Thérapies issues de la connaissance des gènes : essor d’une discipline nouvelle aux

facettes multiples Serge Braun, PharmD, PhD

Directeur scientifique

1866

Lois de l’hérédité (G. Mendel)

1906 1909 1911

« Génétique » (W. Bateson) « Gènes » (W. Johannsen) Gènes portés par les chromosomes (T. Morgan)

1944 1947

« Thérapie génique » (C.E. Keeler; J Hered.)

1932

Gènes transférés par l’acide nucléique: « correction génétique » (O. Avery)

« Ingénierie génétique » (6th International Congress of Genetics)

1866

Lois de l’hérédité (G. Mendel)

1953

Années 60-70

Etablissement des bases de génétique moléculaire: - code génétique - isolement, conception, synthèse et transfert de gènes dans les bactéries, puis les cellules animales et humaines - technologie de l’ADN recombinant avec systèmes de sélection

Joshua Lederberg (Biological future of man . In: Wolstenholme G , ed. Man and his future. London: J & A Churchill. 1963; p263-273)

Double hélice (Watson et Crick)

1932

« Ingénierie génétique » (6th International Congress of Genetics)

Gènes transférés par l’acide nucléique: « correction génétique » (O. Avery)

« Thérapie génique » (K.E. Keeler)

L’ADN en tant qu’outil thérapeutique :

la thérapie génique

Rétrovirus / Lentivirus AAV, Adénovirus Non-viral

- S’intègre

- Efficace

- Risque de rejet anti-vecteur

(et anti-transgène ?)

- Taille des séquences

- Production à grande échelle

- Peut persister

- Ne s’intègre pas (?)

- Efficace

- Risque de rejet

- Taille des séquences

- Production

à grande échelle

- Peut persister

- Ne s’intègre pas (?)

- Larges séquences

- Pas de réponse

anti-ADN

- Peu efficace

Exemples de Vecteurs

RaboralTM

Glycoprotéine rabique

Virus de la vaccine modifié

transgene Une thérapie génique à grande échelle: Vaccination orale antirabique de la faune sauvage

RaboralTM

1989 1997

2001: la rage est déclarée officiellement éradiquée en France

transgene

1970: Stanfield Rogers (Univ Tennessee) - Deux soeurs avec déficit en arginase - Virus du papillome de Shope

1980: Martin Cline (UCLA), β-thalassémie - 2 patientes - Plasmide-β-globin-HSVtk

Transfert du gène sain

Cellules souchesde la moelle osseuse

Rétrovirus

Réinjection

des cellules

corrigées

Transfert du gène sain

Cellules souchesde la moelle osseuse

Rétrovirus

Réinjection

des cellules

corrigées

Controverses scientifiques, de procédures et éthiques recommandations et règlementations

spécifiques

Plasmide

Premières tentatives de thérapie génique chez l’Homme

1990: William French Anderson (NIH) - 1 patiente ADA-SCID - Rétrovirus-ADA

Aleyna,

ADA-SCID

Guérie par

thérapie

génique

Transfert du gène sain

Cellules souchesde la moelle osseuse

Rétrovirus

Réinjection

des cellules

corrigées

Transfert du gène sain

Cellules souchesde la moelle osseuse

Rétrovirus

Réinjection

des cellules

corrigées

(Thérapie génique ex vivo)

Premières preuves de principe

Les premières AMM

• Administration locale, ex-vivo, systémique • Expression court/long terme

AAV-LPL (1M$)

Gendicine®, Oncorine® Ad5-p53 (360$)

2000 essais / 4500 patients

33 10 12

39

11 7 5 9

Ginn et al. Gene therapy clinical trials worldwide to 2012 – an Update J Gene Med 2013; 15: 65–77

Indications

Forme précoce de rétinite pigmentaire

Vision réduite, notamment en lumière faible

RPE65 identifié en 1997

Sain

RPE-/-

Amaurose Congénitale de Leber

hRPE65 huRpe65 Poly A ITR ITR

OS

IS

ONL

RPE c b a

Chien non traité Chien traité Chien sain

rAAV-2/5

rAAV-2/4

Thérapie génique AAV4-RPE65

(administration locale)

hRPE65 human rpe65 Poly AITR ITR

Fabienne ROLLING,

CHU de Nantes,

Laboratoire de

thérapie génique,

Inserm U649

Expression de dopamine, potentialisant la thérapie par la L-DOPA

IRES SIN LTR

TH CH1 AADC CMVp

IRES

Tyrosine

Hydroxylase(TH)

L-DOPA

Dopamine

L-Tyrosine

GTP-

Cyclohydrolase 1(CH1)

BH4

L-aminoacide

aromatique

décarboxylase

(AADC)

Lésion 6-OHDA

Contrôle

Lentivirus équin EIAV pour le traitement de la maladie de Parkinson

L’ADN en tant que cible thérapeutique :

la « chirurgie du génome »

Chirurgie de l’ADN: forme ultime de thérapie génique

Nucléase

Coupure double-brin

Réparation de l’ADN

Applications : Activation / inactivation

de gènes

Recombinaison homologue

• Invalidation • Insertion ou remplacement • Correction

Nucléases à doigts de zinc

Nat Meth 9 (1) 2012 - Urnov et al., Nat. Rev. Genet 2010

• Domaines de liaison à l’ADN trouvés dans facteurs de transcription des eukaryotes

• 1 codon / 1 Zinc finger

• Séquences cibles riches en G = 18-36 nt

• Fusion avec domaine nuclease de FokI

• Optimisation :

de l’interface de dimérisation

de l’interface entre Zn finger

des espaceurs

• Sigma, Sangamo, plateformes OPEN ou CoDA

Nucléases à doigts de Zinc - Clinique

• Glioblastome

- Inactivation du récepteur aux glucocorticoïdes dans LT CD8+

- Phase I - City of Hope Medical Center/Sangamo; déc. 2012

• (Neuropathie diabétique)

• SIDA

- Mutation CCR5D32 chez les patients résistants aux HIV

- Efficacité des ZFNs: >50 % dans LT CD4+

- Spécificité des ZFNs: pas d’activité sur CCR2 - off-target = 1/20000

- Phase I - City of Hope Medical Center/Sangamo; jan. 2013

Avantages

• Tout type de correction

• Correction non aléatoire

• Conservation du promoteur natif du gène d’intérêt

• Plusieurs plateformes disponibles

Inconvénients

• Faible fréquence de recombinaison homologue

• Exclue pour les cellules quiescentes

• Vectorisation nécessaire

• Spécificité - génotoxicité

Chirurgie des génomes basée sur les nucléases

Méganucléases, ZFP, TALEN, CRISPR

L’ARNm cible thérapeutique

Régulation de gènes et

de l’ARN: un rôle clé

de « l’ADN poubelle »

Exons

ADN non codant unique

Types de séquences d’ADN dans le génome humain

ADN répétitif

Introns et séquences régulatrices

ADN répétitif non apparenté aux éléments transposables

L’interférence à ARN

ADN

ARNm

Oligonucléotides antisens

Ribozyme

miARN / siARN

Blocage de la transcription

Protéine

Interférence par ARN

(C. Mello et A.Z. Fire, Nobel 2006)

ARN interférents: ARN qui interagissent avec les ARNm pour réguler/empêcher la synthèse de la protéine correspondante

siARN: une nouvelle classe de nutriments !

Blocage de la traduction

+ Chalcone synthase (R. Jorgensen, 1990)

siARN: small interfering RNA ou petit ARN interférent miARNm: micro ARN (qui comprennent les ARNst pour petits ARN temporaires) snoARN: small nucleolar RNA ou petit ARN nucléolaire snARN: small nuclear RNA ou petit ARN nucléaire circARN: ARN circulaire piARN: PIWI-RNA rasiARN: repeat-associated small interfering stARN: small temporal RNA snmARN: small non-mRNA 21-U ARN Mirtrons: pré-miARNs localisés dans les introns de différents gènes

ARN codants ARN non codants

ARNm

ARN transcriptionnels

ARNr ARNt

petits ARN

siARN, miARN, snoARN, snARN, circARN, piARN, rasiARN, stARN, snmARN,…

Le monde des petits ARN

L’interférence à ARN

ADN

ARNm

Oligonucléotides antisens

Ribozyme

siARN (db) / miARN (sb)

Blocage de la traduction

Protéine

ARN interférents: ARN qui interagissent avec les ARNm pour réguler/empêcher la synthèse de la protéine correspondante

Blocage de la traduction

Thérapies par modulation de l’ARN

Pathologie Gène cible Agent thérapeutiqueStade de

développement

b-thalassémie HBB molécule trans-épissage clones minigènes Alzheimer/Taupathies MAPT molécule trans-épissagelignées cellulaires

Cancer BRCA1, PTCH1oligos antisens clones minigènes oligos antisens, molécule

Mucoviscidose CFTR U1snARN clones minigènes Cancer BCL2L1, FGFR1, oligos antisens souris

Duchenne dystrophine oligos antisens chien GRMD MDM2, MCL1 lignées cellulaires

Hémophilie Fact IX, VII U1snARN clones minigènes multiple molécules lignées cellulaires

Fanconi FANCC U1snARN cellules de patients Amyotrophie spinale infant.SMN2 oligos antisens, molécule Phase I-IIIRétinites pigmentaires Rho, RPGR U1snARN cellules de patients

Alzheimer BACE1, muAPP oligos antisens lignées cellulaires, souris

b-thalassémie HBB oligos antisens souris SOD1 oligos antisens Phase I

Cancer BRCA2 oligos antisens clones minigènes Cancer CDKNA, MYC molécules Phase I

Insuf. congénitale surrén.CYP11A oligos antisens clones minigènes BCL2, TGF b ,custérine oligos antisens Phase III

Mucoviscidose CFTR oligos antisens, molécule cellules de patients

eIF-4E, RNR, Akt-1,

survivine oligos antisens Phase I, Phase IIDuchenne dystrophine oligos antisens cellules de patients ERBB2, SRA1,TERT, oligos antisens lignées cellulairesDystrophie de Fukuyama FKTN oligos antisens souris STAT3 oligos antisens sourisInsuffisance en GH GHR oligos antisens clones minigènes VEGF+kinésine, dsARN Phase II

Progeria (HGPS) LMNA oligos antisens souris DMLA IRS-1, kinase C-Raf oligos antisens Phase III, Phase IDystrophie myotonique DMPK oligos antisens souris REDD-1, RTP801 dsARN Phase IINeurofibromatose NF1 oligos antisens cellules de patients Hyperlipidémie familia. APOB oligos antisens Mipomersen/KinamroNiemann-Pick C NPC1 oligos antisens cellules de patients Asthme, colite IL4/5RA,+CCR3, ICAM-1 oligos antisens Phase I, Phase IIUsher USH1C oligos antisens souris Rétinite à CMV IE2 oligos antisens Fomiversen/Vitravene

Chorée de Huntington HTT oligos antisens sourisCancer BRCA1 oligos antisens cellules de patients Sclérose en plaques CD49D oligos antisens Phase II

Neurofibromatose NF1 molécule cellules de patients Diabète de type II PTP1B, GLP-1R, SGLT1 oligos antisens Phase II, Phase I

Albinisme oculaire de type1GRP143 oligos antisens cellules de patients Myasthénie AChE oligos antisens Phase II

Albinisme oculaire I GRP143 oligos antisens cellules de patients

Myopathie de Duchenne dystrophine oligos antisens 2'OM Phase III HCV miRNA122 oligos antisens Phase I

oligos antisens Morpholino Phase II Œdème maculaire diabét. VEGF siARN Phase II

Epidermolyse bulleuse COL7A1 oligos antisens cellules de patients

Myopathie de Myoshi DYSF oligos antisens cellules de patients Myopathie de Duchenne dystrophine Molécule Ataluren

TRANSLECTURE DE CODONS STOP

CORRECTION D'EPISSAGES ABERRANTS

Dérégulation de l'épissage alternatif

Saut d'exon

Mutations d'épissage

Sites cryptiques d'épissage

Séquences régulatrices

INVALIDATION DE L'EXPRESSION DE GENES (+/- RNase H)

1 / 3500 garçons

Modulation de l’épissage par oligos

antisens: application à la DMD

Duchenne : • Degénérescence musculaire progressive • Atteinte centrale (30%) • Atteintes des muscles lisses, cardiomyopathie • Diagnostic: 16 mois- 8 ans Dystrophie musculaire de Becker: plus tardive, moins marquée

J Neuropathol Exp Neurol. 2009;68:762-73

Dystrophin

Sain DMD

Domaine de liaison à l’actine Hinge C-terminale

Domaine riche en Cystéine Motifs répétés Spectrine-like

Dystrophine

Hors-phase phénotype sévère

(DMD)

Restauration du cadre de lecture

phénotype modéré (BMD)

Saut d’exon par oligonucléotides antisens

Saut d’exon

pour la myopathie de Duchenne

Non traité Traité

EFFICACY ASSESSMENT IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS

Phosphorothioates

51 45-50, 47-50, 48-50, 49-50, 50, 52

50 51, 51-53, 51-55

45 12-44, 18-44, 44, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53, 46-55

53 10-52, 45-52, 46-52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52, 52

44 10-43, 19-43, 30-43, 35-43, 36-43, 40-43, 42-43, 45, 45-54

8 4-7, 5-7, 6-7, 3-7,

55 47-54, 48-54, 49-54, 50-54, 52-54, 54, 56, 56-62

7 2-6,8-11, 8-17, 8-43, 8-45

52 53, 53-55, 53-57, 53-59, 53-60

17 12-16, 18, 18-20, 18-22, 18-25, 18-27, 18-29, 18-33, 18-36,

Exon sauté Délétions ou exons réparés

18-38, 18-41, 18-44

Drisapersen: FDA « breakthrough therapy » 27/06/13)

Implications dans : - Cancer - Maladies autoimmunes - Maladies mentales - Maladies cardiovasculaires - Diabète

Structure de la chromatine

Méthylation De l’ADN

Mécanismes épigénétiques; rôle dans: le développement, l’évolution effets de facteurs environnementaux vieillissement

Modifications des histones

ZolinzaTM

• Thérapie génique • « Chirurgie » de l’ADN • Modulation de la transcription, saut d’exon • Régulation des ARNm • Modulation de la traduction • Epigénétique • Pharmacogénomique

Supposent une connaissance précise des caractères génétiques des individus Génotypage, séquençage à très haut-débit Médecine personnalisée

Thérapies issues de la connaissance des gènes : essor d’une discipline nouvelle aux facettes multiples

Marché ARNi: 2010: 7 Mds $ 2015: >24 Mds $

Comprendre la structure des génomes

Comprendre la biologie des génomes

Comprendre la biologie de la maladie

Innovations thérapeutiques

Améliorer l’efficacité de la prise en charge

>

1950-2000

2004-2010

2011-2020

> 2020

Comprendre la structure des génomes

Comprendre la biologie des génomes

Comprendre la biologie de la maladie

Innovations thérapeutiques

Améliorer l’efficacité de la prise en charge

>

1950-2000

2000-2010

2011-2020

> 2020

Comprendre la structure des génomes

Comprendre la biologie des génomes

Comprendre la biologie de la maladie

Améliorer l’efficacité de la prise en charge

>

1950-2000

2000-2010

2010-2020

> 2020

Innovations thérapeutiques

Comprendre la structure des génomes

Comprendre la biologie des génomes

Comprendre la biologie de la maladie

Innovations thérapeutiques

Améliorer l’efficacité de la prise en charge

>

1950-2000

2000-2010

2010-2020

> 2020