TESTELE DE

HISTOCOMPATIBILITATE

TRANSPLANTUL = Actul de a transfera celule, tesuturi sau

organe dintr-o parte in alta, fie de la acelasi individ, fie intre indivizi diferiti

Tipuri: Autogrefa= transplantul de tesuturi proprii dintr-o

parte in alta a aceluiasi individ Alogrefa = transplantul de tesuturi de la un donor

genetic diferit de acceptor, dar care apartine aceleiasi specii

Xenogrefa = transplantul de tesuturi de la un donor care apartine unei alte specii

ISTORIC Secolul II:

India, autogrefa, piele, rinoplastie Secolul III (??):

Inlocuirea membrului inferior gangrenos al imparatului Iustinian cu cel al unui cadavru

1959: Boston, rinichi, gemeni bizigoti

1967: Denver, ficat

1968: Cape Town, inima; Minneapolis,

maduva hematopoetica

CONDITII TRANSPLANT Compatibilitate AB0 Identitate HLA cat mai mare Absenta in serul pacientului a unor Ac anti-

donor Stimulare slaba la reactia mixta limfocitara

COMPATIBILITATE AB0 Incompatibilitate minora:

Donorul are Ac (aglutinine) Exemplu: donor 0 si primitor A/B/AB

Incompatibilitate majora: Donorul are Ag Exemplu: donor A/B/AB si primitor 0

Incompatibilitate minora si majora Exemplu: donor A/B si primitor B/A

Nu este esentiala Obiectiv: prevenirea hemolizei post-

transplant

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

= MHC La om – HLA (human leucocyte antigen) Grup inrudit de gene pe cromozomul 6 Roluri:

Imunitate celulara Imunitate umorala Mecanisme de recunoastere intercelulara Discriminare self / nonself

ORGANIZAREA HLA 3 clase HLA:

Clasa I: Glicoproteine membranare ~ Celule nucleate Prezentarea Ag peptidice endogene LT citotoxice

Clasa II: Glicoproteine membranare CPA Prezentarea Ag exogene LT helper

Clasa III: Proteine cu functie in imunitate

GENELE HLA

POLIMORFISM GENIC Clasa I:

HLA A – 451 alele HLA B – 782 alele HLA C – 238 alele

Clasa II: HLA DR – 525 alele HLA DQ – 105 alele HLA DP – 147 alele (HLA DM – 11 alele) (HLA DO – 21 alele)

CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE

Se testeaza cel putin 3 locusuri: HLA-A HLA-B HLA-DRB1

6 Ag ≥4 identice

CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE

TESTE DE HISTOCOMPATIBILITATE

Moleculare

Serologice

Celulare

METODE MOLECULARE Leucocite din sange Extractia ADN-ului Amplificarea genelor HLA:

PCR-SSP PCR-SSOP SBT

Interpretarea rezultatelor

PCR-SSP PCR-SSP (Sequence Specific Primers) Pentru HLA clasa I si II Amplificarea genelor HLA utilizand primeri:

Rezolutie mica – se amplifica grupuri de alele Rezolutie inalta – se amplifica alele specifice

Electroforeza pe gel de agaroza a produsilor de amplificare: Deplasare in functie de dimensiuni Comparare cu marker

Citirea si interpretarea rezultatelor: Apare banda specifica doar daca exista alela

PCR-SSP

PCR-SSOP PCR-SSOP (Sequence Specific

Oligonucleotide Probes) Amplificarea intregului exon Hibridizarea produsului de amplificare cu

secventa complementara Vizualizarea strip-urilor cu benzi Interpretarea computerizata Rezolutie scazuta

PCR-SSOP

SBT SBT (Sequence Based Typing) Rezolutie maxima Amplificarea genei de interes Secventializare Confruntare cu baza de date – alele

compatibile Detectarea unor alele noi

SBT

METODE SEROLOGICE Utilizeaza seruri cu concentratii mari de Ac

anti-HLA specifici Femei multipare Lichid placentar Pacienti cu transplante de organ sau transfuzii

multiple Ac monoclonali

METODA DE LUCRU

1. Separarea limfocitelor prin centrifugare in gradient de densitate

2. Ser cu Ac anti-HLA in godeuri3. Se adauga suspensie limfocitara in fiecare

godeu (complexe Ag-Ac)4. Se adauga complement (ser de iepure)5. Daca s-au format complexe se activeaza

complementul liza osmotica a celulelor6. Se adauga colorant vital (eozina)7. Se citeste la microscop cu contrast de faza

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Limfocite vii: necolorate, stralucitoare, refractile

Limfocite moarte: umflate, rosu inchis Pentru fiecare godeu: % limfocite moarte Martor negativ: <10% moarte Martor pozitiv: 100% moarte

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Identificarea serurilor care au reactionat cu suspensia limfocitara

Toate serurile cu specificitatea respectiva trebuie sa dea reactie pozitiva (>50% limfocite moarte)

TIPIZARE HLA-ANumele serului Specificitati ScorA-001 A1 1A-002 A1, Aw36 1A-003 A1, A11 1A-004 A2 1A-005 A2, A28 6A-006 A2, A28, A7 8A-007 A3 8A-008 A3, A4 6A-009 A3, A10, A11, Aw19 8A-010 A11 1A-011 A10, A11 1A-012 A1, A3, A11 4

Interpretare: fenotip HLA A28, A3

TIPIZARE HLA-BNumele serului Specificitati ScorB-001 B51, Bw52, B35 1B-002 B51, Bw52 1B-003 Bw51, Bw52, Bw53 1B-004 B7, Bw42 8B-005 B7, B27 8B-006 B7, B55 8B-007 B8 1B-008 B8, Bw59 2B-009 B44, B45, B21 6B-010 B44, B45 8B-011 B44 8B-012 B45 1

SCREENING PENTRU ANTICORPI ANTI-HLA

Detectarea Ac anti-HLA din sangele primitorului

Metoda de lucru:1. Suspensie de leucocite cu HLA cunoscut in

godeuri2. Se adauga ser de la primitor (complexe Ag-Ac)3. Se adauga Ac anti-Fc4. Se adauga complement (ser de iepure)5. Daca s-au format complexe se activeaza

complementul liza osmotica a celulelor6. Se adauga eozina si se citeste la microscop

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Limfocite vii: necolorate, stralucitoare, refractile

Limfocite moarte: umflate, rosu inchis Pentru fiecare godeu: % limfocite moarte Ac anti-HLA probabilitatea de a gasi un

donator compatibil

REACTIA MIXTA LIMFOCITARA MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) LT ale unei persoane (P1) raspund la Ag

HLA de pe limfocitele unei alte persoane (P2) Stimulare Ag proliferare limfocitara

(sinteza crescuta de ADN) Unidirectionala: se blocheaza proliferarea

limfocitelor P2 si se analizeaza proliferarea limfocitelor P1

Bidirectionala: P1 si P2 se stimuleaza reciproc si se insumeaza raspunsurile

TESTUL DE LIMFOTOXICITATE MEDIATA CELULAR

Se realizeaza o reactie mixta unidirectionala populatie de limfocite citotoxice activate (P1) impotriva limfocitelor P2

P1 se pune in contact cu limfocite P2 marcate cu 51Cr

Se masoara 51Cr eliberat (comparativ cu celule 51Cr nespecifice de la o alta persoana)

~Simulare transplant

PROBLEME LEGATE DE HLA Rejetul transplantului din cauza LT ale

primitorului care recunosc HLA necompatibile Factori care influenteaza rejetul:

Sarcina, transfuzii Incompatibilitate HLA Terapie pre-transplant mai putin agresiva Terapie imunosupresoare post-transplant

suboptimala Depletia LT din grefele de maduva osoasa Clasa I tolerarea grefei Clasa II GVHD

REACTIA GREFA CONTRA GAZDA

GVHD (Graft Versus Host Disease) = transplantarea de tesuturi

imunocompetente (celule stem hematopoetice), necompatibile cu tesuturile primitorului in gazde imunodeprimate patologic sau farmacologic (medicatie imunosupresoare)

Celulele imune din grefa recunosc moleculele HLA ale gazdei ca fiind straine raspuns imun impotriva celulelor gazdei

REACTIA GREFA CONTRA GAZDA

GVHD acut: <100 zile post-transplant Piele, mucoase, plamani, ficat, tract gastro-

intestinal GVHD cronic:

>100 zile post-transplant Piele, mucoase, plamani, ficat, tract gastro-

intestinal, glande exocrine, tesut conjunctiv Corticoterapie

GVHD ACUT

Eritem palmar

GVHD ACUT

Ulceratii ale mucoasei bucale

GVHD ACUT

Degenarea stratului bazal, keratinocite necrozate

GVHD CRONIC

Papule confluente hiperpigmentate

GVHD CRONIC

Placi sclerotice hiperpigmentate

GVHD CRONIC

Modificari lichenoide difuze ale buzelor

GVHD CRONIC

Hiperkeratoza, hipergranuloza, acantoza, degenerarea stratului bazal