teza 10 - rezumate · 2010. 9. 1. · title teza 10 - rezumate author: dori created date: 1/12/2010...
TRANSCRIPT
-
UNIVERSITATEA DE ŞTIIN łE AGRICOLE ŞI MEDICIN Ă
VETERINAR Ă CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORAL Ă
FACULTATEA DE HORTICULTUR Ă
Ing. CRISTIAN RADU SISEA
STUDIUL CONłINUTULUI DE ORGANISME MODIFICATE GENETIC
DIN UNELE PRODUSE ALIMENTARE PE BAZ Ă DE SOIA ŞI PORUMB
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CONDUCĂTOR ŞTIIN łIFIC
Prof. univ. dr. ing. DORU PAMFIL
Cluj-Napoca
2009
-
Rezumat al tezei de doctorat
2
CUPRINS
în cadrulrezumatului
în cadrul tezei
INTRODUCERE ............................................................................................. 4CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL AL CUNOŞTINłELOR ÎN
DOMENIUL OMG-URILOR................................................................. 61.1. ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC ....................................... 6
1.1.1. Introducerea organismelor modificate genetic................................. 61.1.2. Răspândirea PMG-urilor................................................................... 71.1.3. Impactul potenŃial al PMG-urilor ..................................................... 8
1.2. MONITORIZAREA OMG-URILOR.................................................... 91.2.1. LegislaŃia europeană şi cea românească referitoare la OMG-
uri ....................................................................................................... 91.2.2. Etapele analitice incluse în procedura integrată de testare
OMG a produselor alimentare ......................................................... 101.2.2.1. Procedura integrată de testare OMG........................................ 101.2.2.2. Decizia de etichetare pe baza rezultatelor testării OMG .......... 11
1.3. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR................................ 12CAPITOLUL II. MATERIAL ŞI METODE................................................. 13
2.1. LABORATORUL DE TESTARE ....................................................... 132.2. MATERIALUL BIOLOGIC................................................................ 13
2.2.1. Evenimentele de transformare studiate .......................................... 132.2.2. Probele utilizate în cadrul experimentelor...................................... 14
2.3. EŞANTIONAREA............................................................................... 152.4. PREGĂTIREA PROBELOR ............................................................... 162.5. EXTRACłIA ADN-ULUI................................................................... 162.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN ....................................... 17
2.6.1. Cuantificarea spectrofotometrică.................................................... 182.6.2. Evaluarea stării de fragmentare a moleculelor de ADN................. 182.6.3. Confirmarea absenŃei substanŃelor inhibitoare ............................... 18
2.7. METODE ANALITICE UTILIZATE ÎN CADRUL TESTĂRII OMG...................................................................................................19
2.8. TESTAREA OMG CALITATIVĂ ...................................................... 202.8.1. DetecŃia ADN-ului specific taxonului ............................................ 222.8.2. DetecŃia rapidă (screening) a OMG-urilor ..................................... 222.8.3. Identificarea evenimentelor de transformare.................................. 23
2.9. TESTAREA CANTITATIVĂ A OMG-URILOR............................... 242.9.1. Metodologia real-time PCR utilizată în cazul testării OMG.......... 242.9.1.1. Introducerea analizei real-time PCR......................................... 242.9.1.2. Principiul real-time PCR........................................................... 242.9.1.3. Materialele de referinŃă certificate............................................ 262.9.1.4. Sisteme de detecŃie ..................................................................... 26
2.9.2. Confirmarea absenŃei inhibitorilor PCR......................................... 27
...............10
...............17
...............17
...............17
...............29
...............33
...............43
...............43
...............48
...............49
...............53
...............55
...............57
...............57
...............60
...............61
...............68
...............72
...............78
...............80
.............100
.............101
.............105
.............109
.............109
.............120
.............145
.............146
.............150
.............153
.............153
.............155
.............172
.............181
.............190
-
Rezumat al tezei de doctorat
3
2.9.3. Cuantificarea ADN-ului MG.......................................................... 272.9.4. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 ............ 282.9.4.1. Cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000........................... 282.9.4.2. Cuantificarea pe platforma LightCycler 480............................. 29
2.9.5. Cuantificarea evenimentului de transformare Bt176...................... 292.10. EVALUAREA ŞI VALIDAREA METODELOR ANALITICE ...... 29
2.10.1. Validarea şi acreditarea metodelor analitice................................. 292.10.2. Incertitudinea de măsurare............................................................ 31
CAPITOLUL III. REZULTATE ŞI DISCUłII ............................................ 323.1. PREGĂTIREA PROBELOR TEST .................................................... 323.2. TESTAREA METODELOR DE EXTRACłIE A ADN-ULUI.......... 323.3. IZOLAREA ADN-ULUI ÎN CADRUL PROTOCOLULUI
INTEGRAT DE TESTARE ............................................................... 333.4. TESTAREA OMG CALITATIVĂ ...................................................... 34
3.4.1. DetecŃia ADN-ului specific taxonului ............................................ 343.4.2. Screeningul OMG........................................................................... 343.4.3. Identificarea evenimentelor de transformare.................................. 353.4.4. Considerente generale pentru testarea calitativă ............................ 35
3.5. TESTAREA OMG CANTITATIVĂ ...................................................373.5.1. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pe
platforma Rotor-Gene 3000 ............................................................. 373.5.2. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pe
platforma LightCycler 480............................................................... 383.5.3. Cuantificarea evenimentului de transformare Bt176...................... 383.5.4. Considerente generale pentru testarea cantitativă .......................... 39
3.6. REZULTATE GENERALE ALE TESTĂRII OMG........................... 41CONCLUZII ŞI RECOMANDĂRI............................................................... 43BIBLIOGRAFIE............................................................................................ 49
.............191
.............197
.............198
.............200
.............202
.............206
.............207
.............221
.............237
.............237
.............238
.............252
.............257
.............257
.............263
.............266
.............269
.............270
.............270
.............274
.............276
.............279
.............282
.............285
.............293
-
Rezumat al tezei de doctorat
4
INTRODUCERE
Plantele (de cultură) modificate genetic (PMG) (genetically modified crop/GMC)
reprezintă tehnologia agricolă cu cea mai rapidă răspândire din istorie (Raney, 2006),
precum şi subiectul celor mai intense controverse referitoare la introducerea şi utilizarea
biotehnologiilor moderne. Acest tip de organisme modificate genetic (OMG) (genetically
modified organism/GMO) au fost obŃinute încă din anii 1980, momentul introducerii
pentru prima dată în cultura comercială fiind însă discutabil. Mai mulŃi autori (Hails şi
Kinderlerer, 2003; Zhou et al., 1995, în Nap et al., 2003; James şi Krattiger, 1996) afirmă
că PMG-urile au fost utilizate în China, în scop comercial, încă de la sfârşitul anilor 1980
sau începutul anilor 1990. În ceea ce priveşte utilizarea în alimentaŃia umană, tomatele
FlavrSavr reprezintă primele plante de cultură modificate genetic destinate acestui scop
(Lüthy, 1999; James şi Krattiger, 1996). Introducerea lor pe piaŃă s-a făcut în 1996.
Opiniile referitoare la utilzarea PMG-urilor pot fi încadrate în două curente. Pe de
o parte, cultivarea la scară largă este văzută ca având numeroase beneficii economico-
sociale şi ecologice, iar de cealaltă parte, opozanŃii noii tehnologii insistă asupra
potenŃialelor efecte negative pe care OMG-urile le pot provoca asupra echilibrului
ecosistemelor, economiei, sănătăŃii etc.
Conform ligislaŃiei europene (ex. Regulamentul 1829/2003 şi Regulamentul
1830/2003), cultivarea OMG-urilor şi procesarea sau comercializarea sub formă de
alimente, furaje sau material săditor se face doar după parcurgerea unui proces de
autorizare. Pentru a fi autorizate, OMG-urile trebuie să îndeplinească anumite cerinŃe
referitoare la siguranŃă şi liberă alegere, care au de fapt rolul de a asigura coexistenŃa, la
orice nivel, cu produsele convenŃionale (Wikipedia, 2009; GMO Compass, 2006c). Este
astfel protejat dreptul producătorilor, comercianŃilor şi consumatorilor de a alege, iar
instrumente ca trasabilitatea, etichetarea sau monitorizarea post-market, introduse prin
noile actele normative, au rolul de a permite identificarea OMG-urilor de-a lungul
lanŃului de producŃie şi consum.
Din cele prezentate anterior se poate concluziona că ingineria genetică şi
produsele derivate din aceasta reprezintă deja un domeniu important la nivel global, care
-
Rezumat al tezei de doctorat
5
se dezvoltă continuu, având potenŃialul de a genera numeroase beneficii, dar şi efecte
negative. Cu toate că până în momentul de faŃă nu există dovezi clare, care să
fundamenteze temerile legate de posibile urmări nefavorabile ale utilizării OMG-urilor,
se recomandă o abordare prudentă.
În Ńara noastră, soia şi porumbul au fost singurele plante MG cultivate în scop
comercial. Deşi opoziŃia publicului faŃă de aceste culturi este, în general, evidentă,
fermierii susŃin că beneficiile economice obŃinute sunt considerabile. Aceste aspecte au
fost evidenŃiate de rapoartele Serviciului Străin de Agricultură din cadrul
Departamentului de Agricultură al Statelor Unite (USDA Foreign Agricultural Service)
(Cionga, 2005; Higgins, 2000), precum şi de publicaŃii din Ńara noastră.
Astăzi, cultivarea PMG-urilor în România se face pe suprafeŃe foarte restrânse, în
principal datorită implementării legislaŃiei europene care, odată cu aderarea Ńării noastre
la UE, la 1 ianuarie 2007, a impus renunŃarea la soia MG. Această legislaŃie
reglementează strict domeniul biotehnologiilor şi în special cultivarea PMG-urilor. În
consecinŃă, în cadrul UE şi implicit în România, doar două evenimente de transformare
(MON810 şi T25, ambele la porumb) mai sunt încă autorizate pentru cultivare (Comisia
Europeană, 2009; GMO Compass, 2009).
În ceea ce priveşte activitatea de testare OMG, s-au creat şi în România premisele
dezvoltării unui sistem adecvat, capabil să asigure punerea în aplicare a noilor prevederi
legale referitoare la trasabilitatea, etichetarea şi monitorizarea post-market a produselor
alimentare care conŃin OMG-uri, permiŃând astfel o alegere informată şi conştientă
(informed choice) de-a lungul lanŃului de producŃie şi comercializare (Lee et al., 2006;
Zafar et al., 2004).
În vederea armonizării politicilor naŃionale cu cele europene, au fost demarate
procese de acreditare a unor laboratoare de testare OMG, care să corespundă standardelor
acceptate la nivel internaŃional. În acest context se înscrie şi tematica prezentei teze,
motivată, în principal, de existenŃa unui contract CEEX Modul IV (nr. 229/2005) care a
urmărit crearea unui laborator naŃional pentru evaluarea şi certificarea conformităŃii
produselor alimentare de origine vegetală ce conŃin OMG-uri. Laboratorul a fost denumit
CERT-OMG.
-
Rezumat al tezei de doctorat
6
Activitatea de monitorizare presupune efectuarea unor analize moleculare
specifice, concretizate prin detecŃia, identificarea şi cuantificarea materialului MG. În
practica testării OMG sunt folosite metode imunologice, bazate pe analiza proteinelor,
sau metode bazate pe tehnologia PCR (polymerase chain reaction) ce utilizează ADN-ul
ca analit. Cele mai performante şi deci cele mai utilizate, sunt metodele din a doua
categorie (Žel et al., 2008).
Un aspect foarte important referitor la procesul de acreditare al laboratoarelor
OMG este reprezentat de necesitatea validării metodelor analitice, problematică care a
preocupat şi colectivul laboratorului nostru.
CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL AL CUNO ŞTINłELOR ÎN
DOMENIUL OMG-URILOR
1.1. ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC
1.1.1. Introducerea organismelor modificate genetic
Exceptând liniile modificate genetic (MG) răspândite în aproape toate regiunile
globului, cultivarurile utilizate la scară largă pentru obŃinerea produselor alimentare sunt
rezultatul domesticirii formelor sălbatice iniŃiale. Metodologia clasică de recombinare a
genelor responsabile pentru expresia caracterelor de interes, necesită un consum
semnificativ de resurse materiale, dar mai ales de timp. Un alt dezavantaj major al
metodelor clasice este reprezentat de incapacitatea introducerii unei singure caracteristici,
fără a fi necesară recombinarea genoamelor întregi. Cel mai important neajuns al
ameliorării clasice este reprezentat însă de imposibilitatea transferului de material genetic
între organisme îndepărtate din punct de vedere taxonomic. Aceste două limitări pot fi
depăşite, cel puŃin în parte, prin aplicarea tehnologiilor de transformare genetică.
Protocolului asupra BiosecurităŃii de la Cartagena (The Cartagena Protocol on
Biosafety/CPB) definşte organismele vii modificate (living modified organisms/LMOs)
ca fiind acele entităŃi vii (inclusiv cele sterile, virusurile şi viroizii) ce posedă o nouă
-
Rezumat al tezei de doctorat
7
combinaŃie de material genetic obŃinută prin utilizarea biotehnologiilor moderne (CPB,
2000). Deşi face referire la aceeaşi categorie de fiinŃe, Directiva Consiliului 2001/18/CE
le numeşte organisme modificate genetic, denumire care a fost preluată şi este astăzi
utilizată în întreaga lume, la toate nivelurile. Conform Directivei, sintagma „organism
modificat genetic” descrie entităŃile vii, exceptând fiinŃele umane, a căror material
genetic a suferit modificări ce nu pot fi generate prin mecanisme naturale de hibridare sau
recombinare. În acest caz, termenul „organism” subliniază capacitatea entităŃii biologice
în cauză de a se înmulŃi şi de a-şi trasmite informaŃia genetică în descendenŃă.
Aplicată speciilor cultivate, sintagma se referă la plantele în genomul cărora a fost
introdusă stabil, prin transformare genetică, informaŃie genetică provenită de la o altă
specie, efectul dorit fiind exprimarea acesteia în organismul gazdă. Procesul de
introducere şi funcŃionare (exprimare) a genelor în specii neînrudite este denumit
transformare genetică.
1.1.2. Răspândirea PMG-urilor
Fig. 1. EvoluŃia suprafeŃei (milioane ha) globale cultivate cu plante transgenice. Sursă: James (2009).
Extinderea OMG-urilor în culturile agricole s-a făcut foarte rapid în anii care au
urmat introducerii lor pe piaŃă. Astfel, din 1996 şi până la sfârşitul anului 2008, suprafaŃa
globală cultivată cu OMG-uri a crescut de peste 70 ori, ajungând în prezent la 125
-
Rezumat al tezei de doctorat
8
milioane hectare (Figura 1), ceea ce reprezintă aproximativ 8% din suprafaŃa agricolă
mondială (James, 2008). Cea mai mare parte din culturile transgenice este concentrată în
SUA, Argentina, Brazilia, India şi Canada care, împreună cu alte câteva Ńări, sunt
considerate marile cultivatoare de PMG-uri ale lumii („biotech mega-countries”).
În UE, cultivarea OMG-urilor se face la scară mult mai mică, importurile de
materii prime destinate obŃinerii produselor alimentare şi furajelor fiind însă foarte
frecvente. În ceea ce priveşte Ńara noastră, la nivelul anului 2008, suprafaŃa atribuită
culturilor transgenice nu a depăşit 50.000 ha (James, 2009; James, 2008).
1.1.3. Impactul potenŃial al PMG-urilor
Opiniile referitoare la utilitatea şi riscurile inerente utilizării PMG-urilor sunt
foarte diferite. Pe de o parte, aceste organisme sunt promovate ca fiind sigure şi necesare
societăŃii umane, în timp ce opozanŃii le consideră neesenŃiale şi potenŃial cauzatoare de
efecte negative asupra sănătăŃii şi mediului. Niciuna dintre aceste opinii nu poate fi însă
corectă din simplu considerent că PMG-urile nu reprezintă o categorie omogenă, punerea
în balanŃă a beneficiilor şi riscurilor trebuind făcută pentru fiecare caz în parte (Pretty,
2000). Analiza impactului potenŃial al introducerii şi utilizării PMG-urilor are în vedere o
serie de factori ca: implicaŃiile tehnice pentru practica agricolă; inputurile din agricultură;
fluxul de gene; biodiversitatea; impactul economic; avantajele pentru sistemul sanitar;
riscurile pentru sănătatea consumatorilor şi organismele non-Ńintă; asigurarea securităŃii
alimentare; implicaŃiile de natură etică sau culturală.
Pe baza celor studiate, concluzionăm că utilizarea PMG-urilor, ca în cazul oricărei
alte tehnologii, prezintă o serie de avantaje, dar pot genera şi riscuri pentru mediu şi
sănătate. Trebuie de asemenea subliniat că pericolul nu este reprezentat întotdeauna de
tehnologia în sine, ci mai degrabă de utilizarea iraŃională.
O serie din situaŃiile întâlnite demonstrează clar posibilitatea formulării unor
păreri diferite, sau chiar opuse, pe baza aceleiaşi informaŃii, datorită deosebirilor în ceea
ce priveşte percepŃia, valorile sociale, orientările politice, sistemul legislativ şi
capacitatea de acŃiune colectivă (Yogendra, 2004, în Deisingh şi Badrie 2005). De aceea
considerăm că informarea corectă a publicului, precum şi implemetarea metodologiei de
-
Rezumat al tezei de doctorat
9
testare în laboratoare, sunt două obiective importante în conjunctura comercializării
PMG-urilor ca atare sau sub formă de produse alimentare derivate, iar lucarea de faŃă
reprezintă o contribuŃie la eforturile de atingere a acestora în Ńara noastră.
1.2. MONITORIZAREA OMG-URILOR
1.2.1. LegislaŃia europeană şi cea românească referitoare la OMG-uri
Introducerea deliberată în mediu, cultivarea, schimburile transfrontaliere şi
utilizarea în alimentaŃie a OMG-urilor sunt reglementate la nivelul UE de un set de
proceduri stricte, ce alcătuiesc un larg cadru legislativ (Mazzara et al., 2008).
Principale instrumente legale adoptate în cadrul UE pentru reglementarea acestui
domeniu sunt: Directiva 2001/18/CE referitoare la introducerea deliberată în mediu a
OMG-urilor; Regulamentul 1829/2003 privind produsele alimentare şi furajele MG;
Regulamentul 1830/2003 privind trasabilitatea şi etichetarea OMG-urilor şi trasabilitatea
alimentelor destinate alimentaŃiei umane sau animale, produse din OMG-uri, şi de
modificare a Directivei 2001/18/CE; Regulamentului 641/2004 privind normele de
aplicare a Regulamentului nr. 1829/2003; Regulamentul 1981/2006 privind normele de
aplicare a articolului 32 din Regulamentul nr. 1829/2003; Recomandarea 2004/787/EC.
Aceste acte normative au introdus sau consolidat diferite principii sau concepte
referitoare la domeniul OMG-urilor: evaluarea riscului asupra mediului; informarea
cetăŃenilor; alegerea conştientă/informată; etichetarea (labeling) şi trasabilitatea
(traceability) în toate etapele plasării pe piaŃă; monitorizarea post-market (post-market
monitoring); pragul de etichetare al conŃinutului MG (i.e. 0,9%) şi modul de interpretare
a acestuia; coexistenŃa culturilor transgenice cu toate celelalte sisteme agricole;
Laboratorul Comunitar de ReferinŃă pentru Alimente şi Furaje Modificate Genetic
(Community Reference Laboratory for Genetically Modified Food and Feed/CRL-
GMFF); ReŃeaua Europeană de Laboratoare OMG (European Network of GMO
Laboratories/ENGL) etc. A fost stabilit şi rolul în acest domeniu a diferitelor instituŃii
europene ca: Autoritatea Europeană pentru SiguranŃă Alimentară (European Food Safety
Authority/EFSA); CRL-GMFF; Centrul Comun de Cercetare (al Comisiei) (Joint
-
Rezumat al tezei de doctorat
10
Research Centre/JRC); ENGL; Unitatea de Biotehnologii şi OMG-uri (Biotechnology
and GMOs Unit/B&GMOs) a Institutului pentru Sănătate şi ProtecŃia Consumatorului
(Institute for Health and Consumer Protection/IHCP); Institutul pentru Materiale de
ReferinŃă şi Măsurători (Institute of Reference Materials and Measurements/IRMM).
1.2.2. Etapele analitice incluse în procedura integrată de testare OMG a produselor
alimentare
Necesitatea monitorizării OMG-urilor şi a implementării metodologiei de testare,
atât în cazul soiei şi porumbului, cât şi al altor taxoni, rezidă în principal din contextul
geo-politico-economic în care se găseşte România sau alte state membre UE. Astfel, deşi
legislaŃia cu privire la cultivarea OMG-urilor este restrictivă, schimburile comerciale
transfrontaliere oferă posibilitatea introducerii acestui tip de produse pe piaŃa alimentară
(Ujhelyi et al. 2007).
Aplicarea legislaŃiei privitoare la etichetarea produselor care conŃin material MG
se face pe baza rezultatelor obŃinute de către laboratoare specializate. În viziunea
europeană, acreditarea laboratoarelor de testare OMG, în conformitate cu standardele ISO
specifice (i.e. ISO/CEI 17025), este considerată ca fiind un element necesar pentru
desfăşurarea controalelor oficiale (Directiva 93/99/EEC în Schulze, 2008; Recomandarea
2004/787/EC). Acest tip de strategie va trebui aplicat şi în cazul „Laboratorului naŃional
de referinŃă pentru evaluarea şi certificarea conformităŃii produselor vegetale care conŃin
organisme modificate genetic” (CERT-OMG), USAMV Cluj-Napoca, de aceea etapele
analitice, metodele şi procedurile utilizate în această lucrare urmează recomandările şi
liniile directoare stabilite sau acceptate la nivelul spaŃiului comunitar.
1.2.2.1. Procedura integrată de testare OMG
Pentru detecŃia elementelor genetice specifice OMG-urilor, majoritatea
laboratoarelor utilizează metodologii bazate pe reacŃia PCR şi real-time PCR (Morisset et
al., 2009). Toate procedurile de acest fel identificate în literatura de specialitate, urmează
acelaşi principiu general, fiind însă diferite din perspectiva includerii/excluderii sau
-
Rezumat al tezei de doctorat
11
complexităŃii anumitor etape. Sursele folosite direct pentru elaborarea metodologiei de
lucru utilizată în această lucrare (Figura 2) sunt Querci (2004) şi Querci et al. (2005).
Caracteristicile fiecăreia dintre aceste etape analitice vor fi discutate în
subcapitolele următoare.
Fig. 2. Succesiunea etapelor analitice în cadul metodologiei de testare OMG. După Querci (2004), modificat.
1.2.2.2. Decizia de etichetare pe baza rezultatelor testării OMG
Conform legislaŃiei europene (i.e. Directiva 18/2001/CE), OMG-urile
comercializate ca produse în sine sau ca ingrediente ale altor produse trebuie etichetate
corespunzător, în funcŃie de noul prag limită introdus de Regulamentul 1829/2003 –
0,9%, la nivel de ingredient. În acest context, odată ce un produs a fost identificat pozitiv
-
Rezumat al tezei de doctorat
12
pentru unul sau mai multe evenimente de transformare, următoarele etape ale analizei au
ca scop determinarea cantitativă a conŃinutului OMG, iar pe baza rezultatelor obŃinute se
va lua decizia de etichetare. În cazul evenimentelor de transformare neautorizate pentru
comercializare în UE, procedura de testare este similară cu cea descrisă anterior. PrezenŃa
acestora este însă total interzisă (zero tolerance policy) (GMO Compass, 2007).
1.3. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Din cele prezentate anterior se desprinde concluzia că una dintre componentele
esenŃiale ale cercetărilor şi aplicaŃiilor actuale în domeniul OMG-urilor este reprezentată
de testatea calitativă şi cantitativă.
DetecŃia şi cuantificarea evenimentelor de transformare GTS 40-3-2 (Roundup
Ready) la soia şi Bt176 (Maximizer) la porumb a constituit obiectul principal de studiu al
prezentei teze de doctorat, în scopul implementării acestor metodologii în cadrul
laboratorului CERT-OMG al USAMV Cluj-Napoca.
În conformitate cu principiile de analiză a conŃinutului OMG descrise în literatura
de specialitate (ex. Querci et al., 2005; Querci, 2004), în cadrul cercetărilor noastre s-a
avut în vedere realizarea următoarelor obiective: dobândirea competenŃelor teoretice şi
practice necesare desfăşurării activităŃilor specifice acestui domeniu; prospectarea pieŃei
în vederea identificării produselor alimentare pe bază de soia sau porumb; revizuirea
procedurilor de eşantionare; pregătirea probelor pentru analiză; extracŃia ADN-ului;
evaluarea caracteristicilor extractelor obŃinute; detecŃia ADN-ului specific taxonului
analizat utilizând reacŃia PCR ; detecŃia OMG-urilor utilizând metode screening bazate pe
reacŃia PCR; identificarea evenimentelor de transformare utilizând reacŃia PCR;
cuantificarea conŃinutului MG prin real-time PCR; stabilirea metodologiei de testare
OMG şi validarea metodelor în vederea implementării şi acreditării acestora în cadrul
Laboratorului CERT-OMG, USAMV Cluj-Napoca.
-
Rezumat al tezei de doctorat
13
CAPITOLUL II. MATERIAL ŞI METODE
2.1. LABORATORUL DE TESTARE
Pentru buna desfăşurare a fluxului analitic şi obŃinerea unor rezultate de încredere
este esenŃială existenŃa unui spaŃiu adecvat şi cu dotare corespunzătoare. De aceea,
urmarea liniilor directoare şi respectarea normelor acceptate la nivel internaŃional sunt
aspecte de importanŃă majoră, mai ales în cazul în care se doreşte acreditarea metodelor
de testare.
ExperienŃele descrise au fost efectuate în laboratoarele Centrului de Cercetare
pentru Markeri Genetici din cadrul FacultăŃii de Horticultură, USAMV Cluj-Napoca.
SpaŃiul existent aici nu îndeplineşte cerinŃele enunŃate anterior, motiv pentru care se
doreşte transferarea activităŃilor într-un nou spaŃiu conceput şi dotat corespunzător.
Acesta din urmă corespunde laboratorului CERT-OMG, situat în cadrul Institutului
pentru ŞtiinŃele VieŃii al USAMV Cluj-Napoca şi va permite funcŃionarea în condiŃiile
necesare acreditării metodelor de testare, proces care a fost de altfel iniŃiat.
2.2. MATERIALUL BIOLOGIC
2.2.1. Evenimentele de transformare studiate
Alegerea celor două evenimente de transformare, GTS 40-3-2 şi Bt176, pentru
experienŃele propuse, a fost făcută având în vedere considerente ca: importanŃa pe care
porumbul şi soia MG o au în agricultură; stadiul autorizaŃiei pentru comercializarea
acestor OMG-uri în cadrul UE, la nivelul anului 2006; volumul mare de informaŃie
disponibilă pentru testarea acestor două evenimente de transformare.
Evenimentul de transformare la soia (Glycine max) GTS 40-3-2, comercializat sub
denumirea Roundup Ready (RR), a fost creat de Monsanto în scopul utilizării erbicidelor
totale pe bază de glifosat pentru controlul buruienilor în culturile comerciale. Simplitatea
acestui sistem a reprezentat unul dintre motivele succesului rapid pe care la avut în rândul
cultivatorilor (AGBIOS, 2009b). Soia Roundup Ready este cultivată pentru boabe
-
Rezumat al tezei de doctorat
14
destinate alimentaŃiei umane (în special sub formă de ulei, fracŃiuni proteice şi fibre) şi a
animalelor (în special sub formă de şrot) (Querci şi Mazzara, 2004b).
GTS 40-3-2 a fost obŃinut prin introducerea în varietatea comercială A5403
(Asgrow Seed Company) a genei EPSPS, izolată din linia CP4 a speciei Agrobacterium
tumefaciens (Lin et al., 2000). Gena introdusă codifică o proteină EPSPS insensibilă, în
general, la acŃiunea glifosatului, care poate astfel metaboliza aminoacizii aromatici
necesari plantei, chiar şi în cazul aplicării erbicidului Roundup (Deisingh şi Badrie, 2005;
Querci şi Mazzara, 2004).
Syngenta Crop Protection AG deŃine în prezent drepturile de proprietate pentru
evenimentul de transformare la porumb (Zea mays) Bt176, comercializat sub denumirile
Maximizer, NaturGard sau KnockOut.
Bt176 este rezistent la atacul sfredelitorului tulpinilor (european corn borer/ECB)
(Ostrinia nubilalis), dăunător important pentru cultura porumbului (AGBIOS, 2009a).
Planta produce o variantă trunchiată a proteinei CryIA(b), ce corespunde regiunii de la
capătul N al acesteia. Proteina nativă provine de la Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki
linia HD-1 şi are acŃiune insecticidă împotriva anumitor specii de insecte din ordinul
Lepidoptera. Evenimentul Bt176 exprimă de asemenea gena bar clonată de la specia
bacteriană Streptomyces hygroscopicus, care codifică enzima fosfinotricin-N-
acetiltransferaza (phosphinothricin-N-acetyltransferase/PAT) (AGBIOS, 2009a; Querci şi
Mazzara, 2004).
2.2.2. Probele utilizate în cadrul experimentelor
Clasificarea produselor care pot fi testate pentru prezenŃa OMG-urilor se poate
face după: gradul de procesare; tipul ingredientelor; modul de prezentare; gradul de
umiditate. Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoaştere cât mai bună a
proprietăŃilor intrinseci ale probelor ajută la alegerea celor mai potrivite metode de
eşantionare, pregătire şi extracŃie.
Literatura de specialitate menŃionează o paletă largă de produse alimentare ce pot
conŃine soia şi/sau porumb MG. Pe piaŃa din Ńara nostră, produsele de larg consum ce
conŃin soia sunt mai reduse ca număr. Din punctul de vedere al consumatorului acestea
-
Rezumat al tezei de doctorat
15
pot fi clasificate după cum urmează: texturatele proteice - cele mai răspândite produse
alimentare din soia, motiv pentru care au reprezentat principala categorie de probe
necunoscute testate în cadrul experimentelor; produse (ex. cremă vegetală de brâză, pate
vegetal, salam vegetal) în care extractul proteic din soia înlocuieşte ingredientele de
origine animală; laptele de soia, iaurturi şi băuturi răcoritoare; tofu; batoane energizante;
orice sortiment de ciocolată (conŃine lecitină ca aditiv); mâncare pentru nou-născuŃi;
suplimentele proteice; ulei vegetal. În cazul porumbului există următoarele tipuri de
probe: mălai, boabe la conservă, fulgi, amidon modificat (aditiv alimentar), ulei, sirop.
Cu toate că soia şi porumbul destinate alimentaŃiei umane ajung de obicei la
consumatorul final sub formă procesată, testarea seminŃelor este de asemenea importantă
deoarece conceptul de trasabilitate, impus de legislaŃia europeană în vigoare, prevede ca
etichetarea să fie făcută chiar dacă materialul MG nu este detectabil în produsul finit.
O categorie importantă de probe este reprezentată de materialele de referinŃă
certificate (MRC). Aceastea sunt matrici cu caracteristici cunoscute, indispensabile
pentru validarea metodelor sau rezultatelor .
2.3. EŞANTIONAREA
În practica testărilor OMG, operaŃiunea de eşantionare nu revine laboratoarelor de
testare, fiind efectuată de personal specializat din cadrul instituŃiilor abilitate ale statului.
Dorim să subliniem însă importanŃa acestei operaŃiuni care influenŃează semnificativ
etapele ulterioare desfăşurate în laborator, precum şi corectitudinea rezultatelor obŃinute.
Procesul de eşantionare reprezintă întodeauna o sursă de eroare care apare atunci
când din lotul de dimensiuni mari se aleg obiecte pentru a constitui proba ce va fi utilizată
direct în laborator (Querci et al., 2005, Zafar et al., 2004). O bună practică de eşantionare
asigură reducerea erorilor, ceea ce înseamnă de fapt creşterea gradului de
reprezentativitate al probei pentru populaŃia din care provine. În acest scop trebuie
cunoscute, în primul rând, proprietăŃile populaŃiei iniŃiale. În cazul testării OMG
caracterizarea poate fi extrem de dificilă şi diferă în funcŃie de tipul produsului luat în
considerare (ex. produse pocesate comparativ cu cele neprocesate sau produse ambalate
compartiv cu cele în vrac).
-
Rezumat al tezei de doctorat
16
2.4. PREGĂTIREA PROBELOR
Înainte de izolarea analitului este necesară aplicarea anumitor operaŃiuni de
pregătire a probelor (reducerea mărimii, mărunŃire, umectare sau omogenizare), în funcŃie
de caracteristicile matricii supuse analizelor (Querci et al., 2005). Scopul acestora este de
a facilita izolarea şi purificare analitului.
În general, a fost necesară doar mărunŃirea, omogenizarea şi reducerea în
dimensiuni a probei de laborator. Doar în cazul matricilor uscate, umectarea probei
înainte de extracŃie poate duce la îmbunătăŃirea rezultatelor. De asemenea, în cazul
probelor uscate, se poate realiza o separare a fracŃiunilor, astfel încât proba test să fie
constituită din particule cu granulaŃie cât mai fină.
IniŃial, mărunŃirea a fost făcută prin mojarare în azot lichid, iar ulterior s-a trecut la
utilizarea unei mori cu cuŃite rotative, Grindomix GM 200 (Retsch).
2.5. EXTRACłIA ADN-ULUI
După cum s-a specificat într-unul dintre subcapitolele anterioare, reacŃia PCR,
clasică sau real-time, stă la baza celor mai utilizate metode de testare OMG. În cadrul
analizelor ce au la bază această reacŃie, analitul este reprezentat de ADN, a cărui izolare
şi purificare constituie astfel prima etapă a testării OMG, specifică biologiei moleculare.
PerformanŃele analizei PCR pot fi însă influenŃate semnificativ de caracteristicile
intrinseci ale probei şi de performanŃele metodei de extracŃie, aspecte ce se reflectă în
absenŃa/prezenŃa inhibitorilor PCR şi în calitatea şi cantitatea ADN-ului din extracte (Di
Pinto et al., 2007). Cele mai importante caracteristici ale extractelor utilizate în analizele
PCR sunt cantitatea, calitatea şi puritatea, care, dacă sunt nesatisfăcătoare, reduc
sensibilitatea metodei sau fac imposibilă testarea OMG (Engel şi Moreano, 2003, în
Smith şi Maxwell, 2007; Deisingh şi Badrie, 2005).
ExistenŃa unei largi varietăŃi de metode destinate extracŃiei şi purificării acizilor
nucleici impune, în primul rând, alegerea celei mai potrivite tehnici. De aceea, primul
obiectiv, în ceea ce priveşte obŃinerea ADN-ului, a fost testarea comparativă a şase
metode de extracŃie: un protocol pe bază de CTAB (după Somma, 2004, şi SR EN ISO
-
Rezumat al tezei de doctorat
17
21571:2006); kitul DNeasy Plant Mini (Qiagen); kitul QIAamp Stool DNA Mini
(Qiagen); kitul High Pure GMO Sample Preparation (Roche); kitul MagNA Pure LC
DNA Isolation (Roche) în combinaŃie cu extractorul automat MagNA Pure LC (Roche);
kitul Maxwell 16 Tissue DNA Purification (Promega) în combinaŃie cu Maxwell 16
(Promega). În cazul fiecărui protocol de bază (vezi: Somma, 2004, şi SR EN ISO
21571:2006; Qiagen ,2006; Qiagen, 2007; Roche, 2004; Roche, 2009, şi Sakai et al.,
2002; Koller şi Storts et al., 2006, şi Promega, 2006) au fost efectuate mici modificări.
Evaluarea metodelor de extracŃie a avut la bază procedura aplicată de CRL-
GMFF (vezi CRL-GMFF, 2007) pentru validarea metodologiei ce trebuie ataşată
documentaŃiei de autorizare a OMG-urilor, conform Regulamentului 1829/2003. S-au
evaluat următoarele caracteristici, ultimele două nefiind incluse în procedura model:
concentraŃia ADN-ului; cantitatea de ADN recuperat; deviaŃia standard a repetabilităŃii;
puritatea extractului; gradul de fragmentare; absenŃa inhibitorilor reacŃiei PCR; timpul de
lucru aproximativ; costul aproximativ pentru o probă.
Datorită costurilor ridicate ale MRC-urilor, testarea performanŃelor metodelor de
extracŃie s-a făcut pe o probă necunoscută sub formă de texturate (felii) proteice din soia
(T4). A fost aleasă această probă deoarece reprezintă cea mai răspândită categorie de
produse alimentare pe bază soia din Ńara noastră şi este caracterizată printr-o procesare
medie, situându-se din acest punct de vedere între materiile prime (seminŃe) şi alimentele
cu cel mai înal grad de procesare (ex. pate, ulei). Ulterior, metodele au fost verificate şi
cu alte tipuri de matrici.
În etapa de analiză propriu-zisă, extracŃiile au fost efectuate în duplicat (SR EN
ISO 21571:2006; Querci et al., 2005; Germini et al., 2004), fiind incluse şi probele de
control indicate în SR EN ISO 24276:2006.
2.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN
Înainte de efectuarea analizei OMG este necesară testarea pretabilităŃii extractelor
la amplificare PCR clasică, dar mai ales la cea de tip real-time. Criteriile ce au în vedere
în acest context sunt cantitatea de ADN recuperat şi calitea extractului şi a ADN-ului
(Cankar et al., 2006; Meyer, 1999).
-
Rezumat al tezei de doctorat
18
2.6.1. Cuantificarea spectrofotometrică
Datorită în principal avantajelor de ordin practic, cuantificare spectrofotometrică a
extractelor este des utilizată în practică, multe spectrofotometre fiind concepute special
pentru determinarea concentraŃiei şi purităŃii moleculelor biologice. Trebuie însă avut în
vedere faptul că valorile obŃinute nu sunt exacte (sunt, de obicei, supraestimate), existând
o serie de factori ce determină apariŃia unor erori semnificative (MATC, 2009)
Determinările au fost efectuate cu instrumentul NanoDrop Nd-1000 UV/Vis 1µl
Spectrophotometer (Labtech International) conectat la un PC pe care a fost instalat
software-ul spectrofotometrului.
2.6.2. Evaluarea stării de fragmentare a moleculelor de ADN
Integritatea structurală a moleculelor de ADN reprezintă o caracteristică
importantă pentru succesul reacŃiei PCR deoarece un grad ridicat de fragmentare creşte
probabilitatea ca numărul copiilor amplificabile ale secvenŃei Ńintă să fie insuficient,
respectiv sub limita de detecŃie/cuantificare (Berdal şi Holst-Jensen, 2001). Pentru
evaluarea acestei însuşiri se poate utiliza migrarea electroforetică în gel de agaroză şi
marcarea cu EtBr (ex. Debode et al., 2007; CRL-GMFF, 2007; Corbisier et al., 2005)
Migrarea s-a făcut în gel de agaroză 1% (w/v) (sistem TAE) la o intensitate a
curentului electric de 10 V/cm. Gelul trebuie să aibă grosimea mai mică de 1 cm, iar după
migrare gelul este incubat în soluŃie de EtBr timp de 15 minute, la temperatura camerei şi
sub agitare uşoară. SoluŃia de colorare este obŃinută prin diluarea EtBr în tampon TAE
1X, la o concentraŃie finală de 0,01 mg/ml.
Vizualizarea şi înregistrarea rezultatelor s-a făcut cu ajutorul sistemului
BioSpectrum AC Imaging System (Ultra-Violet Products, UVP).
2.6.3. Confirmarea absenŃei substanŃelor inhibitoare
După cum s-a menŃionat şi în subcapitolele anterioare, succesul extracŃiei în
cadrul analizelor OMG depinde de performanŃele metodei utilizate, respectiv capacitatea
-
Rezumat al tezei de doctorat
19
acesteia de a recupera o cantitate suficientă de ADN amplificabil şi de a elimina
substanŃele inhibitoare (Waiblinger et al., 2006). PrezenŃa acestora din urmă în extract şi
influenŃa pe care o au asupra activităŃii polimerazei, pot fi evidenŃiate printr-un
experiment real-time PCR, amplificând o genă endogenă în diluŃii seriale ale extractului
(CRL-GMFF, 2007; Reiting et al., 2007; Foti et al., 2006; Lee et al., 2006; Waiblinger et
al., 2006; Cankar et al., 2006; SR EN ISO 21570:2006). Acest tip de analiză reprezintă o
foarte bună modalitate de evaluare a pretabilităŃii extractelor la amplificarea real-time
PCR, constituind o parte esenŃială a validării efectuate în cadrul laboratorului (in-house
validation), înainte de verificarea printr-un studiu de comparare interlaboratoare
(Waiblinger et al., 2006).
2.7. METODE ANALITICE UTILIZATE ÎN CADRUL TESTĂRII OMG
Tipurile de metode ce pot fi utilizate pentru testarea OMG sunt numeroase şi
variate, atât din punct de vedere al analitului, cât şi în ceea ce priveşte complexitatea
tehnică şi metodologică. Cele mai utilizate sunt prezentate în continuare.
Dintre metodele bazate pe analiza proteinelor, doar cele imunologice sunt folosite
în practica testării OMG. Acestea au la bază interacŃiunea anticorp-antigen, proteina
rezultată în urma expresiei transgenei în organismul gazdă reprezentând antigenul. Există
două formate ale imunotestelor – ELISA şi teste rapide de tipul stripurilor (lateral flow
strips), care diferă, în principal, prin gradul de complexitate şi performanŃa rezultatelor.
Datorită limitelor ce le caracterizează, aceste strategii sunt mai puŃin utilizate, doar
testele rapide găsindu-şi o largă aplicabilitate pentru efectuarea screeningului probelor
proaspete (boabe/seminŃe, plante), în afara laboratorului.
ReacŃia PCR permite amplificarea selectivă, într-un număr foarte mare de copii, a
unei secvenŃe ADN prezentă într-o proporŃie relativ redusă în cadrul unui amestec
complex de fragmente ADN (Zafar et al., 2004). Analiza produşilor rezultaŃi prin
amplificare într-o reacŃie PCR clasică permite formularea unei concluzii calitative („da”
sau „nu”) asupra prezenŃei OMG-urilor în proba testată. În practică, evaluarea
ampliconilor se face, în general, prin separare electroforetică în gel de agaroză, marcare
cu EtBr, vizualizare în prezeŃa luminii UV şi compararea cu probe standard.
-
Rezumat al tezei de doctorat
20
Pentru obŃinerea informaŃiilor cantitative referitoare la conŃinutul de acizi nucleici,
este utilizată tehnica real-time PCR care reprezintă o variantă mult mai performantă a
reacŃiei PCR clasice.
Tehnica microarray are la baza hibridarea moleculară dintre două fragmente
complementare de ADN. În contextul testării OMG, este utilizată în combinaŃie cu
amplificarea PCR multiplex, corespunzând, practic, etapei post-PCR – analiza produşilor
de reacŃie. Această tehnică are o mare capacitate de procesare, constituind o strategie
foarte potrivită pentru o problemă majoră cu care se confruntă domeniul testării OMG –
creşterea numărului de evenimente de transformare.
O mare parte din probele care fac obiectul testărilor OMG este reprezentată de
matrici alimentare. Acestea se caracterizează de obicei printr-un intens grad de procesare,
în special sub influenŃa temperaturilor ridicate (Endres, 2001). Datorită faptului că
termostabilitatea ADN-ului este mai bună decât a proteinelor (Anklam et al., 2002, în
Taverniers et al., 2005; Gachet et al. 1999), reacŃia PCR este cea mai potivită tehnică
pentru detecŃia, identificarea şi cuantificarea OMG-urilor (Anklam et al., 2002, în
Angonesi Brod et al., 2007; Taverniers et al., 2005; Berdal şi Holst-Jensen, 2001).
2.8. TESTAREA OMG CALITATIVĂ
ReacŃia PCR are la bază mecanismul de replicare in vivo a ADN-ului şi este
utilizată pentru amplificarea unei secvenŃe Ńintă de ADN într-un număr mare de copii
(Kubista et al., 2006), fiind considerată un „fotocopiator molecular” (Dalgleish, 2007)
sau o metodologie de „xeroxare a ADN-ului” (NCHGR,1992).
Pentru ca amplificarea să aibă loc, sunt necesari doi primeri oligonucleotidici care
flanchează secvenŃa de ADN Ńintă, nucleotide libere, o polimerază termostabilă şi ioni de
Mg într-o soluŃie tampon. ReacŃia se desfăşoară în cadrul unui ciclu repetitiv de
temperaturi. În prima etapă a amplificării PCR, temperatura înaltă are rolul de a separa
catenele dublului helix de ADN. Temperatura este apoi coborâtă pentru a facilita alipirea
(hibridarea moleculară) primerilor oligonucleotidici la secvenŃa Ńintă. În ultima etapă
temperatura are o valoare optimă pentru activitatea polimerazei care extinde primerii prin
alipirea unor noi nucleotide, în prezenŃa ionilor de Mg. În contextul amplificării PCR,
-
Rezumat al tezei de doctorat
21
cele trei etape constituie un ciclu individual denumit, de obicei, ciclu/pas PCR (PCR
cycle/step). După fiecare ciclu, catenele de ADN nou sintetizate servesc ca matriŃe în
ciclul următor. Principalul produs al acestei reacŃii exponenŃiale este un segment dublu-
catenar de ADN a cărui terminaŃii corespund capetelor 5’ ale primerilor oligonucleotidici.
Lungimea produsului de amplificare (amplicon) este dată de distanŃa dintre cei doi
primeri.
Elementele definitorii ale unui protocol PCR sunt instrumentul utilizat pentru
amplificare (thermal cyclerul) şi componentele reacŃiei: secvenŃa Ńintă, primerii, ADN
polimeraza, nucleotidele libere, soluŃia tampon şi ionii de Mg, numărul ciclurilor de
amplificare.
Testele calitative oferă informaŃii referitoare la prezenŃa/absenŃa ADN-ului Ńintă
din proba analizată. Acest tip de analiză constă, de obicei, în parcurgerea mai multor
etape analitice, fiecare corespunzând unei amplificări PCR. Prima etapă presupune
detecŃia ADN-ului specific taxonului din care derivă OMG-ul analizat, secvenŃa Ńintă
aparŃinând în acest caz unei gene caracteristice speciei respective (genă de referinŃă).
Această analiză are rolul de a elimina posibilitatea obŃinerii unor rezultate fals negative
ce pot apare în cazul în care extractul de ADN nu are parametri corespunzători pentru
amplificare, fiind uneori inclusă într-o procedură mai amplă de evaluare a caracteristiclor
ADN-ului izolat (vezi subcapitolul 2.5), alături de alte analize specifice.
Urmează apoi screeningul, etapă în care se realizează identificarea probelor ce
conŃin material MG. În această etapă se realizează trierea probelor, fiind eliminate din
etapele ulterioare ale procesului analitic cele fără conŃinut transgenic. Screeningul este
necesar mai ales în cazul probelor despre care nu există informaŃii suficiente referitoare la
prezenŃa materialului MG. Chiar dacă aceste informaŃii sunt disponibile, efectuarea
screeningului este totuşi benefică, putând oferi indicii referitoare la prezenŃa unor
evenimente de transformare neaşteptate. łintele pentru amplificare corespund secvenŃelor
celor mai utilizate elemente transgenice (ex. promotorul 35S, ternimatorul nos).
Probele identificate pozitiv în cea de-a doua etapă vor fi testate în vederea
determinării precise a OMG-urilor, amplificând regiuni specifice fiecărui eveniment de
transformare.
-
Rezumat al tezei de doctorat
22
În general, în cadrul experimentelor calitative pe care le-am efectuat au fost amplificate
ambele extracte obŃinute din pentru fiecare probă, iar amplificările au fost făcute în duplicat. Nu
au fost însă utilizate probele de control cu caracter neobligatoriu.
În vederea eficientizării procesului de testare, pe baza informaŃiilor originale a fost
conceput un singur protocol de amplificare care a fost generalizat la toate perechile de
primeri.
2.8.1. DetecŃia ADN-ului specific taxonului
În cadrul acestei etape au fost urilizate următoarele perechi de primeri:
• GMO3/GMO4, creaŃi de Meyer et al., în 1996, pentru detecŃia genei lectinei
de la soia (Le1), iar apoi utilizaŃi de Meyer şi Jaccaud (1997) în a doua fază a
unui protocol de tip „nested PCR”, destinat amplificării ADN-ului extras din
alimente procesate (Querci şi Mazzara, 2004);
• Lektin1/Lektin6, creaŃi de Tengel et al. (2001) pentru detecŃia genei Le1;
• ZEIN3/ZEIN4, proiectaŃi de Studer et al. (1997) pentru faza a doua a unui
protocol nested PCR, care viza detecŃia genei zeinei (Ze1) de la porumb;
• CP3/CP4, creaŃi de Thion et al. (2002); amplifică un segment situat la nivelul
secvenŃei trnL specifică genomului cloroplastelor; evident, această metodă nu
permite discriminarea taxonilor.
2.8.2. DetecŃia rapidă (screening) a OMG-urilor
Pentru experimentele efectuate în această lucrare etapa de screening nu este
esenŃială, obiectul analizelor constituidu-l doar evenimentele de transformare GTS 40-3-2
şi Bt176. Etapa a fost însă inclusă pentru a demonstra aplicabilitatea protocoalelor de
screening. SecvenŃele Ńintă utilizate corespund promotorului P-E35S, respectiv
terminatorului nos.
Primerii folosiŃi pentru screening sunt:
-
Rezumat al tezei de doctorat
23
• p35S-cf3/p35S-cr4; acest protocol conceput de Lipp et al. (2001) este
specific promotorului 35S, prezent în ambele evenimente de transformare
studiate (Querci şi Mazzara, 2004),
• CaMV1/CaMV2 (Wolf et al., 2000), specifici promotorului 35S;
• HA-nos118f/HA-nos118r, creaŃi de Lipp et al. (2001) (Querci şi Mazzara,
2004); reacŃia are ca rezultat amplificarea unui fragment al terminatorului
nos şi se poate aplica doar în cazul soiei MON4-3-2, porumbul Bt176
neconŃinând acest element genic.
Screeningul a fost efectuat şi cu kitul Biogenics Standard produs de Biotools
(http://www.biotools.eu). Acesta permite identificarea promotorului 35S şi a
terminatorului nos şi include de asemenea reacŃii de detecŃie a genei lectinei care indică
prezenŃa soiei, a genei invertazei care indică prezenŃa porumbului şi a genei rbcL din
genomul cloroplastelor, care indică prezenŃa materialului de origine vegetală.
Amplificările se desfăşoară separat, conform pricipiilor PCR-ului clasic, iar rezultatele
amplificării sunt evaluate prin electroforeză în gel de agaroză şi marcare cu EtBr. În acest
caz, au fost utilizate protocoalele indicate de producător, cu mici modificări.
2.8.3. Identificarea evenimentelor de transformare
DetecŃia specifică a casetei genice CTP/EPSPS din linia de soia Roundup Ready a
fost efectuată cu perechile de primeri GMO9/GMO5, GMO8/GMO7 şi RR01/RR04.
Primele două seturi au fost proiectate de Meyer şi Jaccaud (1997) pentru detecŃia
specifică a soiei Roundup Ready în cadrul unui protocol nested PCR (Querci şi Mazzara,
2004), iar cel de-al treilea set a fost utilizat pentru prima dată de Studer et al., în 1998.
Pentru a detecta gena sintetică CryIA(b), specifică evenimentului Bt176, au fost
folosite perechile de primeri CRYIA1/CRYIA2 şi CRYIA3/CRYIA4, proiectate de
Studer et al. (1997) pentru detecŃia specifică a genei sintetice CryIA(b) în cadrul unui
protocol nested PCR.
-
Rezumat al tezei de doctorat
24
2.9. TESTAREA CANTITATIVĂ A OMG-URILOR
2.9.1. Metodologia real-time PCR utilizată în cazul testării OMG
2.9.1.1. Introducerea analizei real-time PCR
Caracterul cantitativ al metodei real-time PCR este conferit de posibilitatea
stabilirii unei corelaŃii directe între cantitatea produsului de amplificare acumulat şi
numărul iniŃial de copii ale moleculei Ńintă (Weighardt, 2004). ParticularităŃile reacŃiei
PCR convenŃionale nu permit realizarea unei astfel de corelaŃii, principala cauză fiind
eficienŃa defectuoasă a amplificării, care nu este constantă între diferitele reacŃii, dar mai
ales între ciclurile aceleiaşi reacŃii (Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004). Această limită
a fost depăşită în 1992 de către Higuchi şi colaboratorii săi, care au iniŃiat analiza cineticii
reacŃiei de amplificare prin crearea metodei real-time PCR capabilă să detecteze produşii
de amplificare odată cu formarea şi acumularea acestora (Kubista et al., 2006; Weighardt,
2004).
Metodologia real-time PCR utilizată astăzi este o îmbunătăŃire a tehnicii iniŃiale
create de Higuchi et al. şi reprezintă cea mai performantă strategie de cuantificare a
acizilor nucleici (Cankar et al., 2006; Miraglia et al., 2004, şi Anklam et al., 2002, în
Engel et al., 2006; Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004; Alary et al., 2002). Pe lângă
precizia cuantificării, a crescut şi capacitatea de analiză, iar incidenŃa erorilor şi a
rezultatelor fals pozitive este mult redusă (Cankar et al., 2006; Alary et al., 2002).
2.9.1.2. Principiul real-time PCR
Tehnica real-time PCR utilizează primeri specifici pentru amplificarea secvenŃei
Ńintă, iar în tandem cu aceştia constructe oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de
molecule incluse în mediul de reacŃie indică acumularea produsului PCR (Burns et al.,
2004). Astfel, de-a lungul mai multor cicluri de amplificare constructele
oligonucleotidice care sunt de asemena specifice secvenŃei Ńintă vor determina
modificarea semnificativă a semnalului fluorescent (Burns et al., 2004).
-
Rezumat al tezei de doctorat
25
Fig. 3. DiferenŃele dintre analiza PCR convenŃională (a, b) şi analiza real-time PCR (c, d). Graficele (b, d) reprezintă concentraŃia produşilor PCR (axa OY) în funcŃie de conŃinutul OMG procentual al probei iniŃiale (axa OX), în punctul A. (a) Punctul A în care sunt colectate datele pentru analiză reprezintă un anumit număr de cicluri de amplificare. (b) Se observă că probele B şi C, în cazul cărora a intervenit fenomenul de plafonare, conŃin cantităŃi de ampliconi similare, cu toate că numerele iniŃiale de copii Ńintă diferă de zece ori. SituaŃia este asemănătoare în cazul probelor C şi D. Este astfel ilustrată lipsa proporŃionalităŃii dintre concentraŃia ADN-ului şi porduşii PCR. (c) Punctul A în care sunt colectate datele pentru analiză reprezintă o anumită valoare a concentraŃiei ampliconilor. (d) Se observă existenŃa unei relaŃii de liniaritate directă între produşii PCR şi concentraŃia ADN-ului în faza exponenŃială a amplificării, corelarea celor două valori fiind posibilă.
După Fagan în Ahmed (2002) modificat.
În cadrul reacŃiei PCR convenŃionale, determinarea este făcută într-un singur
punct, la sfarşitul amplificării (determinare end-point). De aceea proporŃionalitatea între
cantitatea finală de ampliconi şi cea iniŃială de copii ale secvenŃei Ńintă Ńintă este redusă,
nefiind posibilă cuantificarea (Figura 3a şi b). S-a demonstrat totuşi empiric, că această
proporŃionalitate există în timpul fazei exponenŃiale a amplificării, înainte să intervină
plafonarea. Astfel, dacă se cunoaşte numărul de cicluri necesare pentru atingerea unei
anumite concentraŃii a moleculei Ńintă, numărul iniŃial de copii ale acesteia poate fi
determinat cu precizie (Figura 3c şi d). Pentru calcularea concentraŃiei moleculei de
interes într-o probă necunoscută este necesară utilizarea unei curbe de calibrare
(denumită şi curbă standard) (Burns et al., 2004) obŃinută prin analiza unui set de
calibratori (probe standard) (Taverniers et al., 2005) reprezentat de probe al căror număr
iniŃial de copii ale secvenŃei Ńintă este cunoscut (Figura 3a şi c).
ConŃinut iniŃial
Numărul de cicluri PCR ConŃinutul iniŃial
Numărul de cicluri PCR ConŃinutul iniŃial
ConŃinut iniŃial
Pro
duşi P
CR
Pro
duşi P
CR
Pro
duşi P
CR
Cic
luri
PC
R
-
Rezumat al tezei de doctorat
26
Atât în cazul probelor standard, cât şi al celor necunoscute, monitorizarea
acumulării produşilor de reacŃie odată cu desfăşurarea amplificării se face prin
înregistrarea emisiei fluorescente a unor substanŃe speciale aflate în mediul de reacŃie.
Este evident că între semnalul fluorescent şi cantitatea de ampliconi formaŃi există o
relaŃie de proporŃionalitate directă, ambele crescând odată cu numărul de cicluri de
amplificare (Kubista et al., 2006; Grove, 1999, în Burns et al., 2004).
2.9.1.3. Materialele de referinŃă certificate
Materialele de referinŃă certificate reprezintă o categorie de probe foarte
importante în cadrul testării OMG, fiind utilizate pentru controlul calităŃii sau validarea
metodelor (IRMM, 2008; Trapmann et al., 2007; Querci et al., 2005). În ceea ce priveşte
testările cantitative, MRC-urile joacă un rol crucial, cel de calibratori ADN (Querci et al.,
2005; Taverniers et al., 2005; Burns et al., 2004) necesari construirii curbelor standard.
În această situaŃie, variabila independentă necesară construirii acestor curbe cu ajutorul
regresiei liniare, este reprezentată de valoarea pentru care MRC-urile sunt certificate.
Problematica referitoare la disponibilitatea unor MRC-uri adecvate este
recunoscută de comunitatea ştiinŃifică implicată în testarea OMG, fiind însă clară şi
imposibilitatea creării unei game de MRC-uri care să acopere toate necesităŃile (Cankar et
al., 2006).
2.9.1.4. Sisteme de detecŃie
Există două categorii de sisteme ce pot fi utilizate pentru monitorizarea
amplificării: sisteme care utilizează substanŃe de intercalare (ex. EtBr, SYBR Green I, LC
Green, BOXTO); sisteme care utilizează sonde/primeri marcaŃi cu fluorocromi (ex.
TaqMan, FRET, Molecular Beacons, Scorpions, TaqMan MGB).
În cazul optimizării corespunzătoare a reacŃiei de amplificare, sistemul de detecŃie
utilizat nu este important decât sub aspect economic, substanŃele de intercalare fiind mult
mai ieftine. De cealaltă parte, sondele/primerii marcaŃi asigură optimizarea uşoară a
-
Rezumat al tezei de doctorat
27
protocolului de amplificare, din perspectiva specificităŃii, aceste sisteme fiind îndeosebi
recomandate în cazul reacŃiilor multiplex.
2.9.2. Confirmarea absenŃei inhibitorilor PCR
Această analiză a fost efectuată pe platforma LightCycler 480 (Roche) utilizând
kitul LightCycler 480 Probes Master (Roche). Kitul conŃine un master mix universal
pentru reacŃii real-time PCR bazate pe sistemul de detecŃie TaqMan, iar primerii şi
sondele (Lectin-F/Lectin-R/Lectin-TMP pentru soia GTS 40-3-2, respectiv ZM1-R/ZM1-
F/ZM1 pentru Bt176) au fost achiziŃionate separat. Protocoalele de amplificare au fost
preluate din SR EN ISO 21570:2006. Cele două sisteme au fost create pentru detecŃia
ADN-ului specific taxonului (i.e. soia, rspectiv porumb), fiind utilizate şi în cadrul unor
protocoale de cuantificare a evenimentelor de transformare GTS 40-3-2, respectiv Bt176.
2.9.3. Cuantificarea ADN-ului MG
Prin testarea OMG cantitativă, materialul transgenic dintr-o probă nu poate fi
exprimat decât procentual, sub forma raportului dintre cantitatea de ADN MG şi cea de
ADN total corespunzător taxonului analizat (Vaïtilingom et al., 1999). Există însă câteva
aspecte referitoare la modul de exprimare a conŃinutului procentual de OMG-uri, care
trebuie menŃionate. În primul rând, prin Regulamentele 1829/2003 şi 1830/2003 a fost
stabilit pragul conŃinutului procentual de OMG-uri ce trebuie avut în vedere pentru
aplicarea etichetării, respectiv 0,9%, la nivel de ingredient. IniŃial, nu a fost însă indicată
nicio unitate de măsură pentru acest prag, implementarea prevederilor legislative
referitoare la etichetare fiind astfel problematică (Moens et al., 2005). Ieşirea din acest
impas s-a făcut odată cu introducerea Recomandării 2004/787/EC. Această defineşte
„procentul de ADN MG” ca fiind raportul dintre numărul copiilor de ADN MG şi
numărul copiilor de ADN specific taxonului Ńintă, calculat la nivel de genom haploid. Se
face de asemenea precizarea că procentul de ADN MG amintit anterior să fie utilizat
pentru exprimarea rezultatelor analizelor cantitative.
-
Rezumat al tezei de doctorat
28
Strategia de cuantificare descrisă în continuare a fost aplicată în cazul ambelor
evenimente de transformare studiate.
Pentru calculul conŃinutului MG a fost folosită metoda curbei standard,
amplificările pentru cele două secvenŃe Ńintă desfăşurându-se deci în paralel, într-un
sistem simplex.
Amplificările au fost efectuate în triplicat pentru toate tipurile de probe (Cankar et
al., 2006; Foti et al., 2006; Moens et al., 2005; Querci et al., 2005; Applied Biosystems,
2001).
În ceea ce priveşte curbele standard, au fost utilizate cinci puncte de calibrare.
Querci et al. (2005) şi Foti (2004) recomandă de asemenea amplificarea probelor
necunoscute atât nediluate, cât şi diluate (ex. 1:10), pentru a evalua efectul inhibitorilor
asupra eficienŃei de amplificare.
2.9.4. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2
2.9.4.1. Cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000
Pentru cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000 a fost utilizat kitul Biogenics
RoundUp Ready Soya QT (Biotools), dedicat acestui aparat. Protocolul de lucru a fost
elaborat pe baza considerentelor prezentate anterior şi a instrucŃiunilor producătorului.
S-a realizat amplificarea şi detecŃia unei secvenŃe de referinŃă, i.e. gena lectinei de
la soia (Le1), precum şi a unei secvenŃe specifice evenimentului de transformare GTS 40-
3-2 (soia Roundup Ready) (Biotools, 2008). Cele două reacŃii de amplificare se
desfăşoară independent în cadrul aceleiaşi analize de tip real-time PCR (reacŃii simplex),
conform parametrilor metodei curbelor standard.
Probele care constituie punctele curbei standard sunt pregătite ca diluŃii seriale ale
soluŃiei de calibrare inclusă în kit (PC SOYA).
MenŃionăm că au fost efectuate anumite modificări ale protocolului de bază
indicat de producătorul kitului. Acestea au vizat modul de pregătirea a probelor standard
şi amestecul de reacŃie.
-
Rezumat al tezei de doctorat
29
2.9.4.2. Cuantificarea pe platforma LightCycler 480
Pentru cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 a fost utilizată şi
platforma LightCycler 480 în combinaŃie cu kitul LightCycler 480 Probes Master
(Roche). Acesta include un master mix universal de tip „hot-start” optimizat pentru real-
time PCR, sistem TaqMan, la care utilizatorul adaugă elementele de amplificare şi
detecŃie ce conferă specificitate reacŃiei, respectiv primerii şi sonda TaqMan (i.e. Lecti-
F/Lectin-R/Lectin-TMP, pentru gena Le1, respectiv RSR-F/RSR-R/RSR-TMP pentru
transgenă). La realizarea amestecului de reacŃie şi a condiŃiilor de amplificare au fost
avute în vedere recomandările producătorului (Roche, 2006) şi informaŃiile din SR EN
ISO 21750:2006. Pentru construirea curbelor standard s-a utilizat soluŃia de calibrare
inclusă în kitul Biogenics RoundUp Ready Soya QT.
2.9.5. Cuantificarea evenimentului de transformare Bt176
Analizele au fost efectuate pe platforma Rotor-Gene 3000, utilizând kitul
Biogenics Bt-176 Maize QT (Biotools), dedicat acestui aparat.
Metoda presupune amplificarea şi detecŃia unei secvenŃe de referinŃă, i.e. gena
invertazei (ivr1) şi a unei secvenŃe transgenice, în scopul determinării conŃinutului relativ
de ADN specific evenimentului de transformare Bt176 (porumbul Maximizer) (Biotools,
2007). Cele două reacŃii de amplificare se desfăşoară independent în cadrul aceleiaşi
analize real-time PCR (reacŃii simplex).
Modificările protocolului de bază au fost aceleaşi ca şi în cazul kitului Biogenics
RoundUp Ready Soya QT.
2.10. EVALUAREA ŞI VALIDAREA METODELOR ANALITICE
2.10.1. Validarea şi acreditarea metodelor analitice
Furnizarea unor rezultate analitice corecte, care îndeplinesc anumite cerinŃe de
calitate, reprezintă elementul esenŃial în cadrul activităŃii de testare a produselor
-
Rezumat al tezei de doctorat
30
alimentare. De aceea, laboratorul trebuie să fie capabil să îşi desfăşoare activitatea în
conformitate cu toate standardele naŃionale sau internaŃionale în domeniu (SR EN
ISO/CEI 17025:2005), cel mai important aspect tehnic fiind reprezentat de utilizarea unor
metode analitice adecvate. Prin aceasta se înŃelege necesitatea ca laboratorul să
folosească metode validate oficial, dacă aceastea sunt disponibile, sau cel puŃin metode în
cazul cărora s-a demonstrat capacitatea producerii unor rezultate sigure şi repetabile
(Querci et al., 2005).
Alte activităŃi pe care laboratorul trebuie să le implementeze în vederea obŃinerii
unor rezultate de calitate sunt: asigurarea trasabilităŃii; efectuarea controlului intern al
calităŃii (internal quality control/IQC sau in-house quality assurance); participarea la
comparări/studii de comparare interlaboratoare (interlaboratory studies sau
collaborative/ring trials); acreditarea conform unui standard adecvat – în cazul
laboratoarelor de testare OMG este vorba de ISO/CEI 17025 (ENGL, 2008; Trapmann et
al., 2007).
Utilizarea unor metode precise şi exacte şi implementarea măsurilor de asigurare a
calităŃii vor permite laboratoarelor să furnizeze rezultate corecte, de încredere şi
comparabile la nivel internaŃional, acestea constituind premisele pentru desfăşurarea
controlului oficial al OMG-urilor comercializate (Morisset et al., 2009; Žel et al., 2008;
Thompson et al., 2002).
Validarea reprezintă confirmarea prin examinare şi furnizarea unor dovezi
obiective care demonstrează îndeplinirea cerinŃelor specifice unui anumit mod de
utilizare intenŃionată (SR EN ISO/CEI 17025:2005). A valida o metodă înseamnă a
investiga dacă scopul acesteia, reprezentat de obŃinerea unor rezultate analitice cu un
nivel acceptabil de incertitudine, este atins (Thompson et al., 2002).
Dintre instrumentele de asigurare a calităŃii în cadrul laboratoarelor de testare,
acreditarea este considerată ca fiind cel mai detaliat şi important (Querci et al., 2005).
ISO defineşte acreditarea ca fiind procesul prin care o instituŃie abilitată recunoaşte
formal faptul că laboratorul operează conform unui sistem de calitate şi este competent şi
capabil, din punct de vedere tehnic, să furnizeze rezultate valide. Aceasta nu garantează
însă corectitudinea rezultatului obŃinut, dar asigură îndeplinirea anumitor cerinŃe esenŃiale
de calitate precum şi un cadru care să permită identificarea neconformităŃilor (Querci et
-
Rezumat al tezei de doctorat
31
al., 2005). Acreditarea laboratoarelor de testare se desfăşoară în conformitate cu ISO/CEI
17025:2005, recunoscut la nivel internaŃional ca stadard esenŃial în definirea cerinŃelor
generale pentru competenŃa tehnică a laboratoarelor de testare şi calibrare (Žel et al.,
2008).
Parametri care trebuie avuŃi în vedere, în contextul validării şi acreditării
metodelor de testare, sunt (ENGL, 2008; Žel et al., 2008; Trapmann et al., 2007; SR EN
ISO 24276:2006; Žel et al., 2006; Germini et al., 2004; SR ISO 5725-1:1997):
aplicabilitatea (applicability/fitness for purpose); practicabilitatea (practicability);
specificitatea/selectivitatea (specificity/selectivity); sensibilitatea (sensibility); robusteŃea
(robustness); limita de detecŃie (limit of detection/LOD); limita de cuantificare (limit of
quantification/LOQ); nivelul critic (critical level/LC); exactitatea (accuracy); justeŃea
(trueness); raza dinamică (dymic range); repetabilitatea (repetability), sau precizia
intradeterminare (între probe diferite analizate în paralel); reproductibilitatea
(reproducibility), sau precizia interdeterminări; incertitudinea de măsurare (measurement
uncertainty/MU). Criteriile de acceptare pentru aceşti parametri sunt cele difinite de
ENGL (ENGL, 2008; Mazzara et al., 2008):
2.10.2. Incertitudinea de măsurare
Incertitudinea de măsurare (IM) este parametrul cel mai util pentru descrierea
calităŃii unei măsurători (Trapmann et al., 2007) deoarece furnizează dovezi referitoare la
aplicabilitatea metodei, iar procedura de estimare a acesteia permite identificarea
factorilor care contribuie la variaŃia rezultatelor (Burns şi Valdivia, 2007).
Trebuie reŃinut că IM este întotdeauna asociată procesului analitic, indiferent dacă
este sau nu inclusă în raportul de analiză. Mai mult, doar în cazul în care valoarea
incertitudinii extinse a fost estimată şi este specificată, rezultatul raportat poate fi utilizat
în practică fără nicio îndoială (Trapmann et al., 2007). Astfel, în cazul testării OMG
cantitative, IM trebuie scăzută din rezultatul măsurătorii, iar valoarea rezultată va fi cea
folosită pentru evaluarea conformităŃii cu legislaŃia în vigoare.
IM apare datorită unor factori a căror incidenŃă nu poate fi (întotdeauna) evitată.
Utilizarea procedurilor de lucru validate corespunzător şi implementarea măsurilor de
-
Rezumat al tezei de doctorat
32
asigurare a calităŃii vor permite însă obŃinerea unor rezultate cu un înal grad de
repetabilitate, iar bugetul de incertitudine va fi redus. Un design experimental adecvat
contribuie de asemenea la reducerea IM şi facilitează estimarea corectă a acesteia (Burns
şi Valdivia, 2007).
Cu toate că importanŃa estimării incertitudinii asociate testării OMG este evidentă,
cercetările şi aplicaŃiile în domeniu nu sunt pe deplin formate, motiv pentru care un astfel
de exerciŃiu este destul de dificil.
CAPITOLUL III. REZULTATE ŞI DISCUłII
3.1. PREGĂTIREA PROBELOR TEST
În urma experimentelor efectuate s-a constatat că mărunŃirea mecanică a probelor
este mai expeditivă şi necesită mai puŃin efort din partea operatorului, comparativ cu
mojararea manuală în azot lichid.
Un aspect important pentru obŃinerea unor concentraŃii de ADN satisfăcătoare este
reprezentat de gradul de mărunŃire al particulelor ce intră în alcătuirea probei test. În
vederea maximizării performanŃelor metodei de extracŃie, se recomandă utilizarea unei
fracŃiuni cu granulaŃie cât mai fină.
3.2. TESTAREA METODELOR DE EXTRACłIE A ADN-ULUI
În cazul kitului DNeasy Plant Mini şi al extracŃiei automatizate cu Maxwell 16
rezultatele obŃinute în final au fost total nesatisfăcătoare. În schimb, protocolul pe bază de
CTAB şi kiturile QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen), HighPure GMO Sample
Preparation (Roche) şi MagNA Pure LC DNA Isolation (Roche) au produs rezultate
mulŃumitoare. După cum era de aşteptat, extractele obŃinute din probe intens procesate au
avut caracteristici mai slabe, iar în cazul tuturor celorlalte tipuri de probe acestea au fost
considerate relativ bune.
-
Rezumat al tezei de doctorat
33
Subliniem că evaluarea spectrofotometrică şi electroforetică a extractelor are doar
caracter orientativ. Cea mai mare relevanŃă o are testarea amplificabilităŃii extractului,
principiu care, în practică, a fost inclus în mai multe tipuri de metodologii utilizate pentru
verificarea influenŃei substanŃelor inhibitoare.
Rezultatele testării comparative a metodelor de extracŃie sunt prezentate sintetic în
Figura 4.
Fig. 4. Compararea principalelor caracteristici de performanŃă ale metodelor de extracŃie.
Este dificilă găsirea unei metode de extracŃie care să satisfacă toate necesităŃile şi
să permită în orice situaŃie obŃinerea unor rezultate optime. De aceea, în funcŃie de
nevoile şi resursele laboratorului, metoda pentru care se optează poate fi diferită de la caz
la caz. În ceea ce priveşte experimentele pe care le-am desfăşurat, au fost selectate două
metode: kitul QIAamp DNA Stool Mini, pentru izolarea ADN-ului din probele pe bază
de soia; protocolul CTAB, izolarea ADN-ului din probele pe bază de porumb.
3.3. IZOLAREA ADN-ULUI ÎN CADRUL PROTOCOLULUI INTEGRAT DE
TESTARE
Rezultatele obŃinute au fost în concordanŃă cu cele reliefate în etapa anterioară. S-
a observat din nou posibilitatea aplicării cu uşurinŃă a metodelor de extracŃie în cazul
matricilor alimentare nedificile şi importanŃa testării pretabilităŃii la PCR.
S-a remarcat de asemenea corelaŃia pozitivă între gradul de mărunŃire al probei şi
extractibilitatea ADN-ului, conform indicaŃiilor din literatura de specialitate (ex.
-
Rezumat al tezei de doctorat
34
Moreano et al., 2005a, în Engel et al., 2006). Trebuie însă acordată o atenŃie deosebită
creşterii temperaturii în timpul mărunŃirii probei, fenomen ce poate determina reducerea
considerabilă a cantităŃii extrase de ADNdc (Corbisier et al., 2005). Adăugarea apei va
reduce influenŃa termică negativă.
3.4. TESTAREA OMG CALITATIVĂ
3.4.1. DetecŃia ADN-ului specific taxonului
Această analiză constituie o alternativă pentru verificarea efectului de inhibiŃie
prin testarea real-time PCR a unei serii de diluŃii a extractului (Lee et al., 2006). Suntem
însă de părere că prima strategie nu poate stabili clar măsura în care substastanŃele
inhibitoare acŃionează, fiind astfel necesar ca în analiza cantitativă ulterioară să fie
incluse două diluŃii ale extractului.
Am optat pentru această variantă din raŃionamente economice, testarea extractelor
prin real-time PCR fiind mult mai costisitoare, mai ales dacă se utilizează un sistem real-
time bazat pe principiul TaqMan.
În cazul primerilor specifici pentru genele de referinŃă, Le1 la soia, respectiv Ze1
la porumb, toate probele extrase au prezentat produsul de amplificare aşteptat. Probele de
control au prezentat de asemenea rezultatele aşteptate pentru validarea corectitudinii
analizelor. Î
3.4.2. Screeningul OMG
După cum reiese din cele prezentate în Capitolul II, prezenŃa elementelor genice
specifice evenimentelor de transformarea a fost verificată în mai multe moduri,
rezultatele obŃinute fiind aceleaşi. În cazul tuturor probelor cunoscute au fost obŃinute
rezultatele aşteptate, iar în cazul probeleor necunoscute, prezenŃa ADN-ului transgenic a
fost evidenŃiată doar în cazul a patru probe de seminŃe de soia.
-
Rezumat al tezei de doctorat
35
3.4.3. Identificarea evenimentelor de transformare
În cazul ambelor evenimente de transformare, rezultatele obŃinute au fost în
concordanŃă cu cele din etapa anterioară, confirmând aplicabilitatea protocoalelor testate.
3.4.4. Considerente generale pentru testarea calitativă
Rezultatele obŃinute prin testarea calitativă pentru soia MG nu sunt surprinzătoare.
În ceea ce priveşte probele cunoscute şi cele de control, acestea au generat rezultatele
aşteptate, confirmând astfel că metodele utilizate fucŃionează corespunzător şi au fost
aplicate corect.
În cazul probelor neprocesate de soia (boabe) este încă destul de probabilă
existenŃa multor surse, reprezentate în special de producători mici, care deŃin, intenŃionat
sau nu, material MG, cu toate că utilizarea acestuia în cultură este interzisă. De aceea
obŃinerea unor rezultate pozitive pentru anumite probe era de aşteptat.
În ceea ce priveşte produsele procesate, anumite rezultate neoficiale au afirmat
prezenŃa soiei MG, deşi în cadrul laboratorului nostru nu am putut confirma acest lucru.
După cum s-a menŃionat anterior, în cazul probelor pe bază de porumb, prezenŃa
ADN-ul transgenic în probele necunoscute era improbabilă datorită faptului că acest
eveniment de transformare nu mai este autorizat pt comercializare în UE. Celelalte probe
s-au comportat conform aşteptărilor.
Teoretic, lipsa produşilor PCR specifici evenimentelor de transformare analizate
poate avea mai multe cauze: în primul rând, lipsa materialului MG din proba analizată;
prezenŃa materialului MG într-o cantitate foarte mică; degradarea ADN-ului în timpul
procesării, astfel încât analiza nu mai poate fi efectuată.
Reamintim de asemnea că rezultatele obŃinute în cazul fiecărei probe au coincis
de-a lungul tuturor etapelor testării calitative.
Deoarece a fost testat un număr mare de primeri, în vederea eficientizării
procesului, s-a utilizat un singur master mix şi un singur program de amplificare,
conceput pe baza celor descrise în lucrările de specialitate. Avînd în vedere rezultatele
obŃinute, putem afirma că niciuna dintre metodele testate nu este lipsită de robusteŃe.
-
Rezumat al tezei de doctorat
36
Totuşi, în cazul în care se optează pentru implementarea unui anumit set de primeri, este
recomandată utilizarea protocolului original în vederea maximizării performanŃelor
metodei.
În Figura 5 sunt prezentate câteva dintre rezultatele obŃinute în această etapă.
(a)
(b)
(c)
Fig. 5. Rezultate ale testării PCR calitative. Probe: S1 şi S2, seminŃe de soia; R20, MRC soia RR; B1 şi B50, MRC porumb Bt176; E, probă de control pentru mediul de lucru; B, proba neutră de control a extracŃiei; C+, probă pozitivă de control pentru ADN-ul Ńintă; C-, probă negativă de control pentru ADN-ul Ńintă; NTC, probă de control a reactivilor; M, marker ADN. (a) DetecŃia genei lectinei de la soia (Le1) cu primerii Lektin1/Lektin6. (b) Screening OMG a probelor din soia utilizând primerii p35S-cf3/p35S-cr4, specifici promotorului P-35S. (c) DetecŃia genei Cry1A(b) introdusă în Bt176, utilizând primerii CRYIA1/CRYIA2.
420 pb
B1 B50 M E B C- NTC
500 pb
100 pb
S2 R20 M E B C- NTC
400 pb
S1 S2 M E B C+ C- NTC
318 pb
123 pb
-
Rezumat al tezei de doctorat
37
3.5. TESTAREA OMG CANTITATIVĂ
3.5.1. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pe platforma Rotor-
Gene 3000
În cadrul acestui experiment au fost cuantificate MRC-urile ce conŃin soia MG,
precum şi probele sub formă de boabe, identificate pozitiv în etapa anterioară. Rezultatele
sunt prezentate în Tabelul 1.
Modul de prelucrare a datelor a avut la bază studiile publicate de Foti et al.
(2006), Huang şi Pan (2005) şi Vaïtilingom et al. (1999). Datele avute la dispoziŃie nu au
permis şi evaluarea reproductibilităŃii sau a IM.
Conform criteriilor enunŃate de ENGL, atât biasul, cât şi RSDr, nu trebuie să
depăşească ±25% de-a lungul întregii raze dinamice (ENGL, 2008; Wiseman, 2002, în
Burns şi Valdivia, 2007). Subliniem faptul că datele utilizate pentru calculele anterioare
nu acoperă întreaga rază dinamică şi sunt bazate pe un număr redus de măsurători. Cu
toate acestea considerăm că rezultatele sunt promiŃătoare.
Tabelul 1.
Evaluarea justeŃei şi a repetabilităŃii determinărilor cantitative la soia Roundup Ready
Analiza rt-PCR şi prelucrarea datelor Rezultate Probă R102 R202 R502 S13
1 1,02 1,89 5,63 57,93 2 0,97 2,09 4,55 64,21 3 1,17 2,21 5,43 63,14
Determinare
4 - - 5,04 - ConŃinut OMG teoretic (%) 1 2 5 - Media 1,053 2,063 5,163 61,67 Eroare (bias) (%) 5,333 1,666 3,25 - Abaterea standard a repetabilităŃii (SDr) 0,104 0,162 0,476 3,36 Abaterea std. rel. a repetabilităŃii (RSDr)
1 9,881% 7,834% 9,224% 5,44% 1 Se obŃine ca raport între abaterea standard şi medie. 2 MRC pentru soia MG. ConŃinutul teoretic de soia MG este de 1% (R10), 2% (R20), respectiv 5% (R50). 3 Probă de soia boabe.
-
Rezumat al tezei de doctorat
38
În cazul celorlate probe (i.e. două MRC-uri şi trei probe de soia boabe identificate
pozitiv în etapa de analiză calitativă) a fost efectuată o singură determinare cantitativă a
materialului MG derivat din soia GTS 40-3-3. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3.
3.5.2. Cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pe platforma
LightCycler 480
Scopul acestei etape a fost utilizarea unui sistem de cuantificare diferit de cel
bazat pe instrumentul Rotor-Gene 3000. În acest mod s-a dorit evaluarea influenŃei
sistemului de cuantificare (instrument + software + master mix) asupra rezultatelor
analitice.
Rezultatele nu fost însă cele aşteptate. Amplificarea secvenŃei transgenice Ńintă în
soluŃia de calibrare PC SOYA a fost problematică, nereuşindu-se optimizarea acestui
protocol de lucru astfel încât să fie posibilă construirea curbei standard aferentă
sistemului transgenic şi cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2. O
posibilă explicaŃie este omologia imperfectă dintre primeri/sonadă şi siturile de alipire de
pe secvenŃa inclusă în soluŃia de calibrare. SituaŃia este însă mai complexă deoarece alura
curbelor de amplificare indică mai degrabă prezenŃa fenomenului de inhibiŃie sau
pregătirea incorectă a probelor standard.
Sistemul transgenic de detecŃie real-time PCR a funcŃionat însă corespunzător în
cazul extractelor ADN obŃinute din MRC-uri. Deşi nu s-a efectuat cuantificarea, datele
obŃinute în cazul mai multor serii de diluŃii indică posibilitatea folosirii acestui protocol
în scopul dorit.
ReacŃia corespunzătoare sistemului de referinŃă a funcŃionat de asemenea conform
aşteptărilor, atât în cazul calibratorului, cât şi a celorlalte probe, acest protocol fiind
ulterior utilizat pentru evaluarea influenŃei inhibitorilor în extractele ADN .
3.5.3. Cuantificarea evenimentului de transformare Bt176
În cadrul acestui experiment, probele cuantificate au fost reprezentate de MRC-
uri, o parte din rezultatele obŃinute fiind prezentate în Tabelul 2. Modul de prelucrare a
-
Rezumat al tezei de doctorat
39
datelor a avut la bază studiile publicate de Foti et al. (2006), Huang şi Pan (2005) şi
Vaïtilingom et al. (1999). Datele avute la dispoziŃie nu au permis şi evaluarea
reproductibilităŃii sau a IM.
Tabelul 2.
Evaluarea justeŃei şi a repetabilităŃii determinărilor cantitative la porumbul Bt176
Analiza rt-PCR şi prelucrarea datelor Rezultate Probă B102 B202 B502
1 0,90 1,91 5,82 2 1,21 2,11 5,15 Determinare 3 1,09 2,45 5,32
ConŃinut OMG teoretic (%) 1 2 5 Media 1,07 2,16 5,43 Eroare (bias) (%) 6,67 7,83 8,6 Abaterea standard a repetabilităŃii (SDr) 0,156 0,273 0,348 Abaterea std. rel. a repetabilităŃii (RSDr)
1 14,654 12,659 6,414 1 Se obŃine ca raport între abaterea standard şi medie. 2 MRC pentru porumbul MG. ConŃinutul teoretic de porumb MG este de 1% (B10), 2% (B20), respectiv 5% (B50).
Conform criteriilor enunŃate de ENGL