toksisitas 4-vynilcyclohexene diepoxide (vcd) …... · sruktur kimia 4- vynilcyclohexene dan...
TRANSCRIPT
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
TOKSISITAS 4-VYNILCYCLOHEXENE DIEPOXIDE (VCD)
TERHADAP STROMA OVARIUM
Studi pada tikus galur Wistar ( Rattus Novergicus Lam )
(Studi Pendahuluan)
TESIS
Disusun untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan
Mencapai Derajat Magister Kesehatan
Program Studi Magister Kedokteran Keluarga
Minat Utama Ilmu Biomedik
Oleh:
Arif Dharmawan
S500907009
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2012
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
ii
Halaman Pengesahan Tesis
TOKSISITAS 4-VYNILCYCLOHEXENE DIEPOXIDE (VCD)
TERHADAP STROMA OVARIUM
Disusun Oleh:
Arif Dharmawan
S500907009
Telah Disetujui oleh Tim Pembimbing untuk
Komisi
Pembimbing Nama Tanda Tangan Tanggal
Pembimbing I Dr.Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG (K)
NIP. 196208221989122001
…………. ………
Pembimbing II Prof.Dr.J.B.Dalono , dr., Sp.OG (K)
NIP. 194105041970041001
.………… ………
Ketua Program Studi
Magister Kedokteran Keluarga
Dr. Hari Wujoso, dr.,SpF,M.M
NIP. 196210221995031001
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
iii
TOKSISITAS 4-VYNILCYCLOHEXENE DIEPOXIDE (VCD) TERHADAP
STROMA OVARIUM
Studi Pendahuluan pada tikus galur Wistar ( Rattus Novergicus Lam )
Disusun Oleh:
Arif Dharmawan
S500907009
Telah Disetujui oleh Tim Penguji
Pada hari :
Tanggal :
Jabatan Nama Tanda Tangan
Ketua Dr. Hari Wujoso, dr.,SpF,M.M
NIP. 196210221995031001
Sekretaris Prof. Dr. Harsono Salimo, dr.,SpA NIP. 19483131976101001
Anggota Penguji 1. Dr. Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG(K)
NIP. 196208221989122001 2. Prof. Dr.JB. Dalono,dr, Sp.OG (K)
NIP. 194105041970041001
Mengetahui,
Ketua Program Studi Magister
Kedokteran Keluarga
Dr. Hari Wujoso, dr.,SpF,M.M
NIP. 196210221995031001
Direktur Program
Pascasarjana
Prof.Dr.Ir.Ahmad Yunus, MS NIP 196107171986011
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
iv
PERNYATAAN
Nama : Arif Dharmawan
NIM : S500907009
Menyatakan dengan sesungguhnya bahwa tesis berjudul Toksisitas 4-
Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) Terhadap Stroma Ovarium adalah betul-
betul karya sendiri. Hal-hal yang bukan karya saya, dalam tesis tersebut diberi
tanda citasi dan ditunjukkan dalam daftar pustaka.
Apabila di kemudian hari terbukti pernyataan saya tidak benar, maka saya
bersedia menerima sanksi akademik berupa pencabutan tesis dan gelar yang saya
peroleh dari tesis tersebut.
Surakarta, Juni 2012
Yang membuat pernyataan
Arif Dharmawan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
v
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum Wr. Wb.
Alhamdulillahirobbilalamin Yaa Allah, segala puji dan syukur saya
panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan Rahmat, Taufik dan
Hidayah Nya sehingga saya dapat menyelesaikan tesis ini yang disusun untuk
memenuhi persyaratan dalam mengikuti Program Studi Dokter Spesialis I di
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret serta untuk memenuhi persyaratan
mencapai derajat Magister Kesehatan di Program Studi Magister Kesehatan
Universitas Sebelas Maret Surakarta dengan judul “Toksisitas 4-
Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) Terhadap Stroma Ovarium ”.
Terimakasih yang tak terhingga dan penghargaan yang sebesar-besarnya
saya sampaikan kepada Dr.Hj. Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG(K) sebagai
pembimbing I yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah memberikan
dorongan, bimbingan, dan saran di tengah kesibukan beliau yang begitu padat
masih berkenan meluangkan waktu untuk memberi petunjuk, dalam proses
penyelesaian tesis ini.
Terimakasih yang tak terhingga dan penghargaan yang sebesar-besarnya
juga saya sampaikan kepada Prof. Dr. JB Dalono, dr., Sp.OG (K) dan A Laqif,
dr SpOG (K) sebagai pembimbing II yang dengan penuh perhatian dan kesabaran
telah memberikan dorongan, bimbingan, dan saran serta arahan, memecahkan
masalah yang timbul dan ikut membantu dalam proses penyelesaian tesis ini.
Terimakasih yang tak terhingga dan penghargaan yang sebesar-besarnya
juga saya sampaikan kepada Dr. Abkar Raden, dr., Sp.OG (K) sebagai
koordinator tesis yang telah memberikan dorongan, waktu dan kesempatan yang
seluas-luasnya dalam proses penyelesaian tesis ini.
Terimakasih yang tak terhingga dan penghargaan yang sebesar-besarnya
juga saya sampaikan kepada tim penguji, yang telah berkenan memberikan waktu
dan tenaga dalam proses penyelesaian tesis ini.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
vi
Dengan selesainya tesis ini, perkenankanlah pada kesempatan ini saya
mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya dan rasa hormat setinggi-
tingginya kepada yang terhormat:
1. Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.Si., sebagai Rektor Universitas Sebelas
Maret Surakarta.
2. Prof. Dr. Ir. Ahmad Yunus, MS sebagai Direktur Pascasarjana
Universitas Sebelas Maret Surakarta.
3. Dr. Hari Wujoso, dr.,SpF,M.M, sebagai Ketua Program Studi Magister
Kedokteran Keluarga Universitas Sebelas Maret Surakarta.
4. Prof. Dr. Zainal Arifin Adnan, dr., Sp.PD-KR., sebagai Dekan
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
5. Basoeki Sutardjo, drg., MMR., sebagai Direktur RSUD Dr. Moewardi
Surakarta.
6. Dr. Supriyadi Hari R, dr., Sp.OG., sebagai Ka. Bag SMF Obgin
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
7. Dr. Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG (K)., sebagai KPS SMF Obgin
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
8. Affi Agelia dr.SpOG. Mkes., sebagai SPS SMF Obgin Fakultas
Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
9. Seluruh Staff PPDS I Bagian Obgin Fakultas Kedokteran Universitas
Sebelas Maret Surakarta. Prof. Dr. JB Dalono, dr., Sp.OG (K)., Dr.
Soetrisno, dr., Sp.OG (K)., Dr. Supriyadi Hari R, dr., Sp.OG., Dr.
Abkar Raden, dr., Sp.OG (K)., Rustam Sunaryo, dr., Sp.OG,
Glondong Suprapto, dr., Sp.OG, Darto, dr., Sp.OG, Dr. Sri
Sulistyowati, dr., Sp.OG (K)., A. Laqief, dr., Sp.OG (K)., Prof. Dr.
KRMT. Tedja D.O, dr., Sp.OG (K)., Tribudi, dr., Sp.OG (K)., Eriana
Melinawati, dr., Sp.OG (K)., Heru Priyanto, dr., Sp.OG (K).,
Wuryatno, dr., Sp.OG., Glondong Suprapto, dr., Sp.OG., Hermawan
U, dr., Sp.OG., Teguh Prakosa, dr., Sp.OG., Wisnu Prabowo, dr.,
Sp.OG., Affi Angelia R, dr., Sp.OG., Muh. Adrianes Bachnas, dr.,
Sp.OG., Eric Edwin, dr., Sp.OG.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
vii
10. Saya juga mengucapkan banyak terima kasih kepada H. Rusbandi, dr.
SpOG Kepala Bagian Obstetri dan Ginekologi RSU Sragen, Nugroho
Adiwarso, dr SpOG Kepala Bagian Obstetri dan ginekologi RSU Blora,
Eka Budi W, dr. MKes., SpOG Kepala Bagian Obstetri dan Ginekologi
RSU Wonogiri, H. Suroso, dr. SpOG Kepala Bagian Obstetri dan
Ginekologi RSU Kebumen, H. Suwaryo Madsukadi, dr. SpOG Kepala
Bagian Obstetri dan Ginekologi RSU Cepu, L Budiadi, dr SpOG
Kepala bagian Obstetri dan Ginekologi RSU Pandanarang Boyolali yang
selalu memberikan bimbingan dan memberi kesempatan kami untuk
belajar dan menimba pengalaman di rumah sakit jejaring tersebut.
11. Prof.Kuniarsih, drh, MVSc., PhD , Kepala Bagian Patologi Fakultas
Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta beserta semua
staf dan tenaga tehnis atas izin dan kesempatan yang diberikan untuk
menggunakan fasilitas laboratorium dalam penelitian tesis ini.
12. Semua rekan residen PPDS I Obgin Fakultas Kedokteran Universitas
Sebelas Maret Surakarta yang banyak membantu dalam pelaksanaan tesis
ini. Kepada para dokter muda/co-asisten , bidan dan paramedik saya
ucapkan terima kasih atas kerjasamanya yang baik selama masa
pendidikan ini.
13. Ayahanda H.Untung Hadi Purwanto (Alm) dan ibunda Hj.Itje
Mariam BSA, yang telah membesarkan saya, mengasuh, membimbing
dan mendidik disiplin kepada saya dengan penuh kasih sayang,
memberikan dorongan, fasilitas serta mendoakan kelancaran selesainya
pendidikan dan tesis ini.
14. Ayah dan ibu mertua, keluarga H.Zuhri Amin,SH, (Alm) dan
Hj Endang Pertiwi serta Kakek dan nenek ,H Ali Murtadho dan
Hj.Siti Nur Halimah yang telah banyak membantu, memberikan
dorongan, serta mendoakan kelancaran selesainya pendidikan dan tesis
ini.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
viii
15. Istri saya tercinta, dr.Nur Aeni Mulyaningsih yang telah banyak
berkorban selama saya mengikuti pendidikan PPDS I Obgin,dan tetap
mendorong, mendoakan, dan memberikan semangat sampai saya dapat
menyelesaikan pendidikan dan tesis ini.
16. Anak saya, Fairuz Zahiya Meuthia Dharmawan yang dapat menerima
dan memahami kesibukan saya dan juga mendorong semangat saya untuk
menyelesaikan pendidikan dan tugas tesis ini.
17. Saudaruku dr.Prima Isnaeni sekeluarga, Khusnul Laela,ST serta
saudara-saudara iparku, Nur Farida Yuliastuti,ST sekeluarga, Nur
Indah Tri Setyowati,SPsi sekeluarga, drg Nur Solecha Wahyu
Lestari sekeluarga, Nur Zulaicha Soraya S.Ked, Nur Fatmawati
K,SKG. yang telah banyak membantu serta mendorong semangat saya
untuk menyelesaikan pendidikan tugas tesis ini.
18. Semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu yang telah
banyak membantu saya dalam penyelesaian tesis ini.
Akhir kata semoga tesis ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan,
dan semoga Allah SWT melimpahkan rahmat dan karuniaNya kepada kita semua.
Amin Yaa Robbal Alamin.
Wassalamualaikum Wr Wb.
Arif Dharmawan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL....................……………………………………….…....... i
HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMBING................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI TESIS............................………… iii
PERNYATAAN ............................................................................................... iv
KATA PENGANTAR .................................................................................... v
DAFTAR ISI………………………………………………………………..... ix
DAFTAR GAMBAR……………………………………………………….... xii
DAFTAR TABEL.................................................................................... xiii
DAFTAR SINGKATAN…………………………………………………...... xiv
ABSTRAK...................................................................................................... xv
BAB.I. PENDAHULUAN ............................................................................ 1
A. Latar belakang ............................................................................. 1
B. Rumusan Masalah ........................................................................ 3
C. Tujuan penelitian .......................................................................... 3
D. Manfaat penelitian ........................................................................ 3
BAB. II. TINJAUAN PUSTAKA.................................................................. 4
A. Stroma Ovarium............................................................................ 4
1. Endokrinologi Ovarium ........................................................... 5
2. Folikulogenesis ........................................................................ 7
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
x
3. Pertumbuhan Folikel ................................................................. 11
4. Peran Stroma pada Fungsi Ovarium ........................................ 13
5. Kategori Kerusakan Ovarium .................................................. 15
B. 4-Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) ......................................... 18
1. Definisi ..................................................................................... 18
2. Mekanisme Seluler Ovotoksisitas ............................................ 18
3. Mekanisme Molekuler Ovotoksisitas .. ..................................... 20
4. Apoptosis pada Ovarium oleh Pengaruh VCD .. ...................... 23
5. Premature Ovarian Failure ….. ................................................. 26
C. Kerangka Konseptual .................................................................. 32
Keterangan Kerangka Konsep .................................................... 33
D. Hipotesis ...................................................................................... 34
BAB III. METODE PENELITIAN .............................................................. 35
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................... 35
B. Lokasi dan Waktu Penelitian ................................................ 36
C. Subjek Penelitian .................................................................... 36
D. Besar sampel .. ......................................................................... 36
E. Varibel Penelitian .. ................................................................. 38
F. Definisi Operasional .. ............................................................. 38
G. Prosedur Penelitian yang Dilakukan .. ................................. 38
H. Alat dan Bahan Penelitian ..................................................... 39
I. Cara Kerja .. ............................................................................. 40
J. Analisis Data .. .......................................................................... 43
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xi
BAB IV. HASIL DAN ANALISA PENELITIAN ....................................... 44
A. Hasil Penelitian ....................................................................... 44
B. Analisis Data Penelitian ......................................................... 44
BAB V. PEMBAHASAN .............................................................................. 49
BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 51
A. KESIMPULAN ....................................................................... 51
B. SARAN .................................................................................... 51
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 52
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Regulasi Saluran Reproduksi Wanita......................................... 6
Gambar 2. Skematik Perkembangan Ovarium pada Fetus dan Dewasa .. ... 8
Gambar 3. Oogenesis dan folikulogenesis pada tikus ................................. 11
Gambar 4. Aktivitas sekresi faktor pertumbuhan. ..................................... 14
Gambar 5. Penyempitan pembuluh darah Ovarium .................................... 17
Gambar 6. Sruktur kimia 4- vynilcyclohexene dan 4-vynilcyclohexene
diepoxide ................................................................................... 18
Gambar 7. Kerangka Konsep ....................................................................... 32
Gambar 8. Rancangan Penelitian .. .............................................................. 35
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1. Etiologi terjadinya Premature Ovarian Failure ........................ 27
Tabel 4.1. Resume hasil pemeriksaan kerusakan stroma ovarium. ........... 44
Tabel 4.2. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma
ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 0 ................... 45
Tabel 4.3. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma
ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 5 ................... 46
Tabel 4.4. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma
ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 10 ................. 47
Tabel 4.5. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma
ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 15 ................. 48
Tabel 4.6. Hasil uji McNemar tentang perubahan kerusakan stroma
ovarium pada hari ke 5, hari ke 10, dan hari ke 15
dibandingkan dengan hari ke 0 ................................................ 49
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xiv
DAFTAR SINGKATAN
Cu : Cuprum
DNA : Deoxyribonucleic Acid
FSH : Follicle Stimulating Hormone
GnRH : Gonadotropine Releasing Hormone
IGF : Insulin Growth Factor
IL : Interleukin
LH : Luteinisation Hormone
mRNA : Mutation Ribonucleic Acid
POF : Premature Ovarian Failure
SOD : Superoxide Dismutase
TNFα : Tumor Necrosing Factor α
VCD : 4-Vinylcyclohexane Diepoxide
VCH : 4-Vinylcyclohexene
Zn : Zink
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xv
Arif Dharmawan. 2012. Toksisitas 4-Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) terhadap Stroma Ovarium. TESIS. Pembimbing I: Dr.Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG (K), II: Prof.Dr.J.B.Dalono , dr., Sp.OG (K). Program Studi Kedokteran Keluarga, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta.
ABSTRAK
Latar Belakang: Sistem reproduksi wanita terdiri dari ovarium, tuba uterina, uterus, vagina, dan genitalia eksterna. Sebagian besar ovarium berada intraperitoneal dan tidak dilapisi oleh peritoneum. Sebagian besar dari ovarium, baik korteks maupun medula, terdiri dari stroma. Stroma ovarium terdiri dari sel-sel yang berbentuk spindel yang mirip dengan fibroblas dan tersusun dalam suatu bentukan yang khas. Tidak seperti jaringan ikat pada umumnya, stroma ovarium tersusun dari banyak sel dengan serat yang menyokongnya (baik serat retikuler maupun jaringan kolagen biasa). Sel-sel terdiri atas cytoplasmic lipid dan dikelilingi oleh suatu serat retikulin. Beberapa sel menyerupai gambaran seperti miofibroblastik dan immunoreaktif dengan smooth muscle actin (SMA) dan desmin. Sel-sel stroma ovarium berhubungan dengan pematangan folikel, yang juga berkaitan erat dengan fungsi endokrin dan sekresi estrogen.
Pada studi ini peneliti mencoba merancang suatu hewan model untuk menyerupai kondisi alami proses menopause pada wanita. Penelitian dilakukan dengan menginduksikan agen kimia yang bersifat ovotoksik, 4-vinylcyclohexane diepoxide (VCD) pada tikus galur Wistar untuk mempelajari proses kerusakan pada ovarium. Telah diketahui bahwa VCD dapat menyebabkan terjadinya POF pada folikel ovarium hewan uji tikus. Namun masih belum diketahui pengaruhnya terhadap stroma ovarium yang merupakan jaringan penyangga dari ovarium. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui adanya pengaruh VCD terhadap stroma ovarium.
Tujuan: Untuk melihat efek toksisitas VCD terhadap stroma ovarium pada tikus .
Metode penelitian: Penelitian dilakukan di laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada, merupakan penelitian obervasional laboratorium dengan pendekatan pretest -postest control group design. Variabel independen: dosis VCD, variabel dependen: Stroma ovarium pada Premature Ovarian Failure. Jumlah sampel 60, dibagi dalam 3 grup (kontrol, perlakuan 80 mg/KgBB, dan perlakuan 160 mg/KgBB), Purposive Random Sampling. Analisis data dengan uji chi Square, menggunakan SPSS versi 17.00 for Windows.
Hasil Penelitian: Hasil studi menunjukkan bahwa tidak didapatkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian VCD dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB selama 15 hari, yang merupakan dosis yang telah menyebabkan terjadinya kerusakan folikel ovarium yang menyerupai POF, tidak menyebabkan terjadinya kerusakan stroma ovarium. Kata Kunci: Toksisitas, 4-vinylcyclohexane diepoxide, Stroma Ovarium.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xvi
Arif Dharmawan. 2012. Toxicity of 4-Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) through the Ovarin Stroma. DISSERTATION. Supervisor I: Dr.Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG (K), II: Prof.Dr.J.B.Dalono , dr., Sp.OG (K). Program Study of Medical Family, Post-graduate Program of Sebelas Maret University Surakarta.
ABSTRACT
Background: Women reproduction system is consist of ovary, uterine tube, uterus, vagina, and external genitalia. Most of ovary, both cortex and medulla, consist of stroma. Ovarian stromas are spindle formed cells, looks like fibroblast and also lapped on typical form. Ovarian stroma has different form, it lapped on many cells with fibers that contributing on these cells (reticular fibers and collagen tissue). Cells are consist of cytoplasmic lipid and rounded by reticulin fibers. Some cells have form like miofibroblastic and immunoreactive with smooth muscle actin (SMA) and desmin. Ovarian stromal cells are related to follicle maturity, that also thightly related to endocrine function and estrogen secretion.
. In this study, observer is trying to stake out an animal model to become resemble of natural condition of menopause that happen in women. This study is done by inducted ovotoxic substance, 4-vinylcyclohexane diepoxide (VCD), in the wistar mices to examine the prosses of damage thata happen on ovary. It is known that VCD can cause POF on ovarian follicle on mice’s ovary. But, there is still unknown the effect of this substance on ovarian stroma. Ovarian stroma is a supporting tissue for ovary. This study is done for knowing the effect of VCD to the ovarian stroma.
Objectives: to examine the toxicity effect of VCD through ovarian stroma of mice.
Methods: Research is done in Laboratory of Patology, Animal Medicine Faculty, Gadjah Mada University. It is an observational laboratory research with pretest-posttest controlled group design. Independent variable is dose of VCD, dependent variable is ovarian stroma on Premature Ovarian Failure. We used 60 samples, devided inti 3 groups (control, treatment 80 mg/KgBW, and treatment 160 mg/KgBW), Purposive random sampling. Data analysis with Chi Square examination, using SPSS version 17.0 for Windows.
Result: The result of this study shows that there is no significant differences between control group and treatment groups. It shows that induction of VCD on dose of 80 mg/KgBW and 160 mg/KgBW as long as 15 days, that is the dose to make the damages to ovarian follicle that resemble to POF, does not cause of damaging the ovarian stroma. Keywords: Toxicity, 4-vinylcyclohexane diepoxide, Ovarian Stroma.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Perindustrian membawa dampak positif dan negatif pada kehidupan
manusia. Salah satu dampak negatif industri pada kesehatan wanita adalah
kegagalan ovarium dini akibat paparan kronis zat ovotoksik. Ovotoksisitas
merupakan salah satu penyebab kegagalan ovarium dini (premature ovarian
failure). Premature ovarian failure ditandai dengan amenore, hipoestrogen
dan peningkatan kadar hormon gonadotropin yang menetap sebelum usia 40
tahun. Wanita yang menderita premature ovarian failure akan mengalami
gejala-gejala menopause (Shelling, 2010; Shuster et al, 2010). Menopause
berkaitan erat dengan berbagai masalah kesehatan (Hu, et al., 2001).
Premature ovarian failure (POF) atau menopause dini adalah suatu
keadaan dimana terjadi amenorhea yang disebabkan oleh berhentinya fungsi
ovarium sebelum usia 40 tahun. Wanita dengan POF mengalami anovulasi
dan hipoestrogenisme dengan adanya amenorhea primer atau sekunder,
infertilitas, defisiensi hormon steroid sex, dan peningkatan gonadotropin
(Conway, 2000). Rata-rata usia menopause wanita eropa adalah sekitar 51
tahun. Namun, 1-3% dari seluruh wanita mengalami POF, termasuk di
dalamnya 10-28% dari wanita dengan amenorhea primer dan 4-18% dari
wanita yang mengalami amenorhea sekunder (Lanying, 2001). Sebagian
besar kasus POF merupakan keadaan idiopatik (Pal dan Santoro, 2002).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
2
Beberapa agen kimia bersifat toksik terhadap ovarium yang dapat
menginduksi kerusakan folikel dan mengakibatkan kegagalan ovarium dini.
Paparan agen ovotoksik ini bermanifestasi pada risiko jangka panjang terkait
kegagalan ovarium dini pada wanita (Hu et al., 2001). Pada studi ini peneliti
mencoba merancang suatu hewan model untuk menyerupai kondisi alami
proses menopause pada wanita. Peneliti melakukan induksi agen kimia yang
bersifat ovotoksik, 4-vinylcyclohexane diepoxide (VCD) pada tikus galur
Wistar untuk mempelajari proses kerusakan pada ovarium. VCD merupakan
hasil metabolit dari 4-vinylcyclohexane (VCH) yang didapatkan sebagai agen
hasil manufaktur pada pembuatan pestisida, bahan berbasis karet, dan plastik.
Agen kimia ini mempunyai selektifitas untuk merusak folikel primordial dan
primer pada ovarium melalui proses induksi atresia secara alami (Hoyer dan
Sipes, 2007).
Tikus betina galur Wistar yang diinduksi dengan VCD secara
intraperitoneal dapat digunakan untuk mengetahui proses kegagalan ovarium
melalui atresia. Pada studi ini dilakukan evaluasi kadar estrogen, gambaran
morfologis folikel ovarium beserta stroma ovariumnya, ekspresi estrogen
reseptor alfa dan caspase 3 secara imunohistokimia.
Pada studi ini peneliti mencoba meneliti toksisitas 4-vynilcyclohexene
diepoxide (VCD) terhadap stroma untuk merancang suatu hewan model
untuk menyerupai kondisi alami proses menopause, sehingga dapat
digunakan untuk penelitian lebih lanjut mengenai menopause.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
3
B. Rumusan Masalah
Berdasar uraian diatas dapat dirumuskan untuk masalah penelitian
yaitu: Apakah 4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD) dosis 80 mg/KgBB dan
160 mg/KgBB menyebabkan kerusakan stroma ovarium?
C. Tujuan penelitian
1. Tujuan Umum
Untuk melihat efek toksisitas 4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD)
terhadap stroma ovarium pada tikus.
2. Tujuan Khusus
Mengetahui toksisitas 4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD) terhadap
stroma ovarium.
D. Manfaat Penelitian
1. Manfaat teoritis
Memberikan pengetahuan tentang pengaruh 4-vynilcyclohexene
diepoxide (VCD) terhadap jaringan stroma yang dapat digunakan untuk
memperkaya khasanah keilmuan.
2. Manfaat Klinis
Menambah pengetahuan tentang pemeriksaan laboratorium
biomolekuler gambaran jaringan stroma ovarium akibat paparan 4-
vynilcyclohexene diepoxide (VCD) sehingga dapat digunakan untuk
penelitian lebih lanjut dalam pengobatan premature ovarian failure (POF).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Stroma Ovarium
Sistem reproduksi wanita terdiri dari ovarium, tuba uterina, uterus,
vagina, dan genitalia eksterna. Ovarium berwarna putih dan terdiri dari
jaringan fibrosa yang tebal yang menjadi tempat melekatnya ovum. Ovarium
pada wanita dewasa berukuran panjang kira – kira 4 cm, lebar dan tebal kurang
lebih 1,5 cm (Sarwono, 2008).
Ovarium terletak pada lapisan belakang ligamentum latum. Sebagian
besar ovarium berada intraperitoneal dan tidak dilapisi oleh peritoneum.
Ovarium terhubung ke uterus dengan ligamentum ovarii propium. Dan
pembuluh darah ke ovarium melalui ligamentum suspensorium ovarii.
Ovarium merupakan tempat berkembangnya folikel-folikel hingga menjadi
folikel de Graaf, yang akhirnya akan melepaskan ovum saat wanita mengalami
ovulasi. Ovarium diliputi oleh epitel coelom yang dapat berubah menjadi epitel
torak berambut getar, yang memproduksi cairan jernih seperti ditemukan
dalam tuba atau epitel tidak berambut getar yang memproduksi musin seperti
pada endometrium (Bychkov, 2002).
Sebagian besar dari ovarium, baik korteks maupun medula, terdiri dari
stroma. Stroma ovarium terdiri dari sel-sel yang berbentuk spindel yang mirip
dengan fibroblas dan tersusun dalam suatu bentukan yang khas. Tidak seperti
jaringan ikat pada umumnya, stroma ovarium tersusun dari banyak sel dengan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
5
serat yang menyokongnya (baik serat retikuler maupun jaringan kolagen biasa).
Sel-sel terdiri atas cytoplasmic lipid dan dikelilingi oleh suatu serat retikulin.
Beberapa sel menyerupai gambaran seperti miofibroblastik dan immunoreaktif
dengan smooth muscle actin (SMA) dan desmin. Sel-sel stroma ovarium
berhubungan dengan pematangan folikel, yang juga berkaitan erat dengan
fungsi endokrin dan sekresi estrogen (Ganong, 2005).
1. Endokrinologi ovarium
Dalam endokrinologi reproduksi wanita, ovarium memiliki dua fungsi
utama, yaitu fungsi proliferatif dan fungsi sekretorik. Sebagai fungsi
proliferatif (generatif), ovarium merupakan sumber ovum selama masa
reproduksi. Di dalam ovarium terjadi petumbuhan folikel primer, folikel de
Graaf, peristiwa ovulasi, serta pembentukan corpus luteum. Sedangkan
sebagai fungsi sekretorik (vegetatif), ovarium merupakan tempat
pembentukan dan pengeluaran hormon steroid yaitu hormon estrogen,
progesteron, dan androgen (Sarwono, 2008).
Pandangan umum dari interaksi faktor-faktor hormon pada sistem
reproduksi wanita ditunjukkan pada gambar 1. Sistem hormon wanita terdiri
dari otak, hipofise, ovarium, dan organ reproduksi ( tuba, uterus, cerviks dan
vagina). Didalam otak, hipotalamus menghasilkan gonadotropin releasing
hormone (GnRH) yang mengatur sekresi luteinizing hormone (LH) dan
follicle stimulating hormone (FSH) (Speroff, 2005).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
6
Gambar 1. Regulasi saluran reproduksi pada wanita
Ovarium matur mempunyai dua fungsi utama yaitu, maturasi sel
germinal ( folikulogenesis) dan steroidogenesis. Tiap sel germinal pada
akhirnya berkembang didalam folikel, yang merupakan sumber utama
penghasil hormone steroid selama siklus menstruasi. Saat ovulasi, ovum
dilepaskan dan folikel yang pecah berubah menjadi korpus luteum, yang
mensekresi progesteron. FSH terutama berperan pada stimulasi
perkembangan folikel ovarium, sedangkan LH memicu terjadinya ovulasi.
FSH dan LH mengatur steroidogenesis di folikel dan sekresi androgen dan
estrogen, dan LH mengatur sekresi progesteron dari korpus luteum. Steroid
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
7
ovarium akan menghambat sekresi LH dan FSH kecuali pada saat akan terjadi
ovulasi ( midcycle), estradiol menyebabkan umpan balik positif pada aksis
hipotalalamus- hipofisis dan secara bermakna memicu peningkatan sekresi
GnRH, LH dan FSH. Ovarium juga menghasilkan tiga hormone polipeptida
yaitu inhibin yang menekan sekresi FSH, activin (activin-binding protein)
meningkatkan sekresi FSH, dan follistatin (activin-binding protein) yang
menurunkan sekresi FSH (Speroff, 2005; Hutt et al, 2005).
2. Folikulogenesis
a. Ovarium Dewasa
Ovarium berisi tiga bagian yaitu korteks luar, medulla di sentral
dan pintu ovarium (hillus). Hillus berisi pembuluh syaraf, pembuluh
darah dan sel hillus yang menjadi aktif dalam proses steroidogenesis atau
mampu membentuk tumor. Sel ini sangat mirip dengan sel leydig di testis
yang memproduksi testosteron. Bagian korteks yang paling luar disebut
tunika albuginea, yang bagian atasnya ditutupi oleh satu lapis sel kuboid.
Oosit berhubungan dengan kompleks yang disebut folikel. Bagian dalam
korteks tertanam dekat dengan jaringan stroma. Jaringan stroma terdiri
atas jaringan penunjang dan sel interstitial yang berasal dari sel
mesenkim dan mempunyai kemampuan untuk berespon terhadap
luteinizing hormone (LH ) atau human chorionic gonadotropin ( hCG )
dan produksi androgen. Daerah tengah medulla dari ovarium sebagian
besar berasal dari sel mesonefrik (Speroff, 2005).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
8
Gambar 2. Skematik Masa Perkembangan Ovarium pada Fetus dan Dewasa
(Diambil dari Speroff, 2005)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
9
b. Ovarium tikus
Pada masa perkembangan ovarium tikus dari lahir hingga dewasa,
terjadi perubahan dari organ simpel menjadi organ yang multiform. Dalam
perkembangannya, pada ovarium terjadi pertumbuhan, differensiasi, serta
degenerasi.
Ovarium pada waktu tikus lahir terdiri dari 2 tipe sel utama, yaitu
oosit dan sel stroma multipotensial. Disebut multipotensial karena secara
morfologi, sel ini akan berdifferensiasi menjadi berbagai sel penyokong
antara lain sel granulosa, sel teka baik interna maupun eksterna, sel lutein,
serta bentuk sel yang lain (Schwiebert, 2007).
Pada saat lahir, ovarium tikus merupakan organ solid yang berisi
penuh dengan sel germinal dan sel stroma. Organ ini dilapisi oleh adanya
sel-sel epitel yang disebut sebagai epitel germinal walaupun sebenarnya
epitel ini bukan merupakan bagian dari sel germinal. Oosit mengisi
sebagian besar organ, kecuali bagian tengah dari pusat stroma.
Usia pubertas tikus bervariasi tergantung pada jenis tikus, status
nutrisi, serta adanya pengaruh lingkungan, namun secara umum pubertas
tikus terjadi pada usia antara 28 hingga 49 hari. Tanda-tanda terjadinya
pubertas pada tikus betina adalah adanya pembukaan vagina dan
munculnya sel epitel terkornifikasi pada vaginal smear. Fertilitas pada
tikus betina paling banyak terjadi pada usia 75 hingga 300 hari.
Tikus merupakan organisme yang polyestrous. Tikus betina akan
berovulasi setiap 4 sampai 5 hari sekali (dengan beberapa variasi), dan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
10
biasanya terjadi pada malam hari. Ovulasi terjadi secara spontan, biasanya
terjadi 8-11 jam setelah onset estrus, namun ovulasi tidak selalu terjadi
pada setiap siklus estrus. Pap vagina digunakan untuk menentukan tahap
siklus estrus. Kopulasi pada tikus biasanya terjadi pada malam hari dan
dapat dikonfirmasi dengan adanya plug senggama di vagina selama 12-24
jam pasca kopulasi (Schwiebert, 2007).
Sel-sel germinal folikel primordial akan berproliferasi dan migrasi
ke dalam gonad yang belum berdiferensiasi. Pada periode post natal, sel-
sel germinal akan terpecah dan menjadi folikel primordial yang terus
berkembang menjadi folikel primer. Estrogen (E2) menghambat sel
germinal menjadi folikel primordial. Pada tikus yang kekurangan faktor-
faktor transkripsi oosit seperti NOBOX, SOHLH1, SOHLH2, and LHX8,
maka akan terjadi kematian folikel, baik folikel primordial maupun folikel
primer. Kematian dapat pula terjadi bahkan sebelum terbentuk folikel
primordial (Richards dan Pangas, 2010).
Secara morfologi, pembentukan ovarium pada tikus betina tidak
aktif, namun kejadian di tingkat molekuler paling banyak terjadi pada
tahap gonadogenesis. Terdapat lebih dari 1200 ekspresi gen yang mengatur
perkembangan gonad tikus betina pada hari ke-10 sampai hari ke-13 post
koital. Periode tersebut menentukan diferensiasi jenis kelamin gonadal
tikus. Peningkatan ekspresi penghambat siklus sel (seperti inhibitor cyclin-
dependen kinase) dan beberapa gen penanda meiosis terjadi pada gonad
tikus betina dibandingkan tikus jantan. Pola tersebut menandakan bahwa
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
11
proliferasi sel somatik dihambat ketika se-sel germinal ovarium memasuki
tahap meiosis (Uzumchu dan Zachow, 2007).
Gambar 3. Oogenesis dan folikulogenesis pada tikus.
(Sumber: Richards dan Pangas, 2009)
3. Pertumbuhan Folikel
Seperti pada masa pubertas, pada ovarium dewasa terjadi stadium
pembentukan folikel yang akan terus berulang. Pada awalnya oosit akan
membesar dan sel granulosa berproliferasi. Pada sat ini oosit berbentuk
masa bulat yang solid. Teka interna akan terbentuk pada stadium awal.
Zona pellucida mulai terbentuk (Calvanesea, et al, 2005).
Sekarang diketahui bahwa proses pembentukan folikel primer
sampai ovulasi berlangsung selama 85 hari. Pada masa ini tidak tergantung
gonadotropin sehingga kemudian mencapai keadaan yang siap untuk
berespon terhadap rangsangan FSH untuk pertumbuhan folikel. Bila terjadi
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
12
peningkatan gonadotropin seperti yang terlihat pada awal siklus haid, akan
terlihat pematangan folikel yang tergantung pada FSH. Jumlah folikel
yang matur tergantung pada jumlah FSH dan sensitifitas folikel terhadap
gonadotropin. Ekspresi reseptor FSH paling banyak pada sel granulosa,
namun bisa juga dijumpai pada epitel di permukaan ovarium dan epitel
tuba fallopii, yang fungsinya belum diketahui, tapi diduga berperan pada
tumor epitelial (Gosden, et al, 2009).
Pertama kali antrum terlihat sebagai sejumlah kavum intragranulosa
yang disebut badan cell – exner yang digambarkan oleh Emma Call dan
Siegmund Exner di Vienna pada tahun 1875. Pada satu titik saat
pembentukan ini, folikel akan terhenti dan mengalami proses apoptosis
yang dikenal sebagai atresia. Pada awalnya, komponen sel granulosa mulai
mengalami perpecahan. Kavum antral akan diserap dan kavum akan
kolaps dan mengalami obliterasi. Oosit akan berdegenerasi in situ.
Akhirnya, jaringan parut yang berbentuk pita yang berada disekitar sel
teka akan terlihat. Terkadang masa sel teka akan mengalami kehilangan
lipid dan sulit dibedakan dengan massa stroma yang sedang tumbuh. Oleh
karena itu, proses apoptosis akan berlanjut pada granulosa dan lapisan teka
merupakan bagian terbesar dari jaringan interstitial. Sebelum mengalami
regresi, folikel kistik akan berada di korteks untuk beberapa saat. (Speroff,
2005 )
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
13
4. Peran Stroma pada Fungsi Ovarium
Sebagian besar dari ovarium, baik korteks maupun medula,
terdiri dari stroma. Stroma ovarium terdiri dari sel-sel yang berbentuk
spindel yang mirip dengan fibroblas dan tersusun dalam suatu
bentukan yang khas. Tidak seperti jaringan ikat pada umumnya,
stroma ovarium tersusun dari banyak sel dengan serat yang
menyokongnya (baik serat retikuler maupun jaringan kolagen biasa).
Sel-sel terdiri atas cytoplasmic lipid dan dikelilingi oleh suatu serat
retikulin. Beberapa sel menyerupai gambaran seperti miofibroblastik
dan immunoreaktif dengan smooth muscle actin (SMA) dan desmin.
Sel-sel stroma ovarium berhubungan dengan pematangan folikel, yang
juga berkaitan erat dengan fungsi endokrin dan sekresi estrogen.
Selama perkembangan folikel, stroma ovarium yang
mengelilingi folikel tersebut akan berdiferensiasi menjadi teka interna
dan teka eksterna. Proses ini mulai berlangsung pada saat janin dalam
kandungan dan berakhir setelah menopause. Teka interna biasanya
terdiri dari tiga atau empat lapisan yang berbatasan dengan struktur
granulosa. Sedangkan struktur stroma yang lain dengan batas yang
kurang begitu jelas diantara folikel disebut sebagai teka eksterna (Hall
& Guyton, 2006).
Teka interna pada folikel yang berkembang merupakan jaringan
yang kaya akan vaskularisasi terdiri dari kapiler-kapiler yang dilatasi
dan mengelilingi tiap-tiap sel. Sel-sel pada teka interna mempunyai
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
14
bentuk yang bervariasi dari bulat hingga berbentuk poligonal, dengan
diameter antara 12-20 um, berwarna kemerahan dan bersitoplasma
jernih dengan adanya vakuola dan nukleus di bagian sentral.
Teka interna merupakan jaringan yang menyokong
perkembangan folikel karena merupakan tempat terjadinya
steroidogenesis. Namun, fungsi endokrin dari sel teka eksterna masih
belum diketahui secara pasti. Sel teka interna pada folikel adalah
sumber utama estrogen dalam darah dimana terdiri dari tetesan lipid,
retikulum endoplasma yang halus dan luas, dan mitokondria yang
memiliki krista tubuler. Androgen dari sel teka diproses menjadi
estrogen dalam sel granuloma. Estrogen yang dihasilkan dari
granuloma ini kemudian memasuki sirkulasi (Ganong, 2005).
Gambar 4. Aktivitas sekresi faktor pertumbuhan.
(Knight and Glister, 2006).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
15
5. Kategori Kerusakan Stroma Ovarium
Stroma ovarium merupakan jaringan penyokong yang
memungkinkan ovarium untuk menjalankan fungsi normalnya. Kerusakan
yang terjadi pada stroma dapat berpengaruh pada fungsi ovarium. Pada
Premature Ovarian Failure (POF), kerusakan folikel terjadi karena adanya
proses apoptosis folikel itu sendiri. Tidak terjadi kerusakan pada jaringan
penyokong ovarium (stroma). Akan tetapi kerusakan pada stroma dapat
pula menyebabkan terjadinya keadaan yang mirip dengan POF, yaitu
terjadinya kerusakan folikel.
Perubahan-perubahan yang dapat terjadi pada kerusakan stroma
antara lain adalah terjadinya pembesaran fibroblas, hyalinisasi yang
prominen, dan terjadinya penyempitan pembuluh darah.
a. Fibrotik
Salah satu kemungkinan kerusakan yang dapat terjadi pada stroma
ovarium adalah terjadinya proses hyalinisasi yang prominen dan
berakhir pada proses fibrotik. Proses ini dikaitkan dengan adanya
inflamasi, nekrosis lemak, histosit yang berbusa, pembentukan plak
kolesterol, serta pembentukan makrofag hemosiderin.
Pada beberapa keadaan misalnya pemberian kemoterapi pada
pasien kanker, agen kemoterapi yang diberikan dapat berpengaruh pada
jaringan ovarium yang dapat menimbulkan terjadinya respon inflamasi
jaringan. Akibatnya inti sel membengkak, pleomorfik, dan
hiperkromatik serta menunjukkan adanya penggumpalan kromatin.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
16
Sitoplasma sel menjadi granular, bervakuola, dan terjadi dilatasi serta
kerusakan pada pada organela sitoplasma yang dihubungkan dengan
terjadinya destruksi lisosom (Chew et al., 2009).
b. Kekosongan area stroma
Kerusakan pada stroma ovarium dapat menyebabkan penurunan
fungsi jaringan stroma. Penurunan ini terutama terjadi jika didapatkan
adanya perubahan morfologi jaringan stroma. Penelitian yang dilakukan
pada domba dan kambing mengenai kerusakan folikel dan stroma
menunjukkan beberapa perubahan yang terjadi pada kerusakan stroma
ovarium. Diantara perubahan itu adalah terjadinya lisis membran sel
stroma, nekrosis stroma yang dikaitkan dengan adanya kekosongan area
jaringan stroma, serta terjadinya penurunan densitas kolagen dan fibrin
pada jaringan ovairum karena terjadinya kerusakan pada struktur
folikuler (Faustino et al., 2010).
c. Penyempitan pembuluh darah
Suplai darah ke ovarium merupakan suatu sistem end artery, yaitu
tidak didapatkan adanya sistem anastomose. Karena keadaan ini,
apabila terjadi penyempitan atau penyumbatan pembuluh darah akan
mengakibatkan hilangnya aliran darah ke ovarium. Kurangnya suplai
darah ini akan menyebabkan terjadinya fokal fibrosis. Selain itu,
kurangnya suplai darah ke ovarium akan menyebabkan penurunan
jumlah folikel premordial ovarium yang tampak terutama pada daerah
dengan korteks ovarium yang kekurangan suplai (Motta et al., 2002).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
17
Kerusakan dan obstruksi pembuluh darah ovarium dapat
menyebabkan terjadinya iskemia lokal yang berefek pada penghancuran
segmental pada korteks ovarium normal serta terjadinya penurunan
jumlah folikel premordial yang signifikan. Korteks ovarium yang rusak
tersebut akan digantikan oleh jaringan fibrotik dengan disertai
hilangnya fungsi normal ovarium. Apabila keadaan ini terjadi pada
seluruh korteks ovarium, maka akan dimungkinkan ovarium untuk
kehilangan seluruh cadangan folikel premordial yang dimilikinya dan
seluruh jaringan korteks ovarium akan digantikan dengan jaringan
parut. Keadaan ini merupakan suatu kerusakan ovarium total yang
permanen (Meirow, et al., 2007).
Gambar 5. penyempitan pembuluh darah yang terjadi pada pembuluh darah
ovarium (kiri), dan gambaran pembuluh darah ovarium normal (kanan).
(Motta et al., 2002)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
18
B. 4- Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD)
1. Definisi
4-Vinyl Cyclohexene Diepoxide (VCD) adalah hasil metabolisme
dari 4-Vinylcyclohexene (VCH). 4-Vinylcyclohexene (VCH) terbentuk dari
dimerisasi dari 1,3-butadin pada perusahaan karet sintetis, insektisida,
pembuat plastik. 4-Vinylcyclohexene (VCH) akan dimetabolisme tubuh
melalui sitokrom 450 katalis epoxidasi (Xiaoming Hu et al., 2001). 4-Vinyl
Cyclohexene Diepoxide (VCD) sudah lama diketahui sebagai bahan
ovotoksik (Terutaka Kodama et al, 2009). Pada pemberian 4-Vinyl
Cyclohexene Diepoxide secara intraperitoneal selama 30 hari
menghasilkan penurunan jumlah folikel ovarium pada tikus dan mencit
(Hoyer et al, 2001).
VCH: Rumus kimia= C8H12, Berat molekul= 108,18
VCD: Rumus kimia= C8H12O2, Berat molekul= 140,18
Gambar 6. Sruktur kimia 4- vynilcyclohexene dan 4-vynilcyclohexene diepoxide.
(Sumber: Keating et al, 2008)
2. Mekanisme Seluler Ovotoksisitas
Peran VCD dalam menghasilkan kerusakan luas pada folikel telah
lama diidentifikasi. Pemberian VCD secara langsung akan merusak folikel
primordial dan folikel primer yang terlihat pada hari ke 12 sehingga
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
19
menyebabkan penurunan jumlah folikel secara signifikan (Hoyer dan
Sipes, 2007). Pada ovarium mamalia, jumlah folikel primordial yang dapat
berkembang sampai ovulasi jumlahnya kecil, karena kebanyakan dari sel
tersebut akan mengalami atresia, kematian sel ini disebut apoptosis yang
terjadi secara fisiologis dan berbeda dengan nekrosis yang merupakan
respon terhadap jejas atau inflamasi. Apoptosis dan nekrosis berbeda
dalam karakteristik morfologi. Perbandingan perubahan ultrastruktur pada
folikel preantral kontrol dan yang diberi VCD menunjukan bahwa
gambaran oosit dalam folikel yang tidak sehat pada kedua kelompok sama.
Termasuk gangguan organela, peningkatan jumlah vakuola, akumulasi
komponen membran, dan segmentasi abnormal (cleavage). Gambaran
morfologi degenerasi selama atresia, tidak berubah pada pemberian VCD
tetapi VCD meningkatkan proses ini dan atresia terjadi dalam frekuensi
yang lebih tinggi (Hoyer et al, 2001).
Meskipun karakteristik morfologi merupakan metode yang paling
reliabel untuk membedakan antara apoptosis dan nekrosis, juga dapat
dibedakan dengan petanda biokimia dan molekuler. Salah satu gen pada
mamalia yang berkaitan secara spesifik dengan apoptosis adalah Bcl-2
yang bersifat proto-onkogen. Bcl-2 telah diidentifikasi pada membran luar
mitokondria, retikulum endoplasma, membran inti, dan berhubungan
dengan lamanya sel bertahan hidup. Gen lain dari famili Bcl-2 adalah Bax
yang rangkaiannya homolog. Rasio protein Bax terhadap Bcl-2 dalam sel
akan menentukan apakah akan terjadi apoptosis (rasio meningkat) atau sel
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
20
akan bertahan hidup (rasio menurun) (Hsu dan Hsueh, 2000). Pengamatan
terhadap jumlah protein bax pada mRNA yang mengkode kematian sel
menunjukan terdapat peningkatan signifikan jumlah protein Bax
dibandingkan dengan kontrol (sebanyak 72 %, p < 0.005) pada 10 hari
pemberian VCD. Hal ini memberikan bukti keterlibatan bax protein dalam
ovotoksisitas yang diinduksi oleh VCD dan mendukung hipotesis kematian
sel yang disebabkan oleh VCD terjadi melalui apoptosis (Hoyer et al,
2001).
3. Mekanisme Molekuler Ovotoksisitas
Ovarium mengandung berbagai macam enzim yang bertugas untuk
melakukan biotransformasi dan detoksifikasi berbagai bahan ovotoksik.
Enzim tersebut diantaranya epoxidehydrolase, glutathione S-transferases,
dan cytochrome P-450 (Johnson et al., 2004). Mekanisme enzimatik utama
detoksifikasi adalah hidrasi untuk membentuk diol (yang dikatalisis oleh
microsomalepoxidehydrolase) dan konjugasi dengan gluttion (yang
dikatalisis oleh glutathione S-transferase). Pada studi isolasi in vitro folikel
ovarium diketahui bahwa folikel ovarium dapat mengubah secara langsung
VCD menjadi bentuk inaktif tetrol yaitu 4-(1,2- dihydroxy) ethyl-1,2-
dihydroxycyclohexane. Namun jika dibandingkan dengan folikel ovarium
dengan ukuran lebih besar, folikel ovarium kecil menunjukan kapasitas
paling rendah dalam detoksifikasi VCD, sehingga hal ini membuat folikel
preantral kecil sebagai target utama ovotksisitas VCD (Muhammad et al.,
2009).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
21
Antioksidan secara alami terdapat dalam sel, termasuk ovarium
seperti glutathione peroxidase, superoxide dismutase (SOD), dan katalase.
Antioksidan ini berfungsi sebagai enzim yang berespon terhadap stress
oksidatif karena melindungi sel dari efek merusak dari reactive oxygen
species dan apoptosis. Terdapat 3 isoform Superoxide Dismutase, yaitu
Manganese Superoxide Dismutase yang terdapat pada mitochondria,
copper/zinc Superoxide Dismutase yang terdapat pada sitosol, dan secreted
Superoxide Dismutase yang disekresikan ke ruang ektstraseluler.
Peningkatan masing-masing isoform ini memberi petunjuk terhadap
komponen molekuler yang terlibat.
Pemberian VCD meningkatkan level mRNA Manganese Superoxide
Dismutase folikel kecil 148 %, sedangkan peningkatan pada Cu
Superoxide Dismutase dan Zn Superoxide Dismutase sekresi tidak
meningkat secara bermakna. Sebaliknya pada folikel besar, tidak terjadi
efek, hal ini disebabkan tidak terjadi proses stress oksidatif pada folikel
besar. Hal ini memberikan bukti bahwa ovotoksisitas yang disebabkan
VCD pada folikel kecil terjadi pada mitokondria. Pada kondisi apoptosis,
Manganese Superoxide Dismutase juga meningkat secara signifikan,
sehingga memberi bukti tambahan bahwa proses ovotoksisitas VCD
terhadap ovarium menyerupai menopause (Haas et al., 2007).
Pada mitokondria, juga ada bax protein yang terdapat dalam
membran mitokondria. Bax protein terlibat dalam meningkatkan apoptosis
melalui interaksi dengan membran mitokondria. Pada pemberian VCD,
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
22
pada folikel kecil didapatkan peningkatan ekspresi mRNA bax protein. Hal
ini juga memberikan bukti tambahan keterlibatan mitokondria intraseluler
terhadap apoptosis yang diinduksi oleh VCD. Kerusakan membran
mitokondria yang diinduksi oleh bax protein mengakibatkan kerusakan sel
yang dapat menyebabkan kebocoran sitokrom c protein dari mitokondria
ke sitosol. Pada sebuah studi, dimana dilakukan pengamatan dan analisis
ovarium yang telah diinduksi VCD menggunakan mikroskop confocal
dengan imuniohistokimia, didapatkan penurunan jumlah folikel, pada
pewarnaan khusus yang berikatan dengan sitokrom c protein mitokondria,
juga didapatkan peningkatan dan terlihat difus. Pada kondisi normal,
sitokrom c protein terlihat fokus dengan intensitas lebih tinggi namun
terlokalisasi pada mitokondria, sedangkan gambaran difus terjadi karena
sitokrom c protein menyebar ke sitoplasma (Mayer et al., 2002).
Pada apoptosis terjadi aktivasi dari enzim proteolitik caspase 3,
demikian juga pada induksi VCD pada ovarium. Aktivasi caspase 3 terjadi
pada sitosol selama induksi apoptosis, namun aktivasi caspase 3 juga dapat
disebabkan oleh kejadian lain, salah satunya adalah pecahnya mitokondria.
Inisiasi ini oleh sitokrom c protein yang dilepaskan mitokondria. Hal ini
dibuktikan oleh penelitian dimana didapatkan peningkatan aktivitas
caspase 3 pada folikel ovarium kecil dibandingkan kontrol dan folikel
ovarium besar (Takai, 2003).
Dari paparan diatas dapat disimpulkan bahwa target dari
ovotoksisitas yang induksi VCD adalah mitokondria, terutama pada folikel
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
23
ovarium kecil. Dan induksi VCD menyebabkan aktivasi mekanisme
apoptosis yang terlihat pada Manganese Superoxide Dismutase, bax
protein, sitokrom c protein, dan caspase 3.
4. Apoptosis pada Ovarium oleh Pengaruh VCD
Ovarium mengandung berbagai macam enzim yang bertugas untuk
melakukan biotransformasi dan detoksifikasi berbagai bahan ovotoksik.
Enzim tersebut diantaranya epoxidehydrolase, glutathione S-transferases,
dan cytochrome P-450. Mekanisme enzimatik utama detoksifikasi adalah
hidrasi untuk membentuk diol (yang dikatalisis oleh
microsomalepoxidehydrolase) dan konjugasi dengan gluttion (yang
dikatalisis oleh glutathione S-transferase). Pada studi isolasi in vitro folikel
ovarium diketahui bahwa folikel ovarium pada dapat mengubah secara
langsung VCD menjadi bentuk inaktif tetrol yaitu 4-(1,2- dihydroxy)
ethyl-1,2-dihydroxycyclohexane. Namun jika dibandingkan dengan folikel
ovarium dengan ukuran lebih besar, folikel ovarium kecil menunjukan
kapasitas paling rendah dalam detoksifikasi VCD, sehingga hal ini
membuat folikel preantral kecil sebagai target utama ovotksisitas VCD
(Devine et al., 2004).
Antioksidan secara alami terdapat dalam sel, termasuk ovarium
seperti glutathione peroxidase, superoxide dismutase (SOD), dan katalase.
Antioksidan ini berfungsi sebagai enzim yang berespon terhadap stress
oksidatif karena melindungi sel dari efek merusak dari reactive oxygen
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
24
species dan apoptosis. Terdapat 3 isoform Superoxide Dismutase, yaitu
Manganese Superoxide Dismutase yang terdapat pada mitochondria,
copper/zinc Superoxide Dismutase yang terdapat pada sitosol, dan secreted
Superoxide Dismutase yang disekresikan ke ruang ektstraseluler.
Peningkatan masing-masing isoform ini member petunjuk terhadap
komponen molekuler yang terlibat (Forabosco dan Sforza, 2007).
Pemberian VCD meningkatkan level mRNA Manganese Superoxide
Dismutase folikel kecil 148 %, sedangkan peningkatan pada Cu/Zn
Superoxide Dismutase dan Superoxide Dismutase sekresi tidak meningkat
secara bermakna. Sebaliknya pada foikel besar, tidak terjadi efek, hal ini
disebabkan tidak terjadi proses stress oksidatif pada folikel besar. Hal ini
memberikan bukti bahwa ovotoksisitas yang disebabkan VCD pada folikel
kecil terjadi pada mitokondria. Pada kondisi apoptosis, Manganese
Superoxide Dismutase juga meningkat secara signifikan, sehingga member
bukti tambahan bahwa proses ovotoksisitas VCD terhadap ovarium
menyerupai menopause (Di Pasquale, et al., 2004).
Pada mitokondria, juga ada bax protein yang terdapat dalam
membrane mitokondria. Bax protein terlibat dalam meningkatkan
apoptosis melalui interaksi dengan membrane mitokondria. Pada
pemberian VCD, pada folikel kecil didapatkan peningkatan ekspresi
mRNA bax protein. Hal ini juga memberikan bukti tambahan keterlibatan
mitokondria intraseluler terhadap apoptosis yang diinduksi oleh VCD.
Kerusakan membrane mitokondria yang diinduksi oleh bax protein
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
25
mengakibatkan kerusakan sel yang dapat menyebabkan kebocoran
sitokrom c protein dari mitokondria ke sitosol. Pada sebuah studi, dimana
dilakukan pengamatan dan analisis ovarium yang telah diinduksi VCD
menggunakan mikroskop confocal dengan imuniohistokimia, didapatkan
penurunan jumlah folikel, pada pewarnaan khusus yang berikatan dengan
sitokrom c protein mitokondria, juga didapatkan peningkatan dan terlihat
difus. Pada kondisi normal, sitokrom c protein terlihat focus dengan
intensitas lebih tinggi namun terlokalisasi pada mitokondria, sedangkan
gambaran difus terjadi karena sitokrom c protein menyebar ke sitoplasma
(Falcone, et al., 2004).
Pada apoptosis terjadi aktivasi dari enzim proteolitik caspase 3,
demikian juga pada induksi VCD pada ovarium. Aktivasi caspase 3 terjadi
pada sitosol selama induksi apoptosis, namun aktivasi caspase 3 juga dapat
disebabkan oleh kejadian lain, salah satunya adalah pecahnya mitokondria.
Inisiasi ini oleh sitokrom c protin yang dilepaskan mitokondria. Hal ini
dibuktikan oleh studi dimana didapatkan peningkatan aktivitas caspase 3
pada folikel ovarium kecil dibandingkan control dan folikel ovarium besar.
Dari paparan diatas dapat disimpulkan bahwa target dari pada
ovotoksisitas yang induksi VCD adalah mitokondria, terutama pada folikel
ovarium kecil. Dan induksi VCD menyebabkan aktivasi mekanisme
apoptosis yang terlihat pada Manganese Superoxide Dismutase, bax
protein, sitokrom c protein, dan kaspase 3 (Di Pasquale, et al., 2004).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
26
Ketika terjadi deplesi folikel primordial pada ovarium, maka akan
terjadi menopause pada wanita. Karena ovarium mengandung oosit dalam
jumlah yang terbatas ketika lahir, maka paparan bahan kimia lingkungan
dapat menghancurkan folikel primordial sehingga dapat menimbulkan
menopause lebih dini.
5. Premature Ovarian Failure (POF)
a. Definisi dan Epidemiologi
Premature ovarian failure (POF) atau dapat disebut pula
menopause dini adalah suatu keadaan dimana terjadi amenorhea yang
disebabkan oleh berhentinya fungsi ovarium sebelum usia 40 tahun.
Wanita dengan POF mengalami anovulasi dan hipoestrogenisme dengan
adanya amenorhea primer atau sekunder, infertilitas, defisiensi hormon
steroid sex, dan peningkatan gonadotropin (Conway, 2000). Rata-rata
usia menopause wanita eropa adalah sekitar 51 tahun. Namun, 1-3% dari
seluruh wanita mengalami POF, termasuk di dalamnya 10-28% dari
wanita dengan amenorhea primer dan 4-18% dari wanita yang
mengalami amenorhea sekunder (Lanying, 2001).
Menopause dini ditunjukkan dengan amenorhea dan peningkatan
hormon gonadotropin yang disebabkan oleh penurunan jumlah total oosit
dalam ovarium, dan oleh karenanya, kemungkinan untuk kembalinya
fungsi ovarium seperti sebelumnya menjadi tidak ada (Dixit et al., 2004).
Pada penelitian awal tentang POF, diketahui bahwa peningkatan serum
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
27
follicle stimulating hormone (FSH) di atas 40 IU/L menunjukkan suatu
penurunan fungsi dan jumlah folikel ovarium yang permanen (Letur-
Konirsch, 2003). Namun pada beberapa penelitian selanjutnya ditemukan
peningkatan fungsi ovarium yang intermitten, bahkan hingga mengalami
kehamilan pada wanita yang telah didiagnosis POF (Akbari, 2011).
b. Etiologi
Sebagian besar kasus POF merupakan keadaan idiopatik. Meskipun
telah dilakukan berbagai penelitian namun sebagian besar kasus masih
belum didapatkan penyebab pastinya (Pal dan Santoro, 2002).
Sebelumnya, didapatkan anggapan bahwa terjadi deplesi pada folikel
ovarium pada semua kasus POF. Namun pada penelitian selanjutnya
diketahui bahwa tidak semua kasus POF terjadi deplesi folikel ovarium
(Hoyer, 2005). Beberapa kasus POF tidak terjadi deplesi folikel ovarium,
folikel tersebut masih ada, namun tidak responsif terhadap stimulasi
dengan meningkatkan hormon gonadotropin dalam sirkulasi (van
Kasteren, 2001). Secara umum, etiologi POF dapat dibagi menjadi dua
kelompok, yaitu hilangnya fungsi ovarium karena deplesi folikel, dan
hilangnya fungsi ovarium karena disfungsi folikel dalam ovarium.
Penyebab secara lebih rinci dapat dilihat pada tabel 1 berikut.
Tabel 1. Etiologi terjadinya Premature ovarian Failure (POF)
Folicle depletion Chromosomal Abnormalities
X Chromosome Monosomy X, mosaicism Trisomy X, mosaicism
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
28
Mutations or deletions of Xq13-Xq26 Isochromosomes Translocation involving X
Fragile X premutations Trisomi 13, 18 Genetic Syndromes
Ataxia teleangiectasia Mutations of AIRE gene BEPS Syndrome Perrault’s Syndrome
Metabolic Mucopolysaccaridosis Galactosemia
Infections Mumps Shigella Malaria
Idiopatic Follicle Disfunction
Autoimmune Signal Defect
Gonadotropin or receptor abnormalities Steroidogenic enzymes deficiencies
Idiopatic
(Kolp, 2003)
c. Patofisiologi
Pada masa embrionik, yaitu pada usia kehamilan 20 minggu, sel
germinal bergerak keluar dari tabung urogenital menuju ke ovarium
primitif yang kemudian berproliferasi sehingga membentuk 3,5 juta oosit
tiap ovarium. Sebagian besar dari sel germinal ini hancur karena proses
apoptosis (Pru dan Tilly, 2001). Ovarium biasanya memiliki jumlah
folikel premordial yang sama pada saat hamil, yaitu sekitar 1 juta folikel
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
29
tiap ovarium. Jumlah ini akan terus berkurang selama hidup karena
adanya atresia dan terjadinya ovulasi (Forges et al., 2004). Tidak lebih
dari 500 oosit (0,007%) yang dikeluarkan melalui ovulasi selama masa
reproduktif seorang wanita (Conway, 2000).
Pada POF idiopatik, terjadi suatu mekanisme yang belum diketahui
secara pasti yang menyebabkan terjadinya peningkatan apoptosis oosit.
Hal ini dapat mendorong terjadinya penurunan komplemen oosit dalam
ovarium pada saat lahir, atau dapat mempercepat terjadinya atresia (Laml
et al., 2002).
d. Apoptosis
Apoptosis merupakan suatu komponen yang normal pada
perkembangan dan pemeliharaan kesehatan pada organisme multiseluler.
Sel yang mati ini merupakan respon terhadap berbagai stimulus dan
selama apoptosis sel ini dikontrol dan diregulasi, sel yang mati kemudian
difagosit oleh makrofag. Apoptosis berbeda dengan nekrosis, pada
nekrosis terjadi kematian sel tidak terkontrol. Sel yang mati pada
nekrosis akan membesar dan kemudian hancur dan lisis pada satu daerah
yang merupakan respon terhadap inflamasi (Abir, et al. 2004).
Pada apoptosis sel-sel yang mati memberikan sinyal yang
diperantarai oleh beberapa gen yang mengkode protein untuk enzym
pencernaan yang disebut dengan caspase. Gen caspase ini merupakan
bagian dari cystein protease yang akan aktif pada perkembangan sel
maupun merupakan sinyal untuk aktif pada destruksi sel tersebut.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
30
Kematian sel melalui apoptosis merupakan fenomena yang normal, yaitu
terjadi eliminasi sel yang tidak diperlukan lagi. Proses apoptosis secara
fisiologis diperlukan untuk (Hoyer, 2005):
i. Terminasi sel
Apoptosis dapat terjadi pada sel yang mengalami kerusakan
yang tidak bisa di repair,infeksi virus, keadaan yang mengakibatkan
stress pada sel . Kerusakan DNA akibat ionisasi radiasi maupun bahan
kimia toxic juga dapat mencetuskan apoptosis melalui aktivasi tumor
supresor gen p53. Keputusan untuk apoptosis dapat berasal dari sel itu
sendiri, dari jaringan disekitarnya ataupun dari sel yang termasuk
dalam sisem imun.
ii. Mempertahankan homeostasis
Pada organisme dewasa, jumlah sel dalam suatu organ atau
jaringan harus berada dalam keadaan yang relatif konstan. Proses
keseimbangan ini termasuk dalam homeostasis yang dibutuhkan oleh
makhluk hidup untuk mempertahankan lingkungan internalnya.
Keseimbangan (homeostasis) ini dapat tercapai bila kecepatan mitosis
pada jaringan seimbang dengan kematian sel.
iii. Perkembangan embryonal
Kematian sel yang terprogram merupakan bagian dari
perkembangan jaringan. Pada masa embryo , perkembangan suatu
jaringan atau organ didahului oleh pembelahan sel dan diferensiasi sel
yang besar-besaran dan kemudian dikoreksi melalui apoptosis.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
31
iv. Interaksi limfosit
Perkembangan limfosit B dan Limfosit T pada tubuh manusia
merupakan suatu proses yang kompleks , yang akan membuang sel-sel
yang berpotensi menjadi rusak. Cytotoksik T sel dapat secara
langsung menginduksi apoptosis pada sel melalui terbukanya suatu
celah pada target membran dan pelepasan zat-zat kimia untuk
mengawali proses apoptosis. Celah ini dapat terjadi melalui adanya
sekresi perforin, granul yang berisi granzyme B, serine protease yang
dapat mengaktivasi caspase melalui pemecahan residu aspartat.
v. Involusi hormonal
Apoptosis dapat terjadi misalnya pada pelepasan sel
endometrium selama siklus menstruasi, regresi pada payudara setelah
masa menyusui dan atresia folikel ovarium pada menopause.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
32
D. KERANGKA KONSEPTUAL
Gambar 7. Kerangka konsep
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
33
Keterangan Kerangka Konsep
4-Vinyl Cyclohexene Diepoxide (VCD) yang merupakan hasil
metabolisme dari 4-Vinylcyclohexene (VCH) adalah senyawa yang toksik
terhadap folikel ovarium. Pada folikel ovarium stadium antral, terjadi proses
detoksifikasi oleh enzim-enzim pelindung ovarium seperti epoxidehydrolase,
glutathione S-transferases, dan cytochrome P-450, yang dapat mengubah
VCD menjadi metabolit inaktif 4-(1,2- dihydroxy) ethyl-1,2-
dihydroxycyclohexane melalui proses hidrasi yang dikatalisasi oleh
microsomalepoxidehydrolase, dan konjugasi yang dikatalisis oleh glutathione
S-transferase).
Pada folikel yang lebih kecil, aktivitas enzim epoxidehydrolase,
glutathione S-transferases, dan cytochrome P-450 tidak sebesar aktivitasnya
pada folikel yang besar. Aktivitas yang lebih kecil ini tidak mampu untuk
mendetoksifikasi semua VCD menjadi bentuk metabolit yang inaktif. Adanya
VCD yang masih aktif pada folikel yang kecil mengakibatkan terjadinya stres
oksodatif pada folikel tersebut. Keadaan stres oksidatif ini akan mendorong
peningkatan produksi antioksidan alami dalam ovarium seperti glutathione
peroxidase, superoxide dismutase (SOD), dan katalase. Antioksidan ini akan
bekerja untuk melindungi sel dari kerusakan akibat efek reactive oxygen
species dan apoptosis yang disebabkan oleh proses stres oksidatif.
Antioksidan ini banyak mengalami peningkatan terutama pada folikel-folikel
kecil, sedangkan pada folikel besar tidak terjadi efek antioksidan ini karena
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
34
pada folikel besar hampir semua VCD diubah menjadi bentuk inaktif
sehingga tidak menimbulkan stres oksidatif.
Ketidakseimbangan jumlah antioksidan dan stres oksidatif yang terus
timbul menyebabkan ketidakmampuan sel dalam mempertahankan hidupnya.
Hal ini menebabkan terjadinya perubahan-perubahan dalam sel berupa
perubahan morfologi sel, degradasi DNA, serta akan menghasilkan sinyal
apoptosis sel. Sinyal apoptosis ini didapatkan dari peningkatan ekspresi
mRNA bax protein. Ekspresi mRNA bax protein ini akan menyebabkan
kerusakan membran mitokondria yang dapat menimbulkan kebocoran
sitokrom c protein dari mitokondria ke sitosol. Kebocoran sitokrom c ini akan
meyebabkan aktivasi apoptosome caspase-9, yang pada akhirnya akan
mendorong kematian sel karena proses apoptosis.
4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD) merupakan zat kimia yang
merusak folikel primordial dan folikel primer ovarium secara selektif dengan
cara mempercepat proses alamaiah terjadinya atresia. Karena kerusakan yang
terjadi secara selektif, maka tikus akan mengalami kegagalan ovarium secara
bertahap, sampai akhirnya hanya tersisa jaringan stroma ovarium, sehingga
fungsi steroidogenesis dan folikulogenesis hilang.
E. Hipotesis
4-vinylcyclohexane diepoxide ( VCD ) dosis 80 mg/KgBB dan
160 mg/KgBB menyebabkan kerusakan stroma ovarium.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
35
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian.
1. Jenis Penelitian
Penelitian ini secara eksperimental laboratorium.
2. Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan di penelitian ini adalah pretest -
postest control group design.
Gambar 8. Rancangan Penelitian
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
36
B. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan mulai bulan April 2012 sampai dengan bulan Mei
2012, di lembaga pengembagan penelitian terpadu (LPPT) dan laboratorium
Patologi Anatomi Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
C. Subjek Penelitian.
Subjek pada penelitian ini adalah hewan coba tikus betina galur Wistar
dengan kreteria inklusi tikus sehat, berumur 2.5 bulan ,berat badan 170 gr,
makan dan minum disamakan, suhu ruangan sama . Kreteria eksklusi tikus
sakit,gerak tidak aktif,warna bulu kusam dan atau rontok.
D. Besar sampel
Perhitungan jumlah sampel minimum yaitu dengan menggunakan
rumus sebagai berikut:
潐 实揍足广囊能崎税2�呻纵1石�呻邹卒十纵广囊能脐税�囊纵1石�囊邹十�挠纵1石�挠邹邹租挠纵�囊石�挠邹挠
(Murti, 2010)
Keterangan:
n = ukuran sampel masing-masing dari 2 kelompok sampel
P = perkiraan proporsi (prevalensi) variable dependen pada populasi �呻 = (P1+P2)/2
Z1-α = statisitik Z
α = kesalahan tipe I
β = kesalahan tipe II
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
37
Untuk perhitungan ukuran sampel digunakan software OpenEpi®, maka
didapatkan hasil di bawah ini:
Sample Size for Frequency in a Population
Population size(for finite population correction factor or fpc)(N): 1000000 Hypothesized % frequency of outcome factor in the population (p): 50%+/-23
Confidence limits as % of 100(absolute +/- %)(d): 23% Design effect (for cluster surveys-DEFF): 1
Sample Size(n) for Various Confidence Levels
Confidence Level(%) Sample Size
95% 19
80% 8
90% 13
97% 23
99% 32
99.9% 52
99.99% 72
Equation Sample size n = [DEFF*Np(1-p)]/ [(d2/Z2
1-α/2*(N-1)+p*(1-p)] Sample size of group 1 (control) 20 Sample size of group 2 (VCD 80 mg/kgBB) 20 Sample size of group 3 (VCD 160 mg/kgBB) 20 Total sample size 3 groups 60
Results from OpenEpi, Version 2, open source calculator--SSPropor
Jadi dalam penelitian ini secara membutuhkan 60 sampel dengan perincian
20 tikus pada kelompok kontrol dan 40 tikus pada kelompok paparan VCD 80
mg/kgBB dan VCD 160 mg/kgBB (masing-masing kelompok sebanyak 20 tikus).
Sampel penelitian dibagi dalam tiga kelompok yaitu: Kelompok Kontrol
sebanyak 20 ekor yaitu tikus yang tidak mendapatkan perlakuan dengan VCD;
Kelompok Perlakuan I sebanyak 20 ekor yaitu tikus yang mendapat perlakuan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
38
dengan VCD 80mg/kgBB; Kelompok Perlakuan II sebanyak 20 ekor yaitu tikus
yang mendapat perlakuan dengan VCD 160mg/kgBB.
E. Variabel Penelitian.
1. Variabel bebas.
Kadar 4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD).
2. Variabel terikat.
Kerusakan stroma ovarium.
F. Definisi Operasional.
1. 4-Vinyl Cyclohexene Diepoxide (VCD) adalah hasil metabolisme dari 4-
Vinylcyclohexene (VCH). Yang diencerkan dan di beri emulgator sesame
oil yang telah disesuaikan dengan berat badan tikus dan di suntikkan
secara intraperitonial.
2. Stroma ovarium merupakan jaringan penyokong dari proses hormonal dan
fertilitas tikus pada usia reproduksi
3. Kerusakan stroma ovarium adalah adanya suatu kerusakan pada jaringan
stroma ovarium yang dapat berupa fibrotik, kekosongan area stroma,
penyempitan pembuluh darah, iskemia, atau nekrosis.
G. Prosedur penelitian yang dilakukan
1. Pemilihan mencit
2. Penimbangan mencit
3. Pemberian tanda
4. Pengelompokan mencit
5. Penyuntikan VCD intraperitoneal
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
39
6. Pembedahan abdomen mencit
7. Pengambilan ovarium mencit
8. Pemeriksaan histopatologi ovarium
H. Alat dan Bahan Penelitian
Pembuatan Slide jaringan
a. Alat:
- Cassette tissue - Beaker glass
- Mikrotom - Poly L-Lysine slides
- Deckglass - Humidity chamber vertical
- Humidity chamber horisontal - Mikro pipet 10 µl
- Mikro pipet 100 µl - Mikro pipet 1000 µl
- PCR tube - Shaker
b. Bahan
- Formalin buffer 10% - Alkohol 100%, 95%, 80%, 70%.
- Xylol - Parafin
- Aquadest - Buffer sitrat pH 6
- PBS pH 7,2 - 7,4 - Metanol H2O2 0,3%
- Bloking serum - Streptavidin
-Substrat enzim peroksidase: DAB - Hematoxylin
- Canada balsam - Kapas atau tissue
c. Reagen:
- 4-vinylcyclohexane diepoxide (sigma)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
40
- antibodi anti estrogen (sigma)
- antibodi anti mouse reseptor estrogen alfa (sigma)
- antibodi caspase 3 (sigma)
I. Cara Kerja
a.Perlakuan tikus
1. Subyek penelitian yang dipilih yaitu tikus betina galur Wistar sebanyak
60 ekor. Berdasarkan masa puber tikus pada umur 28 hari, maka mulai
umur 21 hari dilakukan pemisahan tikus dari induknya. Pada umur 28 hari
dilakukan sinkronisasi birahi dengan cara penyuntikkan PMSG
intramuskular dosis 5-8 iu (0,1 cc).
2. Sampel penelitian dibagi ke dalam 3 kelompok secara acak, yaitu
kelompok kontrol, kelompok I (VCD 80 mg/kgBB) dan kelompok II
(VCD 160 mg/kgBB). Kelompok kontrol terdiri dari 20 tikus yang
diberikan injeksi sesame oil secara intraperitoneal. Kelompok II terdiri
dari 20 tikus yang diberikan suntikan VCD 80 mg /kgBB (pengenceran
dengan sesame oil 1:40). Kelompok 3 terdiri dari 20 tikus yang diberikan
suntikan VCD 160 mg /kgBB (pengenceran dengan sesame oil 1:40).
3. Kelompok I & II diberikan suntikan VCD secara intraperitoneal sekali
setiap hari selama 15 hari.
4. Sebelum diberikan suntikan VCD dan setiap 5 hari dilakukan ovorektomi
pada dua tikus pada kelompok perlakuan. Pada tikus kelompok kontrol
dilakukan ovorektomi pada hari ke-0, ke-5, ke-10 dan hari ke-15 masing-
masing 5 tikus.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
41
5. Ovarium dikirim ke laboratorium PA FK UGM Yogyakarta untuk
dilakukan blok paraffin dan dipotong dengan mikrotom menjadi preparat
PA.
b.Pembuatan Slide jaringan
1) Fiksasi
Fiksasi berfungsi untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi
stabil secara fisik dan kimiawi dan mencegah terjadinya dialysis atau
pembengkakan pada ruptur. Fiksasi dilakukan dengan menggunakan
larutan formalin buffer 10%.
2) Dehidrasi
Dehidrasi berfungsi untuk menarik air dalam jaringan. Untuk proses
dehidrasi digunakan alkohol 70% hingga 100%.
3) Clearing
Clearing berfungsi untuk menghilangkan/ menarik alkohol dalam
jaringan, memberikan warna bening pada jaringan, serta sebagai zat
perantara masuknya ke dalam parafin. Proses clearing menggunakan
larutan xylol.
4) Infiltrasi Parafin
Setelah clearing, jaringan kemudian dimasukkan ke dalam parafin cair
pada suhu 57-59oC selama ±4 jam. Hal ini berfungsi untuk mengisi
pori-pori dalam jaringan.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
42
5) Embedding
Jaringan yang sudah selesai di proses dikeluarkan dan segera
dinasukkan ke dalam cetakan blok yang sebelumnya sudah diisi
dengan parafin cair hingga mengeras selama ±20 menit.
6) Pemotongan dengan mikrotom
Sebelum dipotong dengan mikrotom, blok didinginkan dengan
pemberian batu es selama 15 menit. Blok dijepitkan pada mikrotom
kemudian dipotong dengan pisau mikrotom dengna kemiringna 30
terhadap blok parafin setebal 2,5 mikron. Hasil potongan yang berupa
pita dimasukkan ke dalam waterbath yang sebelumnya telah diisi
dengan air yang dihangatkan sebanyak 50 C, kemudian diambil dengan
objek glass dan diberi nomor dengan pensil kaca sesuai nomor
registrasi blok, dibiarkan 5 menit, kemudian diinkubasi.
7) Pengecatan/ Staining
a) Deparafinisasi dengan memasukkan preparat xylol I, II, III masing-
masing selama 3 menit
b) Rehidrasi dengan memasukkan preparat ke alkohol 100%, 95%,
80%, dan 70% masing-masing selama 2 menit
c) Preparat dimasukkan ke air mengalir selama 3 menit
d) Pengecatan inti dengan memasukkan ke Mayer Hematoksilin
selama 7 menit
e) Preparat dimasukkan ke air mengalir selama 7 menit
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
43
f) Counter stain dengan memasukkan ke larutan Eosin selama 30
detik
g) Dehidrasi dengan memasukkan ke dalam alkohol 70%, 80%, 95%,
dan 100% masing-masing 3 celupan
h) Clearing dengan memasukkan ke dalam xylol I dan II masing-
masing selama 2 menit.
i) Mounting dengan meneteskan 1 tetes Entelan dan dek glass.
c.Pembacaan
a) Pembacaan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran
10x.
b) Stroma ovarium terdiri dari sel yang berbentuk
spindle/fibroblast,berhubungan dengan pematangan folikel
c) Sel terdiri dari lemak cytoplasmik dan dikelilingi serat
retikulin,menyerupai miofibrioblastik
d) Pembuluh darah di sekitar stroma ovarium
J. Analisis Data.
Data yang diperoleh (hasil akhir skor histologi) dikumpulkan dan
dibandingkan kemaknaannya secara histology/kwalitatif dan kemudian
diolah dengan uji Chi Square menggunakan program SPSS versi 17.0 for
Windows.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
44
BAB IV
HASIL DAN ANALISA DATA PENELITIAN
A. Hasil Penelitian
Penelitian dilakukan dengan membandingkan kerusakan stroma ovarium
pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan pada hari ke 0, hari ke 5, hari
ke 10, dan hari ke 15. Pada hari-hari tersebut, diambil ovarium 5 tikus dari tiap
kelompok. Kemudian dilihat adanya kerusakan stroma dari setiap ovarium
dengan memeriksa sebanyak 10 lapang pandang pada tiap ovarium. Hasil dari
penelitian lengkap dapat dilihat pada lampiran 1. Data yang didapatkan dari
penelitian ini kemudian diolah dengan menggunakan program SPSS statistik
versi 17.0 for windows.
Tabel 4.1. Resume hasil pemeriksaan kerusakan stroma ovarium.
Hari ke 0 Hari ke 5 Hari ke 10 Hari ke 15
Rusak Tidak rusak Rusak
Tidak rusak Rusak
Tidak rusak Rusak
Tidak rusak
Kontrol 0 10 0 10 0 10 0 10
80 0 10 1 9 2 8 2 8
160 0 10 1 9 2 8 2 8
B. Analisis Data Penelitian
1. Hari ke 0 (sebelum perlakuan)
Ovarium tikus sampel diteliti sebelum diberi perlakuan (hari ke 0)
dengan maksud untuk dijadikan sebagai dasar bahwa ovarium tikus yang
digunakan dalam keadaan yang baik. Pada penelitian yang dilakukan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
45
sebelum tikus diberi perlakuan, didapatkan hasil yang menunjukkan bahwa
tidak didapatkan adanya kerusakan stroma ovarium baik pada kelompok
kotrol maupun pada kelompok perlakuan, seperti ditunjukkan dalam tabel
4.2 di bawah ini.
Tabel 4.2. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 0.
Kelompok Kerusakan stroma ovarium
p Ya n (%)
Tidak n (%)
Total n (%)
Kontrol 0 (0) 10 (100) 10 (100)
1,000 VCD 80 mg/KgBB 0 (0) 10 (100) 10 (100)
VCD 160 mg/KgBB 0 (0) 10 (100) 10 (100)
Tabel di atas menunjukkan bahwa sebelum diberi perlakuan, kedua
kelompok tikus tidak terdapat adanya kerusakan stroma ovarium. Sehingga
dari hal ini dapat disimpulkan bahwa tidak didapatkan perbedaan antara
kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.
2. Hari ke 5
Pada hari kelima pemberian VCD dalam dosis 80 mg/KgBB dan 160
mg/KgBB, dilakukan pemeriksaan histopatologis ovarium untuk
mengetahui adanya kerusakan yang terjadi pada stroma ovarium akibat
paparan VCD. Data yang didapatkan pada pemeriksaan pada hari kelima
dapat dilihat pada tabel berikut:
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
46
Tabel 4.3. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 5.
Kelompok Kerusakan stroma ovarium
P Ya n (%)
Tidak n (%)
Total n (%)
Kontrol 0 (0) 10 (100) 10 (100)
0,585 VCD 80 mg/KgBB 1 (10) 9 (90) 10 (100)
VCD 160 mg/KgBB 1 (10) 9 (90) 10 (100)
Tabel tersebut menunjukkan bahwa pada hari kelima pemberian VCD
dengan dosis 80 mg/KgBB dan serta VCD dengan dosis 160 mg/KgBB
didapatkan hasil p = 0,585 (p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa tidak
didapatkan adanya perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol
dengan kelompok perlakuan 80 mg/KgBB serta kelompok perlakuan 160
mg/KgBB. Dapat pula diartikan bahwa pemberian VCD dengan dosis 80
mg/KgBB dan dosis 160 mg/KgBB selama 5 hari menyebabkan terjadinya
kerusakan stroma ovarium, namun secara statistik kerusakan stroma
ovarium yang terjadi tidak signifikan.
3. Hari ke 10
Pada hari ke 10 pemberian perlakuan dengan induksi VCD pada tikus
dilakukan pula pemeriksaan histopatologis ovarium tikus sampel untuk
melihat adanya perubahan pada stroma ovarium sejak diberikannya VCD
pada tikus sampel. Data hasil pemeriksaan pada hari ke 10 tersebut
ditunjukkan dalam tabel berikut:
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
47
Tabel 4.4. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 10.
Kelompok Kerusakan stroma ovarium
P Ya n (%)
Tidak n (%)
Total n (%)
Kontrol 0 (0) 10 (100) 10 (100)
0,315 VCD 80 mg/KgBB 2 (20) 8 (80) 10 (100)
VCD 160 mg/KgBB 2 (20) 8 (80) 10 (100)
Tabel tersebut menunjukkan bahwa pada hari ke 10 pemberian VCD
dengan dosis 80 mg/KgBB dan dengan dosis 160 mg/KgBB didapatkan
hasil p = 0,315 (p>0,05) yang berarti tidak didapatkan perbedaan yang
signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan 80
mg/KgBB dan 160 mg/KgBB. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian VCD
dengan dosis 80 mg/KgBB dan dosis 160 mg/KgBB selama 10 hari
menyebabkan terjadi adanya kerusakan stroma ovarium yang secara statistik
tidak signifikan.
4. Hari ke 15
Selanjutnya dilakukan pula pemeriksaan pada hari ke 15 untuk
melihat adanya kerusakan stroma ovarium yang terjadi. Dari hasil
pemeriksaan didapatkan bahwa terjadi kerusakan stroma ovarium pada
kelompok perlakuan 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB sebanyak 3 kerusakan
dari masing-masing kelompok perlakuan. Data yang didapatkan dari
penelitian tersebut dapat dilihat pada tabel 4.5 berikut ini:
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
48
Tabel 4.5. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 15.
Kelompok Kerusakan stroma ovarium
P Ya n (%)
Tidak n (%)
Total n (%)
Kontrol 0 (0) 10 (100) 10 (100)
0,315 VCD 80 mg/KgBB 2 (20) 8 (80) 10 (100)
VCD 160 mg/KgBB 2 (20) 8 (80) 10 (100)
Dari tabel tersebut ditunjukkan bahwa pada perbandingan kelompok
perlakuan dengan dosis 80 mg/KgBB serta dengan dosis 160 mg/KgBB
didapatkan p = 0,315 (p>0,05). Hal ini berarti bahwa tidak didapatkan
adanya perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dengan
kelompok perlakuan 80 mg/KgBB serta kelompok perlakuan 160
mg/KgBB. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa hingga hari ke 15
pemberian VCD dengan dosis 80 mg/KgBB dan dosis 160 mg/KgBB
menyebabkan terjadi adanya kerusakan stroma ovarium, namun kerusakan
yang terjadi secara satistik tidak signifikan.
5. Perubahan Kerusakan Ovarium
Selain dilakukan pengolahan data statistik dengan menggunakan uji
Chi Square, dilakukan pula uji McNemar untuk melihat perubahan
kerusakan yang terjadi pada stroma ovarium selama 15 hari perlakuan
berupa pemberian VCD dosis 80 mg/KgBB dan dosis 160 mg/KgBB. Hasil
uji McNemar dapat dilihat pada tabel di bawah ini;
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
49
Tabel 4.6. Hasil uji McNemar tentang perubahan kerusakan stroma ovarium
pada hari ke 5, hari ke 10, dan hari ke 15 dibandingkan dengan hari ke 0
Kerusakan Stroma ovarium
Hari ke 5 Hari ke 10 Hari ke 15
N (total) 30 30 30
n (rusak) 2 4 4
% kerusakan 6,7% 13,3% 13,3%
P 0,500 0,125 0,125
Dari hasil yang didapatkan pada uji McNemar di atas, terlihat bahwa
terjadi peningkatan kerusakan stroma ovarium yang terjadi mulai hari ke 5
perlakuan hingga hari ke 15 perlakuan. Kerusakan yang terjadi pada hari ke
5 perlakuan terjadi pada kelompok perlakuan 80 mg/KgBB dan 160
mg/KgBB masing-masing sebanyak 1 kerusakan. Pada uji McNemar,
kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol pada hari ke 5
menunjukkan nilai p = 0,500 (p>0,05). Hal ini berarti tidak didapatkan
perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok
perlakuan.
Kerusakan stroma ovarium yang terjadi pada hari ke 10 dan hari ke 15
perlakuan yaitu sebanyak 2 kerusakan pada kelompok 80 mg/KgBB serta 2
kerusakan pada kelompok perlakuan 160 mg/KgBB. Pada evaluasi dengan
uji McNemar, didapatkan nilai p = 0,125 (p>0,05). Hasil tersebut
menunjukkan bahwa antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
50
telah terdapat perbedaan, meskipun secara statistik hasilniali p tersebut
masih belum signifikan.
(A)
(B) (C)
Gambar 9. Hasil penelitian pada hari ke 15. (A) kontrol,
(B) perlakuan 80 mg/Kg BB, dan (C) perlakuan 160 mg/KgBB
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
51
BAB V
PEMBAHASAN
4-vinylcyclohexane diepoxide (VCD) merupakan suatu hasil metabolit dari
4-vinylcyclohexane (VCH) yang didapatkan sebagai agen kimia hasil manufaktur
pada pembuatan pestisida, bahan berbasis karet, dan plastik. Agen kimia ini
mempunyai selektifitas untuk merusak folikel primordial dan folikel primer pada
ovarium melalui proses induksi atresia secara alami (Hoyer dan Sipes, 2007).
Ovarium mengandung berbagai macam enzim yang bertugas untuk
melakukan biotransformasi dan detoksifikasi berbagai bahan ovotoksik. Enzim
tersebut diantaranya epoxidehydrolase, glutathione S-transferases, dan
cytochrome P-450 (Johnson et al., 2004). Mekanisme enzimatik utama
detoksifikasi adalah hidrasi untuk membentuk diol (yang dikatalisis oleh
microsomalepoxidehydrolase) dan konjugasi dengan gluttion (yang dikatalisis
oleh glutathione S-transferase). Pada studi isolasi in vitro folikel ovarium
diketahui bahwa folikel ovarium dapat mengubah secara langsung VCD menjadi
bentuk inaktif tetrol yaitu 4-(1,2- dihydroxy) ethyl-1,2-dihydroxycyclohexane.
Namun jika dibandingkan dengan folikel ovarium dengan ukuran lebih besar,
folikel ovarium kecil menunjukan kapasitas paling rendah dalam detoksifikasi
VCD, sehingga hal ini membuat folikel preantral kecil sebagai target utama
ovotksisitas VCD (Muhammad et al., 2009). Telah banyak penelitian yang
menyebutkan patofisiologi terjadinya kerusakan folikel ovarium akibat pengaruh
paparan VCD pada hewan uji tikus. Melalui penelitian ini, peneliti mencoba
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
52
untuk mengetahui pengaruh VCD terhadap stroma ovarium yang merupakan
jaringan penyokong dari folikel ovarium.
Untuk mengetahui pengaruh VCD terhadap stroma ovarium, dilakukan
induksi VCD secara peritoneal pada tikus wistar. Tikus dibagi dalam tiga
kelompok, yaitu kelompok kontrol (tidak mendapatkan induksi VCD), kelompok
80 mg/KgBB (mendapat pemberian VCD sebanyak 80 mg/KgBB), serta
kelompok 160 mg/KgBB (mendapat pemberian VCD sebanyak 160 mg/KgBB).
Kelompok kontrol dalam penelitian ini berfungsi sebagai pembanding serta
berfungsi pula untuk mengurangi bias akibat adanya pengaruh dari faktor-faktor
luar yang tidak dapat dikendalikan. VCD diberikan dengan suntikan secara
intraperitoneal terhadap masing-masing tikus sampel dengan dosis 80 mg/KgBB
untuk kelompok 80 mg/KgBB, serta 160 mg/KgBB pada kelompok 160
mg/KgBB. Sedangkan pada kelompok kontrol, disuntikkan cairan sasame oil yang
merupakan zat pelarut VCD dalam penelitian ini.
Pemeriksaan stroma ovarium dilakukan pada setiap kelompok sebanyak
empat kali, yaitu sebelum pemberian perlakuan, hari ke-5 perlakuan, hari ke-10
perlakuan, serta hari ke-15 perlakuan. Penentuan lama penelitian ini dilakukan
berdasarkan pengaruh VCD terhadap ovarium tikus untuk terjadinya Premature
Ovarian Failure (POF). Telah diketahui dari penelitian-penelitian yang dilakukan
sebelumnya bahwa VCD akan menyebabkan terjadinya kerusakan folikel ovarium
dalam pemberian secara intraperitoneal dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160
mg/KgBB dalam jangka waktu pemberian selama 15 hari. Dalam penelitian ini,
peneliti mencoba untuk meneliti tentang pengaruh pemberian VCD secara
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
53
intaperitoneal dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB yang akan merusak
folikel ovarium, apakah juga akan menyebabkan terjadinya kerusakan dari stroma
ovarium hewan coba.
Stroma ovarium diperiksa dengan pemeriksaan histopatologis yang
dilakukan di laboratorim Patologi Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas
Gadjah Mada Yogyakarta. Pemeriksaan histopatologis yang dilakukan tersebut
bertujuan untuk mencari adanya kerusakan stroma ovarium yang disebabkan oleh
pemberian VCD pada hewan uji. Kerusakan stroma ovarium yang mungkin terjadi
dapat berupa terbentuknya jaringan fibrotik pada stroma ovarium, kekosongan
jaringan stroma yang mungkin disebabkan oleh terjadinya vakuolisasi jaringan
stroma atau jaringan stroma yang nekrosis, serta terjadinya kerusakan pembuluh
darah yang memberikan suplai darah ke folikel ovarium. Setiap ovarium hewan
uji diperiksa adakah kerusakan-kerusakan tersebut. Pemeriksaan dilakukan di
bawah mikroskop dengan pembesaran 10x, serta diperiksa sebanyak 10 lapang
pandang untuk setiap ovarium yang diperiksa. 10 lapang pandang yang diperiksa
ini dianggap telah mewakili untuk memeriksa seluruh ovarium.
Pada pemeriksaan sebelum diberi perlakuan, tidak didapatkan adanya
kerusakan stroma ovarium baik pada kelompok kontrol maupun pada kelompok
perlakuan 80 mg/KgBB serta kelompok perlakuan 160 mg/KgBB. Dengan
demikian, dari hasil tersebut menunjukkan bahwa kelompok kontrol dan
kelompok perlakuan merupakan dua kelompok yang setara sehingga layak untuk
digunakan dalam penelitian ini.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
54
Pemeriksaan stroma ovarium dilakukan pada hari ke 5 pemberian VCD.
Pemeriksaan tersebut dilakukan untuk memeriksa adanya kerusakan stroma
ovarium yang disebabkan oleh pemberian VCD dengan dosis 80 mg/KgBB dan
160 mg/KgBB. Pada pemeriksaan hari ke 5 tersebut, didapatkan kerusakan stroma
ovarium pada kelompok perlakuan 80 mg/KgBB maupun kelompok 160
mg/KgBB masing-masing sebanyak 1 buah kerusakan. Kerusakan yang terjadi
adalah sebuah vakuolisasi pada jaringan stroma ovarium. Walaupun kerusakan
yang terjadi sangat kecil, namun hal ini tetap dianggap sebagai adanya kerusakan
pada ovarium tersebut.
Data yang didapatkan dari pemeriksaan ini kemudian diolah dengan
menggunakan program SPSS 17.0 for Windows dan didapatkan hasil berupa nilai
p = 0,585 (p>0,05). Data ini menunjukkan bahwa tidak didapatkan perbedaan
yang signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan pada hari ke
5 pemberian VCD. Sehingga dapat disimpulkan bahwa pada pemberian VCD
dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB selama 5 hari tidak menyebabkan
terjadinya kerusakan stroma ovarium.
Pada hari ke 10 pemberian VCD dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB,
dilakukan kembali pemeriksaan terhadap 5 tikus dari masing-masing kelompok
untuk memeriksa adanya kerusakan stroma ovarium. Pada pemeriksaan hari ke 10
ini didapatkan hasil bahwa terdapat kerusakan stroma ovarium berupa vakoulisasi
jaringan stroma ovarium sebanyak 2 kerusakan pada kelompok perlakuan 80
mg/KgBB serta terjadi 2 kerusakan stroma ovarium yang juga berupa vakuolisasi
dan nekrosis pembuluh darah pada kelompok perlakuan 160 mg/KgBB. Data yang
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
55
telah didapatkan dari pemeriksaan ini kemudian diolah dengan uji Chi Square dan
didapatkan hasil nilai p = 0,315. Hasil uji Chi Square ini menunjukkan bahwa
meskipun terdapat adanya kerusakan stroma ovarium pada kelompok perlakuan,
namun kerusakan yang terjdai pada pemeriksaan ini masih menunjukkan secara
statistik tidak signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan
pada hari ke 10 pemberian VCD dosis 80 mg/KgBB dan dosis 160 mg/KgBB.
Pada pemeriksaan yang dilakukan pada hari ke 15, terdapat kerusakan
stroma ovarium sebanyak 2 kerusakan dari masing-masing kelompok perlakuan
80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB dan hingga hari ke 15 ini, kelompok kontrol
tetap tidak didapatkan adanya kerusakan stroma ovarium. Kerusakan yang terjadi
ini kemudian diolah dengan uji Chi Square dan didapatkan nilai p = 0,315. Hasil
uji ini menunjukkan bahwa meskipun terjadi adanya kerusakan stroma ovarium
pada kelompok perlakuan dan tidak didapatkan adanya kerusakan pada kelompok
kontrol, namun dari hasil tersebut didapatkan bahwa secara statistik adanya
kerusakan stroma ovarium tidak signifikan antara kelompok kontrol dengan
kelompok perlakuan .
Pengolahan data kemudian dilanjutkan dengan menggunakan uji McNemar
untuk mengetahui perubahan kerusakan dari hari ke 0 hingga hari ke 15
penelitian. Uji ini dilakukan dengan menbandingkan data hasil penelitian pada
hari ke 0 dengan masing-masing data penelitian pada hari ke 5, hari ke 10, dan
hari ke 15. Hasil dari uji McNemar ini menunjukkan adanya peningkatan
kerusakan stroma ovarium mulai hari ke 5 hingga hari ke 15, dimana pada hari ke
5 nilai p = 0,500, pada hari ke 10 nilai p = 0, 125, dan pada hari ke 15 nilai p =
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
56
0,125. Pada pengujian dengan menggunakan Chi Square menunjukkan bahwa
hasil penelitian tersebut didapatkan terjadinya kerusakan stroma ovarium
meskipun kerusakan yang terjadi menunjukkan nilai p yang tidak signifikan antara
kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan. Sedangkan pada pengujian dengan
menggunakan uji McNemar, terjadi perubahan kerusakan stroma ovarium pada
hari ke 5 hingga hari ke 15. Perubahan kerusakanstroma ovarium tersebut
menunjukkan nilai p yang tidak signifikan.
Kerusakan yang terjadi pada stroma ovarium akibat pemberian VCD tidak
signifikan karena VCD memiliki sasarannya pada folikel preantral dan folikel
primer. Sehingga kerusakan yang terjadi pada stroma ovarium tidak sebanyak
pada kerusakan yang terjadi pada folikel ovarium.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
57
BAB VI
SIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan analisis hasil penelitian dan pembahasannya, maka
dapat disimpulkan bahwa pada tikus yang diberikan 4-vinylcyclohexane
diepoxide (VCD) secara intraperitoneal dengan dosis 80 mg/KgBB dan
160 mg/KgBB secara klinis dapat menyebabkan terjadinya kerusakan
stroma ovarium yang identik dengan proses pada Premature Ovarian
Failure (POF), meskipun secara statistik menunjukkan adanya kerusakan
stroma ovarium yang tidak signifikan.
B. Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek toksisitas VCD
terhadap stroma ovarium dengan ukuran sampel dan dosis yang lebih
besar.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai terapi Premature
Ovarian Failure (POF) melalui stroma ovarium.