1. Avsedd AnvändningThymune*-M kit är avsett för användning för semikvantitativ mätning av autoantikroppar mot humant tyroidea mikrosomalt antigen.

2. sAmmAnfAttning och testförklAringDetta test grundas på Boyden’s passiva hemagglutinationssystem, som först användes för detektion av tyreoglobulin-antikroppar av Witebsky och Rose8. Celler täckta med mikrosomala antigener agglutineras med specifika autoantikroppar vilket ger ett jämnt lager celler på mikrotiterbrunnens botten; avsaknad av agglutination indikeras av att cellerna formas till en tät ring eller knapp. Efter demonstrationen av tyroglobulin-precipitiner i serum på patienter med Hashimotos sjukdom6,9, har det fastställts att auto-antikroppar till flera olika tyroid-beståndsdelar1,4 associeras med destruktiva inflammatoriska lesioner i sköldkörteln. Antikroppar till två av dessa beståndsdelar, det vill säga tyroglobulin och mikrosomalt antigen, är av särskild vikt för diagnostiska ändamål3,5,7.

3. ProcedUrDet renade mikrosomala antigenet isoleras från humana tyreotoxiska körtlar genom höghastighetscentrifugering. Den mikrosomala fraktionen förbinds sedan till ytan på kalkon-erytrocyter2, som har behandlats med tannin. Dessa sensibilerade celler agglutinerar vid närvaro av specifika autoantikroppar. En liten del av humana sera är reaktiv mot kalkonceller, som föranleder icke-specifik agglutination av de sensibiliserade cellerna. Dessa icke-specifika reaktioner kan upptäckas med hjälp av osensibiliserade kontrollceller. Både test- och kontrollceller behandlas med formalin och frystorkas för att ge långvarig förvaringsstabilitet.

4. reAgensFÖRPACKNINGENS INNEHÅLL

1. Testceller 5 flaskor (vita lock)2. Kontrollceller 1 flaska (vitt lock)3. Spädningsvätska 3 flaskor (vita lock)4. Positivt kontrollserum 1 flaska (rött lock)5. Negativt kontrollserum 1 flaska (blått lock)6. Bruksanvisning 1

BESKRIVNING AV REAGENS, FÖRBEREDELSER FÖR ANVÄNDNING OCH REKOMMENDERAD FÖRVARING

Se även Varningar och försiktighetsåtgärder.

Före rekonstitution ska reagenset förvaras vid 2 till 8°C för att bibehålla sin styrka fram till datumet på förpackningsetiketten.

Test- och kontrollceller ska rekonstitueras med 3 ml destillerat vatten genom följande procedur. Knacka flaskan lätt mot en bänk för att avlägsna eventuellt fast ämne som fastnat på proppen. Avlägsna locket och gummiproppen försiktigt och tillsätt 3 ml destillerat vatten. Sätt tillbaka gummiproppen och snurra flaskan för att underlätta blandningen av reagenset. Låt flaskan stå tills reagenset blandats helt, invertera sedan flaskan och snurra den igen för att säkerställa fullständig blandning. För optimalt utförande av testet ska cellerna rekonstitueras minst 30 minuter för användning.

Efter rekonstitutionen är cellsuspensionerna stabila vid 2 till 8°C i 5 dagar. För mer långvarig förvaring av testceller (upp till en månad) måste cellsuspensionen frysas vid –15°C till –25°C och tinas upp endast en gång. Kontrollceller kan dispenseras i små volymer och förvaras frysta i upp till 18 månader. Spädningsvätska och kontrollsera kan förvaras vid 2 till 8°C hela tiden. Undvik bakteriekontamination av spädningsvätska eller kontrollsera under användning.

Testceller Varje flaska med testceller innehåller

den frystorkade motsvarigheten till 3 ml 1-procentig suspension av kalkonerytrocyter som har behandlats och garvats med aldehyd, och är belagda med mikrosomal antigen och spridda i en fosfatbuffrad koksaltlösning med pH 7,2, innehållande 5% sackaros, 1,5% normalt kaninserum och 0,01% Bronopol.

Kontrollceller Varje flaska med kontrollceller innehåller

den frystorkade motsvarigheten till 3 ml 1-procentig suspension av kalkonerytrocyter som har behandlats och garvats med aldehyd, spridda i en fosfatbuffrad saltlösning med pH 7,2, innehållande 5% sackaros, 1,5% normalt kaninserum och 0,01% Bronopol.

Spädningsvätska Varje flaska innehåller 25 ml isotonisk

saltlösning med normalt humant serum som är negativt för HBsAg och antikroppar till HIV-1 och HIV-2 och HCV, normalt kalkonserum, humant tyroglobulin och 0,1% natriumazid. Mängden av sera som tillsätts justeras för att ge optimala resultat med varje parti sensibiliserade celler. Komponenter från en sats får inte användas med komponenter från en annan sats.

Positivt kontrollserum Varje flaska innehåller 1,0 ml anti-mikrosomalt

utspätt kaninserum. Innehåller 0,1% natriumazid.

Negativt kontrollserum Varje flaska innehåller 1,0 ml utspättt

normalt humant serum negativt för HBsAg

och antikroppar mot HIV-1, HIV-2 och HCV. Innehåller 0,1% natriumazid.

5. vArningAr och försiktighetsåtgärder

Endast för in vitro-diagnostik.

Endast för professionell användning.

Se tillverkarens säkerhetsdatablad och produktetiketten för information om potentiellt farliga komponenter.

HÄLSO- OCH SÄKERHETSINFORMATION

VARNING! Denna kit innehåller komponenter med humant ursprung. Ingen känd testmetod kan ge komplett försäkran att produkter med humant ursprung inte överför infektioner. Allt material med humant ursprung ska därför anses som potentiellt smittsamt. Det rekommenderas att dessa reagens och humana prov hanteras i enlighet med god laboratoriepraxis. Det negativa serum som används för tillverkning av spädningsvätska och negativ kontroll har visats vara negativ mot HBsAg och antikroppar mot HIV och HCV.

1. Spädningsvätskan och de positiva och negativa kontrollsera innehåller 0,1% natriumazid som är klassificerat som skadligt (Xn) enligt Europeiska Ekonomiska Gemenskapens direktiv (EEG). Följande fraser gäller tillämpliga Risk- (R) och Säkerhets-(S) krav.

Xn r22 Farligt vid förtäringr32 Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt

med syras35 Produkt och förpackning skall oskadliggöras

på säkert sätts36 Använd lämpliga skyddskläders46 Vid förtäring kontakta genast läkare och

visa denna förpackning eller etiketten

Observera att azider kan reagera med koppar och bly som används i vissa rörsystem för att skapa explosiva salter. Mängderna i satsen är små, likväl ska azid-innehållande material spolas bort mer stora mängder vatten vid kassering.

ANALYTISKA FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER

1. Använd ej reagens efter utgångsdatumet.2. Torka av mikrotiterplattan med en trasa före användning för

att minska statisk interferens.3. Låt alla reagens och prov nå rumstemperatur (18 till

30°C) före användning. Låt reagensen genast återgå till rekommenderad förvaringstemperatur efter användning.

4. Alla tester måste utföras i rumstemperatur (18 till 30°C).5. Även om testet kan utföras i U- eller V-formade brunnsplattor,

fastställs satsernas prestandaegenskaper av Remel med hjälp av den U-formade varianten. När en V-formad brunnsplatta är att föredra, rekommenderas det att användaren känner till visade reaktionsmönster. Vissa tillverkares mikrotiterplattor ger otillfredsställande resultat. Använd därför plattor som rekommenderats av lokal distributör.

6. UV-formade brunnsplattor ska inte användas.7. Mikropipetter ger mer exakta och reproducerbara resultat än

mikrospädningsapparater, och ska användas när så är möjligt för titrering av prov. Var mycket noga med att volumetrisk

exakthet bibehålls när mikrospädningsapparater används.6. ProvtAgning och förvAringBlod som tagits genom venpunktion ska låtas koagulera naturligt och serum ska renas genom centrifugering före testning. Om det blir nödvändigt att förvara prover före testning, ska de hållas frysta vid –15°C till –25°C. Undvik upprepad nedfrysning och upptinande. Alla patientsera ska inaktiveras genom uppvärmning vid 56°C i 30 minuter före testning.

Plasmaprov är inte lämpliga för testning.

7. ProcedUrTILLHANDAHÅLLET MATERIAL

Reagens för 50 test, se Förpackningens innehåll.

EJ TILLHANDAHÅLLET MATERIAL

Följande utrustning krävs förutom de material som finns tillgängliga i laboratoriet:

• U- eller V-formade mikrotiterplattor för engångsbruk eller återanvändning.

• 0,025 ml dropprör.• 0,025 ml mikropipett (flerkanalig) eller

mikrospädningsapparater.ANMÄRKNINGAR

Dropprör och mikrospädningsapparater finns att tillgå från Dynatech Laboratories. Mikropipetter finns att tillgå från Flow Laboratories.

TESTPROCEDUR

Thymune*-MFör varje prov eller kontroll som ska testas, behövs en hel rad (brunn 1-12) på mikrotiterplattan. Positiva och negativa kontrollsera ska inkluderas i varje analysomgång och behandlas på samma sätt som patientsera. Patientsera ska värmeinaktiveras vid 56°C i 30 minuter.

Steg 1

Med ett 0,025 ml dropprör av standardtyp, tillsätt 4 droppar spädningsvätska i brunn 1 och 2, och 3 droppar i brunn 3-12.Steg 2

Pipettera 0,025 ml serum i brunn 1. Blanda och för över 0,025 ml till brunn 2 med hjälp av en

mikropipett eller mikrospädningsvätska.Steg 3

Med hjälp av en ren mikropipettspets eller mikrospädningsapparat, för över 0,025 ml från brunn

2 till brunn 3 – detta är brunnen för kontrollserum. Blanda brunn 3, kassera 0,025 ml från brunn 3.

Thymune*-MR30850501....................50 tester sv

Key Code TSMX7822

www.oxoid.com/ifu

Europe +800 135 79 135 US 1 855 2360 190

CA 1 855 805 8539 ROW +31 20 794 7071

Steg 4

Med hjälp av en ren mikropipettspets eller mikrospädningsapparat, för över 0,025 ml från

brunn 2 till brunn 4, blanda och för över 0,025 ml till brunn 5. Fortsätt med fyrdubblade spädningar

till brunn 12. Kassera 0,025 ml från brunn 12.Steg 5

Tillsätt genast 0,025 ml kontrollceller i brunn 3 och 0,025 mltestceller till brunn 4-12.

Steg 6

Blanda innehållet på en plattskakapparat i minst 30 sekunder eller genom att knacka plattan ordentligt på alla fyra sidor.

VARNING! Otillräcklig blandning eller användning av plattskakapparaten vid för låg hastighet, leder till

ojämna sättningsmönster och lägre sensitivitet.Täck plattan med ett lock för att undvika avdunstning/

kontamination. Låt plattan stå i rumstemperatur (18 till 30°C), utsätt den ej för direkt solljus

eller vibration. Läs av efter en timme.

8. resUltAtAVLÄSNING AV RESULTAT

I ett positivt test agglutineras de sensibiliserade cellerna av antikroppen och sätter sig på brunnens botten som en diffus beläggning. I ett negativt test sätter sig cellerna i en liten cirkel eller kompakt knapp på brunnens botten. Svaga positiva reaktioner kan resultera i mellanliggande mönster. Slutpunkten ska ses som den högsta spädningen av provet, med ungefär 50% agglutination av testcellerna.

En prozone (en eller fler brunnar som visar oväntat svag agglutination) kan ibland ses vid låga spädningar av starkt positiva sera, var noga med att inte feltolka sådana resultat.

Typiska resultat som erhållts med Thymune*-M

Illustrationen visar åtta titreringar i den U-formade mikrotiterplattan. Den tredje brunnen i varje rad innehåller kontrollceller med 1/100 spädning av serum. Brunn 4-12 innehåller testceller och fyrfaldiga serumspädningar (från en startspädning på 1/100).

Rad A = Positiva 1/102 400 - 1/409 600Rad B = NegativaRad C = Positiva 1/1 600 - 1/6 400Rad D = Positiva 1/6 400 - 1/25 600Rad E = NegativaRad F = Positiva 1/6 400Rad G = Positiva 1/1 600Rad H = Positiva 1/400 - 1/1 600

KVALITETSKONTROLL

Kontrollbrunnen (kolumn 3) måste alltid vara negativ. Heterofila anti-kalkonreaktioner är ovanliga vid spädningar på 1/100 eller större, men om kontrollbrunnen visar agglutination, ska serumprovet absorberas genom att blanda 0,5 ml kontrollcellsuspension med 0,1 ml testserum. Skaka om blandningen, låt stå i 10 minuter och separera sedan absorberat serum genom centrifugering. Upprepa testet med absorberat serum.

Positiva och negativa kontrollsera tillhandahålls för att säkerställa korrekt funktion av test- och kontrollcellsuspensionerna. Negativt serum ska inte orsaka agglutination vid någon spädning, medan positivt serum ska ge agglutination vid spädning på minst 1/400 med testceller. Kontrollceller ska nu visa oagglutinerade mönster i kontrollbrunnen. Titrer som observeras i V-plattan är vanligtvis något högre. (Observera att titer kan ligga mellan de fyrfaldiga spädningarna i det vanliga testprotokollet). Underlåtenhet att bevisa acceptabel titer för positivt kontrollserum indikerar att testet inte hade korrekt sensitivitet och därför bör göras om.

TOLKNING AV RESULTAT

De antikroppar som upptäckts av det mikrosomala hemagglutinationstestet är den huvudsakliga cirkulerande markören av human autoimmun sköldkörtelsjukdom, vilket inkluderar de kliniska störningarna struma lymphomatosa (Hashimotos sjukdom), atrofisk tyreoidit (myxödem) och tyreotoxikos (Graves/Basedows sjukdom)3.

Kombinationen av tyreoglobulin och mikrosomala hemagglutinationtester detekterar praktiskt taget alla fall av Hashimotos struma och ungefär 90% av fall av primära myxödem. De två testerna ska utföras tillsammans för alla fall av struma som ska opereras, då det inte alltid är kliniskt möjligt att skilja autoimmuna tyreoiditer från andra typer av struma. En annan viktig faktor i de två sköldkörtelantikroppstesterna är differentialdiagnosen av primär tyreotoxikos och olika takykardier, ångesttillstånd, oförklarlig viktminskning eller diarré. I fall med unilateral exoftalmus, hjälper testerna att differentiera mellan endokrin etiologi och lokala orbitallesioner, och förebygger därmed invasiva och dyra tester. Mer än 70-90% av fallen med varianter av Graves sjukdom ger positiva tyroglobulin- och/eller mikrosomala hemagglutinationstitrer jämfört med 10-15% av kontrollfall av samma ålder och kön. Trots att de flesta patienter med tyreotoxikos visar relativt låga värden av antikroppar, har ungefär 20% måttliga till höga titrer (tyroglobulin ≥ 1/640, mikrosomala ≥ 1/6400) vilket indikerar antingen en svårare form av sjukdomen med tendens till återfall, eller åtföljande destruktiv tyreoidit, mottaglig för myxödem efter operation eller spontan förlust av sköldkörtelfunktion några år efter den tyreotoxiska

episoden. Likaledes skiljer tyroglobulin, i kombination med mikrosomal hemagglutination, på atrofisk tyreoidit med lätt eller svår hypotyreos och fall av depression eller fetma på grund av andra orsaker. Positiva resultat i dessa två tester är inte tillräckligt för att utesluta sköldkörtelcancer, och låga titervärden (tyroglobulin < 1/160, mikrosomala < 1/1600) indikerar inte alltid allvarliga sköldkörtellesioner, då många fall av “fokal tyreoidit” förblir subkliniska och icke-progressiva. Om ett positivt resultat erhålls, erfordras extra undersökningar såsom tyreoideaskintigrafi för cancer, TRH-test för sköldkörtelautonomi och uppskattning av TSH-värdet i serum för misstänkt hypotyreos. Valet av test beror på kliniska resultat.

Tyroglobulin- och mikrosomala hemagglutinationstester ger användbara förutsägande bevis för möjlig sköldkörteldysfunktion hos patienter med andra autoimmuna endokrina störningar, såsom Addisons sjukdom, insulinberoende diabetes mellitus eller polyendokrina autoimmunopatier, och hos medlemmar av familjer som har anlag för organspecifik autoimmunitet.

9. ProcedUrens begränsningAr En stor proportion av starkt positiva sera ger prozoner i testet. Därför måste en fullständig titrering utföras på varje testserum.

Plasma och infekterade serumprov är olämpliga för testning.

10. förväntAde resUltAt Se Tolkning av resultat.

11. PrestAndAegenskAPer En jämförelse mellan sensitiviteten hos Thymune*-M med hemagglutinationsteknik med fårceller har gjorts genom testning av sera från 158 patienter med Hashimotos sjukdom, primärt myxödem eller tyreotoxikos. God korrelation mellan de två testsystemen påträffades över ett intervall av titrer mellan 1/100 och 1/1 600 000. Korrelationen mellan hemagglutination och fluorescerande antikroppstitrer (FAT) visade sig också vara god, och indikerar ett linjärt förhållande mellan titrer upp till 1/1 600 000 för HA-testet och 1/1280 för FAT2.

När sera från en panel av normala bloddonatorer testades, var förekomsten av positiva resultat 7% med titrer på < 1/16002.

Reagensen kontrolleras noggrant för att säkerställa reproducerbarhet mellan satser. Varje sats testceller förbereds för att ge konsistenta titrer när de testas mot en panel av sera med kända värden av antikroppar, med en tolerans mot inte mer än en dubbel spädning. Reproducerbarhet från sats-till-sats har visats genom testning av 12 prov vid 3 tillfällen med tre satser reagens. Varje prov gav konsistenta resultat inom ett intervall plus-minus en dubbel spädning vid alla tillfällen10.

12. litterAtUrförteckning1. Anderson, J.R., Goudie, R.B., et al (1959).The ‘Thyrotoxic’

Complement-Fixation Reaction. Scot. med. J. 4, 64.

2. Cayzer, I., Chalmers, S.R., et al (1978). An evaluation of two new haemagglutination tests for the rapid diagnosis of autoimmune thyroid desease. J. Clin. Path. 31, 1147.

3. Doniach, D. (1975). Humoral and Genetic Aspects of Thyroid Autoimmunity. Clinics in Endocrinology and Metabolism 4, Part, 2, p. 267, Irvine, W.J. (ed.).

4. Doniach, D. and Roitt, I.M. (1962). Auto-Antibodies in disease1,2. Ann. Rev. Med., 13, 213.

5. Doniach, D. and Roitt, I.M. (1976). Clinical aspects of immunology 3rd edition, ed. P.G.H. Gell, R.R.A. Coombs and P.J. Lachmann, Blackwell, Oxford.

6. Roitt, I.M., Doniach, D., et al (1956). Auto-Antibodies in Hashimoto’s disease (Lymphadenoid Goitre). Lancet, ii, 820.

7. Vallée, G., Izembart, M., et al (1982). Étude de la fréquence des anticorps antithyroglobuline et antimicrosomaux en pathologie thyroïdienne. Ann. Biol. Clin., 40, 651-656.

8. Witebsky, E. and Rose, N.R. (1956). Studies on organ specificity. I.V production of Rabbit Thyroid Antibodies in the Rabbit1. J. Immunol., 76, 408.

9. Witebsky, E., Rose, N.R., et al (1957). Chronic Thyroiditis and Autoimmunization. J. Amer. med. Ass., 164, 1439.

10. Données sur fichier.

13. förPAckning AD11/R30850501.....................................................50 tester

Symboler

Katalognummer

Medicinsk utrustning för in vitro-diagnostik

Se bruksanvisningen

Temperaturbegränsning (förvaringstemp.)

Satsnummer (partinummer)

Använd före (utgångsdatum)

Obs! Se medföljande dokumentation

Tillverkad av: Remel Europe Ltd Clipper Boulevard West, Crossways Dartford, Kent, DA2 6PT StorbritannienFör teknisk hjälp, var god kontakta din lokala distributör.

*varumärke IFU X7822-SE, reviderad 31/12/13 Tryckt i Storbritannien