the limulus amebocytelysate

8/17/2019 The Limulus Amebocytelysate

1/24

Tes Limulus amebocyte lysate (LAL)A. Sejarah dan Latar BelakangThe Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis

kuantitatif endotoksin bakteri. Limulus amebocytelysate (LAL) test adalah metode alternatif

terhadap rabbit pyrogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam produk,

untuk menghindari penggunaan hewan binatang dalam percobaan.

Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus).

!enggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan "ang (#$%&) bahwa

infeksi bakteri gram negatif (E. coli dan Pseudomonas ) pada Limulus polyphemus

menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah. Tahun #$&', Levin and "ang kemudian

menunjukkan bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein

yang dapat menggumpal dalam amubosit shingga agen antiaggregating harus ditambahkan

untuk menghambat agregasi. *thylmaleimade adalah yang paling umum digunakan

sebagai anti-aggregant .+olum (#$-, #$) dan /oung (#$0), melakukan pemurnian dan karaterisasi protein

yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin

merupakan reaksi en1imatik.2ntuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran besar ditangkap, cek

kesehatannya, lalu darahnya diambil dengan menggunakan jarum suntik. 3arah kepiting ini

lalu disentrifuga untuk memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya.


2/24

4Amoebocytelaludifree1edried dan diproses untuk digunakan. 5arganya6 7ne 8uart of LALis worth 9#%,---:

B. Metode Ada empat metode LAL saat ini dilisensi oleh ;3A.


3/24

pengawasan mutu rutin tidak hanya untuk radiofarmasi tetapi juga untuk semua cairanparenteral dan larutan yang digunakan dalam penyusunan kit dalam kedokteran nuklir.

>hodes dan ?roft mencantumkan enam alasan mengapa uji LAL lebih disukai

daripada uji kelinci untuk pengujian pirogen radiofarmasi dan kit reagen6

#. Lebih sensitif.0. Lebih cepat..


4/24

erbedaa

n

!ji kelinci LAL test


5/24

D Mekanisme Reaksi *lusidasi dari reaksi endotoksinLAL telah dihasilkan terutama dari karya oleh Liu et al.,

Takagi et al., dan


6/24

a. 2ji minimum 0- dari maksimum 0H botol per setiap bejana pengeringan.b. $$I batas atas fiducial dari standar deviasi rasio log referensi dan uji lysates untuk 0- vial

tidak lebih besar dari -,.D !ersyaratan umum.a.


7/24

"ambar. # +kema >epresentasi dari mekanisme reaksi LAL.

#. +emua bahan yang akan berkontak dengan reagen LAL atau sampel uji harus dibersihkan dan

didepirogenasi secara menyeluruh.0. +uhu reaksi tidak dapat diluar rentang &H-?.. ?ampuran reaksi harus berada dalam kisaran p5 %.'. Faktu reaksi harus tidak lebih dari # jam.%. +etiap pengujian harus disertai dengan kontrol positif dan negatif

!rosedur dasar pengujian LAL adalah kombinasi -,# ml sampel uji dengan -,# ml reagen

LAL. +etelah # jam inkubasi pada suhu -?, campuran dianalisis untuk melihat adanya sebuah

gumpalan gel. 2ji LAL positif, menunjukkan adanya endotoksin, jika gumpalan gel menjaga

integritasnya setelah inversi lambat dari tabung reaksi berisi campuran (lihat Kambar.').!etunjuk lengkap untuk melakukan uji LAL ditemukan pada kit uji LAL dari produsen

komersial. 2+! (edisi 00) juga berisi petunjuk untuk menggunakan uji LAL untuk memperkirakan


8/24

konsentrasi endotoksin bakteri dalam sampel bahan. nstruksiinstruksi ini diringkas dengankomentar di bawah ini6

"ambar $. +ebuah tes gel LAL bekuan positif ditandai oleh pembentukan gel padat yang tetap

utuh di dasar tabung pada inversi. (?ourtesy of "ioFhittaker, nc, Falkersville,


9/24

'.


10/24

'. Tes LAL dikatakan positif berarti ada indikasi adanya endotoksin jika gumpalan gel tetap

bertahan tidak jatuh saat tabung dibalikkan.

► tandard Penentuan Endotoksin>eferensi +tandard *ndotoksin (>+*) yang pertama kali adalah Lot*?0 yang

didefinisikan # *ndoto=in 2nit (*2) dalam -,0 ng standard dan dalam # vial terdapat #-.--- *2.+tandard lain yang umumnya digunakan adalah ?+* (?ontrol +tandard *ndoto=in) yang

harus di standardisasi kembali terhadap >+*. "erikut standardisasi yang dilakukan6D


11/24

yang digunakan sebelumnya. 3alam tes pipa lainnya, jumlah volume reagen LAL dan endotoksin

starndard dijumlahkan.@ontrol positif adalah reagen LAL dengan sampel yang mengandung konsentrasi

endotoksin yang telah diketahui. +edangkan kontrol negatif adalah reagen LAL ditambah jumlah

volume sampel steril yang sama yaitu jumlah pirogen dan pelarut bebas.+aat jumlah volume yang sama tersebut dicampurkan, tes pipa dimulai dengan diputar

perlahanlahan. @emudian pipa tersebut ditempatkan pada temperatur yang konstan pada water

bath menggunakan kontrol suhu -

? N #-

?. Faktu inkubasi idealnya &- menit. !ada saatinkubasi, pipa jangan sampai terjadi gangguan seperti digerakkan dan sebagainya khawatir akan

ada gumpalan yang akan lepas secara irreversibel sehingga mengurangi hasil akhirnya. +etelah

inkubasi, keluarkan pipa secara hatihati. Analisis hasil inkubasi dengan menggunakan microskop. +atu kaca objek dapat

mengidentifikasi #0 sampel menggunakan volume mikroliter -,# mikroliter. Tambahkan toluidin

biru -,#I dalam etanol ke dalam kaca tersebut. !ositif uji LAL ditandai dengan adanya drople

droplet biru sedangkan hasil negatifnya berupa warna biru yang homogen tanpa adanya droplet.

► ensiti"itas dari LAL+ensitivitas dari LAL didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari endotoksin yang

murni yang memproduksi gel keras yang akan tetap utuh ketika ditelungkupkan secara hatihati

selama # jam inkubasi pada suhu - ?. !ada umumnya, terlihat bahwa uji LAL sensitif terhadap

satuan pictogram dari endotoksin, dan LAL test ini %%- kali lebih sensitif dibandingkan dengan uji


12/24

kelinci terhadap keberadaan endotoksin, bergantung pada jenis studi perbandingan yang

dilakukan.!enelitian terdahulu yang dilakukan oleh cooper et al menunjukkan bahwa uji LAL

setidaknya lima kali lebih sensitif terhadap endotoksin murni dibandingkan dengan uji kelinci. 5al

ini kemudian ditegaskan kembali oleh *lin dan Folff. !erbaikan dalam produksi LAL dan metode

formulasi akan meningkatkan sensitivitas dari LAL #- sampai %- kali lebih besar dibandingkan

dengan uji kelinci.

>onneberger menemukan bahwa LAL test memberikan hasil yang sama atau #- kali lebihsensitif dibandingkan dengan uji kelinci menggunakan lipopolisakarida dari bakteri gram negatif

yang berbeda (table 0.%). !ada lebih dari -- sampel obat, uji LAL dan uji kelinci memberikan

hasil yang sama, meskipun injeksi dalam volume besar menghasilkan sensitivitas yang rendah

dalam uji kelinci.

Tabel %. +pesifisitas dan sensitivitas LAL untuk deteksi Lipopolysakarida


13/24


14/24

endotoksin tidak perlu dipermasalahkan. amun, spesifisitasnya dalam bereaksi hanya pada

endotoksin tertentu merupakan karakteristik penting yang diperdebatkan.!ada #$, *lin and Folff pertama kali melaporkan kekurangan yang mungkin dari

spesifisitas pada uji LAL untuk endotoksin bakteri. !emberian immunoglobulin intravena telah

ditemukan untuk menghasilkan hasil positif palsu pada uji LAL. !eningkatkan jumlah

imunoglobulin yang diberikan akan meningkatkan level material LAL reaktif dalam plasma.amibocyte lysate mengandung 1at yang disebut factor sensitive (#) P3glucan. ;aktor ini

dapat mengaktivasi LAL untuk memproduksi hasil positif palsu terhadap keberadaan endotoksin.


15/24

!endukung dari uji LAL menyatakan bahwa uji tersebut memberikan setidaknya tujuh

keuntungan dibandingkan dengan penggunaan uji kelinci untuk mendeteksi pirogen dalam

produk injeksi parenteral dan peralatan medis6#. +ensitivitas yang lebih besar 0. >eliabilitas yang lebih besar . +pesifisitas yang lebih baik'. Rariasi yang lebih sedikit%. Aplikasi penggunaan yang lebih luas&. 3igunakan sebagai alat pemecahan masalah. "iaya lebih sedikit.

+ebagian besar keuntungan adalah akibat langsung dari kesederhanaan yang luar biasa

dari uji LAL. 2ji in vitro membutuhkan jumlah item minimal untuk menyelesaikan uji, LAL

menawarkan kecepatan dan kehandalan yang tak tertandingi oleh sistem in vivo.@ontrol teknik, penanganan, dan faktor lingkungan eksternal jauh lebih mudah diatur

dengan uji LAL. 5al ini meminimalkan peluang kesalahan dan variasi dalam pengujian hasil.

@emudahan dan kemampuan beradaptasi dari uji LAL memungkinkan untuk digunakan dalam

berbagai situasi dimana penerapan uji kelinci akan tidak dapat atau tidak mungkin dipraktekkan.2ji LAL telah menjadi pengganti yang diterima untuk uji kelinci dalam mengontrol pirogen

dalam prosesfraksi plasma. *mpat keuntungan yang diberikan jika mengganti uji LAL dengan uji

kelinci adalah sebagai berikut6#. uji in vitro, bila tersedia, lebih digunakan daripada uji pada hewan.0. 5asil tersedia dalam waktu $- menit setelah awal prosedur uji.. 2ji yang dapat dilakukan dengan LAL bila uji menggunakan kelinci tidak masuk akal

karena faktor waktu.


16/24

'. 2ji LAL sederhana untuj dilakukan dan tidak mahal.;umarola dan Jirillio menyatakan bahwa menurut beberapa literatur yang berhubungan

dengan uji LAL serta berdasarkan pengalaman, uji dapat diterima, spesifik, cepat, dan metode

yang sensitif untuk uji endotoksin obat parenteral dan produk biologi dan untuk pengujian dalam

larutan parenteral.!eneliti di Laboratorium Travenol telah menerbitkan banyak artikel penyediaan data untuk

mendukung keunggulan uji LAL atas uji kelinci untuk pengujian pirogen dari LR!s. Argumen

mereka dirangkum oleh


17/24

Tidak diragukan lagi, uji LAL memenuhi kebutuhan akan suatu metode yang berguna,

sensitif, akurat, dan murah untuk mendeteksi endotoksin bakteri. amun, bukan berarti tanpa

keterbatasan atau masalah.@eterbatasan terbesar uji LAL adalah masalah gangguan interaksi lysateendotoksin yang

disebabkan oleh berbagai obat dan 1at lainnya. 3ari #- perwakilan kontrol kualitas dari industri

parenteral yang disurvei, mengidentifikasi hambatan dari interaksi lysateendotoksin sebagai

faktor pembatas nomor satu dari penerapan uji LAL. +eperti yang telah dibahas sebelumnya,

reaksi gelasi LAL ditengahi oleh en1im pembekuan yang thermolabil, sensitif terhadap p5, dan

secara kimia terkait dengan tripsin. nhibisi disebabkan oleh bahan yang diketahui dapat

mendenaturasi protein atau menghambat kerja en1im. 3aftar beberapa obat dan bahanbahan

yang dikenal dapat mengubah atau menghambat interaksi lysateendotoksin diberikan dalam

Tabel H. 5ambatan oleh banyak komponen obat dapat diatasi dengan pengenceran atau

penyesuaian p5. Tentu saja, pengenceran mengurangi konsentrasi endotoksin dan tempat yang

dibutuhkan lebih besar untuk mendeteksi jumlah endotoksin yang diencerkan.

Tabel H contoh dari +!Rs yang dilaporkan dapat menghambat tes LAL


18/24

!engujian inhibisi atau aktivasi pada dasarnya melibatkan penggunaan kontrol positif.

5asil akhir dari deteksi pada sampel produk tidak boleh berbeda dari titik akhir pada standar seri.

3engan kata lain, jika jumlah terendah endotoksin yang terdeteksi adalah -,-0% ng ml, jumlah

ini juga harus terdeteksi oleh banyak sama reagen LAL dalam sampel produk. Jika ditemukan

tejadi inhibisi, dilakukan pengenceran terhadap sampel produk sampai tidak ada lagi modifikasi

pada reaksi gelasi.

D 'ambatan


19/24

Reaksi LAL-Endotoksin2ji inhibisi LAL dianggap signifikan jika kontrol positif bervariasi lebih dari dua kali lipat dari

pengenceran standar dalam air.!enyebab utama produk obat menghambat uji LAL adalah dengan6

#. p5 yang tidak optimal0. Agregasi atau adsorpsi endotoksin control. @onsentrasi kation yang tidak sesuai'.


20/24

Ada beberapa sumber variabilitas yang dapat mempengaruhi keakuratan dan keandalan

uji LAL. 5al ini menjawab kenapa validasi sangat penting dan mengapa ;3A membuat pedoman

validasi untuk uji LAL. !earson dan +* 2+!, proses pembuatan yang baik dan

perbedaan formulasi terlihat dalam kondisi endotoksin. perbedaan utama dalam persiapan

pereaksi meliputi penambahan bahanbahan sebagai berikut6 kation divalen, albumin, buffer, danbahan aktif permukaan.

0. Rariabilitas metode>eagen LAL dirancang khusus untuk menghasilkan aktivitas yang optimal dalam setiap uji LAL.

Jadi, lysate#drug product compatibility dapat berubah bila beralih dari satu metode uji ke metode

uji yang lain dengan menggunakan produsen lysate yang sama.. Rariabilitas produk

Telah diketahui bahwa banyak produk parenteral akan terganggu reaksi lisisendotoksin,

meskipun sebagian besar gangguan tersebut dapat diatasi dengan pengenceran.'. Rariabilitas laboratorium

Tipe dari peralatan gelas dan lastik yang digunakan, prosedur kalibrasi peralatan, prosedur

kalibrasi ulang, kemurnian air yang digunakan, prosedur pengenceran, dan prosedur laboratorium

yang berbeda akan menghasilkan variabilitas uji LAL. +eperti dijelaskan sebelumnya, perbedaan

dalam penanganan dan penyimpanan produk parenteral sebelum analisis uji LAL nyata dapat

mempengaruhi hasil uji.


21/24

+ebagai pengulangan, untuk mengendalikan semua sumbersumber variabilitas, ;3A

menulis panduan pada validasi dari uji LAL. !edoman mengatakan, Sinhibitionuji perangkat

tambahan harus diulang pada satu unit produk yang jika pabrik lysate berubah. @etika lysate

banyak berubah, kontrol positif dua lambda digunakan untuk kembali memverifikasi validitas uji

LAL untuk produk.


22/24

sisi piringC gel positif tetap tak tergoyahkan

sedangkan reaksi negatif menunjukkan adanya aliran atau getaran pada petri dish.

reaksi visualisasi ditingkatkan ketika

jumlah kecil (U% Ol) metilen biru -,#I adalah

tambah (5ussaini dan +awtell, #$H&) tapi masalah

subjektivitas dalam menafsirkan titik akhir kurang

dari gelasi lengkap tidak dipisahkan dengan

metode ini


23/24

4+elanjutnya en1im yang diaktivasi (en1im koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu

protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisatamubosit Limulus menghasilkan

koagulin.4+ekalite rhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan membentuk

suatu gumpalanbekuan seperti gel


24/24

!enetapanbatasendotoksin

4#$H 6 ;3A

menentukanbatasendotoksinberdasarkandosismaksimumsediaanobatuntukmanusiaataukelinci4danpenyesuaianbatasendotoksinuntuksemuaobat(kecualiintratekal) dari0,% *2 kg#sampai%,-

*2 kg#4*2 M *ndoto=in 2nit

"atas deteksiuntukbeberapaprodukdiperolehdarimonografi2+! atau*!.

@alautidakdinyatakandalamfarmakope,

batasendotoksinharusdihitungdaridosismaksimummanusia

the limulus amebocytelysate

Documents