topología del adn
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Topología del ADN:
Fundamentos
Sergei Mirkin M, la Universidad de Illinois en Chicago, Illinois, EE.UU.
características topológicas de ADN y el ADN específicamente superenrollamiento influir en todos los principales
ADN de las transacciones en las células vivas. superenrollamiento del ADN induce la formación de inusual
estructura secundaria por repeticiones de ADN específicos que también pueden afectar el funcionamiento del ADN.
Introducción
Una molécula de ADN típico consiste de dos complementarios
cadenas de polinucleótidos que se multiplican interwound,
formando una doble hélice. En la conformación vigente,
llamado B-ADN, se trata de una hélice de la mano derecha con un período de
aproximadamente 10.5 pares de bases (pb) por turno en fisiológicas
condiciones. Aunque a nivel local (es decir, para una secuencia determinada)
ADN puede ser muy diferente de la conformación B, el
éste describe con precisión la estructura general de un ADN
molécula.
aspectos topológicos de la estructura del ADN surgen principalmente
del hecho de que las dos hebras de ADN se repiten
entrelazados. Desenredar estas dos vertientes, que se produce en
todos los procesos genéticos importantes puede resultar bastante difícil. En
el caso más simple de una solución linearDNAin, es desenredar
posible debido a la rotación libre de los extremos del ADN.
Sin embargo, para todas las AND naturales, la rotación de extremo libre está bien
restringido o prohibido por completo. En consecuencia, desenredar
las dos hebras de ADN se convierte en topológicamente
imposible. La Figura 1 ilustra esto para el caso imaginario
de una molécula de ADN circular en las dos cadenas son
enredada una sola vez.
Un segmento de ADN limitado para que la rotación libre de
sus extremos es imposible que se llama un dominio topológico
(Figura 2). Un ejemplo canónico de un dominio topológico
es el ADN circular, que es típica de las bacterias, las mitocondrias,
cloroplastos, muchos virus, etc En este caso, hay
obviamente noDNAends en absoluto, ya que son bothDNAstrands
covalentemente cerrado. A pesar de los cromosomas eucariotas se
lineal general, consisten en grandes bucles de ADN con firmeza
unido a la matriz nuclear. Estos lazos representan
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Contenido del artículo
Introductoria del artículo
. Introducción
. Vinculación de Número, Twist y se retuercen
. ADN Superenrollamiento
. Nudos y catenanos
. Transiciones estructurales SuperCoil-dependientes en el ADN
. Métodos de detección y análisis
. Papel de la topología del ADN en el genoma de Funcionamiento
. Función biológica de las estructuras del ADN Alternativa
Figura 1 A circularDNAmolecule hipotética en la que twoDNAstrands
están vinculados sólo una vez. Desenredar una de las dos cadenas es imposible, a menos que
uno de ellos será quebrantado.
(A) (b)
(C)
(D)
Figura 2 Ejemplos de dominios topológicos. (A) de ADN circular, (b)
bucles de ADN cromosómico, (c) lineales de ADN unidas a la membrana, (d)
Lineales de ADN unido a los agregados de proteínas.
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dominios topológicos, es decir, que son equivalentes a la circular
ADN topológicamente. Los extremos de ADN lineal también se puede
colocada en la membrana, como se ha demostrado para algunos
virus, por lo que este ADN topológicamente cerrado. Por último, un
segmento de ADN situado entre la proteína de dos grandes
órganos también puede considerarse como un dominio topológico. Por
simplicidad, las características topológicas de los dominios se
se analiza a continuación para las AND circular, pero pueden los principios
deben aplicarse en todos los demás casos.
Si la separación capítulo dentro de un dominio topológico es
imposible, ¿cómo puede la función del ADN intracelular en absoluto? Para
frente a este problema un grupo especial de enzimas llamadas
topoisomerasas de ADN ha evolucionado. Estas enzimas introducir
transitoria de una o de doble cadena-breaks intoDNA
para liberar la tensión de torsión en la acumulación de línea
separación en un dominio topológico. Las topoisomerasas son
esenciales para la resolución de numerosos topológico
problemas en el ADN. Tenerlos en su arsenal, las células toman
Disfruta de la naturaleza limitada de sus topológicamente
ADN, como se explica al final de este artículo.
Vinculación de Número, Twist y se retuercen
El parámetro fundamental topológica de un enlace covalente
ADN circular cerrada se llama el número de enlace (Lc).
Suponga que una cadena de ADN es el borde de un imaginario
superficie y contar el número de veces que el otherDNA
línea cruza esta superficie (Figura 3). La suma algebraica de
todas las intersecciones (que representa un signo de cada
intersección) es el Lc. Dos características importantes de la Lc
son evidentes en la Figura 3. En primer lugar, Lucas es siempre un número entero.
En segundo lugar, Lucas no se puede cambiar por cualquier deformación de la
Hebras de ADN, es decir, es invariante topológico. El único
manera de cambiar Lc es introducir un descanso en uno o ambos
DNAstrands, gire el twoDNAstrands relativa a cada
otros y el sello de la pausa. Este es precisamente el papel del ADN
topoisomerasas.
Otra de las características de un ADN circular se llama giro,
o Tw. Tw es el número total de vueltas helicoidales en la circular
ADN en determinadas condiciones. Dado que el ADN es un diestro
hélice con 10,5 pares de bases (pb) por turno, Tw es un
gran número positivo para cualquier naturalDNA.Take un plano,
ADN circular y tratar de separar a nivel local el ADN de dos
capítulos, es decir, para disminuir la Tw. Desde Lc no puede cambiar, un
disminución de la Tw será compensado por varios positivos
se retuerce de la doble hélice (Figura 4). Retorciéndose (Wr) es el
tercera característica importante de ADN circular, describiendo
el puerto espacial del eje de la hélice doble, es decir, la forma de la
Molécula de ADN en su conjunto. Wr pueden ser de cualquier signo, y
generalmente su valor absoluto es mucho más pequeño que el de Ta.
La consideración anterior se puede formalizar por el
la siguiente ecuación:
Lk5Tw + Wr [1]
Tenga en cuenta que, si bien Lucas es un número entero, neitherTwnorWrshould
ser tal. Además, invariantes topológicos neitherTwnorWrare
y sus valores cambian fácilmente con los cambios en el ambiente
condiciones, la temperatura y durante el funcionamiento del ADN.
ADN Superenrollamiento
El número de pares de base perDNAturn se designa como g.
Este parámetro puede variar dependiendo de las condiciones iónicas
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Figura 3 Vinculación número representa una suma algebraica de todas las
cruces hechas por una cadena de ADN a través de la superficie imaginaria tallada
por otra cadena de ADN. La Lc aquí es 8.
Figura 4 relajarse Local de ADN circular relajado lleva a ADN positivo
superenrollamiento.
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ciones, temperatura, etc Si el Lc de la circular N-pb de longitud
molécula de ADN se corresponde exactamente con
Lk05Tw05N / g [2]
esta molécula de ADN se llama relajado. De hecho, de cerca
se parecen a los planos de ADN circular que se muestra en la Figura 4.
En AND real, sin embargo, la ecuación anterior es casi
Nunca accurate.ADNAmolecule whoseLkdiffers de la
Lk0 se llama superenrollado. Una medida cuantitativa de ADN
superenrollamiento es denominada enlace diferencia (t):
t5Lk2Lk05Lk2N / g [3]
Se deduce de la ecuación anterior que la vinculación de diferencia
puede tener un valor positivo o negativo. Cuando el valor
de t es negativo, el ADN correspondiente es negativa
superenrollado. En este caso, el Lucas es menor que N / g, es decir,
negativamente ADN superenrollado es algo desenrolla
en comparación con el ADN relajado. Cuando el valor de t es
ADN positivo, es positivo superenrollado, y es algo
overwound en comparación con el ADN relajado.
"Superenrollamiento" El término refleja la forma del ADN: se
se parece a una hélice de ADN normal en espiral en una hélice de un
de orden superior. Las dos configuraciones principales de superenrollado
ADN, llamado solenoidal y plectonémica, se muestran
en la Figura 5. El plectonémica (o interwound) superhelicoidal es
característica del ADN en procariotas. Solenoidal superenrollamiento
es típico de los eucariotas, donde el ADN se enrolla
alrededor de las partículas nucleosomal. El signo de una pieza de
ADN superenrollado no puede ser determinado con base en la
imparcialidad de la superhélice. Figura 5 ilustra esto para
configuraciones solenoidal y plectonémica. Tanto las autoridades nacionales designadas en
la cifra se superenrollado negativamente, pero la plectonémica
superhélice es la mano derecha mientras que la superhélice solenoidal
es zurdo. Esto se debe a que para determinar el signo de cualquier
nodo, se debe considerar toda la ruta del ADN.
Las flechas en la figura 5, tomar el camino de ADN en cuenta.
Es evidente que la orientación relativa de theDNAsegments
en una intersección es el mismo para ambos superhelicoidal
configuraciones.
Además de la vinculación de diferencia, una característica útil
de ADN superenrollado es la densidad superhelicoidal (s),
define como:
s5t/Lk05gt/N [4]
Es más cómodo de usar s, en lugar de t, para comparar
superenrollamiento AND entre diferentes, ya que s se normaliza
forDNAlength. En una primera aproximación, s estimaciones
el número de supercoils por vuelta helicoidal del ADN. Por
ADN circular aislado de las células vivas del valor absoluto
de s puede variar entre 0,02-0,09, es decir, hay 9.2
supercoils por 100 vueltas helicoidal del ADN.
Las relaciones entre la diferencia de enlace y
giro y se retuercen se puede determinar mediante la combinación de las ecuaciones
[1] - [3]:
t5Lk2Lk05 (Tw2Tw0) 1Wr5DTw1Wr [5]
La fórmula anterior muestra que el estrés causado por topológico
diferencia que une en un cambio circularDNAboth el giro
de su valor óptimo e introduce retuercen. Estudiar
ADN superenrollado negativamente usando una variedad de diferentes
técnicas se ha demostrado que, en fisiológicas
condiciones, Wr ocupa aproximadamente tres cuartas partes de
la diferencia de enlace, mientras que la cuarta parte restante va a
DTW. La distribución de la tensión de torsión en forma positiva
ADN superenrollado queda por determinar.
Desde superenrollamiento induce graves de torsión y flexión
deformaciones en el ADN, que es energéticamente desfavorable.
análisis experimentales y teóricos han
demostrado que la energía libre de superenrollado negativamente
ADN en condiciones fisiológicas es la siguiente:
DG510RTNs2 [6]
donde R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta y
N es la longitud del ADN en pares de bases. Desde la Dirección General es
proporcional al cuadrado de s, los cambios relativamente pequeños en
la densidad de superenrollamiento puede dar lugar a cambios sustanciales
en la energía libre. Uno debe esperar que la dependencia similares
de ADN superenrollado positivamente.
Debido a superenrollamiento es energéticamente desfavorable, locales
ADN cambios que llevan a la relajación se superhelicoidal
favorables. Considere la posibilidad de un 1050-pb de longitud superenrollado negativamente
molécula con una diferencia de vinculación de t5 24. Para
relajarse completamente este estrés, es suficiente para relajarse un 42 -
ADN pb a lo largo del segmento (cuatro vueltas de la doble hélice)
dentro de esta molécula de ADN. Este ejemplo ilustra dos
características importantes de ADN superenrollado negativamente. En primer lugar, una
cambio en un segmento de ADN correspondiente a sólo una pequeña
porcentaje de la totalDNAlength es suficiente para mantener la
resto de la molécula relajada. En segundo lugar, bajo la influencia de
superenrollamiento negativo, el ADN tiende a relajarse.
Positivamente ADN superenrollado, por el contrario, tendería a
overtwist.
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Figura 5 plectonémica (superior) y solenoidal (inferior) supercoils ADN.
Las flechas ilustran que tanto las moléculas de aquí son superenrollado negativamente,
a pesar de imparcialidad diferentes.
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Nudos y catenanos
Vinculación número no es el único invariante topológico
característico de ADN circular. En el proceso de
ciclación, las moléculas de ADN se pueden formar nudos largo de
diferentes tipos y complejidad. Es importante destacar que, después de un
cierre covalente de una molécula de ADN, las características
de un nudo no se puede cambiar por cualquier conformacional
cambios en el ADN por debajo de rotura del hilo. Por lo tanto, el nudo
es otro tipo de invariante topológico. La figura 6a muestra dos
las formas de la más simple nudo, llamado trébol, de diferentes
signos. Nudos de vez en cuando detectó en las células vivas. Ellos
se cree que son los productos secundarios de diversos genética
procesos, tales como recombinación.
También es probable que dos o más moléculas de ADN pueden
interrelación en el proceso de ciclación. Una vez más, después de covalente
cierre de las moléculas, el tipo de vínculo se convierte en
todos los idiomas. ADN circular que están unidos entre sí son
catenanos llamada. Es evidente que hay numerosos posibles
tipos de catenanos. Figure6bshows un catenano simple de dos
Entre los signos posibles. Catenanos rutinariamente se detecten en el interior
las células vivas. Son probablemente se formaron en las últimas etapas de
La replicación del ADN y puede ser posteriormente resueltos por
topoisomerasas.
Superenrollamiento dependiente Estructurales
Transiciones en el ADN
Como se discutió sobre los cambios locales en el ADN de secundaria
estructura que dan lugar a desenrollar el ADN (disminución de la Tw)
son energéticamente favorable en un superenrollado negativamente
ADN. Extensos estudios de estas transiciones en los últimos
dos décadas han puesto de manifiesto varias conformaciones distintas de ADN
que son fundamentalmente diferentes de la canónica
B-DNA. Estas estructuras de ADN se llaman
estructuras alternativas del ADN. Una característica común de estos
estructuras es que están formados por ADN específicas
secuencias, generalmente de carácter repetido, y no por
secuencias aleatorias de ADN. El mejor estudiado alternativas
estructuras de ADN se consideran a continuación.
Cruciformes
Secuencia de elementos llamados repeticiones invertidas son notablemente
generalizada en ambos genomas pro y eucariotas. Estos son
ADN segmentos en los que las bases de ADN que son equidistantes
del centro de la simetría en una cadena de ADN se Watson-
Crick complementa entre sí (Figura 7). En el marco del
influencia de ADN negativo superenrollamiento estas secuencias
pueden formar estructuras de ADN llamado cruciformes (Figura 7).
Estas se forman cuando dos hebras complementarias de ADN
desasociar y, a continuación de cada cadena de ADN de auto-pares. Por lo tanto,
topológicamente, la formación de cruz es equivalente a un total
anulación de la repetición invertida.
Desde desapareamiento de un dúplex de ADN es que consumen energía,
esta etapa representa una barrera energética para la cruz
formación. Además, cruciformes contienen una sola fila
bases en su bucle central y costoso energéticamente
enlaces con el ADN de doble cadena adyacente (la llamada
cuatro cruces de ida). En conjunto, esto conduce a una alta energía
para la formación de cruz, se acerca 20kcal mol21,
lo que significa que la formación de cruz no es factible en
ADN lineal. Debido a cruciformes son topológicamente
equivalente a desenrollar el ADN, sin embargo, su formación
libera la tensión de torsión en el ADN superenrollado negativamente,
el suministro de energía necesario. Obviamente, cuanto más tiempo una
repetición invertida, el supercoils más se relajan en
formación cruciforme. Esto hace que la formación de cruz por
tiempo invertido repite mucho más termodinámicamente
favorable que el de los cortos (que sólo son viables
en densidades superenrollamiento muy alto). De hecho, la energética
cálculos muestran que la probabilidad de cruz
aumenta exponencialmente con la extrusión de la longitud de un
invertida repetir.
Z-DNA
Específica repeticiones directas que consisten en regular alterna
purinas (denotado R) y pirimidinas (denotado Y),
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+ -
Figura 6 Primaria nudos (panel superior) y catenanos (panel inferior) de
signos diferentes.
Figura 7 B-ADN cruciforme transición. Las franjas rojas y azules se
mitades complementarias de una repetición invertida. tiras Negro son el ADN adyacentes.
Fractal tiras de negro son las regiones desenrollado.
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d (RY) n, puede adoptar una conformación de ADN llamada ADN-Z
(Figura 8). Estas repeticiones son mucho más comunes en
eucariotas que en el ADN bacteriano. Por ejemplo, una repetición
(CA) n. (TG) n es uno de los más comunes en los microsatélites
en el ADN de eucariotas, presente en aproximadamente 50 000 ejemplares
por genoma humano. Z-DNA es el mejor caracterizado
conformación del ADN alternativa ya que su estructura de cristal
se ha resuelto con una resolución atómica. Aunque se trata de un
doble hélice, que es fundamentalmente diferente de B-DNA.
En primer lugar, Z-DNA es una doble hélice zurda con un período de
de 12 pares de bases por vuelta. Esto significa que topológicamente,
durante la transición B-to-Z, no sólo los complementarios
Hebras de ADN completamente desasociar, pero el viento también
en la dirección opuesta. Por lo tanto, la transición de n helicoidales
vueltas de la B-DNA en el Z-conformación debe
versión 1.8n superhelicoidales negativas. Esto hace que la formación de
Z-ADN en el ADN superenrollado negativamente excepcionalmente
favorables, incluso para las repeticiones relativamente corto. En la práctica,
esta estructura se ve favorecida y no sólo en virtud de exóticos
condiciones tales como la fuerza iónica muy alto, o la metilación
de todas las citocinas en la repetición de Z que forma en el ADN lineal.
En segundo lugar, la estructura se llama Z-DNA debido a la
en zig-zag de configuración de su esqueleto de azúcar-fosfato.
Debido a la naturaleza repetitiva del ADN Z-formación
secuencias, hay dos pasos definidos a lo largo de una cadena de ADN,
RPY YpRand. Las rotaciones relativas de los adjacentDNA
bases en los dos pasos son muy diferentes: 98 para el RPR
paso y 518 para el paso RPY. Por lo tanto, un azúcar-fosfato
columna vertebral a aYpRstep es casi recto, pero es seguido por
un giro brusco en la fase de RPY. En consecuencia, el
unidad simétrica en Z-DNA es un dinucleótido, en comparación
con un mononucleótido en el B-DNA. Esto también conduce a
el hecho de que la doble hélice del ADN-Z tiene un solo
surco profundo, lo que corresponde al surco menor en el
B-DNA.
Otros dos rasgos distintivos química de Z-DNA
son las conformaciones de las bases y la desoxirribosa del ADN.
Desoxirribosa adopta la conformación del C3 denominada 'endo
en el Z-DNA, en comparación con la conformación endo el C2 'de
desoxirribosa en B-ADN. Purinas en Z-DNA se encuentran en una synconformation,
mientras que las pirimidinas se encuentran en una lucha contra la conformación
en relación con desoxirribosa. Por lo tanto, existe una regular
alternancia de conformaciones syn y anti-base a lo largo
la cadena de ADN en el Z-estructura. De hecho, el requisito
para la secuencia Z-formación a ser un habitual
alteración de las purinas y pirimidinas depende en gran medida
el hecho de que el síndrome de conformación es desfavorable para
pirimidinas.
H-ADN
repite espejo son segmentos de ADN que el ADN en las bases
que son equidistantes del centro de la simetría en un ADN
capítulo son idénticos el uno al otro. Un subgrupo de estos
reitera que son homopurina-homopyrimidine, es decir, contienen
sólo en purinas y pirimidinas oneDNAstrand sólo
en la línea de otro, se llama H-palíndromos. Hpalindromes
son enormemente sobrerrepresentadas en eukaryoticDNAbut
ocurren con una frecuencia oportunidad en bacterialDNA.
Estas repeticiones pueden adoptar una conformación inusual llamada
H-DNA en un estado superenrollado negativamente (Figura 9).
El principal elemento OFH-DNAis un triple intramolecular
hélice. Para construir esta estructura, una cadena de ADN a partir de la mitad
de la repetición se pliega hacia atrás, forma un triple con las dos caras
medio de la repetición, mientras que su complemento sigue siendo singlestranded.
Como puede verse en la Figura 9, los dos
hebras complementarias de ADN no están vinculados en este
estructura, es decir, topológicamente, la formación de H-DNA se
equivalente a la anulación de la homopurina toda-
tramo homopyrimidine. Por lo tanto, se ve favorecida en forma negativa
ADN superenrollado. Puesto que la estructura contiene una amplia
solo strandedDNAsegment, así como triple-doble cara a
y dúplex a una sola línea de uniones, la nucleación
la energía es bastante alto, 18 kcal mol21. En consecuencia, HDNA
Es poco probable que la forma en el ADN lineal.
Dependiendo de la naturaleza química de la cadena de ganado
al triple, ya sea de purina o pirimidina, hay dos
subclases de H-ADN llamados Hy o hora, respectivamente. La
el formulario H-y se construye a partir de T * AT y GC * C1 tríadas
(Figura 10a), donde pirimidinas desde el tercer capítulo se
situado en el surco mayor y la forma Hoogsteen
enlaces de hidrógeno con los purines de las dos caras. La
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Figura 8 La transición de la mano derecha de B-DNA en ZDNA zurdos
por una purina alterna / secuencia de pirimidina. Las tiras de color verde / rojo
muestran la región de alternar purinas / pirimidinas. tiras Negro son
ADN adyacentes. Fractal tiras de negro son las regiones desenrollado.
Figura 9 H-ADN está formado por el espejo homopurina-homopyrimidine
repite. Una hebra de ADN de la mitad de la repetición se pliega formando un
triplex con semidúplex la repetición, mientras que su complemento sigue siendo singlestranded.
El lazo negro representa la línea de homopurina, el rojo
la cinta es la línea de homopyrimidine y cintas verdes son el ADN adyacentes.
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extingency de protonación citosina hace que esta estructura
preferencia de conformidad con un pH moderadamente ácido. La forma de H-r puede ser
construcción de CG * G, TA A * y, a veces tríadas * AT T. En H-r
tríadas, las bases del ADN de la forma inversa tercer capítulo
Hoogsteen enlaces de hidrógeno con los purines de las dos caras
(Figura 10b). Estas tríadas son estables a physiologicalpHand
son, además, se estabilizó en la presencia de bivalentes
cationes.
Otras conformaciones ADN alternativa
Hay otras conformaciones ADN que podría ser
se espera que ocurra en el ADN superenrollado negativamente. Algunos
de ellos están bien definidas estructuralmente, pero aún no se detecta
experimentalmente en el ADN superhelicoidal. Otros han sido
detectado en el ADN superhelicoidal, pero su estructura fina
claro.
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H
G
C +
C
G
G
C
Un
T
T
Un
T
Un
Un
T
T
A. Tríadas Hoogsteen B. Invertir Traids Hoogsteen
Figura 10 tríadas H-DNA.
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G-cuarteto
Esta estructura (Figura 11) puede estar formado por repeticiones directas
contiene en tándem funciona concertada de guaninas. La
elementos de construcción se apilan corre G4 que se estabilizan
por algunos cationes monovalentes (Figure11b). Esta estructura es
definitivamente formado por una sola fila en tándem directa del G-ricos
repite (como repeticiones teloméricas en eucariotas) y es
ampliamente caracterizado con una resolución atómica. Sin embargo,
sólo hay indicios fragmentarios que existe en
ADN superhelicoidal.
S-ADN
repite en tándem directo de la composición de forma aleatoria puede
adoptar una estructura llamada cayó de cadena de ADN (S-ADN).
Esta estructura (Figura 12) utiliza la multiplicación repetida
la naturaleza de la secuencia: a la desnaturalización y renaturalización,
las repeticiones complementarias pueden mispair, resultando en una
peculiar combinación de tramos de doble hélice intercaladas
con bucles de cadena sencilla. Esta conformación es
termodinámicamente desfavorables en el ADN lineal, sino que puede
ser atrapado cinéticamente. En el ADN superhelicoidal, podría
son favorables, dada la liberación de importantes
las torsiones. Los lazos pueden ser estabilizado por el hidrógeno
bonos para algunas de las unidades repetidas, por lo que S-ADN, incluso
más factible. Sin embargo, la prueba inequívoca de la
existencia de S-ADN en el ADN superhelicoidal todavía falta.
ADN-desenrollar elementos
Estas son secuencias muy rica en AT con un cierto sesgo
en la distribución de adeninas y timinas entre el
dos cadenas de ADN. Aparte de eso, no hay evidentes
similitudes entre las secuencias de diferentes DNAunwinding
elementos. Bajo la influencia de negativeDNA
superenrollamiento, estos elementos sufren una transición hacia una
estable conformación desenrollado. Esta transición es no cooperativo,
es decir, la longitud de la zona desenrolla poco a poco
aumenta con el aumento de la densidad de superenrollamiento. La
mecanismo de esta transición es poco conocida. DNAunwinding
elementos que se encuentran a menudo en la replicación
orígenes, los sitios de unión de la matriz y otras importantes
elementos de los genomas pro y eucariotas.
Métodos de detección y análisis
superenrollamiento del ADN ha sido analizada por una variedad de
enfoques y sólo los más comunes se describen
a continuación. Uno de los primeros métodos utilizados históricamente fue el
valoración de superenrollamiento densidad por la sedimentación en
bromuro de etidio gradientes de densidad de sacarosa. Este método
se basa en dos hechos: (1) porque las moléculas de superenrollado
son más compactos que los relajados, que los sedimentos más rápido
a través de un gradiente de densidad de sacarosa; bromuro (2) etidio
intercala entre los pares de bases stackedDNA, relajarse
la doble hélice por 268 por la molécula intercaladas. Como
discutido anteriormente, el ADN desenrollado conduce a una liberación de
superhelicoidales negativas. Cuando negativamente ADN superenrollado es
sometido a centrifugación a través de la densidad de sacarosa
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(A) (b)
G
C2 N1
C6 N3
C4 C5
O6
H H N2
H
N7 C5
O6
C6
C4
N3
N1
C2
H
N2
H
H
O6 C6
N7
C8
N9
H
R
H N2
H
C2 C4
N3
C6 H
C5 N1
O6
R
R
N9
R C8
H
H
H
N7
N2
H
H
C2 N1
N3
H
C8
C4 C5
N9
N9
G
G
G
K +
N7
C8
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
Figura 11 G-cuarteto. (A) Visión general. La línea de negro es la cadena de ADN y los rectángulos de color morado son los apilados del G-cuartetos. (B) Estructura de un Gquartet.
Figura 12 Formación para el deslizamiento de cadena de ADN por repeticiones en tándem directo.
En caso de separación por cada tira, repite complementarias pueden mispair, resultando en una
combinación de tramos de doble hélice intercalados con una sola fila
bucles. Las franjas rojas y azules son hebras complementarias de un particular
repeticiones en tándem, las tiras de negro son el ADN adyacentes.
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gradiente con concentraciones crecientes de etidio
bromuro, su coeficiente de sedimentación disminuye primero hasta
todos los superhelicoidales negativos se eliminan, sino que aumenta a continuación,
tras la acumulación de supercoils positivos. Por
medir una concentración de colorante crítica necesaria para la
relajación completa de un ADN superenrollado negativamente
muestra su densidad superenrollamiento se puede calcular. Se trata de un
preciso, pero laborioso enfoque y fue posteriormente
reemplazado por métodos menos electroforético complejo.
métodos electroforéticos también se basan en la diferencia
en forma entre superenrollado y relaxedDNAmolecules.
Circular de las moléculas de ADN cada vez más compacta, con un
aumento de la densidad de superenrollamiento y migrar más rápido a través
un gel de agarosa que sus contrapartes relajado. En consecuencia,
sobre la separación de una mezcla de ADN topoisómeros
en un gel de agarosa, una escalera de bandas ofDNA se puede observar,
donde las bandas de vecinos son químicamente idénticos pero
difieren en t por 1. Sin embargo, la resolución de una norma
gel de agarosa no es suficiente para topoisómeros con alta
co densidad de superenrollamiento, y que-la migración como una sola
banda. (Esta es la razón por una muestra de ADN del plásmido que
normalmente s 20,05 migra como una banda única en un
gel.) Para separar estas topoisómeros ADN altamente superenrollado,
electroforesis en gel de agarosa se realiza en el
presencia de un intercalator, por lo general la cloroquina. Por
desenrollar la doble hélice, esto convierte intercalator
altamente superenrollado negativamente topoisómeros en menos superenrollado
otros, lo que permite su resolución en un gel.
La desventaja de la electroforesis de una dimensión es
que no permite el análisis de mezclas complejas de
DNAtopoisomers que a la vez puede incluir tanto
positiva y superenrollado negativamente topoisómeros de
diferentes densidades. Este objetivo puede lograrse mediante el uso de
de dos dimensiones electroforesis en gel de agarosa. Una mezcla de
topoisómeros ADN primero se separa en una norma de agarosa
gel. Aquí la movilidad de forma positiva y negativa
superenrollado topoisómeros ADN aumenta con un aumento
en el valor absoluto de su camiseta hasta que se alcanza la saturación.
Tenga en cuenta que en caso de separación en la primera dimensión,
topoisómeros con el mismo número de vueltas superhelicoidales de
signo opuesto prácticamente co-migrar. Para resolver estos comigrating
topoisómeros, electroforesis en una segunda dirección,
perpendicular a la primera, se desempeñasen en el
presencia de cloroquina. Desde que se desenvuelve la cloroquina
ADN superenrollado negativamente topoisómeros ser menos
superenrollado y migrar con mayor lentitud, mientras que de manera positiva
los superenrollado ganancia supercoils extra y migrar más
rápidamente. En consecuencia, las movilidades de los anteriormente co-emigrado
topoisómeros de signos opuestos se hacen diferentes en
acuerdo con sus reales t. En la foto de arco como se muestra en
(Figura 13), el brazo derecho representa positivamente superenrollado
topoisómeros mientras que el brazo izquierdo corresponde a la negativa
topoisómeros superenrollado.
Mientras que los métodos anteriores se pueden utilizar para determinar la
superenrollamiento densidad de ADN circular, dan poco
información sobre la forma de las moléculas de ADN superenrollado.
Esta pregunta puede ser tratado adecuadamente por
técnicas de microscopía electrónica. La microscopía electrónica
permite que la forma real de una molécula superenrollada ser
visto y el número de cruces por una molécula de ser
contados. La desventaja de la electrónica convencional
microscopía es que la conformación del ADN puede cambiar
durante la preparación de la muestra. Además, es difícil determinar
el signo de un cruce. Estos problemas pueden ser abordados por
criomicroscopía electrónica microscopía. Aquí, una muestra de ADN en un agua
solución se enfría rápidamente to21508C. Como resultado, el ADN
moléculas son capturados en una capa delgada de agua y vitrificados
sus imágenes en tres dimensiones se pueden obtener. Uso de
estos métodos, se ha demostrado que la relación Wr / t 0,75
en el ADN superenrollado y que una fracción significativa de
moléculas superenrollado contienen estructuras ramificadas.
El método más fiable para medir el ADN superenrollamiento
in vivo se basa en la tasa de psoraleno photobinding
al ADN. Este compuesto se intercala en el ADN y pueden
formar un entrecruzamiento con las pirimidinas adyacentes en la
oppositeDNAstrands cuando absorbe luz de 360 nm. Desde
unión de un ADN intercalator desenrolla, que preferentemente
se une a superenrollado, en lugar de ADN relajado. Por lo tanto,
tratamiento de células con psoraleno seguido por la medición de la
eficiencia de psoraleno entrecruzamiento proporciona una estimación de
superenrollamiento densidad en vivo. Un control esencial aquí es la
medición de psoraleno photobinding a un completo
ADN relajado intracelular, lo que se consigue normalmente
saturación de la irradiación de rayos X de las células.
Otro valioso enfoque se basa en la eficiencia de
la formación de estructuras alternativas del ADN in vivo. Por
ejemplo mediante la comparación de la tasa de formación de cruz en
in vitro en condiciones fisiológicas con la de una cruz
formación en el ADN intracelular (determinado según lo descrito
más adelante) una estimación razonable de la densidad de superenrollamiento en vivo puede ser
obtenidos.
También existen numerosos enfoques para el estudio de
estructuras alternativas del ADN in vitro. Una forma topológica de
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segunda dimensión
dimensión de primera
0
+1
+5
-10 +10
-5
-1
(A) -15 -20
segunda dimensión
dimensión de primera
0
+1
+5
-10 +10
-5
-1
-15
-20
(B)
Figura 13 análisis electroforético bidimensional de una mezcla de ADN
topoisómeros (a) sin transiciones estructurales locales y (b) con un local
transición hacia una conformación de ADN alternativa. Llena de círculos marrón
representan topoisómeros relajada, llena de círculos rojos son positivamente superenrollado
topoisómeros y lleno de círculos azules son superenrollado negativamente topoisómeros.
Vaciar los círculos azules (b) mostrar el resultado de la movilidad prevista de topoisomers215
TO220 si no se produjo la transición.
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la detección de estas estructuras utiliza gel de dos dimensiones
electroforesis. Si una transición hacia una conformación no-B
se produce, acompañado por la liberación de algunos superhelicoidal
el estrés, la movilidad de los correspondientes topoisómeros
disminuiría. Así, el topoisomer en transición
que co-migran con un topoisomer menos superenrollado en el
primera dimensión de la electroforesis. Debido a la presencia
de un intercalator en la segunda dimensión de la electroforesis,
la tensión superhelicoidal se libera y alternativa
estructuras de ADN se convierten en la B-forma. Posteriormente,
movilidades de los anteriormente co-emigraron topoisómeros se
diferentes, de acuerdo a sus reales t. Un aumento gradual de
movilidad topoisomer se puede ver en la imagen final, hasta que
hay una fuerte caída, lo que refleja la transición (Figura 13b).
Desde su patrón de dos dimensiones, dos características importantes
de una transición estructural se puede obtener: (1)
número de supercoils liberados durante la transición, y (2)
la densidad de superenrollamiento necesarias para la transición. Si el
longitud de la secuencia de la adopción de una nueva configuración es
se conoce, el número de supercoils permitirá a la topológica
situación de esta conformación que se deduce. Medición de la
la densidad de superenrollamiento permitirá que la energía libre necesaria
que se calcula.
La formación de estructuras de ADN alternativa es acompañada
por la aparición de tramos de cadena sencilla
ya sea dentro de las estructuras (como en la cruz o ADN-H)
o en sus fronteras con adyacente B-ADN (como en el Z-DNA).
Por lo tanto, estas estructuras pueden ser detectados por las enzimas y
productos químicos que reconocen específicamente una sola strandedDNA.
Estos agentes se utilizan ampliamente, ya que permiten singlestranded
regiones que se asigna a una resolución de secuencia, es decir,
que proporcionan información estructural bien. Monocatenario
nucleasas específicas de ADN-S1 y P1 son los más comúnmente
utilizada por los enzimas. Superhelicoidal ADN se trata con
cantidades no saturados, de una nucleasa seguido por la restricción
la digestión, al final el etiquetado y la electroforesis en gel de secuenciación.
Como resultado, un patrón de división en un nivel básico puede ser
visto.
También hay productos químicos conveniente que preferentemente
modificar una sola fila bases de ADN. Dietílico pirocarbonato
carboxyethylates purinas en sus posiciones en N7
sola cadena de ADN o la conformación Z. Osmio
formas tetróxido osmate ésteres con el C5-C6 doble enlace
de una sola fila timinas. Cloroacetaldehído formas
ethenoderivatives con las posiciones de apareamiento de bases de
adeninas, citosinas y, menos prominente, guaninas.
El permanganato de potasio oxida timinas monocatenario
y, en menor medida, citocinas. Todos estos
residuos modificados son detectables con una resolución de nucleótidos
después de la escisión piperidina, seguida de la secuenciación del gel
electroforesis.
Los métodos más fiables para el estudio de alternativas
ADN in vivo se basan en la química de sondeo. Algunos de los
productos químicos descritos anteriormente, incluyendo el tetróxido de osmio,
cloroacetaldehído, permanganato de potasio y psoraleno,
penetrar en las células pro-y eucariotas. Intracelular
El ADN es aislado después de la modificación química, con modificaciones,
bases de ADN se detectan. Esto se puede hacer ya sea por
químicos convencionales de secuenciación de ADN o, por cromosómicas
ADN, por métodos más sofisticados de genómica
secuenciación.
Papel de la topología del ADN en el genoma
Funcionamiento
Como se mencionó en el principio de este artículo,
las unidades operativas de prácticamente todos los genomas de ADN son
dominios topológicos. Estos pueden ser simplemente ADN circular,
típica para prácticamente todas las bacterias, mitocondrias y cloroplastos,
ADN, etc, o son grandes bucles adjunta a la
matriz nuclear, como es el caso de los cromosomas eucarióticos.
Por último, los extremos de ADN lineal de algunos virus pueden ser
colocada en la membrana celular. Esto indica que ciertas
características de topológicamente restringida ADN les hizo
ventajosa en el curso de la selección natural.
Una característica importante proviene de ecuación [1]. Esto demuestra que
para un dominio ADN topológicamente cerrado, cualquier cambio de un
secondaryDNAstructure (Tw) se refleja inmediatamente por
un cambio en su forma general (Wr). Por lo tanto, un cambio local en un
topológicamente cerrado ADN, por ejemplo relajarse causada por un
unión a proteínas, se reflejan inmediatamente por un cambio
en el superenrollamiento de la molécula entera, y viceversa. Este
ofrece dos importantes beneficios biológicos. En primer lugar, si es celular
máquinas pueden detectar una relación entre local y global
cambios en el ADN, puede estar seguro de que ambas cadenas de ADN
son integrales, es decir, el ADN no está dañado. Otra garantía de
que el ADN no está roto viene de su superenrollamiento. Como
se discutió anteriormente, es la torsión del ADN superenrollado subrayó,
por lo tanto la aparición de una suela de un solo descanso transición a la competencia dentro de
que conduce a la relajación inmediata. Mientras que el ADN es
superenrollado, no contiene saltos de ADN. Está claro que es
Convendría saber si el ADN está dañado antes de tomar decisiones
en su réplica se hacen. No es de extrañar, son replicones,
por-y-grandes, topológicamente restringida. Tenga en cuenta que este
tema ha sido más estudiado en el procariotas
sistemas, donde se ha demostrado de forma inequívoca
superenrollamiento del ADN que es un requisito previo para la replicación
iniciación. Mientras que algunos estudios insinúan que el mismo es cierto para
eucariotas, se necesitan más datos para apoyar esta conclusión.
El segundo beneficio es que la estructura del ADN en el cambio
un segmento de ADN puede ser inmediatamente detectada en un control remoto
segmento de ADN, es decir, ADN topológicamente son limitados
ideal para la comunicación a distancia. Esto es
importante para muchos procesos genéticos regulada a través de
interacción de dos o más segmentos de ADN separados.
iniciación de la transcripción en pro y eucariotas, por
ejemplo, es a menudo co-regulados por las proteínas que interactúan con
segmentos de ADN separados por cientos o incluso miles
de pares de bases. Este es, sin duda fuera del alcance de un particular
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interacción proteína-proteína en un linearDNAmolecule. Es
ampliamente asumido, por lo tanto, que alguna forma de topológico
la comunicación entre los segmentos de ADN a distancia
involucrados. Del mismo modo, en muchos casos, la recombinación genética
se produce entre los segmentos de ADN muy lejano.
Además de ser topológicamente cerrado, el ADN en la mayoría de
casos es superenrollado. Intracelular del ADN en las bacterias es
de hecho hincapié en la torsión y tiene todas las propiedades de
ADN superenrollado se describe anteriormente. La situación es más
complicado en los eucariotas. Supercoils se acumulan en
la cromatina, donde el ADN se envuelve alrededor de los nucleosomas.
Por lo tanto, a menos que los nucleosomas se quitan, thisDNAis
No torsión restringida. Durante el funcionamiento del genoma,
Sin embargo, los nucleosomas debe ser eliminado o
reubicadas. Se cree, por tanto, que el ADN eucariota
es por lo menos transitoriamente superenrollado. Es revelador considerar
las ventajas biológicas de superenrollamiento del ADN.
DNAis superenrollado negativamente en la mayoría de los organismos vivos,
pro y eucariotas. La razón de que es probablemente el
hecho de que el ADN tiene que ser desenrollada, al menos temporalmente, a
participar en todos los procesos de la genética importante. La replicación del ADN
parte de la primera anulación de la replicación
origen y posteriormente se expande hacia el resto de la
molécula. Durante la transcripción, el ARN polimerasa desenrolla
un ADN de 15 pb a lo largo del segmento a un promotor
seguido de su desplazamiento a lo largo de la plantilla de ADN.
Dos moléculas de ADN intercambiar sus hebras individuales en
el curso de la recombinación homóloga, que requiere
línea de separación en las parejas. Dado que, como se discute
anteriormente, superenrollamiento negativo hace que el ADN desenrollado
energéticamente favorable, todos los procesos anteriores debe
ser facilitado por el superenrollamiento negativo. De hecho, hay
amplia evidencia de que la replicación del ADN, transcripción y
recombinación son estimuladas por el superenrollamiento negativo.
Además, en algunos casos, superenrollamiento negativo es absolutamente
necesarios para esos procesos. Tenga en cuenta, sin embargo, que
los datos más fiables sobre el papel de superenrollamiento del ADN se
obtenidos para el sistema de procariotas, donde el ADN es de hecho
torsión subrayó. Si bien hay datos fragmentarios sobre la
los efectos de superenrollamiento en eucariotas, la situación
es más complicado (ver arriba) y además garantiza
los estudios.
Curiosamente, mientras que los procesos básicos de genética dependen de
DNAsupercoiling, pueden, a su vez, cambia la última. La
mejor estudiados caso de este tipo de relaciones es el proceso de
transcripción. ARN polimerasa desenrolla un segmento de ADN
en un sitio de inicio de la transcripción y se transloca a lo largo de la
gen transcrito. Este ADN translocación fuerzas para girar
alrededor de la elongación de la RNA polimerasa, para que negativas
y ondas positivas de superenrollamiento se generan aguas arriba
y aguas abajo del mismo, respectivamente (Figura 14). Esta así llamada
superenrollamiento transcripcional está bien documentada tanto
in vitro e in vivo. Dado que las ondas se disipan superenrollamiento
rápidamente, el superenrollamiento del ADN de la transcripción es principalmente
dinámica y difiere de la superenrollamiento en estado estacionario
se describe anteriormente. Sin embargo, se sabe que afectan a la estructura y
funcionamiento de los genes que se encuentran en importantes
distancias de un segmento de ADN transcrita.
Algunas arqueas viven en temperaturas extremadamente altas, es decir,
en condiciones en que la separación no deseada de ADN
hebras puede suceder. superenrollamiento negativo sólo
agravar este problema en este caso. Una solución elegante
para este problema encontrado por los termófilos es mantener
su ADN superenrollado positivamente. Desde corrección de los
positivamente ADN superenrollado es energéticamente desfavorable,
esto proporciona una barrera topológica de la cadena de ADN
separación.
Superenrollamiento también mejora sustancialmente la probabilidad
de la yuxtaposición de segmentos de ADN a distancia. Está claro que
equiparación de los dos segmentos de ADN a distancia se produce como
resultado de un randomDNAwalk. Este paseo procede en tres
dimensiones en un nonconstrained (relajado circular o lineal)
molécula de ADN, por lo que la colisión de segmentos distantes
relativamente poco probable. Sin embargo, esta es esencialmente una unidimensional
caminar a lo largo del eje superhélice en barra-como supercoiledDNA
moléculas. Por lo tanto en el ADN superhelicoidal, la probabilidad
del segmento de colisión aumenta en aproximadamente dos órdenes
de magnitud. Esta característica del ADN superenrollado es
importante para los procesos genéticos que requieren colisión de
segmentos distantes de ADN, y está particularmente bien documentado
para la recombinación sitio-específica de las bacterias.
Función biológica de ADN Alternativa
Estructuras
Utilizando los métodos experimentales se discutió anteriormente,
estructuras alternativas del ADN, incluyendo cruciformes, ZDNA
y H-DNA, se ha encontrado que existen en vivo.
A pesar de importantes esfuerzos, sin embargo, sus biológica
funciones siendo difícil de alcanzar. cruciformes de ADN han sido
implicados en la iniciación de la replicación del ADN, la transcripción
y la recombinación en los dos pro-y eucariotas. ZDNA
podrían estar involucrados en el acoplamiento de la transcripción
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Figura 14 Un modelo de superenrollamiento del ADN de la transcripción. ARN polimerasa
transloca un segmento de ADN desenrollado a lo largo del gen transcrito. Este
translocación del ADN a las fuerzas para girar alrededor de la polimerasa de ADN, de modo que
superenrollamiento del ADN negativo y positivo se genera aguas arriba y aguas
aguas abajo de la enzima, respectivamente. El círculo gris representa ARN
polimerasa, las cintas de color marrón se desenrolla el ADN, el lazo rojo es un
ola superenrollamiento positivo y azul de la cinta es un superenrollamiento negativo
onda. Flecha indica la dirección del movimiento de la polimerasa.
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alargamiento withRNAprocessing en eucariotas. Se ha
especuló que H-ADN positiva puede regular la
iniciación de la transcripción y replicación, inhibir la transcripción
y el alargamiento de replicación, y sirven como un punto de acceso
para la recombinación homóloga. ADN-desenrollar elementos
Se cree que participar en la iniciación de la replicación.
G-cuartetos podrían participar en el mantenimiento de la integridad
del ADN cromosómico termina en eucariotas. Por último,
varias proteínas que reconocen específicamente estos inusuales
DNAconformations se han aislado y caracterizado.
La proteína más estudiada de este tipo es un eucariota
enzima adenosina deaminasa dsRNA, que une a Z-DNA
con el mayor grado de especificidad. Los estudios futuros se
necesaria para distinguir entre estos numerosos ya veces
ideas conflictivas.
Lecturas
CR Calladine y Drew HR (1997) Descripción de ADN: La Molécula
y cómo funciona. ed segundo. San Diego, EE.UU.: Academic Press.
Frank-Kamenetskii MD (1997) Desentrañar el ADN: El más importante
Las moléculas de la vida. Lectura, EE.UU.: Addison Wesley.
RR Sinden (1994) Estructura y función del ADN. San Diego, EE.UU.:
Academic Press.
Travers Un Interacciones (1993), la proteína ADN. Londres, Reino Unido: Chapman
y Hall.
Vologodskii Una topología (1992) y Física de ADN circular. Boca
Raton, EE.UU.: CRC Press.
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