test diagnÓsticos “in vitro” de reacciones de ... · test diagnÓsticos “in vitro” de...

Dra. Dorimar Brugaletta Matheus 1

TEST DIAGNÓSTICOS “IN VITRO” DE REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA

Dra Dorimar Brugaletta MatheusDra. Dorimar Brugaletta MatheusResidente Alergología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca

Murcia (España)

Dra Brugaletta Matheus Diciembre 2008 www.alergomurcia.com

MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD



L I E f d bi t 1967

Generalidades

La IgE fue descubierta en 1967.

En condiciones normales esta inmunoglobulina se encuentra presente en suero en concentraciones muy bajas (del orden del 0,004 mg/100 ml).

Sólo los inmunoensayos enzimáticos o los radioinmunoensayos, técnicas con alta sensibilidad, son capaces de cuantificar esta inmunoglobulina.


La tecnología aplicada varía mucho de unos métodos a otros, dependiendo de las características de los extractos alergénicos, tipo de fijación al soporte sólido, g , p j p ,afinidad de los anticuerpos anti-IgE utilizados y criterio de positividad de cada fabricante.

Además, influyen las variaciones inter e intra ensayo, normales en cualquier técnica diagnóstica de laboratorio Todos estos factores hacen necesaria lalaboratorio. Todos estos factores hacen necesaria la validación inicial de estos ensayos para determinar su precisión y repetitividad.



Diagnóstico inmunológico in vitro

CUANTIFICACIÓN DE IgE:– ISOTÓPICAS– ELISA– FLUORESCENCIA– QUIMIOLUMINISCENCIA

TEST DE LIBERACIÓN DE HISTAMINA.DEGRANULACIÓN ÓPTICA DE BASÓFILOS.MICROARRAY.


Inmunoensayo:reacción Ag - Ac

Pilar del diagnóstico “in vitro” en el laboratoriode alergia: detección de IgE específica.



INMUNOENSAYOS MARCADOSGeneralidades:

Inmunoensayos en los que el Ag o Ac están marcadosRápidos menos de 24 hRápidos, menos de 24 h.Alta sensibilidad, de microgramos a nanogramos.Automatizables, aplicaciones.Clasificación: Homogéneos, Heterogéneas.

Competitivos y no competitivos.Tipos

» RIA» RIA » EIA » FIA» QIA


RadioinmunoensayosRAST

Inmunoensayo marcaje radiactivo- Radiación beta: Tritio, carbono 14, etc. - Radiación gamma: Iodo 125, Iodo 135, etc.

Ensayos esencialmente competitivosEnsayos esencialmente competitivos– Ensayos secuénciales y en equilibrio.



FluoroinmunoensayoDeterminación de proteínas, drogas y

hhormonas.Ac se une covalentemente a una molécula fluorescente.

Método directo:Ac marcado directamente proporcional al Ag presente– Ac marcado directamente proporcional al Ag presente

Método indirecto:– Menor Ac fluorescente fijado, mayor será el Ag presente


Enzimoinmunoensayos

Ensa o marcado por na en imaEnsayo marcado por una enzima.Heterogéneos. Paso intermedio o separación:

- Competitivo. Ag Marcado- No competitivo (Sándwich). Ac marcado- Indirecto. Medición niveles de Ac

Homogéneos. No paso intermedioBajo coste, alto nivel de pureza y interferencia



METODOLOGIA

Inmuno CAP Advia Centaur Inmunolite 2000


Inmuno CAP Fluoro - InmunoanalisisAlta capacidad de fijación del alergeno sobre una matriz.

Gran versatilidad, panel más amplio de alergenos (> 450), y permite un cribado múltiple de alergenos (Phadiatop, que combina los neumoalergenos, o los alimentos más frecuentes), e investigar aquellos pacientes con resultado positivo (> 0.35 kU/L).

Diseño : se trata de un Fluoroenzimoinmunoensayo clásico de tipo sándwich, alergeno fijado a fase sólida (Matriz) y a la anti –IgE marcada con enzima beta galactosidasa, liberando el producto fluorescente, la 4-metil- umbeliferona.

Curva de calibración obtenida con 6 calibradores de IgE total.Tiempo de realización del ensayo : 2.5 horas.



1. El alergeno covalentemente unido al uniCAP, reacciona con la IgE especifica del paciente

Inmuno CAP

2. Lavado de IgE especificas no ligadas y se añade la enzima marcada con AC IgE para formar el complejo

3. Incubación: el complejo enzima AC-IgE no ligado es lavado y el complejo ligado es incubado en la solución de desarrollo

4. Después de para la reacción se mide el fluido fluorescente, se compara con el suero de referencia


Inconvenientes Uni CAP

Al ser la IgE extraordinariamente citofílica, sus resultados serán inferiores a los de las PC. Es un error conceptual pedir UniCAP porque la PC haya sido negativa.Los fármacos suelen actuar como haptenos.PC negativa o dudosa, difícilmente de encontrará IgE específica en suero.específica en suero.Bastante caro (sólo se deben realizar para un número limitado de alergenos).



Sistema AlaSTAT Immulite 2000

Incorpora la tecnología de alergenos en fase líquida, están fijados a polímeros solubles.p

La unión a la fase sólida a través de la elevada afinidad de la biotina (fijada también al polímero que porta al alergeno) por la estreptavidina (que recubre la bola de poliestireno).

Tecnología de lavado patentada por centrifugación a 10.000 rpm : mínimas uniones inespecíficas debido a la óptima separación entre las fases ligada y no ligada.

Diseño : Se trata de un enzimo-quimioinmunoanálisis.Velocidad de trabajo del analizador : 100 determinaciones/hora, con un tiempo para el primer resultado de 65 minutos.


El alergeno biotinilado se une a las bolas recubiertas con Estreptavidina mediante la Botina

Sistema AlaSTAT : INMUNOLITE 2000

Bola cubierta de estreptavidina se incuban con el alergeno biotilado y el suero del paciente

El AC IgE (conjugado ) se une a la IgE especifica del suero y El sustrato cataliza la reacción de quimioluminiscencia



Inconvenientes INMUNOLITE

Al ser la IgE extraordinariamente citofílica, sus lt d á i f i l d l PC Eresultados serán inferiores a los de las PC. Es un error

conceptual pedirlo porque la PC haya sido negativa.

Los fármacos suelen actuar como haptenos.

PC negativa o dudosa, difícilmente de encontrará IgEPC negativa o dudosa, difícilmente de encontrará IgE específica en suero.Bastante caro (sólo se deben realizar para unnúmero limitado de alergenos).


Sistema ADVIA-Centaur

Diseño de sándwich invertido : Es la Anti-IgE la que está fijada a la fase sólida (partículas paramagnéticas) capturando sólo la totalidad de IgE que presenta el espécimen del paciente.g q p p p

Es el alergeno el que va a portar el marcaje luminiscente, pero no de forma directa, sino a través de la interacción biotinaestreptavidina.

El ester de acridinio sometido a un cambio de pH emite luminiscencia.

Velocidad de trabajo del analizador : 120 determinaciones/hora. (1º resultado de 47 minutos).



Sistema

ADVIA CETAUR

Diseño Sándwich Invertido:La Anti IgE es la que se fija a la fase sólida y el que lleva en marcaje es el alergeno, pero no de forma directa


Valoración de IgE Especifica

Clase kU/l Niveles de AC0 <0 35 Ausente o Indetectable0 <0,35 Ausente o Indetectable

1 0,35-0,7 Bajo

2 0,7-3,5 Moderado

3 3,5-17,5 Alto

4 17 5-50 Elevado4 17,5 50 Elevado

5 50-100 Elevado

6 >100 Muy elevado



MICROARRAYS

El objetivo de esta nueva tecnología es pasar del diagnóstico basado en extractos alergénicos (formados por conglomerados de moléculas

alergénicas y no alergénicas) al “diagnóstico por componentes”, es decir, establecer exactamente la

molécula alergénica que es la causante de la reacción.Dra Brugaletta Matheus Diciembre 2008 www.alergomurcia.com

MICROARRAYS

La técnica consiste en un microchip de unos de unos 5x5 mm en cuya superficie quedan fijados los 85 componentes moleculares. El suero

d l i t t b ñ di h fi i it l fij ió d ldel paciente, tras bañar dicha superficie, permite la fijación de los anticuerpos, con lo que se consigue posteriormente detectar los

anticuerpos IgE específicos frente a dichos componentes. La técnica nos revela con precisión el perfil de sensibilización del

paciente.



VentajasAmplio abanico de agentes alergénicos que analiza en tan sólo unas horastan sólo unas horas.Realiza el análisis a un nivel molecular, de mayor precisión que los análisis convencionales que se efectúan a partir de fuentes alergénicas completas.Evitar al paciente las molestias habituales de las pruebas cutáneas, frente a un número elevado de alergenos.Reducción de los costes, ya que permite analizar 85 compuestos en una única prueba.


Conclusiones:

La determinación de IgE específica en elLa determinación de IgE específica en el diagnóstico alergológico es una técnica útil

aunque no definitiva, cuyos resultados deben ser interpretados con cautela y siempre como

ayuda a la clínica que presenta el paciente, pero nunca debe considerarse de forma aislada para pestablecer un diagnóstico final de enfermedad

alérgica



Circunstancias en las que puede ser necesario utilizar de forma alternativa o complementaria algún método

in vitro para detectar IgE específica:

- Pacientes con medicaciones que influyan sobre el resultado de las pruebas cutáneas y que no puedan ser suspendidas.

- Alteraciones cutáneas extensas, como la dermatitis atópica, que impidan la realización o valoración de las pruebas.

- Pacientes con sensibilización anafiláctica a un alergeno en los quePacientes con sensibilización anafiláctica a un alergeno en los que la realización de pruebas cutáneas pueda ser un riesgo.

- Ayuda en el diseño y control de una inmunoterapia más adecuada para cada paciente y Protocolos de investigación.


VENTAJAS DESVENTAJAS

Comparativa prick test-in vitro

VENTAJAS DESVENTAJAS

IgE específica en suero

- Sin riesgos.- No interferida por medicaciones.- Valoración cuantitativa.

Resultados demoradosLa negatividad no excluye

sensibilizaciónPrecio

- Mínimamente invasiva.Resultados

Interferidos con medicamentos

Prick test- Resultados inmediatos.- Resultados visibles para el paciente.

medicamentos.Posibles

contraindicacionesPosibles falsos positivosCierto riesgo en ocasiones

Valoración cualitativa Dra Brugaletta Matheus Diciembre 2008 www.alergomurcia.com

test diagnÓsticos “in vitro” de reacciones de ... · test diagnÓsticos “in vitro” de...

Documents