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Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile

Prisca Cima Formazione tecnica in analisi biomediche Scuola superiore medico tecnica, Locarno

2008/2009

Lavoro di diploma svolto presso l’Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona Responsabili: Antonella Demarta AnnaPaola Caminada


Prisca Cima TAB3/SSMT 2

Indice 1.0 RIASSUNTO /ABSTRACT .............................................................................................4 2.0 ABBREVIAZIONI..........................................................................................................5 3.0 INTRODUZIONE..........................................................................................................6 3.1 Il Clostridium difficile...................................................................................... 6 3.2 Patogenicità ................................................................................................... 6 3.2.1 Fattori di virulenza ................................................................................ 7 3.3 Manifestazioni cliniche e prevenzione .......................................................... 7 3.4 Resistenza ...................................................................................................... 8 3.5 Tipizzazioni molecolari ................................................................................... 8 3.5.1 Tipizzazione tramite MALDO TOF ......................................................... 8 3.6 Scopo del lavoro............................................................................................. 8 4. MATERIALE E METODI................................................................................................9 4.1 Ceppi Batterici................................................................................................ 9 4.2 Terreni di coltura ........................................................................................... 9 4.3 Estrazione DNA .............................................................................................. 9 4.4 PCR ribotyping 16S‐23S................................................................................ 10 4.4.1 Migrazione in gel d’Agarosio per ribotipo .......................................... 10 4.5 Multiplex PCR tossine .................................................................................. 12 4.5.1 Migrazione in gel d’Agarosio per tossinotipo ..................................... 12 4.6 Ricerca geni tossina A .................................................................................. 13 4.6.1 Migrazione in gel d’Agarosio per ricerca gene tossina A.................... 14 4.7 PCR 16S ........................................................................................................ 14 4.7.1 Migrazione in gel d’Agarosio per PCR 16s .......................................... 16 4.8 Sequenziamento .......................................................................................... 16 4.8.1 Purificazione prodotto PCR................................................................. 16 4.8.2 Reazione di sequenza.......................................................................... 17 4.8.3 Purificazione con Sephadex G‐50 ....................................................... 17 4.8.4 Sequenziamento ................................................................................. 17 4.9 MALDI‐TOF ................................................................................................... 17 5. RISULTATI E DISCUSSIONE........................................................................................18 6. CONCLUSIONI ..........................................................................................................25 7. RINGRAZIAMENTI ....................................................................................................26 8. BIBLIOGRAFIA ..........................................................................................................27 9. ALLEGATI .................................................................................................................29



9.1 Allegato 1‐ ceppi analizzati .......................................................................... 29 9.2 Allegato 2‐ Thio ............................................................................................ 30 9.3 Allegato 3‐ Agar Sangue............................................................................... 30 9.4 Allegato 4‐ Skim Milk ................................................................................... 30 9.5 Allegato 5‐ Master mix................................................................................. 30 9.6 Allegato 6‐ Agarosio ..................................................................................... 31 9.7 Allegato 7‐ TBE ............................................................................................. 31 9.8 Allegato 8‐ GelRed ....................................................................................... 31 9.9 Allegato 9‐ Peso molecolare ........................................................................ 31 9.10 Allegato 10‐ Loading buffer ......................................................................... 31 9.11 Allegato 11‐ BigDye kit ................................................................................. 32 9.12 Allegato 12‐ Sephadex G‐50......................................................................... 32 9.13 Allegato 13‐ DHB .......................................................................................... 32



1.Riassunto Il C. difficile è un bacillo gram positivo, anaerobico e sporigeno, con una temperatura ottimale di crescita di 36°C. E’ molto diffuso nel suolo, nei sedimenti marini, nelle acque luride e nelle feci di esseri umani e di animali grazie alle sue spore molto resistenti anche in ambiente aerobico. Causa infezioni del tratto gastro‐intestinale, può colpire persone immunocompromesse o che hanno iniziato una cura antibiotica. L’infezione da C.difficile si manifesta con febbre, perdita di appetito, nausea e dolori addominali. Di particolare importanza è il ribotipo 027, in quanto ritenuto un ceppo molto virulento, che si sta propagando in tutto il mondo, ed è già stato isolato anche in Svizzera (Basilea). Lo scopo di questo lavoro è caratterizzare stipiti di C. difficile isolati in Ticino, valutando le eventuali correlazioni tra le varie infezioni occorse negli ospedali e verificando l’eventuale presenza del ribotipo 027. Sono stati inoltre testati i campioni per quanto riguarda il profilo tossigenico, in quanto la produzione di tossine è ritenuto un ulteriore fattore di virulenza. Attualmente dalle analisi svolte all’ICM in routine è unicamente possibile capire se il ceppo è produttore di tossine o meno senza poterle però differenziare. Sono stati analizzati 52 campioni, ma ne sono stati presi in considerazione 46. L’estrazione del DNA è stata effettuata tramite il kit InstaGene Matrix (Bio‐Rad). Per la tipizzazione è stata utilizzata la PCR ribotyping. Per la determinazione delle tossine è stata utilizzata una multiplex PCR. I campioni sono stati inoltre sottoposti ad analisi MALDI‐TOF, che è uno spettrometro di massa. Come risultato abbiamo ottenuto due dendrogrammi, uno dalla PCR ribotyping, al quale è poi associato ospedale di provenienza dei campioni e profilo tossigenico ed un altro dendrogramma ottenuto dall’analisi di spettrometria di massa. Paragonando i risultati della PCR ribotyping con il ceppo di riferimento (ribotipo 027) si è esclusa la presenza di questo ribotipo virulento in Ticino. Analizzando i dendrogrammi si sono potuti discutere molti punti. Comparando i due dendrogrammi non si notano similitudine nella disposizione dei campioni.

1.Abstract Clostridium difficile is a bacillus gram positive, anaerobic and sporogenic which has an optimal growth temperature of 36°C. It is very diffuse in soil, marine sediment, sewage and in human and animal faeces, due to a very resistant spore that also lives in an aerobic environment. It causes intestinal infections and affects the elderly, immunocompromised people, and those who have begun an antibiotic therapy. The infection is characterized by fever, appetite lost, nausea and abdominal pain. The most important strain belongs to the ribotype 027, a very virulent type, which is spreading all over the world and has already been isolated in Switzerland (Basel). The aim of this work is to characterize C. difficile stains isolated in Ticino, evaluating the relations among the infections occurred in hospitals and verifying whether the ribotype 027 is present. At present in routine analysis carried out at ICM is only possible to understand if a strain can produce toxins or not but the method in use can not differentiate them. In our study, the toxigenic profile of each strain has been established. In this study 52 samples were analysed, but were taken into account only 46. DNA extraction was performed using the kit InstaGene Matrix (Bio‐Rad). Typings were made trough the PCR ribotyping. A multiplex PCR has been carried on for the determination of the toxins. The samples were also analysed with MALDI‐TOF, which is a mass spectrometer. As a result, we have obtained two dendrograms, one from the PCR ribotyping, to which hospital origin of the samples and toxinotype were associated, and the second from mass‐spectrometry. Comparing the results of PCR ribotyping with the reference strain for the ribotype 027, the presence of this virulent ribotype in Ticino was excluded. Analyzing the dendrograms many discussion points were emerged. Comparing the two dendrograms no similitarity appears in the disposition of sample.



2. Abbreviazioni ICM Istituto cantonale di microbiologia C. difficile Clostridium difficile CDAD Clostridium difficile‐assaociated diseases PCR Polymerase chain reaction TNFα Tumor Necrosis Factor IL‐1 Interleuchina proinfiammatoria bp Paio di basi agarosio LE agarosio Low Electroendosmosis PFGE Pulsed‐field gel electrophoresis MLVA Multilocus variable‐number tandem‐repeat AFLP Amplified fragment length polymorphism REA Restriction endonuclease analysis MLST Multilocus sequence typing slpAST Surface layer protein A gene sequence typing MALDI‐TOF Matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐

flight TBE Tris‐borato EDTA DHB Dihydroxybenzoic acid OCL Ospedale Civico Lugano ACQ Ospedale di Acquarossa OBV Ospedale Beata Vergine Mendrisio ODL Ospedale la Carità Locarno OIL Ospedale Italiano Lugano IOSI Istituto oncologico Svizzera Italiana OSG Ospedale San Giovanni Bellinzona



3. Introduzione 3.1 Il Clostridium difficile Il C. difficile è un bacillo gram positivo, anaerobico e sporigeno, ha una temperatura ottimale di crescita di 36°C. Grazie alle sue spore, che possono resistere molto a lungo anche in ambienti aerobici, il C. difficile è diffuso nel suolo, nei sedimenti, nelle acque luride e nelle feci di esseri umani e di animali. Il C. difficile è infatti normalmente presente nel loro tratto intestinale. [1] Le colture su agar sangue si presentano solitamente con colonie lucenti, grigie o giallognole, rotondeggianti, dal margine frastagliato ed un odore simile al cavallo. [1] All’Istituto cantonale di microbiologia di Bellinzona il C. difficile viene isolato tramite una piastra selettiva chiamata Brazier’s C. difficile selective medium. Nel caso di una crescita sospetta, vengono inseminate altre due piastre Agar sangue, una viene incubata in ambiente aerobico e una in ambiente anaerobico. In caso di crescita solo sulla piastra incubata in ambiente anaerobico, viene fatto un test di agglutinazione come conferma. Se la presenza di C. difficile viene confermata, si effettua il test delle tossine sia partendo dalla colonia isolata sia dal campione di feci iniziale. Con questo test è possibile unicamente sapere se il patogeno è produttore di tossine oppure no, ma non è possibile distinguere il tipo di tossina prodotta. 3.2 Patogenicità Questo patogeno è sempre più frequentemente riconosciuto come il responsabile di infezioni ospedaliere e di diarrea da antibiotico. Fu identificato come agente patogeno per la prima volta nel 1978 [2]. Grazie ad una capsula polisaccaridica che impedisce la sua fagocitosi, fa in modo che il parogeno può legarsi alla parete gastrica dove poi prolifera causando infiammazione del colon. In pazienti sani, la flora batterica dell’intestino, composta da numerosi microorganismi, non riesce ad esercitare alcun effetto patogeno, in quanto il nostro organismo è in grado di contrastarne un eventuale sopravvento mantenendo però il minimo indispensabile di flora batterica per il corretto funzionamento dell’intestino. Nel caso di assunzione di antibiotici o persone immunocompromesse, avviene uno squilibrio della flora batterica dove il patogeno prende il sopravvento e prolifera indisturbato, causando la tipica manifestazione clinica da infezione di C. difficile: CDAD (= Clostridium difficile associated disease). Il suo insediamento nel tratto gastrointestinale causa patologie che per severità vanno dalla colonizzazione asintomatica, alla diarrea, alla colite pseudomembranosa, al megacolon tossico fino alla perforazione dell’intestino e portare addirittura, anche se raramente, alla morte del paziente. Sono a rischio di infezione da C. difficile specialmente gli anziani, le persone ricoverate in ospedale o in case anziani, le persone sottoposte ad una cura antibiotica, gli immunocompromessi e pazienti che hanno subito interventi chirurgici gastrointestinali. Nel caso di CDAD che insorge dopo trattamento con antibiotici. Ampicillina, amoxicillina, cefalosporine e clindamicina sono i farmici più comunemente associati a questa patlogia, anche se, teoricamente, tutti gli antibiotici sono in grado di provocare una CDAD [3].



Il contagio avviene tramite bocca, mucose, feci (vasche da bagno, servizi igienici, termometri rettali) e tramite operatori sanitari, i quali fungono da vettore manipolando i pazienti. 3.2.1 Fattori di virulenza I principali fattore di virulenza legati a questo patogeno sono l’enterotossina (tossina TcdA) e una citotossina (tossina TcdB). Ci sono ceppi di C. difficile che non sono produttori di tossine, altri che producono una singola tossina (gene TcdA o TcdB) e altri ancora che producono entrambe le tossine. Solamente i ceppi produttori di tossina sono stati identificati come responsabili di CDAD [1]. Alcuni ceppi producono un’ulteriore tossina, chiamata tossina binaria, che li rende particolarmente patogeni [4]. Questa tossina non è relazionata con la tossina A e la tossina B [5]. Nel 1990 è stato descritto un ceppo produttore unicamente di tossina B con una delezione del gene che produce la tossina A [1]. In questo caso il gene TcdA è presente nel genoma del batterio ma a causa di una mutazione vi è una delezione all’interno del gene, rendendolo così incapace di produrre la tossina A.

Figura1 Genoma PaLoc: Insieme dei geni tcdR, tcdB, tcdE, tcdA, tcdC [5]. I geni TcdB, TcdA codificano per la produzione delle tossine A e B [5]. I geni tcdR, tcdE e tcdC sono geni accessori [5]. Le nomenclature H, N, Hc, R, Ec, P, Ha, S, E, Nc mostrano i siti di restrizione.

Le tossine prodotte entrano nelle cellule epiteliali intestinali tramite endocitosi, distruggono l’actina del citoscheletro, causandonene la morte della cellula. Esse inducono inoltre la produzione di TNFα e IL‐1 [3]. La tossina A causa una necrosi delle cellule intestinali, ne aumenta la permeabilità, inibisce la sintesi delle proteine, e infine porta ad un erosione della mucosa gastrica [3]. La tossina B non ha evidenti attività enterotossiche, ed è efficace solo dopo che la parete intestinale è stata distrutta [3]. 3.3 Manifestazioni cliniche e prevenzione L’infezione da C. difficile è caratterizzata da diarrea acquosa, febbre, perdita di appetito, nausea e dolori addominali [3].

PaLoc



Si manifesta nei 4‐10 giorni che seguono l’inizio di assunzione di antibiotici, ma può anche insorgere settimane dopo la fine della terapia [3]. Le infezioni da C. difficile costituiscono un ruolo molto importante delle infezioni ospedaliere; infatti, sempre più spesso sono riconosciute causare epidemie nosocomiali [3]. Il miglior modo per prevenire l’infezione di questo batterio è di evitare l’assunzione di antibiotici se non è strettamente necessario. Per operatori sanitari si dovrebbe ridurre al minimo la possibile trasmissione tra un paziente e l’altro tramite materiale, superfici e manipolazioni; tenendo il tutto il più asettico possibile. 3.4 Resistenza Come molti altri batteri, anche il C. difficile mostra delle resistenze verso degli antibiotici. Alcuni ceppi sono resistenti a tetraciclina, cloramfenicolo o eritromicina mentre tutti i C. difficile sono sensibili a metronidazolo e vancomicina [1]. Nei casi più gravi, come ultimo rimedio, può essere necessario asportare parte dell’intestino infettato [3]. 3.5 Tipizzazioni molecolari Per la tipizzazione di questo battere esistono diversi metodi, i più importanti sono la PCR ribotyping, la PFGE, ma ne esistono altri meno usati come la MLVA, AFLP, REA, MLST, slpAST [7]. Per il mio lavoro di diploma è stato deciso di utilizzare come metodo per la tipizzazione, la PCR ribotyping [9]. La scelta è stata orientata verso questo metodo in quanto in Europa è il metodo più utilizzato, è di facile esecuzione e interpretazione rispetto alla PFGE [7] Per la determinazione delle tossine è stata scelta questa metodica perché necessitavamo di un metodo per la determinazione delle tossine rapido e funzionale, così da avere una differenziazione delle eventuali tossine prodotte dal patogeno [8]. 3.5.1 Tipizzazione tramite MALDI‐TOF I campioni testati sono stati sottoposti ad analisi tramite lo spettrometro di massa MALDI‐TOF. Lo spettrometro di massa, viene utilizzato in svariati campi, uno di questi è la microbiologia per l’identificazione delle famiglie e dei ceppi batterici. La classificazione si basa sulla massa molecolare o atomica e alla loro carica elettrica. Lo spettrometro di massa può essere diviso in quattro grandi parti distinte:

1. L’introduzione dei campioni sottoforma di gas, liquido o solido. 2. Ionizzazione dei campioni sotto vuoto. 3. Separazione delle particelle in base alla carica elettrica. 4. Analisi informatica.

Si ottiene così uno spettro di massa (rapporto tra massa e carica elettrica) così da poter identificare le colonie sottoposte a quest’analisi [10]. 3.6 Scopo del lavoro In Europa, si sta diffondendo un ceppo particolarmente virulento di C. difficile caratterizzato dal ribotipo 027. Questo ribotipo è stato isolato anche in Svizzera (Basilea).



Lo scopo del mio lavoro è di riuscire a caratterizzare a livello molecolare dei ceppi di C. difficile isolati in diversi ospedali e studi medici del Canton Ticino. Tutti i risultati ottenuti dalla PCR ribotipo vengono analizzati utilizzando il programma informatico BioNumerics versione 5.1 (Applied Maths, Belgio). Questo programma permette di parificare i vari gel, per poter così confrontare le varie bande che costituiscono i patterns, inoltre è in grado di trovare le eventuali similitudini tra patterns riuscendo a costruire un dendrogramma. Questo ha permesso di verificare se le varie infezioni accorse negli ospedali ticinesi hanno una correlazione fra loro, e di capire se ci fosse traccia del ribotipo 027 anche in Ticino. Infine ogni ceppo analizzato è stato sottoposto ad analisi con MALDI‐TOF per valutare se i risultati ottenuti da PCR ribotyping e della multiplex PCR per il profilo tossigenico, sono confrontabili e di conseguenza se in futuro sarà possibile passare alla spettromettria di massa per l’identificazione del C. difficile.

4. Materiale e metodi 4.1 Ceppi Batterici Ho analizzato 52 ceppi di C. difficile che sono stati isolati nel corso del 2008 ed inizio del 2009 dal reparto di microbiologia dell’ICM (allegato 1). I ceppi sono stati conservati nei tamponi di trasporto a ‐20°C. Il ceppo di riferimento (ribotipo 027) è stato gentilmente messo a disposizione dal Dr. Med R. Frei dell’Ospedale Universitario di Basilea. 4.2 Terreni di coltura Terreno di coltura liquido: Thio (thioglicolato) (allegato 2) Terreno di coltura solido: Agar Sangue (allegato 3) Terreno di conservazione a ‐80°C: Skim Milk (allegato 4) Ogni campione è stato scongelato, coltivato in brodo Thio in camera anaerobica per 24 ore a 36°C ed inseminato su Agar Sangue in camera anaerobica per 24 ore a 36°C. Per l’ottenimento di una colonia pura si è ripiastrato su Agar Sangue. Ogni ceppo è stato poi ricongelato in Skim Milk a ‐80°C direttamente dal terreno Agar Sangue. 4.3 Estrazione del DNA Per l’estrazione del DNA è stato usato il kit InstaGene Matrix (Bio‐Rad, Svizzera) secondo la metodologia fornita. In breve, si lisano le cellule batteriche ottenute da una coltura pura su piastra Agar Sangue, si aggiunge una matrice che assorbe i resti della lisi batterica (membrana batterica, polisaccaridi, proteine) e che tramite centrifugazione li trascina sul fondo, lasciando il DNA purificato, in soluzione nel sovranatante. Metodica InstaGene Matrix

• prendere un ansata sulla piastra e risospendere in 1 ml di acqua MilliQ (Millipore, NOIONAQUA Sagl, Svizzera) autoclavata, filtrata e sterilizzata.

• Centrifugare per un minuto a 10’000‐12’000 rpm. Rimuovere il sovranatante.



• Aggiungere 200 μl di InstaGene matrix nella provetta eppendorf e incubare a 56°C per un tempo che può variare tra i 15 e 30 minuti.

• Vortexare ad alta velocità per 10 secondi. Mettere la provetta eppendorf a 100°C per 8 minuti.

• Vortexare ad alta velocità per 10 secondi. Centrifugare a 10’000‐12'000 rpm per 2‐3 minuti.

• Usare il necessario per la reazione PCR, il rimanente conservare a ‐20°C. In caso di un seguente uso scongelare l’estratto, vortexare ad alta velocità per 10 secondi e centrifugare a 10’000‐12'000 rpm per 2‐3 minuti.

4.4 PCR ribotyping 16S‐23S I cicli di amplificazione del DNA vengono effettuati con il thermal Cycler “Applied Biosystem VERITI Termal Cycler” (Applied Biosystems, USA). Il Master Mix (QIAGEN) (allegato 5) utilizzato contiene già tutto il necessario per la reazione PCR esclusi i primer (Mycrosinth) ed il DNA. Tabella 1 Volume per il mix di reazione PCR ribotyping [9]

Mix di PCR per 1 campione

Master Mix 25 μl Primer 16S 10 μM 1.5 μl Primer 23S 10 μM 1.5 μl H2O RNAse free 17 μl DNA 5 μl Tabella 2 Primer utilizzati nella reazione PCR ribotyping [9]

16S 5’‐GTG CGG CTG GAT CAC CTC CT‐3’ 23S 5’‐CCC TGC ACC CTT AAT AAC TTG ACC‐3’ Il programma con il cycler è composto da: 6 minuti a 94°C (ciclo di denaturazione iniziale), seguito da 35 cicli composti da: 1 minuto a 94°C (denaturazione), 1 minuto a 57°C (annealing) e 1 minuto a 72°C (elongazione), per finire un estensione finale a 72°C per 7 minuti [9]. 4.4.1 Migrazione in gel d’agarosio per PCR ribotyping Questo prodotto PCR, per ottenere un risultato ottimale, necessita di una migrazione su gel d’agarosio ad alta risoluzione (allegato 6) al 3%. Essendo un gel ad alta concentrazione e avendo bisogno una risoluzione molto elevata (bande ben visibili e ben separate), la preparazione del gel è molto importante. Per far in modo di mantenere la concentrazione del gel costante anche dopo aver sciolto l’agarosio ho seguito il seguente metodo [11].

• Pesare l’agarosio • Aggiungere la quantità necessaria di tampone TBE 1X (allegato 7), in seguito pesare (beuta,

agarosio, tampone). • Aggiungere in eccesso il 10/20% del peso di acqua MilliQ (Millipore, NOIONAQUA Sagl,

Svizzera).



• Far bollire tenendo controllato il punto in cui, tramite evaporazione, il peso torna equivalente a quello di partenza.

• Nel caso in cui il peso dovesse scendere al di sotto di quello iniziare, si può aggiustare aggiungendo acqua distillata bollente.

• Aggiungere 10 μl di GelRed (colorante) (allegato 8), per 100 ml di TBE. • Versare il gel nello stampo.

In questa migrazione vengono caricati due marcatori di taglia da 100 bp (allegato 9) il controllo negativo, il ceppo di riferimento (ribotipo 027) ed i campioni.

Tabella 3 Volume da caricare su gel per elettroforesi

Campioni e controlli Marcatore di taglia Campione/controllo 10 μl Loading buffer 6X (allegato 10) 4 μl Marcatore di taglia 100 bp 9 μl

Nel primo e nell’ultimo pozzetto vengono caricati i marcatori di taglia, nei pozzetti centrali i campioni il controllo ed il ceppo di riferimento. Devono migrare per 3 ore a 25 V su di un gel al 3% di dimensioni 10 cm per 6 cm, tenendo il tampone raffreddato con del ghiaccio posto sotto la vaschetta elettroforetica. Si ottiene un profilo di ribotipo con più bande in quanto all’interno del genoma circolare del C. difficile le regioni 16S e 23S sono ripetute più volte, con uno spazio intergenico che varia in lunghezza da un operone all’altro.

Figura 2 Rappresentazione schematica dell’operone contenente le regioni conservate 16S‐23S. Nella PCR ribotyping viene amplificato lo spazio intergenico variabile, utilizzando i primer 16S e 23S.

Figura 3 Risultato PCR ribotyping. Nel primo e nell’ultimo pozzetto sono caricati i marcatori di taglia, nel secondo pozzetto si trova il controllo negativo, seguito dai campioni.

16S 23S Spazio intergenico

Primer 16S Primer 23S



4.5 Multiplex PCR tossine I cicli di amplificazione del DNA vengono effettuati con il thermal Cycler “Applied Biosystem VERITI Termal Cycler” (Applied Biosystems, USA). Il Multiplex Master Mix (QIAGEN) (allegato 5) contiene già tutto il necessario per la reazione PCR esclusi i primer (Mycrosinth) ed il DNA. Per i primer viene fatto un mix contenente i sei primer ad una concentrazione di 2 μM; 10 μl di ogni primer a 100 µM (tcdA‐R, tcdA‐F, tcdB‐R, tcdB‐F, tpi‐R, tpi‐F), e 440 μl di acqua RNAse free. I primer tcdA‐R tcdA‐F vanno a ricercare il gene che codifica per la produzione di tossina A, i primer tcdB‐R e tcdB‐F per la tossina B e i primer tpi‐R e tpi‐F si legano ad una regione costante presente in tutti i C. difficile, serve da conferma che il patogeno analizzato è effettivamente un C. difficile.

Tabella 4 Volume per il mix di reazione per la multiplex PCR tossine [8]

Mix di PCR per 1 campione Multiplex Master Mix 25 μl Mix dei primer (tcdA‐R, tcdA‐F, tcdB‐R, tcdB‐F, tpi‐R, tpi‐F)

5 μl

H2O RNAse free 15 μl DNA 5 μl

Tabella 5 Primer utilizzati nella reazione [8]

TcdA‐R 5’‐GTA TCA GGC ATA AAG TAA TAT ACT TT‐3’ TcdA‐F 5’‐AGA TTC CTA TAT TTA CAT GAC AAT AT‐3’ TcdB‐R 5’‐ATC TTT AGT TAT AAC TTT GAC ATC TTT‐3’ TcdB‐F 5’‐GGA AAA GAG AAT GGT TTT ATT AA‐3’ Tpi‐R 5’‐CAT AAT ATT GGG TCT ATT CCT AC‐3’ Tpi‐F 5’‐AAA GAA GCT ACT AAG GGT ACA AA‐3’ Il programma del cycler è composto da: 15 minuti a 95°C seguito da 11 cicli dove la temperatura di annealing diminuisce di 1°C ogni ciclo, parte dai 65°C per terminare ai 55°C. Questi 11 cicli sono composti da: 30 secondi a 95°C (denaturazione), 30 secondi a 65‐55°C (annealing) e 30 secondi a 72°C (elongazione). A questi 11 cicli seguono altri 29 cicli composti da: 30 secondi a 95°C (denaturazione) 30 secondi a 55°C (annealing) e 30 secondi a 72°C (elongazione) ed un estensione finale a 72°C per 7 minuti [8]: 4.5.1 Migrazione in gel d’agarosio per multiplex PCR tossinotipo Per questo prodotto PCR viene fatta un’elettroforesi in gel d’agarosio LE (allegato 6) all’1,5% Viene preparato facendo sciogliere l’agarosio nel tampone TBE 1X facendolo bollire ed in seguito vengono aggiunti 10 μl di GelRed per 100 ml di TBE. Quando è solidificato nell’apposito supporto, vengono caricati i campioni.




Campioni e controlli Marcatore di taglia Campione/controllo 10 μl Loading buffer 6X 4 μl Marcatore di taglia 100 bp 9 μl Migrazione per 1 ora e 45 a 100 V su di un gel di dimensioni 10 cm per 15 cm. Dal risultato si può avere la conferma se si tratta effettivamente di un C. difficile, se è produttore di tossine e in tal caso di differenziarle. Di questo prodotto PCR si possono ottenere sei varianti,

1. non si tratta di un C. difficile (nessuna banda) 2. è un C. difficile ma non produce tossine (una banda a 230 bp) 3. C. difficile produttore di tossina A (una banda a 230 bp e una a 369 bp) 4. C. difficile produttore di tossina B (una banda a 230 bp e una a 160 bp) 5. C.difficle produttore di tossina binaria (una banda a 230 bp, una a 369 bp e una a 160 pb) 6. C. difficile produttore di tossina B con delezione del gene A (una banda a 230 bp, una a 160

bp e una a 110 bp

Figura 4 Risultato elettroforesi PCR multiplex. [8]

4.6 Ricerca geni tossina A Questa PCR è stata fatta per verificare se i campioni nei quali ho ottenuto un profilo tossigenico solo B+ ha comunque il gene tcdA ma non è in grado di produrne la tossina. I cicli di amplificazione del DNA vengono effettuati con il Cycler “Appled Biosystem VERITI Termal Cycler”(Applied Biosystems, USA). Il Master Mix utilizzato contiene già tutto il necessario per la reazione PCR esclusi i primer ed il DNA.

negativo

Tpi (230bp)

tcdB (160bp)

tcdA non deleto (369bp)

tcdA deleto (110bp)

1 2 3 4 5

1. Negativo 2. Non tossigenico 3. Tossina A e tossina B 4. Tossina A e tossina B 5. Tossina A deleta

tossina B



Tabella 7 Volume per il mix di reazione per la ricerca del gene tcdA [12]


Master Mix (QIAGEN) 25 μl Primer yt28 10 μM (Mycrosinth) 1.5 μl Primer yt29 10 μM (Mycrosinth) 1.5 μl H2O RNAse free 17 μl DNA 5 μl

Tabella 8 Primer utilizzati nella reazione [12]

Yt28 5’‐GCA TGA TAA GGC AAC TTC AGT GG‐3’ Yt29 5’‐GAG TAA GTT CCT CCT GCT CCA TCA A ‐3’ Il programma del cycler è composto da una denaturazione iniziale da 94°C per 10 minuti, seguita da 35 cicli, ognuno composto da 50 secondi a 94°C per la denaturazione, 40 secondi a 54°C per l’annealing e 50 secondi a 72°C per l’elongazione, mentre l’estensione finale è di 10 minuti a 72°C. 4.6.1 Migrazione in gel d’agarosio per ricerca gene tossina A Per questo prodotto PCR viene fatta un’elettroforesi in gel d’agarosio LE all’1,5% Viene preparato facendo sciogliere l’agarosio nel tampone TBE 1X facendolo bollire ed in seguito vengono aggiunti 10 μl di GelRed per 100 ml di TBE. Quando è solidificato nell’apposito supporto, vengono caricati i campioni.


Campioni e controlli Marcatore di taglia Campione/controllo 10 μl Loading buffer 6X 4 μl Marcatore di taglia 9 μl Viene fatto migrare a 100 V per 1 ora e 15 minuti su di un gel di dimensioni 10 cm per 15 cm. Se il campione analizzato possiede il gene tcdA, si ottiene una banda a 602 bp. 4.7 PCR 16S Dei 52 campioni che ho analizzato, alcuni tramite PCR multiplex non confermavano essere C. difficile, così è stata fatta una PCR 16S per verificare se il risultato della multiplex è stato negativo perché la concentrazione di DNA contenuta nell’estratto è troppo bassa oppure se si tratta di un altro battere. Per questa PCR vengono usati dei primer universali, i quali vanno a legarsi alla sequenza 16S in una regione costante e uguale in tutti i batteri, così da amplificare poi il contenuto della regione, che è diversa per ogni specie batterica.



Figura 5 Regione amplificata della regione conservata 16S Se la PCR 16S risulta positiva, con una banda a 1500‐1600bp, partendo dallo stesso materiale utilizzato per l’analisi del profilo tossigenico, si conferma il risultato negativo ottenuto con i primer per il gene specifico di C. difficile tpi e cioè che non si tratta effettivamente di un C.difficile. Al contrario se la PCR 16S risulta negativa significa che la concentrazione di DNA nell’estratto non è sufficiente. I cicli di amplificazione del DNA vengono effettuati con il Cycler “Applied Biosystem VERITI Termal Cycler” (Applied Biosystems, USA). Il Master Mix (QIAGEN) utilizzato contiene già tutto il necessario per la reazione PCR esclusi i primer (Mycrosinth) ed il DNA.

Tabella 10 Volume per il mix di reazione per la PCR 16S


Master Mix 25 μl Primer UniL 10 μM 1.5 μl Primer UniR 10 μM 1.5 μl H2O RNAse free 17 μl DNA 5 μl

Tabella 11 primer utilizzati per la reazione

UniL 5’‐AGA GTT TGA TCA TGG CTC A‐3’ UniR 5’‐GTG TGA CGG GCG GTG TGT A ‐3’

16S 23S

Sequenza variabileSequenza conservata Sequenza conservata

Primer universale Primer universale

5S

OPERONE



Il programma cycler è composto da una denaturazione iniziale a 95°C per 5 minuti, seguita da 35 cicli composti da 30 secondi a 94°C per la denaturazione, 30 secondi a 52°C per l’annealing e 1 minuto a 72°C per l’elongazione, con un estensione finale a 72°C per 7 minuti, alla fine dei cicli. 4.7.1 Migrazione in gel d’agarosio per PCR 16S Per questa migrazione è necessario un gel d’agarosio LE allo 0.8%, viene preparato facendo sciogliere l’agarosio LE (allegato 6) nel tampone TBE 1X facendolo bollire, quando l’agarosio è ben sciolto vengono aggiunti 10 μl di GelRed per 100 ml di TBE. Quando il gel è solidificato vengono aggiunti i campioni.


Campioni e controlli Marcatore di taglia Campione/controllo 10 μl Loading buffer 6X 4 μl Marcatore di taglia 100 bp 9 μl Far migrare a 100 V per 25 minuti su di un gel di grandezza 6 cm per 4 cm. Il programma cycler è composto da una denaturazione iniziale a 94°C per 5 minuti, seguita da 35 cicli, ognuno composto da: 30 secondi a 94°C per la denaturazione, 30 secondi a 52°C per l’annealing e 60 secondi a 72°C l’elongazione. L’estensione finale viene effettuata a 72°C per 7 minuti. 4.8 Sequenziamento Per poter capire di che battere si tratta è stato necessario fare un sequenziamento. Il sequenziamento consiste nel stabilire la sequenza nucleotidica, in questo caso della regione 16S. Siccome ogni battere all’interno della regione 16S ha una sequenza specifica per la sua specie, eseguendo questa tecnica è possibile stabilire l’esatta specie batterica. Dopo la PCR 16S per poter proseguire con il sequenziamento è stato purificato l’amplificato, per eliminare i primer e i nucleotidi in eccesso. 4.8.1 Purificazione del prodotto PCR La purificazione viene fatta tramite il kit NucleoSpin Extract II (Macherey‐Nagel, Germania).

• Per purificare bisogna unire 100 μl di campione e 200 μl di Buffer NT, se i campioni sono inferiori a 100 μl aggiustare il volume con acqua distillata o Buffer NT.

• Mettere una colonnina NucleoSpin Extract II in una provetta da 2ml, depositarvi il campione e centrifugare 1 minuto a 11'000 g. Il DNA rimane legato sulla membrana.

• Aggiungere 600μl di Buffer NT3. Centrifugare per 1 minuto a 11'000 g. • Per eliminare completamente il Buffer NT3, centrifugare per 2 minuti a 11'000 g. • Cambiare la provetta e metterne una pulita, aggiungere 15‐50 μl di Elution Buffer NE,

incubare a temperatura ambiente per 1 minuto e centrifugare 1 minuto a 11'000 g.



4.8.2 Reazione di sequenza Partendo dagli amplificati purificati è stata fatta la reazione di sequenza.

Tabella 13 Volume per mix di reazione di sequenza

Mix per 1 campione

BigDye Terminator (applied biosystem) (allegato 11) 3.0 μl Buffer BigDye 5x (allegato 11) 1.5 μl Primer UniL 1 μM 2.4 μl H2O RNAse free 7.1 μl Amplicon purificato 1 μl I campioni sono stati caricato sul cycler con una denaturazione iniziale a 96°C per 1 minuto, seguito da 25 cicli ognuno composto da: 10 secondi a 96°C per la denaturazione, 5 secondi a 50°C per l’annealing e 4 minuti a 60°C per l’elongazione. 4.8.3 Purificazione con Sephadex G‐50 Per poter proseguire con il sequenziamento è necessario purificare la reazione di sequenza per eliminare gli elementi in eccesso. Questa procedura è stata fatta utilizzando il Sephadex G‐50 (allegato 12). Il Sephadex è una matrice solida che viene sospesa in acqua per poter essere pipettata. Dopo centrifugazione si ottiene un disco che serve da filtro.

• Mettere una colonnina in un epperndorf tube da 1.5 ml • Nella colonnina aggiungere 900 μl di Sephadex • Centrifugare 3 minuti a 770 g • Gettare l’acqua che si è depositata sul fondo dell’eppendrof • Pipettare 15‐20 μl di reazione di sequenza nella colonnina • Centrifugare per 3 minuti a 770 g • Nella eppendorf si ottiene il risultato della reazione di sequenza purificato

4.8.4 Sequenziamento Al prodotto reazione di sequenza sono stati aggiunti 10 μl di HI‐DI Formamide (evita l’evaporazione del campione) a 10 μl di reazione di sequenza purificata. Le provette di reazione sono state caricate sull’apparecchio ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) per determinarne la sequenza. Il risultato ottenuto dall’apparecchio è stato confrontato con la banca dati (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) per determinare la specie batterica. 4.9 MALDI‐TOF L’apparecchio utilizzato per l’analisi MALDI‐TOF, è il modello AXIMA confidence (Schimatzu biotech, Giappone). Per quest’analisi è necessario isolare una colonia batterica su Agar Sangue, la deposizione dei campioni deve avvenire dopo incubazione di 24 ore in camera anaerobica.



Questa colonia viene poi spottata su di un’apposita lama e aggiunto 0.5 μl di matrice DHB 2,5. (allegato 13) Questa lama viene posta nell’apparecchio il quale procede con l’analisi.

5. Risultati e discussione Dei 52 campioni analizzati ne sono stati presi in considerazione 46; 45 stipiti confermati ed un ceppo di riferimento (ribotipo 27) per la PCR ribotyping. (Allegato 1) 10 dei 52 campioni analizzati tramite multiplex PCR per il tossinotipo, non confermavano essere C. difficile. Per valutare se effettivamente si trattava di un altro battere, è stata fatta una PCR 16S seguita da sequenziamento. Tre campioni, dal sequenziamento risultavano essere C. difficile. Infatti facendo nuovamente una multiplex PCR tossinotipo è stato confermato il risultato. Gli altri sette campioni con il sequenziamento sono stati identificati come batteri non C. difficile, per questo motivo sono stati eliminati.

Figura 6 ospedale di provenienza dei campioni utilizzati, si nota che

l’ospedale OCL.

I risultati ottenuti dalla PCR ribotyping sono stati analizzati con il programma informatico bioNumerics versione 5.1 (Applied maths, Belgio) e si è ottenuto un dendrogramma, che ha raggruppato i vari campioni basandosi sul numero di bande visibili dopo elettroforesi. I profili che il programma ha ritenuto identici sono stati raggruppati vicini, più si differenziano più sono posti lontani uno dall’altro sul dendrogramma. Al dendrogramma ottenuto dall’analisi della PCR ribotyping, ad ogni campione, è stato associata la data di raccolta del materiale, l’ospedale di provenienza e il tossinotipo ottenuto dalla multiplex PCR tossinotipo.



Figura 7 Dendrogramma ribotipo, basato sul numero delle bande, correlazione con ospedale di provenienza e tossinotipo.

Cluster 1

Cluster 2

Cluster 3

100

9080706040816

43678

43673

3218725303

25566

34379

34366

4355930246

39077

182

36190

1072733825

44222

39510

33506

2868341349

19673

39043

39040

4324443114

37253

44221

38806

3960433335

34368

34839

35213

PCR 14221

41488

37814

42514

4006942958

30669

41754

35

3553943371

41709

01.12.2008

24.12.2008

24.12.2008

23.09.200830.07.2008

05.08.2008

10.10.2008

06.10.2008

24.12.200808.09.2008

17.11.2008

02.01.2009

24.10.2008

28.03.200906.10.2008

31.12.2008

21.11.2008

06.10.2008

25.08.20080.12.2008

12.06.2008

14.11.2008

17.11.2008

22.12.200819.12.2008

05.11.2008

31.12.2008

14.11.2008

19.11.200801.10.2008

10.10.2008

10.10.2008

10.10.2008

ribotipo25.04.2008

08.12.2008

05.11.2008

15.12.2008

26.11.200817.12.2008

12.09.2008

08.12.2008

02.01.2009

20.10.200824.12.2008

08.12.2008

OCL

OCL

OCL

OBVACQ

ACQ

Studio medico

OCL

ODLOCL

Studio medico

ODL

Studio medico

IOSIStudio medico

OCL

Studio medico

Studio medico

OCLACQ (Casa anziani)

OSG

ACQ

OBV

ACQACQ

OCL

OCL

OCL

ODLOSG

OCL

OIL

OCL

027ACQ

OCL

OSG

OCL

OCLOCL

OCL

OCL

OSG

OCLStudio medico

OCL

A- DEL B+

A- DEL B+

A- B+

Non tossigenicoA+ B+

A+ B+

A+ B+

A- B+

A- B+A- B+

A- B+

A+ B+

A- B+

A- B+A- B+

Non tossigenico

A- B+

A- DEL B+

A+ B+A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+

Non tossigenicoA+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+

A+ B+A+ B+

A+ B+

1

2

3

4

5

6

7

8

Campione Tossinotipo Data di raccolta Ospedale



I campioni sono stati analizzati tramite spettrometro di massa MALDI‐TOF per verificare se la disposizione del dendrogramma è paragonabile alla disposizione del tossinotipo.

Figura 8 Dendrogramma MALDI‐TOF

Campione Tossinotipo



Al giorno d’oggi, siccome ceppi sempre più virulenti di C. difficile si stanno diffondendo in tutto il mondo, è determinante poter stabilire la patogenicità del battere e sapere a che ceppo ci si trova di fronte. È soprattutto di fondamentale importanza capire tempestivamente se il patogeno riscontrato fa parte del ribotipo 027, al quale appartengono ceppi di C. difficile molto virulenti. Analizzando il dendrogramma ottenuto tramite programma bioNumerics (Applied Maths, Belgio), che confronta le bande ottenute dalla PCR ribotyping, si osserva che i ceppi analizzati sono stati suddivisi in 30 diversi ribotipi che abbiamo raggruppato in tre cluster (vedi figura 7). In letteratura sono stati descritti 116 ribotipi differenti [13]; tenendo conto del numero di ceppi analizzati in questo lavoro, si può affermare che il metodo è discriminante e che in Ticino circolano molti ribotipi differenti. L’analisi effettuata ha messo in evidenza 8 gruppi di stipiti che presentavano un profilo di PCR ribotyping identico (figura 7). Il gruppo 1 è composto da tre campioni che provengono dallo stesso paziente, il secondo ed il terzo campione sono stati prelevati lo stesso giorno, a 23 giorni di distanza dal primo. Possono esserci più motivi per i quali questo paziente ha avuto due infezioni di C.difficile a distanza di un mese: o il batterio ha sviluppato una resistenza all’antibiotico utilizzato per la prima infezione oppure le spore della prima infezione sono rimaste latenti all’interno dell’intestino, causando una seconda infezione. I profili di PCR ribotyping sono molto simili (il primo ed il secondo campione hanno profili identici). E’ quindi molto probabile che lo stipite causa della prima infezione non sia stato eradicato. Al secondo gruppo appartengono tre campioni. In questo caso si tratta di tre pazienti diversi, due ricoverati presso l’ospedale Civico di Lugano nello stesso reparto e periodo, ed uno all’Ospedale Distrettuale di Locarno. Al gruppo 3 appartengono tre campioni, provenienti tutti da medici e ospedali diversi, mentre al gruppo numero quattro appartengono due campioni che provengono da ospedali diversi. Del quinto gruppo fanno parte quattro campioni, due appartenenti allo stesso paziente. Tre di questi campioni provengono dall’ospedale di Acquarossa; questi campioni sono stati prelevati nel corso di un mese. Il gruppo sei è il raggruppamento più grande e comprende sette campioni, provenienti tutti da pazienti diversi. Il settimo campione di questo raggruppamento è stato trattato come appartenente a questo gruppo in quanto si differenzia per un'unica banda. Quattro di questi campioni provengono dall’ospedale Civico di Lugano, mentre i tre rimanenti provengono da altri nosocomi del Cantone Ticino. I campioni provenienti dall’OCL sono stati prelevati nel corso di due mesi e mezzo. Gli ultimi due gruppi, il 7 e l’8 sono composti da due campioni provenienti da pazienti ed ospedali diversi. Si può dunque affermare che all’interno dei nosocomi ticinesi si sono verificate due piccole epidemie da C.difficile, una all’ospedale di Acquarossa, e la seconda leggermente più estesa all’OCL. Le infezioni causate da ceppi con lo stesso ribotipo ripetute all’interno degli ospedali hanno toccato più reparti, questo indica la difficoltà a circoscrivere le piccole epidemie all’interno di un singolo reparto. Per poter risalire al motivo per il quale lo stesso ceppo è stato riscontrato in più reparti, bisognerebbe fare una ricostruzione del movimento dei pazienti e degli operatori sanitari all’interno dell’ospedale, ciò che esula dal contesto di questo lavoro.



E’ importante notare che il ribotipo che costituisce il sesto gruppo, oltre ad essere fonte di varie infezioni all’interno dell’OCL, è un profilo molto comune in tutto il cantone Ticino. Esso è stato infatti riscontrato almeno una volta in quasi tutti i nosocomi ticinesi. Siccome il ceppo di riferimento per il ribotipo 027risulta essere molto simile ai ceppi che formano i gruppi 5 e 6, è stata fatta nuovamente una PCR ribotyping e un elettroforesi, così da avere le identiche condizioni di preparazione dei campioni, e da poterli confrontare meglio. Questa procedura è stata ritenuta necessaria per escludere con piena sicurezza che nessuno dei campioni fosse di ribotipo 027.

Figura 9 Gel di PCR ribotyping per confermare l’assenza di un ribotipo 027. Da sinistra: Marcatore di tagli, controllo negativo, ceppo di riferimento ribotipo 027 seguito dai campioni posti nelle vicinanze del ribotipo 027 sul dendrogramma della PCR ribotyping ( campioni da sinistr a destra: 14221, 35213, 34839, 34638, 33335,39604).

Dalla foto si nota che nessuno dei campioni testati presenta lo stesso profilo di questo particolare ribotipo. Dopo aver ottenuto il dendrogramma, per ogni campione è stato aggiunto il risultato ottenuto dalla multiplex PCR tossinotipo, per verificare se vi fosse un’eventuale correlazione con il tossinotipo/ribotipo. Come atteso, poiché i campioni inviati all’Istituto provengono tutti da pazienti sintomatici, nella maggior parte dei ceppi entrambe le tossine sono state positive (A+B+), in numero elevato è stato riscontrato anche la positività solamente della tossina B (A‐B+). La combinazione A+B‐ è stata riscontrata solamente nel ribotipo 027, mentre la combinazione (Adeleto B+) è stata trovata in tre campioni. Anche tramite il profilo tossigenico è quindi possibile suddividere il dendrogramma in tre cluster che ricoprono le stesse suddivisioni principali del ribotipo. Nel primo cluster si raggruppano quattro campioni: il campione dall’Ospedale Beata Vergine che presenta un profilo con poche bande è risultato essere non tossigenico mentre gli altri tre presentano tutti un profilo tossigenico A‐B+. Nel secondo cluster, composto da 14 campioni, troviamo tutti i profili A‐B+, tranne alcune eccezioni, mentre nel terzo cluster troviamo tutti gli A+B+ tranne un campione non tossigenico. Si può quindi affermare che il profilo tossigenico è separato in modo netto e segue le separazioni ottenute dall’analisi dei ribotipi.



Il profilo tossigenico A‐B+ raggruppa ceppi particolarmente virulenti che si stanno diffondendo sempre più [14]. Anche nella collezione che abbiamo analizzato questo profilo è molto rappresentato. Per i campioni A‐B+ è stata fatta una PCR supplementare, per capire se questi ceppi hanno il gene per la tossina A o meno, tutti i campioni sono risultati avere il gene che codifica per la tossina A. Per il gene A esistono 28 tossinotipi diversi [14]. Alcuni di questi tossinotipi sono caratterizzati da delezioni, inserzioni, o siti di restrizione polimorfi all’interno della zona PaLoc, che fanno in modo che non vi sia la produzione della tossina A, malgrado il gene sia presente [14]. Siccome la PCR utilizzata per determinare il profilo tossigenico prende in considerazione un solo tipo di delezione nel gene tcdA (vedi figura 10) che corrisponde al tossinotipo A‐B+ più frequentemente ritrovato in Europa, si presume che gli altri campioni A‐B+ siano mutati in altre localizzazioni del gene che fanno in modo che la tossina non venga prodotta.

Figura 10 Sito di amplificazione del gene tcdA. Se c’è la delezione all’interno del gene tcdA verrà amplificato un frammento di 110bp, se non c’è nessuna delezione il frammento amplificato è di 369bp [8]. Con la multiplex PCR tossine utilizzato è possibile risalire unicamente a questo tipo di delezione, ma ne esistono altre.

Si ritiene inoltre che ceppi di tossinotipo A+B+ abbiano una capacità di resistenza agli antibiotici maggiore rispetto a ceppi A‐B+ [14]. Nel caso di pazienti dai quali sono stati isolati ceppi con ribotipo identico in diversi periodi di tempo, l’analisi del profilo tossigenico indicava il profilo A+B+, ciò che permette di ipotizzare che il trattamento antibiotico seguito da questi pazienti non abbia dato l’esito sperato forse grazie alla maggior resistenza dei Clostridi A+B+. Solamente in un caso un paziente è stato colpito da una reinfezione con un tossinotipo A‐B+. Da studi recenti sembrerebbe che alcuni ceppi A‐B+ siano riusciti a sviluppare una resistenza ad alcuni antibiotici come clindamicina, eritromicina, tetraciclina, ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, mixifloxacina e gatifloxacina [14]. Si può quindi affermare che anche questo batterio sta sviluppando delle pericolose e sempre più numerose resistenze agli antibiotici.



I ceppi del ribotipo 027 dovrebbero avere un profilo tossigenico A+B+ [15]. Dalle nostre analisi il ceppo utilizzato come referenza risulta essere di tipo A+B‐. Riteniamo che questo fenotipo sia frutto di una mutazione avvenuta nel ceppo utilizzato come riferimento per la PCR ribotyping. E’ d’altronde risaputo che il tossinotipo è soggetto a facili mutazioni [14]. Purtroppo non ci è stato possibile ottenere altri ceppi appartenenti al ribotipo 027. Per capire se in futuro sarà possibile identificare questo patogeno più rapidamente, si è voluto analizzare tutti i campioni tramite spettrometro di massa Maldi‐Tof. Dai profili ottenuti si è costruito un dendrogramma. Analizzando il dendrogramma ottenuto dallo spettrometro di massa si conta una suddivisione, anche in questo caso di 30 differenti ceppi di C.difficile. Essendo le tossine delle proteine, ci aspettavamo un raggruppamento dal Maldi‐Tof in funzione del profilo tossigenico. Questo non si è però verificato. Una separazione simile a quella ottenuta per il ribotipo si era già esclusa in quanto tramite spettrometro di massa vengono analizzate delle proteine; siccome con la PCR ribotyping vengono amplificati degli spazi intergenici, che non codificano per nessuna proteina, non ci si aspettava di avere una separazione paragonabile. L’ICM intende indagare ulteriormente questo risultato inserendo nell’analisi anche ceppi non tossigenici e caratterizzando meglio il gruppo di ceppi che comunque viene differenziato dagli altri nel dendrogramma MALDI‐TOF.



6. Conclusioni Concludendo si può affermare che in Ticino non si è ancora diffuso il ribotipo 027. D’altra parte si è notata la presenza di un ribotipo molto comune e diffuso nei nostri ospedali che è stato il responsabile di una piccola epidemia all’ospedale OCL. I metodi utilizzati per la determinazione del ribotipo e del profilo tossigenico del C. difficile sono dei metodi molto validi, precisi e non estremamente laboriosi. Si può quindi pensare all’identificazione di questo patogeno tramite biologia molecolare anche nel laboratorio di routine. Attualmente si sta ancora lavorando sull’analisi MALDI‐TOF per capire se sarà possibile identificare il patogeno tramite spettrometria di massa, che rispetto alla biologia molecolare è un metodo ancora più rapido, riducendo ulteriormente i tempi di attesa per il risultato. In futuro sarebbe interessante poter testare i campioni per quanto riguarda le resistenze agli antibiotici in quanto sempre più frequentemente si riscontrano dei ceppi resistenti ad alcuni antibiotici [14].



7.Ringraziamenti Ringrazio tutti coloro che mi hanno aiutata nello svolgere il mio lavoro di diploma. Innanzitutto grazie al direttore dell’Istituto Cantonale di Microbiologia Dr.Orlando Pettrini per avermi permesso di svolgere il mio lavoro presso l’istituto. Ringrazio la Dr.ssa Antonella Demarta e la Tecnica in analisi biomediche AnnaPaola Caminada per avermi seguita e consigliata durante lo svolgimento del lavoro. Voglio inoltre ringraziare Dr.ssa Cinzia Benagli per il sostegno tecnico con lo spettrometro di massa MALDI‐TOF e alla Tecnica in analisi biomediche Nadia Ruggeri per i preziosi consigli. Ringrazio il direttore della Scuola Superiore Medico Tecnica di Locarno Andrea Boffini e i docenti Giovanni Togni e Claudio Naiaretti per i consigli metodologici. Inoltre un grazie va alle docenti Susan Gilbert, Sonja Marci e Daniela Marcacci. Grazie anche ai miei zii, Sonia e Giancarlo per aver creduto in me, e a Simon per il sostegno.



8. Bibliografia [1] Murray P., Baron E., Jorgensen J.H., Landry M.L., Pfraller M.A., Manual of clinical microbiology. 9th edition. Volume 1. [2] Sunenshine R.H., Clifford McDonald L. 2006. clostridium difficile‐associated disease: New challenges from an establisched pathogen. Cleveland clinic journal of medicine. 73: 187‐197 [3] Wu E. clostridium difficile as a nosocomial pathogen. 2007. power point http://bioinfo.bact.wisc.edu/Bact330/EW%20Clostridium%20difficile.ppt ultima visita 01.06.2009 [4] Terhes G., Urbàn E., Sóki J., Abdul Hamid K., Nagy E. 2004. Community‐Acquired Clostridium difficile Diarrea Caused by Binary Toxin, Toxin A, and Toxin B Gene‐Positive Isolates in Hungry. Journal of clinical microbiology. 42: 4316‐4318. [5] Runpnik M., Dupuy B., Fairweather N.F., Gerding N.D., Johnson S., Just I., Lyverly D.M., Popoff M.R., Rood J.I., Sonenshein A.L., Thelestam M., Wren B.W., Wilkins T.D., Eichel‐Streiber C. 2005. Revised nomenclature of Clostiridium difficile toxins and associated genes. Journal of Medical Microbiology. 54: 113‐117 [6] Dupuy B., Govind R., Antunes A., Matamouros S. 2008. Clostridium difficile toxin syntesis is negatively regulated by TcdC. Journal of Medical Microbiology. 57: 685‐689 [7] Killgore G., Thompson A., Johnson S., Brazier J., Kuijper E., Pepin J., Frost E.H., Savelkoul P., Nicholson B., van den Berg R.J., Kato H., Sambol S.P., Zukowski W., Woods C., Limbago B., Gerdin D.N., McDonald C. 2008. Comparison of Seven Techniques for Typing International Epidemic Strains of Clostridium difficile: Restriction Endonuclease Analysis, Pulsed‐Field Gel Electrophoresis, PCR‐Ribotyping, Multilocus Sequence Targeting, Multilocus Variable‐Number Tandem‐Repeat Analysis, Amplified Fragment Lenght Polymorphism, and Surface Layer Protein A Gene Sequence Typing. Journal of clinical microbiology. 46: 431‐437. [8] Lamee L., Dhalluin A., Testelin S., Mattrat M.‐A., Maillard K., Lemeland J.‐F., Pons J.‐L. 2004. Multiplex PCR Targeting tpi (Triose Phosfate Isomerase), tcdA (Toxin A), and tcdB (Toxin B) Genes for Toxigenic Culture of Clostridium Difficile. Journal of clinical Microbiology. 42: 5710‐5714. [9] Bidet P., Barbut F., Lalande V., Burghoffer B., Petit J.C. 1999. Development of a new PCR‐ribotyping method for Clostridium difficile based on ribosomial RNA gene sequencing.ELSEVIER FEMS microbiology letters. Letters 175: 261‐266. [10] Prof. Varesio, università di Ginevra. Corso 3°anno chimica analitica farmaceutica, spettrometria di massa. 2007/2008. [11] http://www.fermentas.com/techinfo/electrophoresis/pagarosegels.htm. ultima visita 01.06.2009 [12] Titov L., Lebedkova N., Shabadov A., Tang Y.J., Cohen S.H., Silva J. 2000. Isolation and Molecular Characterization of Clostridium difficile Strains from Patients and the Hospital Environment in Belarus. Journal of Clinical Microbiology. 38: 1200‐1202.



[13] Strubbs S. L. J., Braziers J.S., O’Neil G. L., Duerden B. I. 1999. PCR Targeted to the 16S‐23S rRNA Gene Intergenic Spacer Region of Clostridium difficile and Construction of a Library Consisting of 116 Different PCR Ribotypes. Journal of Clinical Microbiology. 37: 461‐463. [14] Drudy D., Fenning S., Kyne S. 2007. Toxin A‐negative, toxin B‐positive Clostridium difficile. ELSEVIER International Journal of Infectious Diseases. 11: 5‐10. [15] Rupnik M. 2008. Heterogeneity of large clostridial toxins: importance of Clostridium difficile toxinotypes. FEMS Microbiologie, review article. 32: 541‐555



9. Allegati 9.1 Allegato 1 Ceppi analizzati

Numero di identificazione

ospedale di provenienza

data raccolta risultato multiplex

PCR

38806 OCL 14.11.2008 A+B+ 39043 ACQ 14.11.2008 A+B+ 39040 OBV 17.11.2008 A+B+ 39077 Studio medico 17.11.2008 A‐B+ 39604 ODL 19.11.2008 A+B+ 40816 OCL 01.12.2008 A deleto B+ 41754 OCL 08.12.2008 A+B+ 42514 OCL 15.12.2008 A+B+ 42958 OCL 17.12.2008 A+B+ 43114 ACQ 19.12.2008 A+B+ 43244 ACQ 22.12.2008 A+B+ 43673 OCL 24.12.2008 A‐B+ 43678 OCL 24.12.2008 A deleto B+ 43371 Studio medico 24.12.2008 A+B+ 44221 OCL 31.12.2008 A+B+ 44222 OCL 31.12.2008 A+B+ 43559 ODL 24.12.2009 A‐B+ 34368 OCL 10.10.2008 A+B+ 34379 Studio medico 10.10.2008 A+B+ 34839 OIL 10.10.2008 A+B+ 37253 OCL 05.11.2008 A+B+ 37814 OSG 05.11.2008 A+B+ 39510 Studio medico 21.11.2008 A‐B+ 40069 OCL 26.11.2008 non tossigenico 41349 Casa anziani ACQ 01.12.2008 A+B+ 41488 OCL 08.12.2008 A+B+ 35 OSG 02.01.2009 A+B+ 182 ODL 02.01.2009 A+B+ 25303 ACQ 30.07.2008 A+B+ 30246 OCL 08.09.2008 A‐B+ 30669 OCL 12.09.2008 A+B+ 32187 OBV 23.09.2008 non tossigenico 33335 OSG 01.10.2008 A+B+ 33506 Studio medico 06.10.2008 A deleto B+ 34366 OCL 06.10.2008 A‐B+ 35213 OCL 10.10.2008 A+B+ 36190 Studio medico 24.10.2008 A‐B+ 10727 IOSI 28.03.2009 A‐B+ 14221 ACQ 25.04.2008 A+B+ 19673 OSG 12.06.2008 A+B+ 25566 ACQ 05.08.2008 A+B+ 28683 OCL 25.08.2008 A+B+ 33825 Studio medico 06.10.2008 A‐B+

OCL ospedale Civico Lugano ACQ ospedale Acquarossa

OBV ospedale Beata Vergine Mendrisio

ODL ospedale la Carità Locarno

OIL ospedale Italiano Lugano

OSG ospedale San Giovanni Bellinzona

IOSI istituto oncologico Svizzera Italiana



35539 OCL 20.10.2008 A+B+ 41709 OCL 08.12.2008 A+B+ 27 CEPPO DI RIFERIMENTO RIBOTIPO 027

9.2 Allegato 2 Thio‐ terreno liquido per la coltivazione di batteri

30 g Thioglycolate Medium 0.1 ml Vitamina K1 1% 1’000 ml Acqua demineralizzata

9.3 Allegato 3 Agar Sangue‐ terreno solido per la coltivazione di batteri

312 g Columbia Agar Base (Oxoid) 7600 ml Acqua demineralizzata 400 ml Sangue di montone (Mischler)

9.4 Allegato 4 Skim Milk‐ terreno per il mantenimento a lungo termine

10 g Skim Milk BBL 70 ml Acqua demineralizzata 10 ml Calf serum (sigma) 20 ml Glicerolo (Fluka)

9.5 Allegato 5

Taq PCR Master Mix 1000 units cat. No 201445 (QIAGEN)

Taq DNA Polymerase QIAGEN PCR Buffer dNTPs

Multiplex PCR Master Mix cat.No 206143 (QIAGEN)

HotStarTaq DNA Polimerase Multiplex PCR buffer dNTP mix



9.6 Allegato 6 Resophor agarose hight resolution (Eurobio) Agarose Low Electroendosmosis (Roche) 9.7 Allegato 7 TBE 1X

100 ml TBE 10X 900 ml Acqua MilliQ (Millipore, NOIONAQUA Sagl, Svizzera) TBE 10X (Tris‐borato)

108 g Tris‐base (Fluka) 55 g Acido borico 40 ml EDTA 0.5 M pH 8

9.8 Allegato 8 GelRed 10000x in acqua (Biotium, Brunschwig Schweiz)

9.9 Allegato 9

DNA molecular weigh marker XIV 100 base pair ladder (Roche, Svizzera)

Solution in 10mM EDTA, pH8 Concentrazione 250 μg/ml Marcatore di taglia 100bp

36μl marker 100bp 54μl H20 RNAse free 18μl loading buffer 6X

9.10 Allegato 10 Loading buffer 6X

0.25% Blu di bromotimolo (Merck) 0.25% Xylene cyanol 30% glicerolo in acqua



9.11 Allegato 11 BigDye terminatori v1.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems)

9.12 Allegato 12 Sephadex G‐50

Sephadex G‐50 fine DNA grade (GE Healthcare) Acqua demineralizzata

9.13 Allegato 13 DHB.

98% ALDRICH 15 mg/333μl ethanol 333 μl ACN 333 μl H2O 0.3 μl TFA

tipizzazione molecolare di - sbt · i principali fattore di virulenza legati a questo patogeno sono...

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