tinciones y metodos microscopicos
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Presentado: Yohanna Adames
Métodos Microscópicos Tinciones Diferenciales
Tinciones Ácido-Resistente
Tinciones Fluorescentes
Métodos Microscópicos
MICROSCOPÍA ÓPTICA.El microscopio óptico normal es un microscopio compuesto que consta de una fuente luminosa, una lente condensadora de la
luz y dos juegos de lentes (oculares y objetivos) que permiten la ampliación de la imagen.
Características
- Amplificación:Producto del aumento
individual de los oculares y los objetivos.
- Resolución:Espacio de máxima
aproximación entre dos puntos en el que aún
pueden observarse éstos como entidades separadas.
Determina la máxima amplificación útil del
microscopio.
Observaciones de los microorganismos
Dos posibilidades:• "In vivo“:
Indicada para observar movimiento, inclusiones,
morfología, etc. • Con tinción: Aumenta el contraste entre el objeto a observar y el medio
acuoso que lorodea.
Métodos Microscópicos
OTRAS MICROSCOPÍAS ÓPTICAS• Las células tienen un índice de refracción más
elevado que el medio, lo que implica una alteración en la fase de la luz. El contorno celular se observa con gran nitidez. Muy bueno para observaciones in vivo, flagelos, entre otros.
Contrastes de fases
• El microscopio de interferencia más empleado es el microscopio de contraste diferencial de Nomarski. Es muy útil para observaciones de células sin teñir pues produce imágenes de alto contraste y gran relieve topográfico (casi tridimensionales).
De Interferenci
a
• El condensador normal es reemplazado por un condensador de campo negro que no permite transmitir la luz directamente a través del espécimen hacia el objetivo. Contraste excelente.
De Campo Oscuro
De
Inte
rfer
enci
a
De
Cam
po O
scur
oCo
ntra
ste
de F
ases
Métodos Microscópicos
• Utiliza luz de una longitud de onda tal que es capaz de excitar alguna sustancia a fluorecer (emite luz de diferente). Se utiliza para:
• - microorganismos que tienen fluorescencia natural: metanobacterias (P420)
• - tinciones especiales: FISH, inmunofluorescencia
De Fluorescenc
ia
• Tiene un poder de resolución mayor, pues la longitud de onda de la luz UV es menor que la de la luz visible
De Luz Ultravioleta
Métodos Microscópicos
No se observa directamente, si no por fotografías
OTRAS MICROSCOPÍAS ÓPTICAS
De Fluorescencia De Luz Ultravioleta
Métodos Microscópicos
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICADe
transmisión
Sustituyendo la fuente luminosa por un haz
electrónico y las lentes por una serie de electroimanes.
Para aumentar el contraste en MET se utilizan tinciones con
sales de metales pesados de elevada
densidad electrónica.
De Barrido
Utiliza un haz de e- muy fino que barre la
superficie del espécimen.
El haz electrónico primario arranca e- de
la superficie del espécimen y los e- secundarios son transmitidos a un
colector, amplificados y utilizados para formar
una imagen en una pantalla de rayos
catódicos.
Métodos Microscópicos
Técnicas de Tinción. Fundamento
Ejemplos de constituyentes celulares:
flagelos, esporas, cápsulas paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Los colorantes pueden emplearse para:
- distinguir entre tipos de células diferentes
- revelar la presencia de determinados
constituyentes celulares
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal, que resultan difíciles de ver con el
microscopio ópticoLa principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea
el medio más simple de aumentar el contraste es la
utilización de colorantes
Técnicas de Tinción. Fundamento
Fijación
Las células generalmente son
tratadas para coagular el
protoplasma antes de teñirlas
Para bacterias
la fijación por el calor es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con
sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes.
Si se añade colorante:
Después de la fijación, no se
producen cambios estructurales en el
protoplasma
Los métodos de tinción son de gran utilidad;pero deben usarse
siempre con precaución, ya que pueden conducir a
errores
Las moléculas de colorante forman en
ocasiones precipitados o agregados que
parecen estructuras celulares
auténticas,
Tales estructuras se denominan
artefactos,
Tipos de Tinciones
•Tinción Diferencial
•Tinción Ácido Resistente
•Tinción Fluorescente
Tinción Diferencial:Si se desean observar las
características morfológicas de
las bacterias
resulta sumamente útil el
utilizar las preparaciones fijas y teñidas
debido a que estas permiten
que las células se visualicen de
mejor manera
y se puedan diferenciar las
distintas especies por su coloración
Pasos a seguir para la tinción
de las bacterias
Realizar el frote
La fijación
Aplicar el
colorante
Grupos Genera
les
Trifenil-metan
o
Oxacina
Tiacina
Tinción Diferencial:
en general se utiliza la clasificación de acuerdo a su carácter ácido – base.
Es decir: ácidos, bases o neutros, debido a que de esto depende mucho su comportamiento
La coloración se da de acuerdo con:- la acción de los iones complejos del colorante y
- los sitios activos de la superficie o del interior de la célula.
Las tinciones diferenciales más comúnmente
utilizadas son:
- Tinción de Gram- Tinción de Ziehl-
Neelsen
Tinción Ácido-Resistente:La “ácido-resistencia" se refiere a una propiedad física específica de
ciertas bacterias, es decir, su capacidad de resistir la
decoloración del ácido durante los procedimientos de tinción.
Estos organismos resistentes se denominan "microorganismos
ácido-resistentes", y sólo pueden ser coloreados para fines de
visualización utilizando tinción ácidorresistente.
Hay tres tinciones principales que se utilizan
con éxito con los organismos
acidorresistentes:
La tinción de Ziehl-Neelsen
El modo Kinyoun Algunos tintes
fluorescentes
Tinción Ácido-Resistente:
Tinción de Ziehl_Neelsen
Tinción bacteriológica especial que se utiliza para ver microorganismos ácidorresistentes, principalmente
Mycobacteria.
Los organismos acidorresistentes que se tiñen con la tinción de Ziehl-Neelsen se vuelven de un color
rojo brillante.
4. Haz una contra-tinción con verde
malaquita o azul de metileno.
1. Cubre el portaobjetos con
carbolfucsina, durante 3 a 5
minutos mientras se calienta con
vapor.
2. Decolora el portaobjetos utilizando una mezcla de etanol y
ácido clorhídrico.
Tinción de Kinyoun
Es similar a la tinción de Ziehl-Neelsen, con la diferencia principal de que no se
calienta la placa
4. Deja que se sequen al aire antes de
verlas.
3. Cubre las placas con colorante azul de metileno durante 3 minutos y enjuaga
suavemente con agua hasta que salga clara.
1. Cubre las placas con carbolfucsina Kinyoun durante 5
minutos y enjuágalas con agua hasta que
salga clara.
2. Cubre las placas con ácido-alcohol –
3% de HCl en etanol - durante 3 minutos y enjuaga con agua
hasta que salga clara.
Tinción Ácido-Resistente:
• Tinción Fluorescente
Tinción Ácido-Resistente:
Puede dar lugar a
diferentes tipos de manchas
fluorescentes.
- Diferenciar entre las partes de una célula
- Para aislar ciertos
componentes
- Ver las muestras
con mayor claridad
• Tinción Fluorescente
Tipos de manchas
fluorescentes
Hematoxilina que se utiliza para aislar los
núcleos
Eosina que aísla el resto de
la célula
Fucsina , que tiñe el colágeno
o células de músculo liso
Rodamina que aísla proteínas
Malaquita verde, para
teñir las bacterias y
esporas.
CITAS BIBLIOGRÁFICAS• Métodos en Microbiología II. Técnicas Microscopicas.J. L. Sanz.
[Soporte: en línea][28 de septiembre de 2014]. Disponible en: http://www2.cbm.uam.es/jlsanz/docencia/archivos/03.pdf
• Tinción Diferencial. . [Soporte: en línea][28 de septiembre de 2014]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_diferencial
• Tinciones Diferenciales. Prácticas de Laboratorio II. Dr. Magariños J., et al. . [Soporte: en línea][28 de septiembre de 2014]. Disponible en: http://es.slideshare.net/josemagarinos/tinciones-diferenciales-aspectos-tecnicos?related=1
• Técnicas de Tinción. Fundamento. [Soporte: en línea][28 de septiembre de 2014]. Disponible en: http://www.bio-nica.info/biblioteca/TincionBacterias.pdf
• Tres tipos de tinción ácido-resistente. . [Soporte: en línea][28 de septiembre de 2014]. Disponible en: http://www.ehowenespanol.com/tres-tipos-tincion-acidoresistente-info_242576/
