17.10.2013

The Nature of Hydrogen Bonds in

Cytidine-H+-Cytidine DNA Base Pairs

A. L. Lieblein, M. Krämer, A. Dreuw, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem. Int. Ed.

2012, 51, 4067 –4070.

Seminar „Moderne Anwendungen der Magnetischen

Resonanz“

Annabell Peters

17.10.20

1 17.10.2013

i-Motiv

• Nicht kanonische Basenpaarung

• Semiprotonierte Cytidin···H+···Cytidin-Basenpaare (C·C+)

• pH-Wert ≈ 6

• DNA Sequenz: d(CCCTAA)3CCC

C8

A6

C7

C9

C14

T16

C15

C13

A17

A12 T10

A11

5‘

3‘

C2

T4

C3

C1

C20

A18

C19

C21

A5

Abb. 1: C·C+ Basenpaar.

Abb.2: DNA i-Motiv-Struktur.

N

O

R1

N

H

H

H

N

O

R2

N

H

H

N

N+

2 17.10.2013

Art der Wasserstoffbrückenbindung

1. Symmetrische Wasserstoffbrückenbindung

N------H------N

2. Asymmetrische Wasserstoffbrückenbindung

ka

kb

Na----H--------Nb Na--------H----Nb

N

NO

NH2N

N+

O

NH2

H

R1

R2

N

N

O

NH2

R2

N+

NO

NH2

R1

H

ka

kb

Abb. 3: NH+N Wasserstoffbindungen im semiprotonierten C·C+ Basenpaar.

3 17.10.2013

Untersuchung der C·C+- Bindung

NMR Spektroskopisch

• Selektiv Isotopenmarkierte DNA Stränge

• 1D 15N HMQC, 2D 1H-15N HMQC NMR Experimente

• Bestimmung von:

1J(NH) Kopplungskonstanten

1H 15N chemische Verschiebungen

Solvenz Austauschparameter

Quantenmechanische Untersuchungen

• density functional theory (DFT)

• Bestimmung von:

Elektronische Struktur der Wasserstoffbindung

Dynamik der Wasserstoffbindung

4 17.10.2013

NMR- Untersuchungen

• Labeling:

Immer ein Cytidin ist 50% 13C und 50% 15N angereichert

12 verschiedene, selektiv markierte DNA Sequenzen

• 1J(N3a,H3) und 1J(N3b,H3) Kopplungskonstanten von allen Cytidinen konnten

bestimmt werden

• 2hJ(N3a, N3b) und 1hJ(H3,N3) Kopplungen wurden größtenteils unterdrückt

• Wasserstoffaustauschexperimente:

Austauschhalbzeit t1/2 im Sekundenbereich

Austausch ist langsamer als in einer DNA-Doppelhelix, da C·C+-Basenpaare stabiler

sind

5 17.10.2013

Chemische Verschiebung

• 1H chemische Verschiebung ist gleich (Δδ(1H)≈0.01-0.02 ppm)

• 15N chemische Verschiebung ist unterschiedlich (Δδ(15N)≈0.45-2.92 ppm)

Basenpaar δ(1H) [ppm] δ(15N) [ppm]

Δδ(15N)

[ppm]

(15N)C7-C19 15.31 193.40 2.92

C7-(15N)C19 15.32 190.48

(15N)C3-C15 15.46 190.73 0.61

C3-(15N)C15 15.47 190.12

(15N)C8-C20 15.73 191.11 0.45

C8-(15N)C20 15.74 191.56

(15N)C2-C14 15.62 192.60 2.73

C2-(15N)C14 15.60 189.87

(15N)C9-C21 15.53 191.51 -

C9-(15N)C21 - -

(15N)C13-C1 15.49 190.20 1.32

C13-(15N)C1 15.47 191.52

Abb.4: 1D 15N-HMQC, 2D 1H15N-HMQC von C3 und

C15.[1]

Tab. 1:1H und15N chemische Verschiebungen aus 15N-

HMQC.[1]

6 17.10.2013

Kopplungskonstanten

Basenpaar

1J(NH) [Hz] Δ1J(NH) [Hz]

theoretisch (c/h/m) expt theoretisch expt

(15N)C7-C19 54.3/4.6/23.8 36 12.0 10

C7-(15N)C19 55.1/5.1/35.8 46

(15N)C3-C15 63.2/0.0/28.9 42 5.3 2

C3-(15N)C15 63.2/0.0/34.2 44

(15N)C8-C20 63.6/0.1/31.1 42 1.4 0

C8-(15N)C20 63.5/0.1/32.5 42

(15N)C2-C14 64.0/0.1/27.6 39 8.9 7

C2-(15N)C14 63.9/0.1/36.5 46

(15N)C9-C21 64.3/0.2/29.9 41 4.8 -

C9-(15N)C21 64.3/0.3/34.7 -

(15N)C13-C1 63.8/0.0/28.6 45 6.7 0*

C13-(15N)C1 63.9/0.0/35.3 45*

Tab. 2: experimentell Bestimmte und berechnete 1J(NH) Kopplungskonstanten der

Wasserstoffbindung in den Basenpaaren (c: kovalent gebunden, h: Wasserstoffbrückenbindung,

m: populationsgewichteter Mittelwert, *große Fehler in den experimentellen Werten).

7 17.10.2013

Konformere

• 2 verschiedene Konformere des DNA i-Motivs

• 1J(NH) Kopplungskonstanten beider Konformere sind

ähnlich

Abb. 5: Haupt-und Nebenkonformation des DNA i-Motivs.[2]

Abb. 6: 15N gefiltertes 1D Experiment.[1]

8 17.10.2013

Quantenmechanische Untersuchungen

• Berechnung der NMR Parameter mittels DFT

• Modelle wurden konstruiert aus

NMR Daten (PDB)

Geometrieoptimierung

• Berechnung von:

Energiedifferenzen

Relative Bolzmanverteilung

1J(NH) Kopplungskonstanten

9 17.10.2013

Quantenmechanische Untersuchungen

• Protonentransfer-Barriere beruht auf dem N-N-Abstand

• Normaler N-N Abstand: 2,6-2,8 Å

Energiebarriere höchstens 6 kcal mol-1

Protonentransfer mind. 108 s-1

Abb. 7: Energiebarriere und resultierende

Wasserstoff-Austauschrate zwischen den

Stickstoffatomen in einem C·C+ Basenpaar.[1]

10 17.10.2013

Berechnete und Experimentelle Werte

Basenpaare ΔE [kcal mol−1] Relative population 1J(NH) [Hz] Δ1J(NH) [Hz]

theory expt theoretisch (c/h/m) expt theoretisch expt

(15N)C7-C19 0.278 0.62 0.78

54.3/4.6/23.8 36 12.0 10

C7-(15N)C19 55.1/5.1/35.8 46

(15N)C3-C15 0.099 0.85 0.95

63.2/0.0/28.9 42 5.3 2

C3-(15N)C15 63.2/0.0/34.2 44

(15N)C8-C20 0.027 0.96 1.00

63.6/0.1/31.1 42 1.4 0

C8-(15N)C20 63.5/0.1/32.5 42

(15N)C2-C14 0.165 0.76 0.84

64.0/0.1/27.6 39 8.9 7

C2-(15N)C14 63.9/0.1/36.5 46

(15N)C9-C21 0.091 0.86 n.d.

64.3/0.2/29.9 41 4.8 -

C9-(15N)C21 64.3/0.3/34.7 -

(15N)C13-C1 0.123 0.82 1.00

63.8/0.0/28.6 45 6.7 0

C13-(15N)C1 63.9/0.0/35.3 45

Tab. 3: Berechnete sowie experimentell bestimmte Werte der N-H+-N- Bindungen im i-Motiv.[1]

11 17.10.2013

N···H+···N-Bindung

• asymmetrisches doppeltes Wannenpotential

• Verschiedene Potentialminima für den Protonentransfer

• Verschiedene Raten für den Hin- und Rück-Transfer

Abb. 8: Energiediagramm der N-H+-N-Bindung.[1]

12 17.10.2013

Positionen der Protonen

• 1J(NH) ≈45 Hz

Die Protonen sind nicht an nur einem Stickstoffatom

lokalisiert

• 1J(NH) Kopplungskonstanten und 15N chemische

Verschiebungen variieren für jedes Basenpaar

• QM Rechnungen spiegelten diese kleinen Unterschiede

wieder

Protonenkonzentration an den Cytidin-Resten C14, C15,

C19, C20 und C21 sind leicht höher

C8

A6

C7

C9

C14

T16

C15

C13

A17

A12 T10

A11

5‘

3‘

C2

T4

C3

C1

C20

A18

C19

C21

A5

Abb. 9: Das i-Motiv. Die rot

markierten Cytidine weisen eine

leicht erhöhte

Protonenkonzentration auf.

13 17.10.2013

Positionen der Protonen

• Vermutung:

asymmetrische π-Stapeln der sechs Basenpaare

elektrostatische Repulsion

• Bevorzugte Position eines Protons:

größter Abstand zum Proton des nächsten C-C+-Basenpaars

Nächstes Proton sitzt an der gegenüberliegenden Seite

der großen Furche

• Vermutung: gekoppelter Protonentransfer entlang des i-

Motivs

C8

C7

C9

H+C14

H+C15

C2

C3 C20H

+

C19H+

C21H+

≈ ≈ ≈

≈ ≈ ≈ ≈

≈

Große Furche

Kleine Furche

Abb. 10: Ausschnitt aus dem

i-Motiv. Die Protonen-

konzentration ist an den rot

markierten Cytidinen etwas

höher.

14 17.10.2013

2D 1H-15N SOFAST-HMQC

• Band-Selective Optimized Flip-Angle Short-Transient heteronuclear multiple

quantum coherence (SOFAST-HMQC) Experiment

• Für 15N und 13C-markierte Makromoleküle

• Flip-Winkel α

Ernstwinkel: βopt = cos-1(exp(-Trec/T1))

Verbesserte Wiederholungsrate ohne Verlust an S/N pro Messzeit

• Bandenselektive 1H Pulse

Verbesserte Spin-Gitter Relaxation T1

α

z

x

y

Abb.11 Darstellung des

Flipwinkels im Vektorraum.

Abb.12: Pulssequenz des SOFAST-HMQC Experiments. X = 13C oder 15N.

15 17.10.2013

Quellen

[1] A. L. Lieblein, M. Krämer, A. Dreuw, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem. Int.

Ed. 2012, 51, 4067 –4070.

[2] A. L. Lieblein, J. Buck, K. Schlepckow, B. Fürtig, H. Schwalbe, Angew. Chem.

2012, 124, 255 – 259.

[3] P. Schanda, B. Brutscher, J Am Chem Soc 2005, 127, 8014-8015.

[4] P. Schandaa, E. Kupce, B. Brutschera, J Biomol NMR 2005, 33, 199-211.

17.10.2013

Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit