TP1 BMCROMILA ISMAIL

1.1. a) Os resultados da pista 1 correspondem ao ensaio i pois é o único ensaio que digere o plasmídeo apenas uma vez e, consequentemente apenas forma um pedação único de DNA. Os Resultados da Pista 2 já correspondem ao ensaio ii pois:

ensaio ii: ensaio iii:

c)

2.1 A única hipotese que permite a formação de uma molécula de DNA recombinante com o DNA I é a) pois as bases de nucleótidos têm que ser complementares.

2.2 DNA Ligase

2.3 Tecnica PCR

3. 1 a)

b) Codão Start: Codão STOP:

c) 5’UTR – tudo até ao codão START; 3’UTR – do codão STOP até ao fim

3.2

4. 1 – Isolamento da sequência de cDNA a ser clonado; 2 – Uso de m plasmídeo que sirva de vetor, com o gene que confere resistência ao meio seletivo (Ampicilina)3 – Seccionar com a mesma nuclease o plasmídeo e o fragmento de DNA e formar plasmídeo recombinante4 – Introdução do plasmídeo recombinante na célula hospedeira/plataforma de expressão5 – Coloca –se as bacterias em gel de agarose e no meio seletivo antibacteriano e as selecionadas multiplicam-se, replicando o plasmídeo recombinante.

4.2 Produção mais rentável e mais rápida de proteínas para vacinas, hormonas de substituição, fármacos no geral, seres transgénicos, etc...

5. 1 Uso da BamHI para clonagem pGEX-T2: 4948 pares de bases; BamHI – 930; EcoRI – 940 - Digerimos com BamHI para introduzir o cDNA

cDNA: - clivado com BamHI (pois temos que incluir o codão START e o codão de terminação) obtém-se um fragmento de aprox. 730 bp

Se inserirmos o Fragmento de cDNA no plasmídeo obtemos um plasmídeo recombinante com 5678 bp no total;

5.3 Para verificar a se a inserção foi feita no sentido correto digerimos o plasmídeo recombinante com EcoRI e verificamos os resultamos em eletroforese

Caso esteja a orientação no sentido correto a EcoRI vai clivar em 1231 e em 1691 e forma-se dois fragmentos de comprimentos 460 e 5239.

Caso esteja no sentido errado a EcoRI vai clivar em 1401 e 1691 e forma-se dois fragmentos de comprimentos 290 e 5409

SENTIDO CORRETO:

5218

200 480 930

280 450

280

EcoRI - 1210BamHI - 930

SENTIDO INCORRETO:

5.5 Procedimento a realizar para a obtenção da proteína desejada:- Isolamento da sequência de mRNA que corresponde à proteína de interesse de uma célula que a expresse. - Uso da transcriptase reversa para se obter cDNA- Seccionar o cDNA em 2 extremidades cegas por nucleases de restrição- Digerir o vetor com as mesmas nucleases de restrição- Introdução do cDNA no vetor com DNA ligase- Transformação da célula hospedeira (plataforma de expressão)- Inserção da célula num meio nutritivo de agarose e seletivo com ampicilina- Amplificação dos clones resistentes à ampicilina- Isolamento do DNA plasmídico- Verificação da orientação correta da cadeia- Testes de sequênciação do DNA- Lise das células hospedeiras e purificação das proteínas dos restantes lisados recorrendo a: colunas de cromatografia (para a separação da proteína com GST do resto), Glutatião reduzido (para reagir com a proteína, saindo da coluna) e proteases de restrição (para separar o glutatião reduzido da proteína)- Identificação apropriada da proteína

290

5388

450

280EcoRI - 1670

EcoRI - 1380

5678 bp

BamHI - 930

BamHI - 1660

cDNA