con la respectiva calificación. Dando por concluida esta tutoría de trabajo de titulación, CERTIFICO, para los fines pertinentes, que la estudiante está apta para continuar con el proceso de revisión final. Atentamente, ______________________________________
Blgo. Ever Morales Avendaño, MSc., PhD. TUTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN C.I. 0959966342
ANEXO 4
FACULTAD CIENCIAS NATURALES CARRERA DE BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
RÚBRICA DE EVALUACIÓN TRABAJO DE TITULACIÓN
TÍTULO DEL TRABAJO: Efecto de la salinidad y pH en la composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en cultivos discontinuos AUTORA: Diana Yomaira Macías Candelario
ASPECTOS EVALUADOS PUNTAJE MÁXIMO
CALF.
ESTRUCTURA ACADÉMICA Y PEDAGÓGICA 4.5 4.5
Propuesta integrada a Dominios, Misión y Visión de la Universidad de Guayaquil. 0.3 0.3
Relación de pertinencia con las líneas y sublíneas de investigación Universidad / Facultad/ Carrera
0.4 0.4
Base conceptual que cumple con las fases de comprensión, interpretación, explicación y sistematización en la resolución de un problema.
1 1
Coherencia en relación a los modelos de actuación profesional, problemática, tensiones y tendencias de la profesión, problemas a encarar, prevenir o solucionar de acuerdo al PND-BV
1 1
Evidencia el logro de capacidades cognitivas relacionadas al modelo educativo como resultados de aprendizaje que fortalecen el perfil de la profesión
1 1
Responde como propuesta innovadora de investigación al desarrollo social o tecnológico. 0.4 0.4
Responde a un proceso de investigación – acción, como parte de la propia experiencia educativa y de los aprendizajes adquiridos durante la carrera.
0.4 0.4
RIGOR CIENTÍFICO 4.5 4.5
El título identifica de forma correcta los objetivos de la investigación 1 1
El trabajo expresa los antecedentes del tema, su importancia dentro del contexto general, del conocimiento y de la sociedad, así como del campo al que pertenece, aportando significativamente a la investigación.
1 1
El objetivo general, los objetivos específicos y el marco metodológico están en correspondencia.
1 1
El análisis de la información se relaciona con datos obtenidos y permite expresar las conclusiones en correspondencia a los objetivos específicos.
0.8 0.8
Actualización y correspondencia con el tema, de las citas y referencia bibliográfica 0.7 0.7
PERTINENCIA E IMPACTO SOCIAL 1 1
Pertinencia de la investigación 0.5 0.5
Innovación de la propuesta proponiendo una solución a un problema relacionado con el perfil de egreso profesional
0.5 0.5
CALIFICACIÓN TOTAL * 10 10
* El resultado será promediado con la calificación del Tutor Revisor y con la calificación de obtenida en la Sustentación oral.
___________________________________________
Blgo. Ever Morales Avendaño, MSc.,PhD. TUTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN No. C.I. 0959966342 FECHA: 22 de febrero de 2019
ANEXO 5
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FECHA: 22 de febrero de 2019
CERTIFICADO PORCENTAJE DE SIMILITUD
Habiendo sido nombrado Ever Darío Morales Avendaño, tutor del trabajo de titulación certifico que el presente trabajo de titulación ha sido elaborado por Diana Yomaira Macías Candelario, C.I.:0929097376, con mi respectiva supervisión como requerimiento parcial para la obtención del título de Bióloga.
Se informa que el trabajo de titulación: Efecto de la salinidad y pH en la composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en cultivos discontinuos, ha sido orientado durante todo el periodo de ejecución en el programa antiplagio (URKUND) quedando el 5% de coincidencia.
______________________________________
Blgo. Ever Morales Avendaño, MSc., PhD. TUTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN C.I. 095996634
ANEXO 6
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD CIENCIAS NATURALES
CARRERA BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
Guayaquil, 15 de Marzo de 2019
Sra. Blga. DHIALY COELLO, MSc . DIRECTORA DE LA CARRERA DE BIOLOGÍA FACULTAD CIENCIAS NATURALES UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL Ciudad.- De mis consideraciones: Envío a Ud. el Informe correspondiente a la REVISIÓN FINAL del Trabajo de Titulación Efecto de la salinidad y pH en la composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en cultivos discontinuos, de la estudiante Diana Yomaira Macías Candelario. Las gestiones realizadas me permiten indicar que el trabajo fue revisado considerando todos los parámetros establecidos en las normativas vigentes, en el cumplimento de los siguientes aspectos: Cumplimiento de requisitos de forma:
• El título tiene un máximo de 18 palabras.
• La memoria escrita se ajusta a la estructura establecida.
• El documento se ajusta a las normas de escritura científica seleccionadas por la Facultad.
• La investigación es pertinente con la línea y sublíneas de investigación de la carrera.
• Los soportes teóricos, en su mayoría son de máximo 7 años.
• La propuesta presentada es pertinente. Cumplimiento con el Reglamento de Régimen Académico:
• El trabajo es el resultado de una investigación.
• El estudiante demuestra conocimiento profesional integral.
• El trabajo presenta una propuesta en el área de conocimiento.
• El nivel de argumentación es coherente con el campo de conocimiento. Adicionalmente, se indica que fue revisado, el certificado de porcentaje de similitud, la valoración del tutor, así como de las páginas preliminares solicitadas, lo cual indica el que el trabajo de investigación cumple con los requisitos exigidos. Una vez concluida esta revisión, considero que la estudiante Diana Yomaira Macías Candelario, está apta para continuar el proceso de titulación. Particular que comunico a usted para los fines pertinentes. Atentamente, ___________________ _____ Blgo. Xavier Cornejo MSc. DOCENTE TUTOR REVISOR C.I. 0910758366
ANEXO 7
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD CIENCIAS NATURALES
CARRERA BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
RÚBRICA DE EVALUACIÓN MEMORIA ESCRITA TRABAJO DE TITULACIÓN
________________________________ Blgo. Xavier Cornejo MSc. DOCENTE TUTOR REVISOR No. C.I. 0910758366 Fecha: 15 de Marzo del 2019
Título del Trabajo: Efecto de la salinidad y pH en la composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en cultivos discontinuos Autora: Diana Yomaira Macías Candelario
ASPECTOS EVALUADOS PUNTAJE MÁXIMO
CALF. COMENTARIOS
ESTRUCTURA Y REDACCIÓN DE LA MEMORIA 3 3 Formato de presentación acorde a lo solicitado 0.6 0.6 Tabla de contenidos, índice de tablas y figuras 0.6 0.6 Redacción y ortografía 0.6 0.6 Correspondencia con la normativa del trabajo de titulación 0.6 0.6 Adecuada presentación de tablas y figuras 0.6 0.6
RIGOR CIENTÍFICO 6 6 El título identifica de forma correcta los objetivos de la investigación 0.5 0.5 La introducción expresa los antecedentes del tema, su importancia dentro del contexto general, del conocimiento y de la sociedad, así como del campo al que pertenece
0.6 0.6
El objetivo general está expresado en términos del trabajo a investigar 0.7 0.7 Los objetivos específicos contribuyen al cumplimiento del objetivo general 0.7 0.7 Los antecedentes teóricos y conceptuales complementan y aportan significativamente al desarrollo de la investigación
0.7 0.7
Los métodos y herramientas se corresponden con los objetivos de la investigación
0.7 0.7
El análisis de la información se relaciona con datos obtenidos 0.4 0.4 Factibilidad de la propuesta 0.4 0.4 Las conclusiones expresa el cumplimiento de los objetivos específicos 0.4 0.4 Las recomendaciones son pertinentes, factibles y válidas 0.4 0.4 Actualización y correspondencia con el tema, de las citas y referencia bibliográfica
0.5 0.5
PERTINENCIA E IMPACTO SOCIAL 1 1 Pertinencia de la investigación/ Innovación de la propuesta 0.4 0.4 La investigación propone una solución a un problema relacionado con el perfil de egreso profesional
0.3 0.3
Contribuye con las líneas / sublíneas de investigación de la Carrera/Escuela 0.3 0.3
CALIFICACIÓN TOTAL* 10 10
* El resultado será promediado con la calificación del Tutor y con la calificación de obtenida en la Sustentación oral.
ANEXO 8
Firma del Docente Revisor Firma del Tutor de Titulación
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CARRERA DE BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
ANEXO 10
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO:
Efecto de la salinidad y pH en la composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en cultivos discontinuos
AUTOR(apellidos/nombres): Macías Candelario Diana Yomaira
REVISOR (ES)/TUTOR(ES) (apellidos/nombres):
Revisor: Cornejo Xavier Tutor: Morales Avendaño Ever Darío
INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil UNIDAD/FACULTAD: Facultad de Ciencias Naturales MAESTRÍA/ESPECIALIDAD: GRADO OBTENIDO: Bióloga FECHA DE PUBLICACIÓN: Abril del 2019 No. DE PÁGINAS: 86 ÁREAS TEMÁTICAS: Desarrollo biotecnológico, conservación y aprovechamiento
sostenible de los recursos naturales PALABRAS CLAVES/ KEYWORDS:
Carbohidratos, crecimiento, lípidos, pH, proteínas, salinidad, Scenedesmus sp.
RESUMEN/ ABSTRACT (150-250 palabras):
En el presente estudio se evaluó el efecto del pH (5, 6, 9,11) y de la salinidad (6, 12, 26 y 36 UPS) en el crecimiento y la producción de pigmentos, proteínas, carbohidratos y lípidos de la microalga Scenedesmus sp. en el medio de cultivo BG11. Los cultivos discontinuos se mantuvieron por 19 días, con aireación constante, irradiancia de 50.22 μmol m-2s-1, fotoperiodo 12:12 h y a 25±2 ºC. Entre los resultados se determinó que en cultivos no salinos y a pH 9 se presentaron las densidades celulares más elevadas con 9.48±0.32x106 cél.mL-1 con diferencias significativas p<0.05 entre el control (pH 8-10) y el rango de pH estudiados. Mientras, que los de clorofila a y b se produjeron a 0 UPS y pH (8-10) con 5.52±0.09 y 2.03±0.16 µg.mL-1, respectivamente, pero con un descenso con el aumento de NaCl. Así mismo, se demostró que los carotenoides se incrementaron a 12UPS y pH 11 de 0.20±0.004 a 1.45±0.004 µg.mL-1 y el más elevado en lípidos (p<0.05) se evidenció a 6 UPS con 16±32.37 µg.mL-1. Sin embargo, los mayores contenidos de proteínas y carbohidratos se produjeron a 0UPS y pH 11 con 377.37±23.88 y 122.69±1.68 µg.mL-1; respectivamente; demostrándose que el efecto del pH tuvo mayor influencia en la acumulación de proteínas y carbohidratos. Los resultados de la adaptación gradual al NaCl permiten concluir que esta cepa de Scenedesmus sp., aunque es halotolerante presentó un crecimiento óptimo, mayor contenido de clorofila y de carotenoides en condiciones no salinas y en medio alcalino. ADJUNTO PDF: SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0997039576 E-mail: [email protected]
CONTACTO CON LA INSTITUCIÓN:
Nombre: Facultad de Ciencias naturales
Teléfono: 043080777 – 043080758
E-mail: [email protected]
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD CIENCIAS NATURALES
CARRERA BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
Guayaquil, 15 de Marzo de 2019
CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR
Habiendo sido nombrado Ever Morales Avendaño, Docente Tutor, del trabajo de titulación Efecto de la salinidad y pH en la composición bioquímica de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en cultivos discontinuos, certifico que el presente trabajo de titulación, elaborado por Diana Yomaira Macías Candelario con C.I. No. 0929097376, en la Carrera de Biología, Facultad de Ciencias Naturales, ha sido REVISADO Y APROBADO en todas sus partes, encontrándose apta para su sustentación.
Anexo 11
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN
LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA
EL USO NO COMERCIAL DE LA OBRA CON FINES ACADÉMICOS
Yo, Diana Yomaira Macías Candelario con C.I. No. 0929097376, certifico que los
contenidos desarrollados en este trabajo de titulación, cuyo título es Efecto de la
salinidad y pH en la composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp. (UGB-
RJ-3009) en cultivos discontinuos son de mi absoluta propiedad y responsabilidad y
SEGÚN EL Art.114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN*, autorizo el uso de una licencia
gratuita intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la presente obra con
fines académicos, en favor de la Universidad de Guayaquil, para que haga uso del
mismo, como fuera pertinente.
Diana Yomaira Macías Candelario C.I. No. 0929097376
ANEXO 12
*CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN (Registro Oficial n.899 – Dic/2016) Artículo 114.- De los titulares de derechos de obras creadas en las instituciones de educación superior y centros educativos – En el caso de las obras creadas en centros educativos, universidades, escuelas politécnicas, institutos superiores técnicos, tecnológicos, pedagógicos, de artes y los conservatorios superiores, e institutos públicos de investigación como resultado de su actividad académica o de investigación tales como trabajos de titulación, proyectos de investigación o innovación, artículos académicos u otros análogos, sin perjuicio de que pueda existir relación de dependencia, la titularidad de los derechos patrimoniales corresponderá a los autores. Sin embargo, el establecimiento tendrá una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra con fines académicos.
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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
EFECTO DE LA SALINIDAD Y pH EN LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE LA
MICROALGA Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) EN CULTIVOS DISCONTINUOS
Autor: Diana Yomaira Macías Candelario
Tutor: PhD. Ever Morales Avendaño
RESUMEN
En el presente estudio se evaluó el efecto del pH (5, 6, 9,11) y de la salinidad (6, 12, 26 y 36 UPS) en el crecimiento y la producción de pigmentos, proteínas, carbohidratos y lípidos de la microalga Scenedesmus sp. en el medio de cultivo BG11. Los cultivos discontinuos se mantuvieron por 19 días, con aireación constante, irradiancia de 50.22 μmol m-2s-1, fotoperiodo 12:12 h y a 25±2 ºC. Entre los resultados se determinó que en cultivos no salinos y a pH 9 se presentaron las densidades celulares más elevadas con 9.48±0.32x106 cél.mL-1 con diferencias significativas p<0.05 entre el control (pH 8-10) y el rango de pH estudiados. Mientras, que los de clorofila a y b se produjeron a 0 UPS y pH (8-10) con 5.52±0.09 y 2.03±0.16 µg.mL-1, respectivamente, pero con un descenso con el aumento de NaCl. Así mismo, se demostró que los carotenoides se incrementaron a 12UPS y pH 11 de 0.20±0.004 a 1.45±0.004 µg.mL-1 y el más elevado en lípidos (p<0.05) se evidenció a 6 UPS con 16±32.37 µg.mL-1. Sin embargo, los mayores contenidos de proteínas y carbohidratos se produjeron a 0UPS y pH 11 con 377.37±23.88 y 122.69±1.68 µg.mL-1; respectivamente; demostrándose que el efecto del pH tuvo mayor influencia en la acumulación de proteínas y carbohidratos. Los resultados de la adaptación gradual al NaCl permiten concluir que esta cepa de Scenedesmus sp., aunque es halotolerante presentó un crecimiento óptimo, mayor contenido de clorofila y de carotenoides en condiciones no salinas y en medio alcalino.
Palabras claves: carbohidratos, crecimiento, lípidos, pH, proteínas, salinidad,
Scenedesmus sp.
Anexo 13
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA
UNIDAD DE TITULACIÓN
EFFECT OF SALINITY AND pH ON THE BIOCHEMICAL COMPOSITION
OF THE MICROALGAE Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) IN BATCH
CULTURES
Author: Diana Yomaira Macías Candelario
Advisor: PhD. Ever Morales Avendaño
ABSTRACT
In the present study, the effect of pH (5, 6, 9, 11) and salinity (6, 12, 26 and 36 UPS) on the growth and production of pigments, proteins, carbohydrates and lipids of the microalgae was evaluated. Scenedesmus sp. in the BG11 culture medium. The discontinuous cultures were maintained for 19 days, with constant aeration, irradiance of 50.22 μmol m-2s-1, photoperiod 12:12 h and at 25 ± 2 ºC. Among the results, it was determined that in non-saline cultures and those at pH 9 presented the highest cell densities having 9.48 ± 0.32x106 cells.mL-1 with significant differences of p <0.05 between the control (pH 8-10) and the pH range studied. Meanwhile, chlorophyll a and b were produced at 0 UPS and pH (8-10) with 5.52 ± 0.09 and 2.03 ± 0.16 μg.mL-1, respectively, but with a decrease with the increase in NaCl. Likewise, it was shown that carotenoids were increased to 12UPS and pH 11 from 0.20 ± 0.004 to 1.45 ± 0.004 μg.mL-1. In contrast, the highest in lipids (p <0.05) was evidenced at 6 UPS with 16 ± 32.37 μg.mL-1. However, the highest protein and carbohydrate contents were produced at 0UPS and pH 11 with 377.37 ± 23.88 and 122.69 ± 1.68 μg.mL-1; respectively; demonstrating that the effect of pH had a greater influence on the accumulation of proteins and carbohydrates. The results of the gradual adaptation to NaCl allow us to conclude that this strain of Scenedesmus sp. although it is halotolerant, showed an optimal growth, a higher content of chlorophyll and of carotenoids in non-saline conditions and in an alkaline medium.
Keywords: carbohydrates, growth, lipids, proteins, pH, salinity, Scenedesmus sp.
Anexo 14
i
© Derechos de Autor
Diana Yomaira Macías Candelario
2019
DIRECTOR DE TESIS
En mi calidad de Tutor de esta Tesis Certifico que, el presente trabajo ha sido
elaborado por la señorita Diana Yomaira Macías Candelario por lo cual autorizo
su presentación
-------------------------------------------------------------
Blgo. Ever Morales Avendaño, MSc., PhD.
Director de Tesis
ii
DEDICATORIA
A Dios quien en su infinita bondad me ha guiado en este difícil proceso
dándome fuerzas y ánimos para no desistir en los momentos que quería
hacerlo.
iii
AGRADECIMIENTOS
A Dios y a mi familia por estar siempre presente apoyándome, a mi padre
Jhonny Macías por ser un pilar fundamental en mi formación personal y
académica, siempre alentándome y aconsejándome en todo momento, más aún
cuando las cosas se ponían difíciles; a mi madre Diana Candelario y a mis
hermanos por su apoyo incondicional.
Agradezco a mi tutor PhD. Ever Morales Avendaño, siempre alegre y atento
por su paciencia y participación en el desarrollo de esta investigación.
Al biólogo Leonardo García, por ensañarme las bases de ficología, aportando
con sus conocimientos, tiempo y apoyo, siempre paciente estando conmigo en
el desarrollo de esta investigación, haciendo más ameno el proceso experimental
de este trabajo.
A mis compañeros del área de bioprospección de microalgas, Yelsin Loor y
Lisbeth Plúas, por su apoyo y colaboración en este arduo trabajo porque esta
investigación es producto de la integración de un equipo y eso es lo más
gratificante.
A mis profesores, por haberme brindado parte de sus conocimientos y guiado
durante mi vida estudiantil.
Al equipo de investigadores del Laboratorio de Biotecnología por el apoyo
brindado en el desarrollo de esta investigación.
iv
ÍNDICE DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1
CAPÍTULO I ................................................................................................. 3
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................. 3
1.2 OBJETIVOS ....................................................................................... 4
1.2.1 Objetivo General ........................................................................... 4
1.2.2 Objetivos específicos .................................................................... 4
1.3 JUSTIFICACIÓN .................................................................................. 5
1.4 HIPÓTESIS ......................................................................................... 6
CAPÍTULO II ................................................................................................ 7
2.1 ANTECEDENTES ................................................................................ 7
2.2 MARCO TEÓRICO .............................................................................. 9
2.2.1 Generalidades de las microalgas .................................................. 9
2.2.2 Género Scenedesmus ................................................................ 10
2.2.3 Composición bioquímica de las microalgas................................. 11
2.2.3.1 Proteínas ............................................................................. 11
2.2.3.2 Carbohidratos ...................................................................... 12
2.2.3.3 Lípidos ................................................................................. 13
2.2.4 Aplicaciones biotecnológicas de las microalgas ......................... 14
CAPÍTULO III ............................................................................................. 16
3.1 METODOLOGÍA ................................................................................ 16
v
3.1.1 Obtención de la cepa .................................................................... 16
3.1.1.1 Escalamiento del cultivo madre ............................................... 16
3.1.2 Diseño experimental ...................................................................... 17
3.2.1 Condiciones generales de cultivo................................................... 17
3.2.2 Medio de cultivo .......................................................................... 18
3.2.2.2 Composición del medio de cultivo BG11. .............................. 18
3.3.1 PREADAPTACIÓN A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SALINIDAD. ................................................................................................. 19
3.4.1 PARÁMETROS DE CRECIMIENTO ............................................ 19
3.4.1.1 Densidad celular .................................................................... 19
3.4.1.2 Método de turbidez ................................................................ 20
3.5.1 EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS ............... 21
3.6.1 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS
ORGÁNICAS. .............................................................................................. 22
3.6.1.1 Determinación de proteínas ................................................... 22
3.6.1.2 Determinación de carbohidratos ............................................ 22
3.6.1.3 Determinación de lípidos ........................................................ 23
3.7.1 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................ 23
CAPÍTULO IV ............................................................................................. 24
4.1 RESULTADOS .................................................................................. 24
4.1.1 Crecimiento de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009). ..................... 24
4.1.1.1 Cinética de crecimiento pre-adaptación a diferentes
concentraciones de NaCl (0, 6, 26,36 UPS). ................................................ 24
vi
4.1.1.2 Turbidez pre adaptación a distintas concentraciones de NaCl
.................................................................................................................... 25
4.1.2 Cinética de crecimiento a diferentes pH y salinidad. ...................... 26
4.1.2.1 Crecimiento a diferentes pH a 0 UPS. ..................................... 27
4.1.2.2 Crecimiento a diferentes pH a 6 UPS ...................................... 28
4.1.2.3 Crecimiento a distintos pH a 12 UPS ...................................... 30
4.1.3 Turbidez ......................................................................................... 31
4.2.1 Pigmentos Fotosintéticos ............................................................... 33
4.2.1.1 Clorofila a................................................................................ 33
4.2.1.2 Clorofila b................................................................................ 34
4.2.1.3 Carotenos totales .................................................................... 35
4.3.1 Producción de Proteínas ................................................................ 37
4.4.1 Producción de Carbohidratos ......................................................... 38
4.4.5 Producción de Lípidos ................................................................... 39
DISCUSIÓN ................................................................................................ 42
CONCLUSIONES ....................................................................................... 46
RECOMENDACIONES ............................................................................... 48
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 49
ANEXOS .................................................................................................... 55
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Diseño experimental (factores de estudio y variables de
respuesta)……………………………………………………………………………..17
Tabla 2. Plan de adaptación a distintas concentraciones de salinidad
(UPS)………………..………………………………………………………………...19
Tabla 3. Valores máximos de crecimiento obtenidos por los métodos de
Recuento celular y Turbidez en Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) frente al
estrés inducido por la salinidad y pH
......…………………………………………………..33
Tabla 4. Contenido de clorofila total en la microalga Scenedesmus sp. frente al
estrés inducido por los diferentes pH y concentraciones de salinidad
……………………………………………..............................................................36
Tabla 5. Contenido (µg.mL-1) de pigmentos liposolubles totales en Scenedesmus
sp. a diferentes pH y concentraciones de salinidad
………………………………………………………………………………………....37
Tabla 6. Producción bioquímica de Scenedesmus sp. frente al estrés inducido
por la salinidad y
pH………………………………………………………………………………………41
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Scenedesmus en su morfotipo cenobial de 8 células……………….10
Figura 2. Escalamiento de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en medio de
cultivo BG11………………………………………………………………………..16
Figura 3. Cultivos de Scenedesmus sp…………………………………………...18
Figura 4. Efecto de la adaptación a diferentes concentraciones de salinidad
sobre el crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-
3009)…………………………………………………………………………………..25
Figura 5. Efecto de la adaptación gradual al NaCl sobre el crecimiento de
Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) mediante turbidez (absorbancia a 680
nm)……………………………………………………………………………………..25
Figura 6. Curvas de crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp. adaptada
a distintas concentraciones de NaCl (UPS)………………………………………..26
Figura 7. Efecto del pH sobre el crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus
sp. a 0 UPS……………………………………………………………………………27
Figura 8. Densidades celulares (x106 cél.mL-1) máximas alcanzadas de
Scenedesmus sp. en los días seleccionados a 0 UPS……………………………28
Figura 9. Efecto del pH sobre el crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus
sp. a 6 UPS de NaCl…………………………………………………………………29
Figura 10. Densidades celulares (x106 cél.mL-1) máximas de Scenedesmus sp.
a 6 UPS de NaCl……………………………………………………………………..29
Figura 11. Efecto del pH sobre el crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus
sp. a 12 UPS de NaCl………………………………………………………………..30
Figura 12. Densidades máximas (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp.
alcanzadas en los días seleccionados……………………………………………..31
ix
Figura 13. Efecto del pH sobre el crecimiento (680 nm) de Scenedesmus sp. 0
UPS……………………………………………………………………………………31
Figura 14. Efecto del pH sobre el crecimiento (680 nm) de Scenedesmus sp. a
6 UPS………………………………………………………………………………….32
Figura 15. Efecto del pH sobre el crecimiento (680 nm) de Scenedesmus sp. a
12 UPS………………………………………………………………………………...32
Figura 16. Efecto del pH a diferentes concentraciones de NaCl sobre el
contenido de clorofila a (µg.mL-1) en Scenedesmus sp…………………………..34
Figura 17. Efecto del pH a diferentes concentraciones de NaCl sobre contenido
de clorofila b (µg.mL-1) en Scenedesmus sp………………………………………35
Figura 18. Efecto del pH y a diferentes concentraciones de NaCl (UPS) sobre
el contenido de carotenos totales (µg.mL-1) en Scenedesmus sp……………...36
Figura 19. Contenido de Proteínas (µg.mL-1) de Scenedesmus sp. (salinidad-
pH) en los días 4 y 19………………………………………………………………..38
Figura 20. Producción de carbohidratos a diferentes pH y salinidad de
Scenedesmus sp. en los días 4 y 19………………………………………………39
Figura 21. Contenido de lípidos (µg.mL-1) de Scenedesmus sp. a diferentes pH
y salinidad……………………………………………………………………………..40
x
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) control (0 UPS) a pH 11 observada
en el microscopio con el objetivo de 40x……………………………………………55
Anexo 2. Extracto metanol-cloroformo/ lípidos……………………………………55
Anexo 3. Determinación de Lípidos mediante carbonización simple (salinidad-
pH)……………………………………………………………………………………..56
Anexo 4. Curva estándar de proteínas…………………………………………….56
Anexo 5. Células de Scenedesmus sp. adaptada a 26 UPS, observada en
microscopio electrónico con objetivo de 40x……………………………………….57
Anexo 6. Cultivos de Scenedesmus sp. adaptada a diferentes concentraciones
de NaCl (6, 26 y 36 UPS)…………………………………………………………….57
Anexo 7. Cultivos de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) salinidad- pH………..58
Anexo 8. Densidades celulares máximas obtenidas en el estudio previo de
adaptación a diferentes concentraciones de salinidad……………………………58
Anexo 9. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos realizado en el programa
StatGraphics Plus versión 5.1 para el factor pH con un nivel de confianza del
95% para el método de Recuento Celular………………………………………….59
Anexo 10. pH inicial y final de los cultivos pre adaptación a distintas
concentraciones de salinidad……………………………………………………….59
Anexo 11. Contraste Múltiple de Rangos para el método de turbidez a 680 nm
para el factor pH………………………………………………………………………60
Anexo 12. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para el factor salinidad-
Método de Turbidez a 680 nm……………………………………………………….60
xi
Anexo 13. Análisis de Varianza (ANOVA FACTORIAL) para la variable Lípidos
con un nivel de confianza del 95%.....................................................................61
Anexo 14. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para la variable lípidos
según el factor salinidad en el día 4 de cultivo……………………………………..61
Anexo 15. Análisis estadístico de Contraste Múltiple de Rangos para el factor
pH en el cuarto día de cultivo para lípidos………………………………………….62
Anexo 16. Análisis estadístico de Contraste Múltiple de Rangos para el factor
salinidad al final del experimento con un nivel de confianza del 95%................63
Anexo 17. Contraste Múltiple de Rangos para Lípidos según el factor pH hacia
el final del experimento (día 19)……………………………………………………63
Anexo 18. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para proteínas según el
factor salinidad en el cuarto día de cultivo………………………………………….64
Anexo 19. Análisis estadístico para la variable de proteínas de Scenedesmus
sp. en el día 19 de cultivo según salinidad…………………………………………64
Anexo 20. Análisis estadístico de contraste múltiple de rangos realizado en el
programa StatGraphics Plus versión 5.1 para proteínas según pH con un nivel
de confianza del 95% en el cuarto día de cultivo………………………………….65
Anexo 21. Contraste Múltiple de Rangos para proteínas de Scenedesmus sp.
en el día 19 según pH………………………………………………………………..65
Anexo 22. Análisis estadístico de Carbohidratos según salinidad (día
4)……………………………………………………………………………………….66
Anexo 23. Análisis estadístico de Contraste Múltiple de Rangos para
Carbohidratos según salinidad (día 19)…………………………………………….66
Anexo 24. Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según pH (día
4)……………………………………………………………………………………….67
Anexo 25. Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según pH (día
19)……………………………………………………………………………………...67
xii
Anexo 26. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para Pigmentos
Fotosintéticos (Clorofila a) según salinidad (día 4)………………………………68
Anexo 27. Contraste Múltiple de Rangos clorofila a según salinidad (día
19)……………………………………………………………………………………...68
Anexo 28. Análisis estadístico de clorofila a según pH (día 4)………………….69
Anexo 29. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para Pigmentos (clorofila a)
de Scenedesmus sp. según pH (día 19)……………………………………………69
xiii
EFECTO DE LA SALINIDAD Y pH EN LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA
DE LA MICROALGA Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) EN CULTIVOS
DISCONTINUOS
Autor: Diana Yomaira Macías Candelario
Tutor: PhD. Ever Morales Avendaño
RESUMEN
En el presente estudio se evaluó el efecto del pH (5, 6, 9,11) y de la salinidad (6, 12, 26 y 36 UPS) en el crecimiento y la producción de pigmentos, proteínas, carbohidratos y lípidos de la microalga Scenedesmus sp. en el medio de cultivo BG11. Los cultivos discontinuos se mantuvieron por 19 días, con aireación constante, irradiancia de 50.22 μmol m-2s-1, fotoperiodo 12:12 h y a 25±2 ºC. Entre los resultados se determinó que en cultivos no salinos y a pH 9 se presentaron las densidades celulares más elevadas con 9.48±0.32x106 cél.mL-1
con diferencias significativas p<0.05 entre el control (pH 8-10) y el rango de pH estudiados. Mientras, que los de clorofila a y b se produjeron a 0 UPS y pH (8-10) con 5.52±0.09 y 2.03±0.16 µg.mL-1, respectivamente, pero con un descenso con el aumento de NaCl. Así mismo, se demostró que los carotenoides se incrementaron a 12UPS y pH 11 de 0.20±0.004 a 1.45±0.004 µg.mL-1 y el más elevado en lípidos (p<0.05) se evidenció a 6 UPS con 16±32.37 µg.mL-1. Sin embargo, los mayores contenidos de proteínas y carbohidratos se produjeron a 0UPS y pH 11 con 377.37±23.88 y 122.69±1.68 µg.mL-1; respectivamente; demostrándose que el efecto del pH tuvo mayor influencia en la acumulación de proteínas y carbohidratos. Los resultados de la adaptación gradual al NaCl permiten concluir que esta cepa de Scenedesmus sp., aunque es halotolerante presentó un crecimiento óptimo, mayor contenido de clorofila y de carotenoides en condiciones no salinas y en medio alcalino.
Palabras claves: carbohidratos, crecimiento, lípidos, pH, proteínas, salinidad,
Scenedesmus sp.
xiv
EFFECT OF SALINITY AND pH ON THE BIOCHEMICAL COMPOSITION
OF THE MICROALGAE Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) IN BATCH
CULTURES
Author: Diana Yomaira Macías Candelario
Advisor: PhD. Ever Morales Avendaño
ABSTRACT
In the present study, the effect of pH (5, 6, 9, 11) and salinity (6, 12, 26 and 36 UPS) on the growth and production of pigments, proteins, carbohydrates and lipids of the microalgae was evaluated. Scenedesmus sp. in the BG11 culture medium. The discontinuous cultures were maintained for 19 days, with constant aeration, irradiance of 50.22 μmol m-2s-1, photoperiod 12:12 h and at 25 ± 2 ºC. Among the results, it was determined that in non-saline cultures and those at pH 9 presented the highest cell densities having 9.48 ± 0.32x106 cells.mL-1 with significant differences of p <0.05 between the control (pH 8-10) and the pH range studied. Meanwhile, chlorophyll a and b were produced at 0 UPS and pH (8-10) with 5.52 ± 0.09 and 2.03 ± 0.16 μg.mL-1, respectively, but with a decrease with the increase in NaCl. Likewise, it was shown that carotenoids were increased to 12UPS and pH 11 from 0.20 ± 0.004 to 1.45 ± 0.004 μg.mL-1. In contrast, the highest in lipids (p <0.05) was evidenced at 6 UPS with 16 ± 32.37 μg.mL-1. However, the highest protein and carbohydrate contents were produced at 0UPS and pH 11 with 377.37 ± 23.88 and 122.69 ± 1.68 μg.mL-1; respectively; demonstrating that the effect of pH had a greater influence on the accumulation of proteins and carbohydrates. The results of the gradual adaptation to NaCl allow us to conclude that this strain of Scenedesmus sp. although it is halotolerant, showed an optimal growth, a higher content of chlorophyll and of carotenoids in non-saline conditions and in an alkaline medium.
Keywords: carbohydrates, growth, lipids, proteins, pH, salinity, Scenedesmus sp
1
INTRODUCCIÓN
Las microalgas son organismos eucariotas que contienen clorofila a, b, c, d;
carotenoides y otros pigmentos fotosintéticos para realizar la fotosíntesis
oxigénica. Además, son capaces de fijar CO2, liberar O2 y forman parte de los
microrganismos con mayor velocidad de crecimiento (Bermeo, 2011; Gómez,
2007).
La primera microalga aislada y mantenida axénicamente fue Chorella vulgaris
en 1890; sin embargo no fue hasta la década de 1960 cuando Japón y Taiwán
desarrollaron la producción industrial de Chlorella para el uso de alimentos
saludables y suplementos nutricionales (García, Pavía, García, Chirivella y
Serrano, 2017; Borowitzka, 2013). Las microalgas también son utilizadas en
biotecnología ambiental, mediante la biorremediación de efluentes y de suelos
contaminados (Von Albensleben, Magnusson y Heimann, 2015).
Actualmente, las microalgas han adquirido mucho interés en bioeconomía
debido a que producen grandes cantidades de productos básicos y compuestos
de valor agregado como proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos grasos en
cortos períodos de tiempo. Así mismo son utilizadas para la producción de
biocombustibles como el biodiesel, biometano y bioetanol; lo que las hace
considerar como una alternativa viable y fuente prometedora de producción de
energía debido al alto potencial que presentan (Bermeo, 2011;Von Albensleben,
Magnusson y Heimann, 2015).
Por otra parte, dada su versatilidad metabólica, son susceptibles a variar su
composición bioquímica y producción de biomasa al modificar las condiciones
físico-químicas del cultivo como la concentración de nutrientes, temperatura,
irradiancia, pH, salinidad y la edad del cultivo para obtener bioproductos de
interés comercial para la industria farmacéutica y alimenticia (Maldonado,
Morales y Romero, 2014). Entre los géneros de importancia económica se
encuentran Chlorella, Dunaliella, Scenedesmus, Haematococcus, y la
cianobacteria Spirulina; las cuales son fuente de proteínas, pigmentos y
comercializadas para el consumo humano (Hernández y Labbé, 2014).
2
El género Scenedesmus, contiene niveles de proteínas de entre el 25 y 35 %
y de lisina superiores al patrón propuesto por la Food and Agriculture
Organization of the United Nations (FAO) (Quevedo, Morales y Acosta, 2008).
Entre los estudios realizados se han descrito los relacionados con la producción
masiva de biomasa a gran escala utilizada con fines comerciales. De igual
manera, especies de esta microalga han sido sugeridas para su utilización en la
industria nutracéutica por su contenido elevado de ácido eicosanopentaenoico
(EPA), vitaminas y minerales esenciales (Kent, Welladsen, Mangott y Li, 2015).
En cuanto a su aplicación en biorremediación, de aguas residuales y de efluentes
industriales, se han obtenido excelentes resultados en la remoción de materia
orgánica (DBO5), N, P, sólidos totales (Andrade R., Vera B., Cárdenas L. y
Morales A., 2009).
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del pH y la salinidad en la
composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp. con el fin de reportar
el comportamiento de esta cepa frente a diversos factores de estrés teniendo en
cuenta la variación de la producción de pigmentos (clorofila a, b y carotenoides)
y macromoléculas de interés comercial como proteínas, carbohidratos, lípidos y
variabilidad del crecimiento en comparación con las condiciones de cultivo
establecidas para esta microalga.
3
CAPÍTULO I
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las microalgas son organismos fotosintéticos muy estudiados en
biotecnología debido a su capacidad de producir proteínas, ácidos grasos
poliinsaturados, antioxidantes, vitaminas, minerales, clorofila y carotenoides
(Cerón, 2013; Espinoza, 2017). Además, de ser fuente de compuestos utilizados
industrialmente; tales como las ficobiliproteínas, lípidos y polisacáridos (Olarte y
Valencia, 2016). Es por ello que estos microorganismos son empleados para la
obtención de biocombustibles, compuestos de interés en biomedicina,
farmacología y en acuicultura como fuente de alimento para el cultivo de larvas
de peces, crustáceos y moluscos (González, 2015; García, Pavía, García Sanz,
Chirivella y Serrano, 2017).
La investigación con microalgas requiere de medios de cultivo que aporten los
nutrientes necesarios con parámetros físico-químicos controlados para su
crecimiento óptimo; sin embargo una modificación en las condiciones de cultivo
como la variación de la iluminación, la temperatura, el pH y salinidad pueden
modular la producción de pigmentos como los carotenoides; así como la de
obtener una mayor productividad de biomasa y de metabolitos de interés.
Con la presente investigación se quiere determinar ¿cuál es el efecto del pH
y la salinidad en la composición bioquímica de la microalga Scenedesmus sp.?
ya que la producción de pigmentos y de otros bioproductos que son de interés
biotecnológico, varían dependiendo del medio de cultivo utilizado y de la especie.
De esta manera las diferentes concentraciones de salinidad y pH en el medio,
pueden influenciar el metabolismo de la microalga; obteniéndose así una
modulación en el crecimiento y en la productividad de pigmentos, proteínas,
carbohidratos y lípidos.
4
1.2 OBJETIVOS
1.2.1 Objetivo General
• Evaluar el efecto del pH y la salinidad en la composición bioquímica
de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en cultivos discontinuos.
1.2.2 Objetivos específicos
• Cuantificar la producción de proteínas, carbohidratos, lípidos,
clorofilas y carotenoides a diferentes pH y concentraciones de salinidad.
• Determinar y comparar el crecimiento y composición bioquímica de
Scenedesmus sp. a diferentes pH y concentraciones de salinidad.
5
1.3 JUSTIFICACIÓN
Dentro de los estudios de bioprospección de microalgas es importante realizar
investigaciones para determinar la halotolerancia específica de las cepas
microalgales y así identificar especies que tengan amplios rangos de tolerancia
a la salinidad con el objetivo de proporcionar una mejor aplicación en diferentes
sitios de cultivo, ya sea a escala de laboratorio o cultivos a gran escala
(Borowitzka, 2013).
Investigaciones realizadas sobre la respuesta de las especies al estrés
producido por la salinidad han demostrado que este a menudo induce una
disminución de la producción de biomasa por el costo de osmorregulación, sin
embargo, cabe destacar que esta respuesta al estrés puede ser un factor
importante para manipular la composición bioquímica de las microalgas,
generando un aumento en el contenido de ácidos grasos como se evidencia en
las microalgas marinas Isochrysis sp. y Nannochloropsis oculata y en la
microalga dulceacuícola Chlamydomonas mexicana; así mismo se ha
demostrado que Desmodesmus armatus regula la producción de metabolitos de
interés comercial y Scenedesmus sp. ha demostrado tener gran potencial en la
producción de pigmentos y biocombustibles (Von Albensleben, Magnusson,
Heimann, 2015).
Esta investigación dará a conocer el efecto del pH y de la salinidad sobre el
crecimiento y composición bioquímica de Scenedesmus sp., debido a que
algunas especies de microalgas modifican el contenido de los compuestos que
las forman en función de las variaciones producidas en el medio de cultivo o el
ambiente. Por lo que, es necesario determinar la composición bioquímica para
poder inferir en cuanto a la producción de pigmentos, carbohidratos, lípidos y
proteínas. En este estudio se aportará conocimiento sobre el comportamiento de
esta cepa de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) frente a diversos factores de
estrés (valores extremos de pH y salinidad) generando información útil para
estudios posteriores sobre producción de biomasa de microalgas y de
metabolitos de interés comercial; además de compararse la respuesta de la
microalga en condiciones de cultivo con medio no salino y pH (7 y 9) con medios
de cultivo modificados a distintas concentraciones de NaCl y pH entre 5-11.
6
1.4 HIPÓTESIS
Hipótesis alternativa (Ha):
Scenedesmus sp. cultivada a diferentes pH y concentraciones de salinidad
presentará diferencias significativas en el crecimiento y composición bioquímica.
Hipótesis nula (H0):
Scenedesmus sp. cultivada a diferentes pH y concentraciones de salinidad no
presentará diferencias significativas en el crecimiento y composición bioquímica.
7
CAPÍTULO II
2.1 ANTECEDENTES
Kirrolia, Bishnoi y Singh (2011), analizaron el impacto de la salinidad en la
microalga Scenedesmus quadricauda a las concentraciones de 0.2 a 1.0 Mm
(0.012 a 0.06 UPS). Los resultados indicaron que a la concentración de 0.2 Mm
(0.012 UPS) se obtuvo la mayor producción de biomasa, pero con el aumento de
NaCl disminuyó. Así mismo; se encontró que con el incremento inicial de la
salinidad, el contenido de lípidos disminuyó de 6.75 a 6.12%. Al contrario del
control en el que hubo poca diferencia en los valores de acumulación de 6.75 a
6.65 %. De la misma forma; se reportó que el contenido de clorofila disminuye
con el aumento de NaCl en comparación con el control. En cambio, el contenido
de carbohidratos aumentó en todas las concentraciones de NaCl. No obstante,
se encontró que la concentración de proteínas disminuyó en las concentraciones
de 0.2 y 0.4 mM, y aumentó a concentraciones mayores (0.6 mM). Estos
resultados, indicaron que la microalga presentó diversas respuestas al estrés
inducido por la salinidad.
Salama et al. (2013), evaluaron el contenido de biomasa, lípidos y ácidos
grasos bajo estrés salino en Clamydhomonas mexicana y Scenedesmus oblicuo
utilizando como medio de cultivo Bold´s Basal y obteniendo como resultados que
a una concentración de 25 mM (1.5 UPS), el contenido de biomasa seca fue de
0.8 y 0.65 g/L y el de lípidos de 34 y 36% para cada una respectivamente.
Además, reportaron que la tasa de crecimiento para ambas microalgas aumentó
a medida que la concentración de NaCl (0-25 mM) era mayor, llegando a la
conclusión de que la adición de cloruro de sodio al medio de cultivo favorecía el
crecimiento de estas microalgas.
Difusa et al. (2015), estudiaron el efecto del pH (5, 6, 7, 8,9) e intensidad de
luz en el crecimiento de dos especies de Scenedesmus ADIITEC-II y
GUBIOTJT116 y entre los resultados se produjo el mejor crecimiento a pH 7,
alcanzando una densidad celular máxima de 7.77 y 4.05x 106 cél.mL-1 en
ADIITEC-II y GUBIOTJT116 y una producción de biomasa de 0.38 y 0.23 g/L
respectivamente. En dicho estudio también se demostró que las condiciones
8
ácidas (a pH 5 y 6) no favorecieron la densidad celular, ni la producción de
biomasa en ambos cultivos. Sin embargo, a pH 8 y 9 la densidad celular fue
constante obteniendo mayor productividad de biomasa en ADIITEC-II a ambos
pH; mientras que en GUBIOTJT116 el pH 8 y 9 disminuyó las tasas de
crecimiento; así como la producción de biomasa. El rango de pH óptimo para el
crecimiento de las dos especies de Scenedesmus estuvo entre 7 y 9.
Prakash, Gautom y Sharma (2015), evaluaron el efecto del pH, salinidad e
intensidad de luz en el crecimiento y producción de lípidos de Chorella sp.
obteniendo resultados que indicaron que el contenido de lípidos incrementó con
el aumento de la salinidad; mientras que el crecimiento de la microalga fue mayor
con valores de 0,822 y 1,021 g.L− 1 para el control y concentraciones de NaCl
menores a 0.2 M (12 UPS); respectivamente. Además; se reportó que el
contenido máximo de lípidos se obtuvo a 0.5 M (30 UPS) con un 26.84% en
comparación con el control con un 14%. En este trabajo se demostró que la cepa
cultivada a 0.2 M (12 UPS) de NaCl presentó un mejor crecimiento que a 0.5 M
(30 UPS). Con respecto al pH esta cepa de microalga produjo la mayor
acumulación de lípidos a pH 8 con 0.1995 g.L-1.
9
2.2 MARCO TEÓRICO
2.2.1 Generalidades de las microalgas
En ficología las microalgas son organismos eucariotas autótrofos
fotosintéticos que carecen de estructuras multicelulares sin diferenciación de
raíces, hojas y tallo, que poseen una amplia diversidad de tamaño y formas.
Características que no solo se presentan entre individuos de la misma especie
sino también en diferentes etapas de la vida de las mismas, con estructuras
unicelulares, coloniales y filamentosas han sido las responsables de cambiar la
composición de la atmósfera primitiva aumentando los niveles de oxígeno hace
unos 3500 millones de años; además son responsables de gran parte de la
productividad primaria del planeta (Richmond y Hu, 2013; García, 2014).
Se encuentran en una diversidad de hábitats y su distribución está ligada a
factores ambientales que sean convenientes para el desarrollo de cada una de
las especies, su distribución comprende desde lugares con gran cantidad de
nutrientes, suficiente luz para realizar la fotosíntesis, una fuente de carbono y
temperaturas adecuadas como los mares, y cuerpos de agua dulce hasta sitios
con condiciones extremas para la vida como cuerpos de agua hipersalinos
(Zepeda, 2017).
Producen una variedad de compuestos de interés comercial proteínas,
carbohidratos, lípidos, pigmentos como los carotenoides, vitaminas(A, C, B1, B2,
B3(niacina), B6), antioxidantes, compuestos bioactivos, ácidos grasos omega-3
e inmunoestimulantes como el β-glucano, utilizados como aditivos para piensos,
alimentos, para la producción de energía, cosméticos, nutracéuticos y alimentos
funcionales (Priyadarshani & Rath, 2012; Espinoza-Gallardo, Contreras-Porcia &
Ehrenfeld, 2017), de la misma manera géneros de microalgas como Chlorella,
Dunaliella y Haematococcus son utilizadas con fines terapéuticos (Cano Europa
et al., 2012).
10
2.2.2 Género Scenedesmus
En la actualidad Scenedesmus tiene la siguiente clasificación taxonómica.
Imperio: Eukaryota Reino: Plantae Subreino: Viridiplantae Phylum: Chlorophyta Clase: Chlorophyceae Orden: Sphaeropleales Familia: Scenedesmaceae Género: Scenedesmus
Scenedesmus es un género de microalgas de la familia Scenedesmacea que
agrupa cientos de especies de algas de agua dulce. Las células de este género
se agrupan en colonias inmóviles de color verde constituido de células alineadas
en forma de una placa aplanada, se las puede encontrar en sus formas
unicelulares o en cenobios y el número de células por cenobios es en múltiplos
de dos (4, 8,16 o 32) (Pastor y Pozo, 2013; "Scenedesmus .sp", 2019).
La forma de las células puede variar entre cilíndrica, elipsoidales, triangulares,
ovoideas, semilunares, aciculares y fusiformes con paredes lisas o adornadas
con aristas, la pared celular de estas microalgas puede ser corrugadas, lisas o
granuladas o espiculadas y está cubierta con una capa hemicelulósica y
esporopoleninica. Algunas especies de este género son en gran medida
Figura 1. Scenedesmus en su morfotipo cenobial de 8 células. Fuente: Guiry & Guiry, 2018.
11
polimórficas por lo que las condiciones de cultivo pueden inducir variaciones en
las formas de las células. Además, presentan un cloroplasto simple parietal que
en células jóvenes es laminado con un solo pirenoide, y que en las viejas llega a
llenar toda la cavidad (Meyen, 1829; Pastor y Pozo, 2013; "Scenedesmus .sp"
2019).
Scenedesmus son microalgas con cenobios laminares rectos generalmente
curvos, las células de los cenobios se encuentran dispuestas en dos líneas, se
reproducen de forma asexualmente por autoesporas (Toledo-Cervantes,
Garduño Solórzano, Campos, Martínez-García y Morales, 2018).
2.2.3 Composición bioquímica de las microalgas.
Las biomoléculas se clasifican en proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos
nucleicos, la producción bioquímica de las microalgas puede ser modificada a
través de las condiciones de cultivo como la variación de los niveles de
irradiancia, el pH, disposición de los nutrientes, la fotoaclimación u otros factores
ambientales (Toledo-Cervantes, Garduño Solórzano, Campos, Martínez-García
y Morales, 2018).
2.2.3.1 Proteínas
Las proteínas son biomoléculas compuestas por carbono, hidrogeno, oxígeno
y nitrógeno (C, H, O, N) formadas por aminoácidos y unidas por enlaces
peptídicos presentan una estructura química compleja, que tienen propiedades
nutricionales, funcionales y tecnofuncionales forman bases importantes en la
investigación para usos morfológicos, fisiológicos y tecnológicos (Barka y
Blecker, 2016)
La producción de proteína microalgal es diversa, se ha demostrado que los
géneros de microalgas como Chlorella, Scenedesmus y Porphiyridium pueden
producir del 30 al 60% de proteínas en peso seco (Andersen, 2013). La biomasa
microalgal está constituida en gran parte de proteínas que por contener los
12
aminoácidos esenciales son muy utilizadas en acuicultura, y en la alimentación
humana (Murcia & Parra, 2018). Dentro del cultivo de microalgas las células en
crecimiento que frecuentemente son ricas en proteínas son las que se
encuentran en la fase logarítmica o exponencial del crecimiento celular; además
se ha demostrado que la producción de proteínas está influenciada por la
disposición de macronutrientes en el medio de cultivo, y de factores físicos como
las temperatura y la intensidad de luz, sin embargo; se ha reportado que la
limitación de nitrógeno es uno de los factores limitantes en la acumulación de
proteínas de las microalgas debido a que muchos organismos buscan la
presencia del nitrógeno en el medio ambiente o de cultivo; por lo tanto son
utilizadas como fuente en la producción de biofertilizantes y de nutracéuticos
para animales y humanos (Murcia y Parra, 2018; Andersen, 2013).
2.2.3.2 Carbohidratos
Los hidratos de carbono están formados de carbono, hidrógeno y oxígeno (C,
H, O). Las microalgas acumulan gran cantidad de carbohidratos a través del
metabolismo realizado en la fijación del carbono y la fotosíntesis, estas
biomoléculas orgánicas se depositan en las células, generalmente en los plastos
en forma de almidón u otro producto similar como material de reserva de energía;
aunque pueden llegar a formar parte importante de la pared celular (Yen Chen
et al., 2013; Cheng et al., 2017; Andersen, 2013). Algunos de los principales
hidratos de carbono que se acumulan en la biomasa de las microalgas son la
celulosa, almidón sin residuos de lignina y bajos contenido de hemicelulosa (Yen
Chen et al., 2013; Visca et al., 2017), aunque esta composición puede variar con
las condiciones de cultivo, el tiempo de cultivo o de una especie a otra (Cheng
et al., 2017; Yen Chen et al., 2013).
El contenido de carbohidratos presentes en las microalgas es de
aproximadamente el 20 % de su peso seco, del cual el 10 % está representado
por el almidón (Cheng et al., 2017); de esta forma se ha demostrado que los
géneros como Chlorella, Dunaliella, Chlamydomonas, Scenedesmus y la
13
cianobacteria Spirulina contienen más del 50% de su peso seco en carbohidratos
en forma de almidón y glucógeno (John, Anisha, Nampoothiri y Pandey, 2011).
Actualmente la biomasa de microalgas enriquecida con carbohidratos es
utilizada para la producción de biocombustibles como el bioetanol, además es
empleada en la industria textil, cosmética, farmacéutica y como alimento
(Markou, Angelidaki, Nerantzis y Georgakakis, 2013). Sin embargo es
mayormente utilizada en la bioproducción de etanol a partir de la fermentación
con levaduras etanologénicas que pueden fermentar azúcares simples como la
fructosa y la glucosa; puesto que algunas microalgas poseen un elevado
contenido de carbohidratos en sus paredes celulares que son utilizadas como
fuente de carbono para el proceso de fermentación (Markou, Angelidaki,
Nerantzis y Georgakakis, 2013; Yen Chen et al., 2013). Además se ha reportado
que a una alta intensidad de luz o escasez de nutrientes las especies
microalgales pueden llegar a acumular hasta un 65% de hidratos de carbono en
repuesta al estrés inducido en el metabolismo de las células (Markou, Angelidaki,
Nerantzis y Georgakakis, 2013).
2.2.3.3 Lípidos
Los lípidos son biomoléculas orgánicas que no se disuelven en agua sino en
solventes orgánicos no polares, se pueden clasificar según su composición
química en: triglicéridos, ácidos grasos, fosfolípidos, glucolípidos y colesterol
(Gallardo, 2019). La fracción de lípidos que contienen las microalgas es del 10
al 30 % (Khatoon, Rahman, Suleiman, Banerjee y Abol-Munafi, 2017).
En condiciones óptimas de crecimiento las microalgas pueden llegar a
acumular del 5 al 20% de lípidos en peso seco, siendo principalmente
glicerolípidos que son lípidos de membranas (Solovchenko, 2012), esto ocurre
en el día cuando las células son más activas y experimentan un mayor velocidad
de crecimiento y tiempo de duplicación, mientras que se ha reportado que por
las noche las células pueden llegar a presentar una disminución del contenido
de lípidos de hasta el 30% (Khatoon, Rahman, Suleiman, Banerjee y Abol-
Munafi, 2017). Además la composición química de estas biomoléculas se puede
14
manipular con las condiciones de cultivo aplicando factores estresantes como el
pH, la salinidad y la disposición de nutrientes (Andersen, 2013).
Las condiciones de estrés, como la salinidad inducen el metabolismo de las
microalgas estimulando a la célula a elevar el contenido de lípidos modificando
su composición química a fosfolípidos, esteroles y ácidos grasos insaturados
como respuesta a la presión osmótica (Salama et al. 2013; Castillo, 2013)
además el pH también incita cambios en el metabolismo de producción de lípidos
de las microalgas; es decir a pH alcalinos se produce acumulación de
triacilglicéridos (TAG) (Solovchenko, 2012), sin embargo la iluminancia continua
también es un factor físico asociado a la acumulación de lípidos con aumento en
la producción de ácidos grasos (Khatoon, Rahman, Suleiman, Banerjee y Abol-
Munafi, 2017).
Actualmente se ha puesto interés en el cultivo de microalgas con énfasis en
la producción de lípidos; puesto que estas macromoléculas son utilizadas en la
producción de biocombustibles como componentes principales en la industria
química, en la producción de aceites para alimentos y para la salud (Visca et al.,
2017); de este modo se ha comprobado que algunas microalgas acumulan
ácidos grasos poliinsaturados como el ácido eicosapentanoico, ácido α
linolénico, y ácido linoleico además de ácido araquidónico (Solovchenko, 2012),
por lo tanto especies como Isochrysis galbana, Schizochytrium sp. y
Phaeodactylum tricornutum producen ácido docosahaexanoico (DHA) y ácido
eicosapentanoico (Martínez y Ramírez, 2018).
2.2.4 Aplicaciones biotecnológicas de las microalgas
El cultivo de microalgas ha generado interés a nivel biotecnológico debido a
que estos organismos tienen la capacidad de acumular metabolitos de interés
como proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos grasos, pigmentos carotenoides
como el beta caroteno y la astaxantina, vitaminas, minerales y glicerol; además
son utilizadas en la industria cosmetológica, la acuicultura, en la industria
farmacéutica y en la biorremediación de aguas residuales y de suelos (Cerón,
2013; Martínez y Ramírez, 2018); también en la producción de biofertilizantes,
15
biocombustibles como el bioetanol, bioetano y biodiesel, (Castillo, 2013),
además la biomasa microalgal enriquecida es utilizada para la obtención de
bioproductos de alto valor agregado útiles en la nutrición y salud humana
(García, Pavía, García Sanz, Chirivella y Serrano, 2017).
Algunas especies de microalgas como Dunaliella salina y Hematococcus
pluvialis son muy cultivadas debido a que producen pigmentos de valor comercial
como el betacaroteno y la astaxantina respectivamente; mientras que la biomasa
de los géneros Scenedesmus, Chlorella y la cianobacteria Spirulina presentan
beneficios para la salud de los animales (Hernández y Labbé, 2014; Guerrero et
al., 1999)
16
CAPÍTULO III
3.1 METODOLOGÍA
3.1.1 Obtención de la cepa
Se utilizó la cepa Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) perteneciente al banco
de cepas de microalgas del área de Bioprospección de Microalgas y
cianobacterias del Laboratorio de Biotecnología de la Universidad de Guayaquil.
La misma se mantiene conservada en placas de Petri con agar en el medio de
cultivo BG11 en condiciones controladas de laboratorio.
3.1.1.1 Escalamiento del cultivo madre
En una cámara de flujo laminar previamente esterilizada con alcohol al 70% y
luz ultravioleta se inocularon colonias viables de Scenedesmus sp. conservadas
en placas con agar en el medio BG11.
Los cultivos se mantuvieron en tubos de ensayo por 7 días con un volumen
final de 4mL, luego de esto se sembraron en matraces para escalar a volúmenes
mayores de 250 y 1000 mL de cultivo. El cultivo madre se mantuvo en su fase
de crecimiento exponencial alimentando al cultivo cada cierto periodo de tiempo.
Los cultivos fueron mantenidos con aireación constante, fotoperiodo 12:12 horas
(luz-oscuridad), temperatura de 25±2 ºC y una intensidad lumínica unilateral de
50.22 μmol m-2s-1.
Figura 2. Escalamiento de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en medio de cultivo
BG11.
17
3.1.2 Diseño experimental
Se realizó un diseño factorial teniendo como factores de estudio diferentes pH
y concentraciones de sal (NaCl).
Los tratamientos se realizaron por triplicado con un total de 36 unidades
experimentales.
Tabla 1. Diseño experimental (factores de estudio y variables de respuesta).
SALINIDAD (UPS)
pH
RÉPLICAS
VARIABLES DE RESPUESTA
0
CONTROL 3
DENSIDAD CELULAR
TURBIDEZ
PIGMENTOS
PROTEÍNAS
CARBOHIDRATOS
LÍPIDOS
5 3
6 3
9 3
11 3
6
CONTROL 3
5 3
6 3
9 3
11 3
12
CONTROL 3
5 3
6 3
9 3
11 3
3.2.1 Condiciones generales de cultivo
Las unidades experimentales constaron de botellas de vidrio con capacidad
de 500 mL, en las cuales se trabajó por triplicado con un inóculo inicial de 5x105
cél.mL-1 y un volumen final de 250 mL. Todos los cultivos fueron mantenidos
durante 19 días en aireación constante, con un fotoperiodo 12:12 horas (luz-
oscuridad), una irradiancia de 50.22 μmol m-2s-1 generada por lámparas
fluorescentes de luz fría y a una temperatura de 25±2 ºC.
18
3.2.2 Medio de cultivo
Como medio control se utilizó el medio de cultivo BG11 sin modificar.
Para la obtención de medios de cultivo salinos estos se prepararon utilizando
agua destilada previamente esterilizada agregándole soluciones stock de
macronutrientes y micronutrientes del medio de cultivo BG11; además, de la
adición de solución de NaCl hasta llegar a las concentraciones de salinidad 6
UPS y 12 UPS.
El pH se ajustó diariamente dos veces al día (mañana y tarde) a 5, 6, 9,11 con
hidróxido de sodio (NaOH) y ácido clorhídrico (HCl) 1 Molar.
3.2.2.2 Composición del medio de cultivo BG11.
NaNO3 75.0 g, K2HPO4 2.0 g, MgSO4.7H2O 3.75 g, CaCl2.2H2O 1.80 g, ácido
cítrico 0.30 g, Citrato férrico de amonio 0.30 g, EDTANa2 0.05 g, Na2CO3
Metales trazas:
H3BO3 2.86 g, MnCl2.4H2O 1.81 g, ZnSO4.7H2O 0.22 g, Na2MoO4.2H2O 0.39g,
CuSO4.5H2O 0.08 g, Co(NO3)2.6H2O 0.05 g.
Figura 3. Cultivos de Scenedesmus sp.
19
3.3.1 PREADAPTACIÓN A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
SALINIDAD.
Para obtener cultivos adaptados a varias concentraciones de sal se realizaron
ensayos previos a una densidad inicial de 5x105 cél.mL-1. La salinidad de los
cultivos se ajustó con un refractómetro añadiendo gradualmente cloruro de
sodio, hasta alcanzar salinidades de 6 UPS, 12 UPS, 26 y 36 UPS, de las cuales
se escogió las que mejor crecimiento presentaron (6 UPS y 12 UPS) para cultivar
a distintos pH.
Tabla 2. Plan de adaptación a distintas concentraciones de salinidad (UPS).
DÍAS
UPS
0 6 12 26 36
0 0 0 0 0 0
1 0 2 2 6 6
2 0 2 2 6 6
3 0 4 6 10 10
4 0 4 6 10 10
5 0 6 8 12 18
6 0 6 8 12 18
7 0 6 12 16 30
8 0 6 12 16 30
9 0 6 12 22 36
10 0 6 12 22 36
11 0 6 12 26 36
12 0 6 12 26 36
3.4.1 PARÁMETROS DE CRECIMIENTO
3.4.1.1 Densidad celular
Se tomaron alícuotas diarias de 1mL de cultivo en microtubos Eppendorf de
capacidad de 2 mL, con los cuales se realizaron recuentos celulares diarios en
cámara de Neubauer de 0.1 mm de altura y 1 mm2 de área. Para el llenado de
la cámara por capilaridad se colocó 20 uL de la muestra con una micropipeta
20
cerca del borde del cubreobjetos; luego de esto se procedió a contar las células
según sus morfotipos cenobiales y unicelulares en un microscopio óptico con el
objetivo de 40x.
El cálculo de la densidad celular se realizó mediante la siguiente fórmula:
N cél/mL = (N células contadas/N de cuadros contados) x 104
3.4.1.2 Método de turbidez
El crecimiento celular por turbidez se determinó con espectrofotometría a una
longitud de onda 680 nm en un espectrofotómetro Multiskan Go 1.00.40. Thermo
Scientific. Para esto se tomaron alícuotas diarias de 1 mL de cultivo de todos los
tratamientos en microtubos Eppendorf homogenizando la muestra con vórtex,
para luego distribuir 200 µL en los pocillos de la placa Thermo Nunc F- bottom
well y realizar la respectiva lectura.
Para la estimación de las fases de crecimiento se utilizó las fórmulas
propuestas por Becker (1994).
µ =𝐿𝑁 (𝑋1)−𝐿𝑁(𝑋0)
𝑡1 −𝑡0 𝑡𝑑 =
𝐿𝑁 (2)
µ
Donde:
μ= Velocidad de crecimiento (número de divisiones por día)
td= Tiempo de duplicación
X0= Número de células inicial
X1= Número de células final
T0= tiempo inicial
T1= Tiempo final
LN= Logaritmo natural
21
3.5.1 EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS
La cuantificación de pigmentos fotosintéticos se realizó tomando alícuotas de
2 mL de cultivo por triplicado en tubos Eppendorf de 2 mL de capacidad, se
realizó el lavado de las muestras con agua destilada para desalinizar a las
muestras y se centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos descartando el
sobrenadante.
Las muestras luego se liofilizaron a una temperatura de -56°C y 0,180 mbar
durante 24 horas. Una vez liofilizadas se procedió a la extracción de pigmentos
liposolubles con Metanol puro según el método descrito por Arredondo, Voltolina
y Cordero (2017). El contenido de clorofilas y carotenoides se determinó en un
espectrofotómetro Multiskan Go 1.00.40. Thermo Scientific con las siguientes
longitudes de onda: 666 nm y 653 nm para clorofila a y b respectivamente y 470
nm para carotenoides. Además; la concentración celular de clorofilas y
carotenoides totales se calculó mediante las fórmulas propuestas por Wellburn
(1994).
Los resultados fueron expresados en µg/mL de cultivo.
Ca= 15.65A666 nm -7.34A653 nm
Cb= 27.05A653 nm – 11.21A666 nm
Cx+c= (1000A470 nm – 2.86Ca -129.2Cb)/221
22
3.6.1 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS
ORGÁNICAS.
3.6.1.1 Determinación de proteínas
La determinación de proteínas de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) se
realizó extrayendo alícuotas de 2 mL de cultivo en el inicio de la fase estacionaria
del crecimiento microalgal en microtubos Eppendorf. Las muestras fueron
lavadas con agua destilada y centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos.
Posteriormente, a la biomasa húmeda obtenida se le adicionó 2 mL hidróxido de
sodio (NaOH) 1 Molar y se calentó en baño maría a 100 grados por 1 hora.
El contenido de proteínas se cuantificó en un espectrofotómetro a una
absorbancia de 750 nm como indica el método de Lowry et al. (1951) modificado
por Morales (2012). Previamente se realizó la curva estándar de calibración
preparada con 300 µg.mL-1 de BSA (Bovine Serum Albumins) a un rango de
concentración entre 15-150 µg.mL-1.
3.6.1.2 Determinación de carbohidratos
El contenido de carbohidratos totales se llevó a cabo tomando muestras de 2
mL del cultivo en tubos de ensayo de 15 mL de capacidad previamente lavados
con ácido clorhídrico al 10 % (HCl) enjuagados con agua destilada y secados
en estufa. Todas las muestras fueron lavadas y centrifugadas a 4000 rpm por 10
minutos. La extracción de carbohidratos se realizó añadiéndole 4mL hidróxido
de sodio 1 M (NaOH) a la biomasa húmeda y calentando en termo-baño por 30
minutos y su concentración se determinó en un espectrofotómetro a una longitud
de onda de 484 nm mediante el método de fenol-ácido sulfúrico propuesto por
Dubois et al (1956) y modificado por Morales (2012), utilizando una curva de
calibración elaborada con glucosa anhidra con un rango de concentración de 12
a 120 µg.mL-1.
23
3.6.1.3 Determinación de lípidos
El contenido de lípidos totales se efectuó tomando muestras de 2 mL de todas
la unidades experimentales en tubos de ensayo de 15 mL previamente lavados
con HCl al 10 % enjuagados con abundante agua destilada y secados en estufa.
Las muestras fueron lavadas con agua destilada para eliminar restos de sal y así
evitar interferencias y centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos. Luego, la
extracción se realizó agregando metanol-cloroformo en proporción 3:1.5 a la
biomasa liofilizada como indica el método de calcinación propuesto por Marsh y
Weinstein (1966) y modificado por Morales (2012).
Para la curva de calibración se utilizó como estándar, una disolución de
Tripalmitina en 10 mL de cloroformo (Morales, 2012) y para la cuantificación se
utilizó un espectrofotómetro Multiskan Go 1.00.40. Thermo Scientific a una
longitud de onda de 375 nm.
Los resultados de los análisis de proteínas, carbohidratos y lípidos fueron
expresados en µg /mL de cultivo.
3.7.1 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para realizar el análisis estadístico de las diferentes tratamientos se utilizó el
programa StatGraphics Plus versión 5.1 (2000), con el cual se procedió a realizar
un análisis de varianza (ANOVA FACTORIAL) a todos los tratamientos con un
nivel de significancia p ≤ 0.05, utilizando como factores el pH y la salinidad y
como variables dependientes el recuento celular, turbidez, pigmentos, lípidos,
carbohidratos y proteínas.
Además se aplicó un análisis de Contraste Múltiple de Rangos para
determinar cuáles de las medias presentaron diferencias estadísticamente
significativas entre tratamientos.
Para determinar que variable tuvo mayor influencia entre los factores
analizados se realizó un análisis de Contraste Múltiple de Rangos con el que se
determinó si las variables estudiadas en los distintos tratamientos tuvieron o no
diferencias estadísticamente significativas con un nivel de confianza del 95 %.
24
CAPÍTULO IV
4.1 RESULTADOS
4.1.1 Crecimiento de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009).
4.1.1.1 Crecimiento mediante recuento celular pre-adaptación a
diferentes concentraciones de NaCl (6, 26,36 UPS).
El crecimiento de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) determinado por el
método de recuento celular demostró el comportamiento de la cepa frente al
estrés inducido por la adaptación gradual al NaCl.
Los ensayos tuvieron una duración de 16 días, para el día 7 se logró adaptar
la cepa a 6 UPS; mientras que para los días 10 y 12 se logró crecimiento a 36 y
26 UPS, respectivamente.
La mayor densidad celular se registró en el control (0 UPS) con 7.13±0.53x106
cél.mL-1 en el día 16 de cultivo, seguido de la concentración de 6 UPS con
4.70±0.32 x106 cél.mL-1 en el día 9. A 26 UPS el mayor crecimiento se obtuvo en
el día 7 con 3.22±0.46x106 cél.mL-1; mientras que a 36 UPS se observó una
reducción de la densidad celular con un máximo de 1.78±0.35x106 cél.mL-1 en el
día 5 de cultivo. Se mostró diferencias significativas (p<0.05) entre los distintos
tratamientos (Figura 4). Estos resultados indican que a pesar de que el
crecimiento de la microalga es inhibido con la concentración del NaCl, se observó
una tendencia a una adaptación a medida que gradualmente se le incrementaba
la salinidad.
25
Figura 4. Efecto de la adaptación a diferentes concentraciones de salinidad sobre el
crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009).
4.1.1.2 Crecimiento mediante el método de turbidez pre adaptación a
distintas concentraciones de NaCl.
El mejor crecimiento medido a DO 680 nm se registró en los cultivos no salinos
(0 UPS) con 1.12±0.05, seguido de 6 UPS con 0.913±0.04, la densidad máxima
registrada en los cultivos que se les indujo adaptación gradual hasta 26 UPS fue
de 0.683±0.06 y la menor densidad celular se obtuvo a 36 UPS con un máximo
de 0.619±0.004 (Figura 5).
Figura 5. Efecto de la adaptación gradual al NaCl sobre el crecimiento de Scenedesmus sp.
(UGB-RJ-3009) mediante turbidez (absorbancia a 680 nm).
26
4.1.2 Efecto del pH y salinidad sobre el crecimiento.
Las curvas de crecimiento determinadas mediante recuento celular nos
permiten observar el comportamiento que presenta Scenedesmus sp. al estrés
inducido por el pH y la salinidad. Los cultivos se iniciaron con una densidad
celular 5x105 cél.mL-1, tanto para el control a distintas concentraciones de sal
(NaCl), como para los distintos pH.
Los cultivos adaptados a diferentes concentraciones de salinidad (6 y 12 UPS)
se mantuvieron por un periodo de 19 días, hasta su posterior cosechado. La
mayor densidad celular se registró en el control (0 UPS) con 9.7±0.14x106
cél.mL-1, seguido del cultivo adaptado a 6 UPS con 9.43±0.22x106 cél.mL-1 y con
el menor valor de 4.5±0.21x106 cél.mL-1 a 12 UPS (Figura 6). El análisis
estadístico Anova factorial y contraste múltiple de rangos mostró diferencias
estadísticamente significativas (p<0.05) entre las distintas concentraciones de
NaCl separándoles en tres grupos diferentes con un nivel de confianza del 95%.
Figura 6. Curvas de crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp. adaptada a distintas
concentraciones de NaCl (UPS).
27
4.1.2.1 Crecimiento a diferentes pH a 0 UPS.
Los ensayos tuvieron una duración de 4, 12, 19 y de 19 días a pH 5, 6, 9 y
11; respectivamente. La máxima densidad celular se presentó en los cultivos
ajustados a pH 9 con 9.48±0.32x106 cél.mL-1, seguido del pH 11 (7±0.09 x106
cél.mL-1), observándose el menor crecimiento celular a pH 5 con (1.6±0.44x106
cél.mL-1) (Figura 7). Se encontraron diferencias estadísticamente significativas
(p<0.05) entre el control (8-10) y el rango de pH estudiados (5-11). Sin embargo,
cabe destacar que entre los pH 6 y 11 no hubo diferencias significativas.
Figura 7. Efecto del pH sobre el crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp. a 0 UPS.
28
Figura 8. Densidades celulares (x106 cél.mL-1) máximas alcanzadas de Scenedesmus sp. en
los días seleccionados a 0 UPS.
4.1.2.2 Crecimiento a diferentes pH a 6 UPS
La máxima densidad celular se registró a pH 9 (6.71±0.38x106 cél.mL-1),
seguido del cultivo a pH 6 con 5.88± 0.25x106 cél.mL-1; mientras que a pH 11 el
valor máximo de crecimiento fue de 3.29±0.51x106 cél.mL-1; reduciéndose la
densidad celular a pH 5 con 0.92±0.35x106 cél.mL-1 (Figura 9). Se resalta que
entre los distintos tratamientos hubo diferencias significativas (p<0.05).
29
Figura 10. Densidades celulares (x106 cél.mL-1) máximas de Scenedesmus sp. a 6 UPS de
NaCl.
Figura 9. Efecto del pH sobre el crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp. a 6
UPS de NaCl.
30
4.1.2.3 Crecimiento a distintos pH a 12 UPS
El estudio del pH determinó que el crecimiento de Scenedesmus sp. es
favorable entre 7 (control) y 11. En cambio, se demostró una reducción de la
densidad celular a pH desde 6 hasta 5, causando una inhibición y efecto letal a
los cultivos de la microalga a partir del día 11 y día 4; respectivamente.
Al final del experimento al día 19, la densidad celular del control (pH 7) se
mantuvo superior respecto a todos los pH analizados, alcanzando 4.5±0.21x106
cél.mL-1 con diferencia significativa (p>0.05). En cambio a pH 9 y 11, reportaron
valores de 2.48±0.23x106 cél.mL-1 y de 1.98±0.03x106 cél.mL-1, respectivamente.
Estos resultados reflejan que el pH 7 optimiza el crecimiento de Scenesdesmus
sp. a las condiciones de cultivos expuestas. No obstante, en condiciones
ligeramente ácidas a pH 6 se observó cierta tolerancia hasta el día 12 con una
densidad celular reducida hasta de 1.78±0.05 x106 cél.mL-1; la misma que es
más reducida a pH 5 con 0.6±0.08 x106 cél.mL-1 (Figura 11); mientras que a partir
del día 12, este pH causó mortalidad en los cultivos. No se encontró diferencias
estadísticamente significativas entre los pH 6 y 11 con un nivel de confianza del
95 %.
Figura 11. Efecto del pH sobre el crecimiento (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp. a 12 UPS
de NaCl.
31
Figura 12. Densidades máximas (x106 cél.mL-1) de Scenedesmus sp. alcanzadas en los días
seleccionados.
4.1.3 Turbidez
El mayor valor de absorbancia a 680 nm se obtuvo a 0 UPS con 1.44±0.13,
seguido del pH 11 con 1.39±0.09; sin embargo, el menor valor se registró a pH
5 y a 6UPS con 0.090±0.009 (Figura 13). El análisis estadístico presentó
diferencias significativas (p<0.05) entre los distintos tratamientos estudiados
tanto para el factor salinidad como para el pH.
Figura 13. Efecto del pH sobre el crecimiento (680 nm) de Scenedesmus sp. 0 UPS.
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
6,000
Día 4 Día 12 Día 19
x10
6C
él.m
L-1
Tratamientos
Recuento celular -12 UPS
pH 5
pH 6
Control (pH 7)
pH 9
pH 11
32
Por otra parte, en los tratamientos a 6 UPS fue el control quien obtuvo
superioridad (p>0.05) en los valores de absorbancia registrados con 1.13±0.05,
seguido del pH 9 que presentó 1.02±0.03 (Figura 14), mostrando diferencias
estadísticamente significativas (p>0.05) en todos los tratamientos.
Figura 14. Efecto del pH sobre el crecimiento (680 nm) de Scenedesmus sp. a 6 UPS.
De la misma manera en los ensayos a 12 UPS se presentó la misma tendencia
en que el control obtuvo los mayores valores de absorbancia (0.42±0.04),
seguido del pH 9 con (0.36±0.02) (Figura 15). No se presentó diferencias entre
el control (pH 7) y pH 9.
Figura 15. Efecto del pH sobre el crecimiento (680 nm) de Scenedesmus sp. a 12 UPS.
33
Tabla 3. Valores máximos de crecimiento obtenidos por los métodos de Recuento celular y
Turbidez en Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) frente al estrés inducido por la salinidad y pH.
Tratamientos Crecimiento
Salinidad
(UPS)
pH
Recuento Celular (x106 cél.mL-1)
Turbidez (DO 680 nm)
0
Control (8-10) 5 6 9
11
9.7±0.14 a
1.6±0.44 b 4.43±0.13 c 9.48±0.32 d 7±0.09 c
1.44±0.13 a
0.19±0.013 b 0.58±0.12 c 1.20±0.034 a 1.39±0.093 d
6
Control (8) 5 6 9
11
9.43±0.22 a
0.92±0.35 b 5.88±0.25 c 6.71±0.38 d 3.29±0.51 c
1.13±0.05 a
0.19±0.04 b 1.02±0.03 c 0.75±0.07 a 0.57±0.12 d
12
Control (7) 5 6 9
11
4.5±0.21 a
0.6±0.08 b 1.78±0.05 c 2.48±0.23 d 1.98±0.03 c
0.42±0.04 a
0.090±0.009 b 0.29±0.45 c 0.36±0.02 a 0.26±0.38 d
4.2.1 Pigmentos Fotosintéticos
4.2.1.1 Clorofila a
Las concentraciones de clorofila a en los diferentes tratamientos fueron
analizadas en los días 4 y 19 de cultivo. Los valores de concentración máxima
se alcanzaron en el control a 0 UPS de salinidad con 1.06±0.03 µg.mL-1 para el
día 4, aumentando en 5.2 veces hacia el día 19 con 5.52±0.09 µg.mL-1 (Figura
16).
El análisis de contraste múltiple de rangos presentó diferencias
estadísticamente significativas para el factor salinidad en las distintas
concentraciones (6 y 12 UPS), así mismo; para el factor pH se encontraron
diferencias significativas p<0.05 entre las variables de pH 5,9 y control (7-10),
sin embargo para los tratamientos de pH 6 y 11 no se encontró diferencias con
*Letras minúsculas en sentido vertical indican diferencias significativas con un nivel de
significancia p<0.05.
34
un nivel de confianza del 95% para el día 4; mientras que hacia el día 19 se
mostraron diferencias para los dos factores de estudio en sus distintas variables.
Figura 16. Efecto del pH a diferentes concentraciones de NaCl sobre el contenido de clorofila
a (µg.mL-1) en Scenedesmus sp.
4.2.1.2 Clorofila b
Los máximos valores se presentaron en los controles a 12 y 0 UPS,
mostrándose en el día 4 una concentración de 0.69±0.12 y 0.48±0.006 µg.mL-1
con un aumento del contenido de clorofila b para el día 19 con 1.43±0.16 y
2.03±0.16 µg.mL-1, respectivamente (Figura 17). Se registraron diferencias entre
las distintas concentraciones de salinidad. En cuanto a pH no hubo diferencias
significativas entre las variables 9, 6, 11; sin embargo, entre los tratamientos
control (pH 7-10) y pH 5) se demostraron diferencias significativas en
comparación con los otros tratamientos en el día 4. Cabe destacar que hacia el
día 19 el factor pH mostró diferencias (p<0.05) entre las variables 9,11 y control,
pero la salinidad no mostró diferencias (p<0.05) entre el control (0 UPS) y la
concentración de 6 UPS.
35
Figura 17. Efecto del pH a diferentes concentraciones de NaCl sobre contenido de clorofila b (µg.mL-1)
en Scenedesmus sp.
4.2.1.3 Carotenos totales
El mayor contenido de carotenoides se obtuvo a 12 UPS y 0 UPS en los
cultivos ajustados a pH 11. En estos se produjo un incremento con la edad del
cultivo, es decir, del día 4 al 19 aumentó de 0.20±0.004 a 1.45±0.004 µg.mL-1,
respectivamente. La menor producción se presentó a pH 5 en todos los
tratamientos, alcanzando el máximo valor de 0.086±0.01 µg.mL-1 a la
concentración de 6 UPS (Figura 18). Además, no se mostraron diferencias
estadísticamente significativas (p<0.05) entre las distintas salinidades. En cuanto
al pH, se encontraron diferencias entre los cultivos ajustados a 5 y 11. En
cambio, entre el control, pH 6 y 9 no varió el contenido de carotenoides, se
presentaron diferencias significativas para el día 4 de cultivo. De la misma
manera para el día 19 se encontró diferencias entre el control (0 UPS) y 6 UPS
de salinidad; mientras que para los tratamientos a distintos pH no se encontró
diferencias significativas.
36
Figura 18. Efecto del pH y a diferentes concentraciones de NaCl (UPS) sobre el contenido
de carotenos totales (µg.mL-1) en Scenedesmus sp.
El contenido de clorofila total fue superior (p<0.05) en el control (pH 8-10) a
0 UPS con 7.55±0.25 µg.mL-1 en el día 19 de cultivo, seguido del pH 9 a salinidad
de 6 UPS con 6.56±0.44 µg.mL-1; mientras que la menor concentración se obtuvo
a 12 UPS de salinidad con 1.85±0.31 µg.mL-1 (Tabla 4).
Tabla 4. Contenido de clorofila total en la microalga Scenedesmus sp. frente al estrés inducido
por los diferentes pH y concentraciones de salinidad.
TRATAMIENTOS Concentración (µg.mL-1)
Salinidad (UPS) pH Clorofila total
Día 4 Día 19
0
Control (8-10) 5 6 9 11
1.23±0.034 0.44±0.030 0.81±0.081 1.07±0.093 1.24±0.005
7.55±0.25
6.16±0.77 4.92±0.27
6
Control (8) 5 6 9 11
0.89±0.039 0.44±0.04 1.22±0.07 0.62±0.13 0.73±0.18
6.52±0.73
6.56±0.44 3.36±0.27
12
Control (7) 5 6 9 11
0.95±0.16 0.34±0.006 0.85±0.27 0.82±0.06 1.20±0.18
4.23±0.43
2.79±015 1.85±0.31
37
Tabla 5. Contenido (µg.mL-1) de pigmentos liposolubles totales en Scenedesmus sp. frente a
diferentes pH y concentraciones de salinidad.
Tratamientos Concentración (µg.mL-1)
Salinidad
(UPS)
pH
Día 4
Día 19
Clorofila a Clorofila b Carotenos Clorofila a Clorofila b Carotenos
0
Control (8-10)
5 6 9 11
1.06±0.03 acd 0.37±0.02 b 0.69±0.04 ca 0.88±0.08 dce 1.04±0.0006 ed
0.48±0.00 6 a 0.21±0.07 b 0.26±0.05 ca 0.24±0.04 dce 0.35±0.03 e
0.17±0.001 abc 0.07±0.009 b 0.12±0.03 cd 0.18±0.01 dce 0.20±0.004 ed
5.52±0.09 a 4.66±0.69 d 3.84±0.25 e
2.03±0.16 a 1.50±0.08 d 1.07±0.01 e
1.21±0.10 ade 1.21±0.32 dae 1.45±0.004 ead
6
Control (8) 5 6 9 11
0.73±0.03 acd 0.35±0.02 b 1.04±0.02 ca 0.51±0.09 dce 0.58±0.02 ed
0.35±0.08 a 0.11±0.03 b 0.41±0.07 ca 0.26±0.008 dce 0.20±0.04 e
0.16±0.004 abc 0.086±0.01 b 0.18±0.05 cd 0.11±0.04 dce 0.15±0.02 ed
4.56±0.58 a 4.62±0.32 d 2.39±0.20 e
1.95±0.15 a 1.94±0.11 d 0.96±0.06 e
1.43±0.16 ade 0.89±0.07 ade 0.61±0.07 ade
12
Control (7) 5 6 9 11
0.90±0.13 acd 0.29±0.003 b 0.77±0.25 ca 067±0.03 dce 0.94±0.12 ed
0.69±0.12 a 0.14±0.001 b 0.51±0.21 ca 0.31±0.08 dce 0.38±0.01 e
0.051±0.02 abc 0.04±0.003 b 0.07±0.02 cd 0.15±0.03 dce 0.26±0.16 ed
2.79±0.28 a 1.90±0.08 d 1.24±0.23 e
1.43±0.16 a 0.89±0.07 d 0.61±0.07 e
0.46±0.04 ade 0.46±0.02 ade 0.33±0.019 ade
4.3.1 Producción de Proteínas
Los análisis de producción de proteínas se realizaron en dos días
representativos (4 y 19). Los cultivos a 0 UPS y pH 9 presentaron
concentraciones superiores con 129.73±18.92 µg.mL-1 hacia el día 4; sin
embargo, se evidenció un cambio hacia el día 19 donde el pH 11 mostró el mayor
valor con 377.37±23.88 µg.mL-1, seguido del pH 9 con 334.89±36.47 µg.mL-1. De
la misma forma a salinidad 6 y 12 UPS las concentraciones superiores se
registraron a pH 9 con 62.36±15.4 y 106.67±5.5 µg.mL-1, respectivamente para
el día 4 de cultivo; mientras que hacia el día 19 se demostró una variación en la
producción, siendo el pH 11 el que mayor contenido de proteínas presentó con
177.08±33.47 µg.mL-1 para la concentración de 6 UPS, y 132.16±2.1 µg.mL-1
para 12 UPS (Figura 19).
*Letras diferentes en sentido vertical indican diferencias significativas entre variables de tratamientos
con un nivel de confianza del 95 %.
38
Para el factor salinidad, las variables de 6 y 12 UPS no presentan diferencias
estadísticamente significativas; mientras que a 0 UPS se muestran diferencias
del contenido de proteínas en comparación con los otros dos tratamientos para
el día 4. Así mismo; hacia el día 19 todos los tratamientos presentaron
diferencias en la concentración de proteínas de la microalga. Con respecto al
factor pH, en los días antes mencionados no existe diferencias estadísticamente
significativas entre los tratamientos: 5, 6, 11 y control (7-10); mientras que el pH
9 muestra diferencias en ambos días. Es decir los factores pH y salinidad
influencian la producción de proteínas.
Figura 19. Contenido de Proteínas (µg.mL-1) de Scenedesmus sp. (salinidad-pH) en los
días 4 y 19.
4.4.1 Producción de Carbohidratos
La concentración de carbohidratos en cultivos no salinos para el día 4 fue de
47.33±6.99 µg.mL-1, con un aumento para el día 19 de 122.69±1.68 µg.mL-1 en
cultivos ajustados a pH 11. De la misma manera, en cultivos adaptados a 6 UPS
el mayor contenido se registró a pH 11 con valores de 58.94±32.50 µg.mL-1 en
el día 4, cabe recalcar que para el día 19 el control (pH 8) obtuvo los mayores
valores de productividad con 111.08±4.6 µg.mL-1. La menor producción se
produjo a pH 5 con 21.68±1.9 µg.mL-1; así mismo a la concentración de 12 UPS
el pH 11 presentó los contenidos superiores de carbohidratos hacia el día 4 con
39
52.46±4.68 µg.mL-1; sin embargo, para el día 19 la máxima acumulación se
evidenció a pH 9 con 89.25±1.26 µg.mL-1 (Figura 20).
El factor salinidad no presentó diferencias estadísticamente significativas
entre los tratamientos en el día 4, de la misma manera que el pH hacia el día 19.
Cabe recalcar que en este día la variable de 12 UPS demostró disimilitud en
comparación con los otros tratamientos; sin embargo, para el día 4 el pH mostró
diferencias significativas (p<0.05).
Figura 20. Producción de carbohidratos a diferentes pH y salinidad de Scenedesmus sp.
en los días 4 y 19.
4.5.1 Producción de lípidos
La mayor acumulación de lípidos entre los tratamientos se obtuvo a 0 UPS y
pH 6 con 36.50±15.60 µg.mL-1, seguido de los ensayos a 6 UPS y pH 11 con
valores de 127.73±58.06 µg.mL-1 para el día 4. Por lo tanto, hacia el día 19 se
evidenció un incremento de los valores de acumulación en los distintos
tratamientos, mostrando un contenido superior de lípidos el pH 11 a 6 UPS con
206.16±32.37 µg.mL-1, seguido de 0 UPS con 158.34±14.35 µg.mL-1, y con la
menor producción el pH 9 a 12 UPS, con un valor de 45.18±17.48 µg.mL-1 (Figura
21).
40
El análisis de contraste múltiple de rangos para el factor salinidad en el día 4
demuestran que las concentraciones de 0 y 12 UPS no presentan diferencias
estadísticamente significativas (p<0.05); sin embargo, para el día 19 existe
diferencias entre las variables. Por lo tanto; se mostró que la concentración de 6
UPS en los días 4 y 19 tiene diferencias significativas en comparación con los
otros dos tratamientos. En cuanto al factor pH, no se presentaron diferencias
estadísticamente significativas entre las variables en ambos días. Por lo que se
puede inferir que este factor no tiene influencia en la acumulación de lípidos de
Scenedesmus sp.
Figura 21. Contenido de lípidos (µg.mL-1) de Scenedesmus sp. a diferentes pH y salinidades.
41
Tabla 6. Producción bioquímica de Scenedesmus sp. frente al estrés inducido por la salinidad y pH.
*Las letras minúsculas indican diferencias significativas entre las variables de estudio con un nivel de confianza del 95%.
Tratamientos Concentración (µg.mL-1)
Salinidad
(UPS)
pH
Proteínas
Carbohidratos Lípidos
Día 4 Día 19 Día 4 Día 19 Día 4 Día 19
0
Control (8-10)
5 6 9
11
124.88±5.56 a 111.52±40.55 a 87.25±5.56 a 129.73±18.92 b 118.81±9.63 a
282.69±35.1 a 334.89±36.47 a 377.37±23.88 b
31.06±12.21 a 20.72±0.74 b 32.92±3.05 cb 44.40±3.41 d 47.33±6.99 e
120.90±19.36 a 102.44±0.84 a 122.69±1.68 a
34.0±6.26 a 21.05±9.98 a 36.50±15.60 a 27.52±6.50 a 29.58±7.08 a
134.50±34.33 a 134.06±4.99 a 158.34±14.35 a
6
Control (8) 5 6 9
11
29.58±0.001 a 18.66±5.2 a 17.44±4.2 a 62.36±15.4 b 35.05±2.57 a
138.84±3.64 a 144.60±7.72 a 177.08±33.47 b
22.97±3.9 a 21.68±1.9 b 29.8±8.9 cb 36.7±2.9 d 58.94±32.50 e
111.08±4.6 a 101.55±7.15 a 100.66±18.52 a
61.07±20.36 a 41.06±4.86 a 53.72±16.28 a 104.78±29.34 a 127.73±58.06 a
166.14±32.41 a 169.23±29.34 a 206.16±32.37 a
12
Control (7) 5 6 9
11
9.55±2.3 a 15.93±4.5 a 22.30±2.5 a 106.67±5.5 b 25.34±4.2 a
60.54±10.9 a 27.76±15.4 a 132.16±2.1 b
41.97±0.95 a 17.14±0.52 b 20.04±13.26 cb 43.71±2.59 d 52.46±4.68 e
62.61±1.89 a 89.25±1.26 a 56.80±2.94 a
3.69±2.4 a 9.87±2.1 a 11.93±2.5 a 6.78±4.37 a 2.36±0.62 a
44.30±3.74 a 45.18±17.48 a 42.97±23.0 a
42
DISCUSIÓN
Este estudio demostró que Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) presentó
respuestas diversas al estrés inducido por la salinidad y el pH. En cuanto a la
salinidad, este género de microalga de hábitat dulceacuícola, presentó tolerancia
al NaCl hasta 26 UPS, comprometiendo el crecimiento con la menor densidad
celular obtenida a esta salinidad; mientras que a medida que se aumentó
gradualmente la salinidad hasta 36 UPS se evidenció una disminución del
crecimiento celular en comparación con el control que presentó un máximo de
7.13±0.53x106 cél.mL-1. Estos datos son comparables con los expresados por
Arora et al. (2019) quienes demostraron que la presencia del NaCl puro en el
medio de cultivo puede afectar a la microalga produciendo inhibición de su
crecimiento a altas concentraciones; a 36, 18 y 6 UPS. Sin embargo, el presente
estudio demostró que a concentraciones de 6 y 12 UPS se produjo una buena
capacidad de adaptación al NaCl.
Al respecto, Pandit, Fulekar y Karuna (2017), registraron que Chlorella
vulgaris y Acutodesmus obliquus presentaron buen crecimiento con el
incremento de Cloruro de sodio de 0 a 6 UPS; mientras que al aumentar la
concentración de NaCl a 18 y 24 UPS el crecimiento de ambas microalgas
disminuyó. La disminución de la densidad celular en respuesta al aumento de la
concentración de cloruro de sodio permite inferir que esta cepa de microalga es
poco halotolerante a niveles mayores a 12 UPS de salinidad.
Dentro del rango de pH estudiado el mejor crecimiento se presentó a pH 9 en
todos los tratamientos. Estos resultados discrepan con los registrados por Difusa
et al. (2015) y Prakash, Gautom y Sharma (2015), quienes indican que el mejor
crecimiento se obtuvo a pH 7, quizás debido a la cantidad de nutrientes
presentes en el medio de cultivo.
El crecimiento inhibitorio a pH 5 demuestra que esta cepa de Scenedesmus
sp. no es resistente a las condiciones ácidas de cultivo este comportamiento es
similar a los presentados por Difusa et al. (2015), quienes reportaron que las
condiciones ácidas (pH 5 y 6) no favorecieron el crecimiento celular y la
productividad de biomasa obteniendo una disminución lineal del crecimiento en
43
estas condiciones debido a que las microalgas presentan sensibilidad a las
variaciones o cambios de pH, este factor tiene un efecto significativo en el
crecimiento y producción bioquímica de las mismas.
Cabe destacar que en el presente estudio a salinidad y pH 6 se produjo un
desarrollo exponencial en cuanto a la abundancia de las células de
Scenedesmus sp., en contraste con el control, en el que a similares condiciones
se produjo un ligero descenso de la densidad celular. No obstante, este hallazgo
discrepa con los registrados por Difusa et al. (2015), en que las condiciones de
pH 6 no tuvieron un efecto positivo en el crecimiento de Scenedesmus.
La salinidad tuvo efecto en la producción de pigmentos fotosintéticos
disminuyendo los valores de clorofila a, b, y carotenoides con el aumento de
cloruro de sodio de 0 a 12 UPS. Los mismos, son comparables con los
registrados por Kirrolia, Bishnoi y Singh (2011), en los que encontraron que a
concentraciones de 0.012 UPS y 0.006 UPS la concentración de clorofilas de
Scenedesmus quadricauda disminuyó con el incremento de NaCl en
comparación con el control de los tratamientos estudiados.
Por otra parte, para el factor pH el mayor contenido de clorofila total y de
carotenos se registraron en el control (pH 8-10) a 0 UPS y 12 UPS y pH 11,
respectivamente; demostrándose que el pH tuvo efecto positivo en la producción
de pigmentos liposolubles en todos los tratamientos. En cambio, en una cepa de
Chlorella sp. estudiada por Mora, Moronta, Ortega y Morales (2005) se demostró
que el contenido de clorofila y carotenoides se incrementa con el aumento de la
salinidad en comparación con el control; además reportaron que el pH no tuvo
influencia en la producción de pigmentos, como ha sido observado en
Scenedesmus sp.
La composición bioquímica de la microalga se vio influenciada por el pH y la
salinidad; de este modo la producción de proteínas fue mayor en los tratamientos
a 0 UPS y pH 11; pero disminuyendo con el aumento de la salinidad a 6 y 12
UPS. Estos datos no concuerdan con los obtenidos por Kirrolia, Bishnoi y Singh
(2011); puesto que en su investigación mostraron que el contenido de proteínas
de Scenedesmus era menor a concentraciones de NaCl entre 0.012 y 0.024
44
UPS; mientras que a mayor salinidad 0.036 UPS el contenido de proteínas
aumentó.
Por otra parte en este estudio se demostró que las condiciones ácidas (pH 5
y 6) no favorecen la síntesis de proteínas; mientras que en condiciones básicas
(pH 9,11) la producción mejoró, obteniéndose así los mayores valores a pH 11
en cultivos no salinos. No obstante, Hodaifa, Martínez y Sánchez (2009)
evidenciaron los mayores valores de proteínas a pH 7 con 25.6 % de
productividad en Scenedesmus obliquo; esto sugiere que posiblemente el efecto
de la salinidad estaría relacionado con la respuesta para cada especie y
dependiendo de las condiciones ambientales existentes.
La mayor producción de carbohidratos se evidenció en cultivos no salinos, el
estrés inducido por la salinidad provocó que Scenedesmus presentara una
respuesta diversa en el contenido de carbohidratos; puesto que en los primeros
días de cultivo (día 4) se presentó mayor contenido de estas macromoléculas
con aumento de la salinidad (12 UPS). Sin embargo, hacia el final del
experimento se obtuvo un comportamiento distinto en la productividad de
hidratos de carbono de la célula, obteniendo los mayores valores de producción
en cultivos no salinos. Además, dentro del rango de pH estudiado la mejor
respuesta se presentó en el pH 11 con un contenido máximo de 122.69 µg.mL-1.
Estos resultados discrepan con los expresados por Kirrolia, Bishnoi y Singh
(2011), que demostraron que el contenido de carbohidratos aumentó en todas
las concentraciones de salinidad (0.012-0.036 UPS) estudiadas, aunque las
concentraciones utilizadas en el presente estudio son muy bajas; mientras que
Arora et al. (2019) evidenciaron un incremento del contenido de carbohidratos
con el aumento de la salinidad de 6 a 36 UPS de NaCl; este comportamiento
puede deberse a que la célula establece estrategias fisiológicas para regular su
equilibrio osmótico, produciendo moléculas para resistir y/o adaptarse a las
condiciones estresantes de cultivo.
En cuanto al contenido de lípidos en relación al pH entre 5 y 11, los resultados
sugieren que este factor no tuvo influencia en su producción. En cambio, la
salinidad si mostró influencia; ya que se demostró diferencia significativa en
45
todas las concentraciones, con el mayor contenido a 6 UPS hacia el final del
experimento.
El comportamiento de Scenedesmus sp. frente al incremento de la salinidad
desde 0 a 6 UPS de NaCl si fue efectivo, pero no lo fue al ser expuesta a un
incremento gradual de 12 UPS; esto sugiere que esta cepa de Scenedesmus es
halotolerante solo a bajas concentraciones. Este hallazgo es comparable con los
registrados por Kirrolia, Bishnoi y Singh (2011), quienes observaron una
disminución del porcentaje de acumulación de lípidos con el aumento de la
salinidad; mientras que Salama et al. (2013) obtuvieron un mayor porcentaje de
acumulación con el aumento de la salinidad a 1.5 UPS. De tal manera que es
posible que tal efecto sea dependiente de cada especie de microalga. Por
ejemplo, Pandit, Fulekar y Laskhmi (2017) registraron un incremento en el
contenido de lípidos de Chlorella vulgaris y Acutodesmus obliquo a la
concentración de 24 UPS de NaCl; que puede sugerir que el comportamiento
pueda ser diferente a nivel específico.
46
CONCLUSIONES
Los resultados de la adaptación gradual a diferentes concentraciones de NaCl
nos permiten concluir que esta cepa de Scenedesmus sp. es halotolerante;
puesto que evidencia tolerancia al estrés producido por la salinidad hasta 26
UPS. Sin embargo, el mejor crecimiento se registró a las concentraciones de 6
UPS y 12 UPS sin superar al control; mientras que con el aumento de la salinidad
hasta 36 UPS se observó una disminución considerable del crecimiento celular.
De acuerdo a los resultados obtenidos sobre el efecto del pH (5, 6, 7, 9, 11)
se demostró que Scenedesmus sp. presentó el mejor crecimiento a pH 9 y a 0
UPS, con una densidad celular máxima de 9.48±0.32x106 cél.mL-1; esto
demuestra su nicho alcalino. En cambio, en condiciones ácidas entre pH 6 y 5
mostró tolerancia hasta el día 12 y 4, respectivamente, pero con una mortalidad
tanto en los cultivos controles a pH 8-10, como a los sometidos a salinidades de
6 y 12 UPS. Esto significa que en medio ácido la microalga no reflejó un
crecimiento sustentable. Sin embargo, a pH 6 y con un aumento de salinidad a
6 UPS Scenedesmus sp. mostró resistencia en el crecimiento hasta el día 12.
En cuanto al efecto de la salinidad y pH sobre el contenido de clorofila a y b
se produjo el valor más elevado en el control (0 UPS y a pH 8-10); pero en cambio
hubo un descenso con la salinidad. Así mismo, la mayor concentración de
carotenoides se obtuvo a 0 UPS y pH 11. Estos resultados sugieren que,
Scenedesmus sp. acumula mayor contenido de clorofila y de carotenoides
cuando se expone a condiciones no salinas y en medio alcalino.
El pH no demostró influencia en la producción de lípidos puesto que no se
encontró diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos; sin
embargo, la salinidad a 6 UPS estimuló su producción.
En relación al contenido de proteínas se encontraron los valores más elevados
entre pH 7 y 10; no obstante en condiciones ácidas no fue favorecida su
producción en diferentes salinidades.
47
La concentración de carbohidratos se modificó en los diferentes tratamientos
salinidad-pH, registrándose los mayores valores a pH 11 y hasta la salinidad de
6 UPS.
El presente estudio sugiere que Scenedesmus sp. es una cepa con una
moderada tolerancia a la salinidad y con capacidad de óptimo crecimiento y
producción de pigmentos, proteínas y carbohidratos en condiciones no salinas
y en medio alcalino.
48
RECOMENDACIONES
Realizar estudios sobre la haloterancia específica de Scenedesmus sp. para
identificar a que concentración de cloruro de sodio se produce la mayor cantidad
de lípidos, para realizar cultivos intensivos con fines comerciales.
Investigar las condiciones de cultivo óptimas de esta cepa en medios de
cultivo de bajo costo para optimizar una producción rentable de metabolitos de
interés comercial.
Realizar estudios utilizando otras variables de cultivo como intensidad de luz,
temperatura, medio de cultivo, fuentes de nitrógeno, para la optimización de la
producción bioquímica e identificar en qué condiciones de cultivo se produce una
mejor producción de pigmentos, proteínas, carbohidratos y lípidos en esta y otras
microalgas.
Analizar el tipo de lípidos presentes en Scenedesmus sp. el perfil de ácidos
grasos para la producción de biodiesel y su utilización en la industria alimenticia
y farmacéutica.
Extender los estudios sobre el efecto del pH y salinidad en la producción de
biomasa, carbohidratos, proteínas, lípidos y pigmentos fotosintéticos en otras
cepas microalgales nativas.
Determinar el crecimiento y producción bioquímica de otros géneros de
Chlorophytas y Cianobacterias en las condiciones evaluadas en este estudio.
49
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Biotechnology [Ebook] 2nd ed., pp. 3-14. Amos Richmond and Qiang Hu.
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production of microalga Scenedesmus sp. with wastewater from fishery. Revista
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Arredondo, B., Cordero, B., y Voltolina, D. (2017). Determinación de
pigmentos totales métodos espetrofotométricos. B. Arredondo, D. Voltolina, T.
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55
ANEXOS
Anexo 1. Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) control (0 UPS) a pH 11 observada en el microscopio con el objetivo de 40x.
Anexo 2. Extracto metanol-cloroformo/lípidos.
56
Anexo 3. Determinación de Lípidos mediante carbonización simple (salinidad-pH).
Anexo 4. Curva estándar de proteínas.
57
Anexo 5. Células de Scenedesmus sp. adaptada a 26 UPS, observada en microscopio óptico con objetivo de 40x.
Anexo 6. Cultivos de Scenedesmus sp. adaptada a diferentes concentraciones de NaCl (6, 26 y 36 UPS).
58
Anexo 7. Cultivos de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) salinidad-pH.
Anexo 8. Densidades celulares máximas obtenidas en el estudio previo de adaptación a
diferentes concentraciones de salinidad.
Tratamientos Crecimiento
Salinidad
(UPS)
Recuento celular
(x106 cél.mL-1)
Turbidez
(DO 680 nm)
Control (0) 7.13±0.53 1.12±0.057
6 4.70±0.32 0.913±0.045
26 3.22±0.46 0.683±0.063
36 1.78±0.35 0.619±0.004
59
*Indica una diferencia significativa
Anexo 9. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos realizado en el programa StatGraphics
Plus versión 5.1 para el factor pH con un nivel de confianza del 95% para el método de
Recuento Celular.
Anexo 10. Valores de pH inicial y final de los cultivos durante la pre-adaptación de los
cultivos a distintas concentraciones de salinidad.
Contraste Múltiple de Rangos para Conteo según pH
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
5 63 0.426341 0.220802 X
11 165 1.90451 0.136198 X
6 96 2.05606 0.178932 X
9 165 3.00332 0.136198 X
Control 165 3.55433 0.136198 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 5 *1.47817 0.508077
11 – 6 -0.151544 0.44034
11 – 9 *-1.09881 0.377379
11 – Control *-1.64982 0.377379
5 – 6 *-1.62972 0.555784
5 – 9 *-2.57689 0.508077
5 – Control *-3.12799 0.508077
6 – 9 *-0.947262 0.44034
6 – Control *-1.49827 0.44034
9 – Control *-0.551009 0.377379
Tratamientos pH
Salinidad (UPS)
Inicial Final
Control 7 9-10
6 7 8
26 7 8
36 7 8
60
*Indica una diferencia significativa
Anexo 11. Contraste Múltiple de Rangos para el método de turbidez a 680 nm para el
factor pH.
Anexo 12. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para el factor salinidad-Método de
Turbidez a 680 nm.
Contraste Múltiple de Rangos para Absorbancia según pH
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
5 60 0.0863975 0.0353557 X
6 88 0.261709 0.0293051 X
11 162 0.454211 0.021444 X
9 162 0.519849 0.021444 X
Control 162 0.560139 0.021444 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 5 *0.367813 0.0809054
11 – 6 *0.192502 0.0709905
11 - 9 *-0.0656379 0.0593857
11 - Control *-0.105928 0.0593857
5 – 6 *-0.175311 0.0894868
5 – 9 *-0.433451 0.0809054
5 - Control *-0.473741 0.0809054
6 – 9 *-0.25814 0.0709905
6 - Control *-0.29843 0.0709905
9 - Control -0.0402901 0.0593857
Contraste Múltiple de Rangos para Absorbancia según Salinidad
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
12 172 0.140087 0.0217257 X
6 231 0.40774 0.0183886 X
0 231 0.581555 0.0183886 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 *0.173815 0.0497317
0 – 12 *0.441468 0.0540515
6 – 12 *0.267653 0.0540515
61
*Los coeficientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Anexo 13. Análisis de Varianza (ANOVA FACTORIAL) para la variable Lípidos con un nivel
de confianza del 95%.
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 14. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para la variable lípidos según el factor
salinidad en el día 4 de cultivo.
Análisis de la Varianza para Lípidos- Sumas de Cuadrados de Tipo III
Fuente Suma de Cuadrados
GL Cuadrado Medio Coeficiente-F P- Valor
EFECTOS PRINCIPALES A: pH B: Salinidad
2143.62 63090.5
2 2
1071.81 31545.3
1.70
49.96
0.2165 0.0000
RESIDUOS 9471.1 15 631.407
TOTAL (CORREGIDO) 75469.9 19
Contraste Múltiple de Rangos para Lípidos según Salinidad (Día 4)
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
12 9 11.4761 8.72067 X
0 12 29.1066 7.55186 X
6 13 73.3548 7.25422 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 *-44.2482 21.5138
0 – 12 17.6305 23.6012
6 – 12 *61.8788 23.3493
62
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 15. Análisis estadístico de Contraste Múltiple de Rangos para el factor pH en el
cuarto día de cultivo para lípidos.
Contraste Múltiple de Rangos para Lípidos según pH (Día 4)
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
5 7 26.6786 9.85657 X
6 6 33.0089 10.7715 X
Control 8 33.2648 9.22164 X
9 7 44.9398 9.85754 X
11 6 52.0038 10.6032 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 5 25.3252 29.7041
11 – 6 18.9949 31.0127
11 – 9 7.06392 29.7055
11 – Control 18.739 28.8329
5 – 6 -6.33026 29.7531
5 – 9 -18.2613 28.6505
5 – Control -6.58618 27.6341
6 – 9 -11.931 29.9343
6 – Control -0.255917 28.8872
9 – Control 11.6751 27.633
63
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 16. Análisis estadístico de Contraste Múltiple de Rangos para el factor salinidad al
final del experimento con un nivel de confianza del 95%.
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 17. Contraste Múltiple de Rangos para Lípidos según el factor pH hacia el final del
experimento (día 19).
Contraste Múltiple de Rangos para Lípidos según Salinidad (Día 19)
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
12 6 46.9517 10.2584 X
0 6 142.304 10.2584 X
6 8 181.352 8.94305 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 *-39.0474 29.0076
0 – 12 *95.3525 30.9222
6 – 12 *134.4 29.0076
Contraste Múltiple de Rangos para Lípidos según pH (Día 19)
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
Control 7 114.032 9.56052 X
9 6 118.956 10.2584 X
11 7 137.618 9.56052 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 9 18.6618 29.8889
11 – Control 23.5859 28.6284
9 - Control 4.92402 29.8889
64
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 18. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para proteínas según el factor salinidad
en el cuarto día de cultivo.
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 19. Análisis estadístico para la variable de proteínas de Scenedesmus sp. en el día 19
de cultivo según salinidad.
Contraste Múltiple de Rangos para Proteínas según Salinidad (Día 4)
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
6 10 32.08 7.07701 X
12 12 32.9949 6.50622 X
0 15 114.442 5.7001 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 *82.3621 18.5584
0 – 12 *81.4472 17.6656
6 – 12 -0.914952 19.7591
Contraste Múltiple de Rangos para Proteínas según Salinidad (Día 19)
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
12 8 77.2245 9.92634 X
6 7 155.235 10.6122 X
0 9 331.655 9.30629 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 *176.42 29.5426
0 – 12 *254.43 28.479
6 – 12 *78.0102 30.3279
65
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 20. Análisis estadístico de contraste múltiple de rangos realizado en el programa
StatGraphics Plus versión 5.1 para proteínas según pH con un nivel de confianza del 95% en el
cuarto día de cultivo.
Anexo 21. Contraste Múltiple de Rangos para proteínas de Scenedesmus sp. en el día 19
según pH.
Contraste Múltiple de Rangos para Proteínas según pH (Día 4)
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
5 7 37.2649 8.49361 X
6 8 41.4828 7.83342 X
11 8 59.3498 7.83599 X
Control 6 60.3223 9.12723 X
9 8 100.775 7.83599 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 5 22.085 23.4054
11 – 6 17.867 22.678
11 – 9 *-41.4254 22.5431
11 - Control -0.972468 24.5806
5 – 6 -4.21797 23.7059
5 – 9 *-63.5103 23.4054
5 - Control -23.0574 25.4915
6 – 9 *-59.2924 22.678
6 - Control -18.8395 24.4249
9 - Control *40.4529 24.5806
Contraste Múltiple de Rangos para Proteínas según pH (Día 19)
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
Control 9 160.693 9.30629 X
9 7 172.172 10.6122 X
11 8 231.249 9.92634 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 9 *59.0773 30.3279
11 – Control *70.5563 28.479
9 - Control 11.4791 29.5426
66
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 22. Análisis estadístico de Carbohidratos según salinidad (día 4).
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 23. Análisis estadístico de Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según
salinidad (día 19).
Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según Salinidad (Día 4)
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
6 13 33.7739 2.04252 X
0 12 35.0307 2.12698 X
12 14 36.007 1.9643 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 1.25678 6.0438
0 – 12 -0.976303 5.88457
6 – 12 -2.23308 5.7844
Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según Salinidad (Día 19)
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
12 9 75.8907 4.98975 X
6 6 104.433 6.11117 X
0 6 115.348 6.11117 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 10.9144 18.3213
0 – 12 *39.457 16.725
6 – 12 *28.5427 16.725
67
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 24. Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según pH (día 4).
Anexo 25. Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según pH (día 19).
Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según pH (Día 4)
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
5 8 20.3736 2.59693 X
6 7 28.0786 2.77723 XX
Control 8 32.1313 2.59693 X
9 8 42.0886 2.59665 X
11 8 52.0138 2.59665 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 5 *31.6403 7.49377
11 – 6 *23.9352 7.77149
11 - 9 *9.92524 7.45559
11 - Control *19.8825 7.49377
5 – 6 -7.70507 7.73025
5 – 9 *-21.715 7.49377
5 - Control *-11.7577 7.45559
6 – 9 *-14.01 7.77149
6 - Control -4.05267 7.73025
9 - Control *9.95729 7.49377
Contraste Múltiple de Rangos para Carbohidratos según pH (Día 19)
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
11 7 93.3128 5.69266 X
Control 7 101.137 5.69266 X
9 7 101.222 5.69266 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 9 -7.90936 16.9622
11 – Control -7.82432 16.9622
9 - Control 0.0850469 16.9622
68
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 26. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para Pigmentos Fotosintéticos
(Clorofila a) según salinidad (día 4).
*Indica una diferencia significativa.
Anexo 27. Contraste Múltiple de Rangos clorofila a según salinidad (día 19).
Contraste Múltiple de Rangos para Pigmentos_Clorofila a según Salinidad (Día 4)
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
6 11 0.630777 0.048473 X
12 11 0.726173 0.048473 XX
0 11 0.820355 0.048473 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 *0.189577 0.141082
0 – 12 0.0941817 0.141082
6 – 12 -0.0953957 0.141082
Contraste Múltiple de Rangos para Pigmentos_Clorofila a según Salinidad (Día 19)
Método: 95.0 porcentaje LSD
Salinidad Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
12 7 1.92336 0.17575 X
6 7 3.89318 0.17575 X
0 7 4.6449 0.175826 X
Contraste Diferencias +/- Límites
0 – 6 *0.751719 0.528599
0 – 12 *2.72155 0.528599
6 – 12 *1.96983 0.523485
69
*Indica una diferencia significativa. Anexo 28. Análisis estadístico de clorofila a según pH (día 4).
Anexo 29. Análisis de Contraste Múltiple de Rangos para Pigmentos (clorofila a) de Scenedesmus sp. según pH (día 19).
Contraste Múltiple de Rangos para Pigmentos_Clorofila a según pH (Día 4)
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS
Sigma LS Grupos Homogéneos
5 6 0.358193 0.0652851 X
9 7 0.703001 0.0607068 X
11 7 0.832492 0.0607068 XX
6 6 0.837279 0.0652851 XX
Control 7 0.897876 0.0607068 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 5 *0.474299 0.183248
11 – 6 -0.00478739 0.183248
11 – 9 0.129491 0.176856
11 – Control -0.0653839 0.176856
5 – 6 *-0.479087 0.189782
5 – 9 *-0.344808 0.183248
5 – Control *-0.539683 0.183248
6 – 9 0.134278 0.183248
6 – Control -0.0605966 0.183248
9 – Control *-0.194875 0.176856
Contraste Múltiple de Rangos para Pigmentos-Clorofila a según pH (Día 19)
Método: 95.0 porcentaje LSD
pH Recuento Media LS
Sigma LS
Grupos Homogéneos
11 6 2.49614 0.188601 X
9 7 3.6986 0.175826 X
Control 8 4.2667 0.164328 X
Contraste Diferencias +/- Límites
11 – 9 *-1.20246 0.546613
11 – Control *-1.77057 0.530292
9 - Control *-0.568105 0.513453