THROMBOSIS FROM A PROTHROMBIN MUTATIONCONVEYING ANTITHROMBIN RESISTANCE

Yuhri Miyawaki, M.Sc., Atsuo Suzuki, M.Sc., Junko Fujita, B.Sc., Asuka Maki, B.Sc.. All e. t.c

.

Presentado por:Juliana Sandoval y Sandra Quiroz

RestrepoEstudiantes III semestre

Facultad de medicina UPB

INTRODUCTION

• This work is about the finding of a mutation on the gene which codifies the coagulation factor Prothrombine in patients with inherited thrombosis, such mutation leads to a resistance to antithrombine.

THROMBOSIS

• Thrombosis is defined as the formation of a clot which appears after a injury produced to the endothelium of a vein or a artery. This occlusion can lead to cell or tissue death and represents a bigger risk if they start forming in brain and heart.

PROTHROMBIN

• The prothrombine also called Factor II is the precursor of thrombin (which is the active form of the Factor II) in the coagulation cascade; it is also part of the Vitamin K-Dependent factors and its synthesized in the liver for approximated 72 hours period of life.

ANTITHROMBIN

Is located in the first chromosome 1q23-q25.1 locus.

It is a glycoprotein, that have an important role in the control of blood clotting and subsequent

clot dissolution

Antithrombin III is the most representative.

CORRELACION

PROTHROBIN

ANTITROMBIN

Hemostasis

OBJECTIVE GENERAL

• TO DETERMINATE THE THROMBOSIS FROM A PROTHROMBIN MUTATION CONVEYING ANTITHROMBIN

RESISTANCE.

MATERIALES Y METODOS

PCR- RFLP

ELISA

Dot: Blot

DNAc

MATERIALES Y METODOS

PCR• DNA plantilla, primers, DNTps, pstI, buffers, DNA polimerasa

PCR-

RFLP

• Electroforesis, gel de agarosa , enzima de restricción.

ELISA

• Reacción entre antígenos y anticuerpos, requiere un paso de separacion

Dot-

blot• DNAc

CASO CLINICO

• Paciente de 17 años de edad, japonesa.• El origen de su familia es Yukuhashi en la parte norte de

las islas de Kyushu.

• Antecedente personales: Presenta su primer episodio de trombosis venosa profunda a los 11 años

• Tratamiento: Desde el inicio de la enfermedad hasta la actualidad manejada con warfarina.

CASO CLINICO

• Antecedentes familiares:

nueve de los miembros de su familia habían presentado uno o más episodios de trombosis venosa profunda, de los cuales:

Dos familiares tenia un embolismo pulmonar y otros tres murieron a

causa de la trombosis.

Cinco miembros de la familia, incluido el caso índice, habían tenido una trombosis de menores

CASO CLINICO

Panel A shows the family pedigree. The proband (IV-1) is indicated by an arrow. Solid symbols represent affected family members, open symbols unaffected family members, and slashed

symbols deceased family members. Circles represent female family members, and squares male family members.

MATERIALES Y METODOS

ANALISIS DE DNA

Con el PCR se amplían todos los fragmentos de los 14 exones.

Para detectar el sitio exacto de la mutación se utilizo la PCR - RFLP

Se utilizaron 2 cebadores.

Se introdujo en un sitio PstI para la amplificación de un alelo mutante.

MATERIALES Y METODOS

RECOMBINATES DE PROTROMBINA:

una sonda DNAc , para obtener un vector de protrombina mutante (PCR)

(hibridación), en células renales; con el fin de determinar cual tenia mayor expresión por la protrombina

Dot- blot

ELISA

5′-TGTAGAAGCCATATTTCCCcTgC-3′ 5′-TTTCCCATCCaGGTCACAGCCTTCA-3

MATERIALES Y METODOS

LAS PRUEBAS FUNCIONALES DE PROTROMBINAS RECOMBINANTES

Se realizaron tres pruebas de actividad de protrombina:

• Una etapa de coagulación• Coagulación en 2 etapas• 1 ensayo cromogénico que utiliza s2238 ( sustrato de trombina colorea la

escisión)

Para examinar las funciones de la protrombina recombinante en el plasma

MATERIALES Y METODOS

FORMACIÓN DEL COMPLEJO TROMBINA- ANTITROMBINA :

• Protrombina mutada• Protrombina nueva complejo TAT se utilizaron 2 pruebas :

Con heparina y sin heparina en rangos diferentes de tiempo y detenidas con PPACK

MATERIALES Y METODOS

PRUEBA DE GENERACION DE TROMBINA:

NUEVA

MUTANTE

MUTANTEHETEROCI

GOTICA

Mezcla1: Plasma deficiente en protrombina ,con protrombinas recombinadas (100%)

Mezcla2:antitrombina eficiente en plasma con antitrombina humana (50%)

RESULTADOS

ANÁLISIS DEL DNA

Heterocigótica La misma mutación fue

detectada en su madre y en otros tres miembros de la familia

RESULTADOS

ANÁLISIS DEL DNA

RESULTADOS

• PROTROMBINAS RECOMBINANTES

Se utilizó ELISA para medir los niveles de protrombina en el medio de cultivo después de la absorción de sulfato de bario

Se encontraron que ambos, el tipo salvaje y la protrombina mutante fueron absorbidos completamente.

RESULTADOS

• PRUEBAS FUNCIONALES DE PROTROMBINAS RECOMBINANTES

RESULTADOS• FORMACION DEL COMPLEJO TROMBINA-

ANTITROMBINA

• Sin heparina : nueva incrementa de forma tiempo dependiente. Y la protrombina mutante , no fue legible durante los primeros 30 minutos.

• Con heparina: ambos incrementan , pero la protrombina mutante se ve mas afectada.

RESULTADOS

PRUEBA DE GENERACIÓN DE TROMBINA

DISCUSION

Akhavan S, Mannucci P, Lak M, et al.

AGREE “Prothrombin deficiency is an autosomal recessive disorder associated with a

moderately severe bleeding tendency”

Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH,Bertina RM

AGREE A common genetic variationin the 3′-untranslated region

of the prothrombingene is associated with

elevatedplasma prothrombin levels

and an increasein venous thrombosis

DISCUSIONRosendaal FR. AGREE knowledge about the

aetiology of venous thrombosis has advanced

with the discovery of several ctors that contribute to the

incidence of thrombosis, particularly the role of

coagulation abnormalities

De Stefano V, Finazzi G, Mannucci P.

AGREE Patients with hereditary thrombophilia often present with unusual

clinical episodes of venous thrombosis at a

young age and recurrencein atypical vessels, often with a family history of

the condition

CONCLUSION• It was achieved to demonstrate that the replacement of arginine with

leucine, which is the major cause of mutation, explains the resistance of prothrombin.

• Thrombosis is more lethal in men than in women, because the affectation over coronary vessels.

• A thrombin-generation assay revealed that the peak activity of the mutant prothrombin was fairly low.

• Young women with a predisposition to thrombophilia are exposed to risk factors like planning anticonceptive, by favoring the condition of venous insufficiencies.