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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR (I)

PAPEL DE RIAM EN LA INVASIÓN Y EN

LA DINÁMICA DE LAS ADHESIONES

FOCALES DE CÉLULAS DE MELANOMA

TESIS DOCTORAL

PABLO HERNÁNDEZ VARAS

2011

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR (I)

PAPEL DE RIAM EN LA INVASIÓN Y EN

LA DINÁMICA DE LAS ADHESIONES

FOCALES DE CÉLULAS DE MELANOMA

Este trabajo de tesis ha sido realizado por Pablo Hernández Varas para optar al

grado de Doctor, en el Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid (CSIC), bajo

la dirección del Dr. Joaquín Teixidó Calvo.

Fdo. Dr. Joaquín Teixidó Calvo.

El verdadero camino pasa por una cuerda

que no está tensada en las alturas, sino

apenas por arriba del suelo. Más pareciera

estar destinada a hacernos tropezar que a

ser recorrida.

Franz Kafka, Aforismos de Zürau, 1917

A mi madre y a mi padre

AGRADECIMIENTOS

Muchas personas han contribuido a esta tesis, algunas echándome generosamente una mano en el trabajo del día a día y otras cuya valiosa labor ha sido la de apoyarme manteniendo mi ánimo alto en los momentos difíciles. Espero reconocer en estas líneas la contribución del mayor número de personas implicadas de una u otra forma en este largo viaje. En primer lugar quiero agradecer a Joaquín, mi director de tesis, el haberme acogido durante todos estos años en el laboratorio, enseñándome a discutir críticamente. Gracias por haberme dirigido con paciencia y dedicación. A continuación quiero dar las gracias a todos mis compañeros del labo, pasados y presentes, porque me habéis hecho las cosas fáciles. Ha sido un placer trabajar codo con codo con vosotros, disfrutando todo este tiempo. Sois de lo mejor que me llevo. Quiero agradecer a Rubén el haberme enseñado (biología y otras ciencias), sin él no hubiera podido llegar hasta aquí. A Georgina quiero darle las gracias por haber compartido tanto trabajo conmigo pacientemente, alegrándome los días con su forma de ser. A David, mi vecino, quisiera darle gracias por escucharme en los malos momentos, y por compartir mi punto de vista en muchos aspectos de la vida, y a Anita, porque tras esa fachada llena de ángulos se esconde una niña tierna, siempre dispuesta a ayudar. A Nohemí quisiera agradecer su dedicación diaria a la preparación de geles (jeje), y sobre todo su paciencia, haciendo que las cosas parezcan más sencillas; a Sole, nuestra más reciente incorporación, por darle un toque amable al día a día; a Ana Serrano, por hacerme reír tanto; también a Jan (JW), nuestro holandés errante, y a Martuqui. Y a Isabel, porque aunque hace tiempo que nos dejó, se hizo un hueco tan grande que aún la echo de menos. Quiero tener unas palabras de agradecimiento para aquéllos con los que empecé esta aventura. Con ellos hice los cursos de doctorado, y disfruté de las cañas de después… qué tiempos aquéllos. Quiero agradecer en primer lugar a Evita, por ser mi desahogo en muchas ocasiones, a Jesusillo, a Sarita, a Rubencico, a Cris y, sobre todo, a Roci, que a pesar de estar tan lejos siempre ha estado tan cerca de mí. También me gustaría decir a todos con los que me cruzo diariamente en el pasillo que sois geniales. Sois uno de los motivos por los que me levanto con ganas de ir a trabajar cada día. Y por ello os quiero dar las gracias. A Estefi me gustaría decirle que es el mayor tesoro que me llevo de estos cuatro años y medio. Te has ganado un huequito para siempre en mi vida, sinceramente gracias por estar ahí. A Elvirita, Merce e Irene, por las tantas visitas que he hecho al labo de Geli, donde siempre han tenido palabras de cariño (y reactivos gratis) para mí. A Mariangels, gracias por

0

contagiarme tu alegría de vivir. Gemita, Sara y Patri, sois unos soles. A otros miembros de esta gran familia como David, Juande y Sergio, como Tamara, Agustín y Sheila, y a los que ya no están, gracias. En siguiente lugar quiero agradecer al personal de los servicios del centro la labor que realizan. Y en especial a Pedro Lastres, de citometría, por ayudarme con todos mis ensayos, a Maite y Óscar de confocal, y también a la gente del servicio de limpieza. Quiero agradecer a los doctores Esther Lafuente, Carlos Cabañas, Paloma Sánchez Mateos, Rafael Samaniego, Vasiliki Boussiotis, Marisol Soengas, Venidle Jiménez, Ronen Alon, Francisco Sánchez‐Madrid, José Mª Rojas, Xosé Bustelo, Guido Tarone, Alicia García Arroyo, Andrés Hidalgo, Rick Horwitz, Ángeles García Pardo y José Luis Rodríguez Fernández su contribución a este trabajo. Gracias por todos los reactivos facilitados y por sus útiles comentarios científicos y sugerencias. Sin su contribución nuestro trabajo no habría sido posible. En un lugar muy destacado para mí se encuentra el laboratorio de Staffan Strömblad y su gente (Andrew, John Lock, Tânia, Steve, Helene, Hamdah, Sara, Tina, Miao y los demás), gracias por acogerme, descubrirme un nuevo país y hacerme sentir como en casa. Mis amigos merecen una mención especial, porque aunque pase el tiempo sé que puedo contar con ellos, ya estén cerca o lejos. Quiero darles las gracias por su disponibilidad en los malos momentos, sus palabras de cariño y de aliento. Gracias Ire, gracias Clara. Quiero agradecer a Asun, Cano, Rafa, Carmen y Gonzalo todo el tiempo compartido no sólo estos años, sino todo lo que hemos vivido juntos desde hace tanto. Chicos, sois los mejores.

Por último, y más importante, quiero dar las gracias a mi familia. Mil gracias por vuestro apoyo incondicional aunque no siempre entendáis lo que hago. Por estar conmigo cada día. Por aseguraros de que cuido bien de las células. Por aguantar los cambios de humor y los malos momentos. Por disfrutar de los buenos. Por quererme siempre, gracias de corazón. Gracias a mi hermano, mi verdadero compañero de viaje en la vida. Gracias a mi madre y a mi padre, por sentiros orgullosos de mí en cada paso que doy. Gracias a mi tía y mis abuelas, por su preocupación constante. Gracias.

Gracias a todos.

i

ÍNDICE

ABREVIATURAS……………………………………………………………………………………………………..v RESUMEN……….…………………………………………………………………………………………………… .ix ABSTRACT…………………………………………………………………………………………………………… .xi INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………… 13 El melanoma maligno………………………………………………………………………………… 15 Las quimioquinas y sus receptores……………………………………………………………… 17 La quimioquina CXCL12 y su receptor CXCR4………………………………… 19 Las integrinas…………………………………………………………………………………………….. 22 Las integrinas β1 y sus ligandos……………………………………………………… 25 Señalización intracelular outside‐in dependiente de integrinas………………..… 27 Las MAP‐quinasas…………………………………………………………………………. 27 Las MAPKs Erk1 y Erk2………………………………………………………………….. 28 La fosfatidil‐inositol‐3‐quinasa (PI3‐K) y sus efectores……………………31 La migración celular: Las Rho GTPasas y la dinámica de las adhesiones focales……………………………………………………………………….. 32 Las GTPasas monoméricas de pequeño tamaño…………………………… 32 La migración celular……………………………………………………………………….33 Las GTPasas de la familia Rho y su implicación en la migración celular…………………………………………………………. 36 Los GEF de las GTPasas Rho; Familia Vav………………………………………. 39 El ensamblaje y el desensamblaje de las adhesiones focales………… 41 La paxilina………………………………………………….………………………………....43 La quinasa de las adhesiones focales FAK……………………………………… 46 Talina……………………………………………………………………………………………. 48 Las GTPasas de la subfamilia Ras y sus efectores………………………………………..50 Rap1, una GTPasa de la subfamilia Ras…………………………………………. 50 RIAM, un efector de Rap1…………………………………………………………….. 52 OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………………….. 55 MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………………………………….. 59 Líneas celulares empleadas……………………………………………………………………..... 61 Anticuerpos……………………………………………………………………………………………….. 61 Reactivos………………………………………………………………………………………………….… 61 Vectores de expresión y siRNAs………………………………………………………………….. 63 Transfección………………………………………………………………………………………………. 66 Western‐blotting……………………………………………………………………………………….. 67

ii

Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT‐PCR)…………………………………………………………….. 69 Ensayo de invasión celular a través de matrigel…………………………………………. 70 Ensayos de adhesión celular………………………………………………………………………. 70 Citometría de flujo……………………………………………………………………………………… 71 Ensayo de cierre de heridas……………………………………………………………………….. 72 Ensayos de quimiotaxis……………………………………………………………………………... 72 Zimografía………………………………………………………………………………………………….73 Microscopía confocal………………………………………………………………………………….73 Time‐Lapse microscopy……………………………………...………………………………………74 Experimentos de FRAP (Fluorescente Recovery

After Photobleaching)…………………………………………………………………… 75 Cultivos en geles de colágeno tipo I……………………………………………………………. 76 Ensayos de tumorigénesis y metástasis in vivo…………………………………………… 77 Ensayos de proliferación celular MTT…………………………………………………………. 78 Ensayos de citotoxicidad……………………………………………………………………………. 78 Ensayos de citotoxicidad……………………………………………………………………………. 78 Ensayos de formación de colonias en Soft‐Agar…………………………………….…… 79 Estudios estadísticos………………………………………………………………………………….. 79 RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………. 81 I.‐ Determinación del papel del eje de señalización Rap1‐RIAM

en la invasión de células de melanoma. Caracterización de los mecanismos moleculares implicados……………………………………………. 83 Rap1 y RIAM son requeridas para la invasión de células de

melanoma en respuesta a CXCL12…………..……………………………………. 83 La direccionalidad y la persistencia de la migración se encuentran

afectadas en células BLM silenciadas para RIAM………………………….. 95 La activación de Vav2, RhoA y MLC está inhibida en células

BLM silenciadas para RIAM…………………………………………………………… 97 La asociación de talina y β1 se encuentra reducida en células RIAM KD………………………………………………………………..……….…101 Las células deficientes para RIAM tienen alterada la

adhesión mediada por integrinas β1……………………………………………..103 Las células de melanoma silenciadas para RIAM tienen

una activación deficiente de Erk1/2 y de Akt…………………………………106 Crecimiento y propiedades metastáticos de las células

de melanoma silenciadas para RIAM…………………………………………….109 Las células de melanoma silenciadas para RIAM tienen inhibida

su capacidad de proliferación in vitro……………..……………………………112 Las células en las que se ha silenciado la expresión de

RIAM son más propensas a la apoptosis tanto en ambientres bidimensionales como tridimensionales…………………113

iii

II.‐ Regulación de la dinámica de las adhesiones focales por RIAM. Mecanismos bioquímicos implicados………………………………………………………118 Las células de melanoma silenciadas para RIAM muestran

alteraciones en el número y la distribución de las adhesiones focales………………………………………………………………………..118

Las células de melanoma silenciadas para RIAM tienen un desensamblaje deficiente de las adhesiones focales……………………..124

RIAM es necesario para la correcta asociación de talina‐FAK y FAK‐paxilina en células de melanoma……………………………………………126

El silenciamiento de RIAM conduce a un incremento de la fosforilación de FAK y paxilina en residuos de tirosina…………………..129

El defecto en la activación de la MAP‐quinasa Erk1/2 en las células deficientes para RIAM es responsable del desensamblaje deficiente de sus adhesiones focales……………………………………………..136

La expresión de formas activas de Rho se traduce en una recuperación parcial del recambio de las adhesiones focales en células BLM silenciadas para RIAM………………………………144

DISCUSIÓN…………………..……………………………………………………………………………………..147 CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………………....... 159 BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………....163 ANEXO Riam Controls invasion and cell growth of melanoma cells......................189

v

ABREVIATURAS

ADN Ácido desoxirribonucleico.

ANOVA Analysis of variance, análisis de la varianza.

ARN Ácido ribonucleico

ARNm ARN mensajero.

BCECF‐AM 2’,7’‐bis (carboxyethyl)‐5(6’)‐carboxyfluorescein‐acetoxymethyl ester,

2’,7’‐bis (carboxietil)‐5(6’)‐carboxifluoresceinato de acetoximetil

ester.

BSA Bovine serum albumin, albúmina de suero bovino.

Col‐I Colágeno tipo I.

DAG Diacilglicerol.

DAPI 4’6‐diamidino‐2‐fenylindole, 4’6‐diamidino‐2‐fenilindol.

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium, medio de Eagle modificado por

Dulbecco.

ECM Extracellular matrix, matriz extracelular.

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid, ácido etileno‐diamino‐tetraacético.

EGF Epidermal growth factor, factor de crecimiento epidérmico.

EGFR EGF receptor, receptor de EGF.

EMT Epitelium to mesenchyma transition, transición epitelio‐mesénquima.

Erk1/2 Extracelular signal‐regulated kinase, quinasa regulada por señales

extracelulares.

FAK Focal adhesion kinase, quinasa de adhesión focal.

FBS Foetal bovine serum, suero bovino fetal.

FGF Fibroblast growth factor, factor de crecimiento de fibroblastos.

FGFR FGF receptor, receptor de FGF.

FITC Fluorescein isothiocyanate, isotiocianato de fluoresceína.

FN Fibronectina.

vi

FRAP Fluorescente recovery alter photobleaching, recupreación de la

fluorescencia tras su extinción.

GAP GTPase‐activating protein, proteína activadora de actividad GTPasa.

GAPDH Glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase, gliceraldehído‐3‐

fosfato deshidrogenasa.

GDI GDP‐dissociation inhibitor, inhibidor de disociación de GDP.

GDP Guanine 5’‐diphosphate, guanina 5’‐difosfato.

GEF Guanine nucleotide exchange factor, factor intercambiador de

nucleótidos de guanina.

GFP Green fluorescent protein, proteína verde fluorescente.

GPCR G‐protein coupled receptor, receptor acoplado a proteínas G

heterotriméricas.

GST Gluthation sulphur transferase, transferasa de azufre a glutation.

GTP Guanine 5’‐triphosphate, guanina 5’‐trifosfato.

HRP Horseradish peroxidase, peroxidasa de rábano.

IGF Insulin‐like growth factor, factor de crecimiento insulínico.

IGFR IGF receptor, receptor de IGF.

ILK Integrin‐linked kinase, kinasa asociada a integrinas.

IRM Interference of the reflection microscopy, microscopía basada en la

interferencia de la reflexión.

Jak Janus kinase, quinasa janus.

JNK c‐Jun N‐terminal kinase, quinasa N‐terminal de c‐Jun.

KD Knock‐down, deplecionado.

MAPK Mitogen‐activated protein kinase, quinasa de proteínas activadas por

mitógenos.

MLC Myosine II light chains, cadenas ligeras de la miosina II.

MRL Mig10/RIAM/Lamellipodin family, familia Mig10/RIAM/Lamelipodina.

MTOC Microtubules organizing centre, centro organizador de los

microtúbulos.

NF‐κB Nuclear factor‐κB, factor nuclear κB.

vii

PAGE Poliacrylamide gel electrophoresis, electroforesis en geles de

poliacrilamida.

PBS Phosphate buffered saline, solución salina tamponada con fosfatos.

PDGF Platelet‐derived growth factor, factor de crecimiento derivado de

plaquetas.

PH Pleckstrin‐homology domain, dominio de homología con pleckstrina.

PI3‐K Phosphatidylinositol‐3‐kinase, quinasa fosfatidilinositol‐3.

PIP2 Phosphatidylinositol 4,5‐biphosphate, fosfatidilinositol 4,5‐bifosfato.

PIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5‐triphosphate, fosfatidilinositol 3,4,5‐

trifosfato.

PKA AMPc‐dependent protein‐kinase, proteín‐quinasa dependiente de

AMPc.

PKC Calcium‐dependent protein‐kinase, proteín‐quinasa dependiente de

calcio.

PMA Patch morphology analisys software, programa informático de

análisis de la morfología de los elementos.

PR Proline‐rich regions, regiones ricas en prolina.

PVDF Polyvinylidene difluoride, difluoruro de polivinilideno.

RA Ras association domain, dominio de asociación con Ras.

ROCK Rho‐kinase, Rho‐quinasa.

RTK Tyrosine‐kinase receptor, receptor tirosín‐quinasa.

RT‐PCR Reverse transcription‐polimerase chain reaction, (ensayo de)

transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa.

SCID Severe combined immunodeficiency, inmunodeficiencia combinada

severa.

SDF‐1 Stromal‐cell derived factor‐1, factor derivado de células estromales‐1.

SDS Sodium dodecyl sulfate, dodecilsulfato de sodio.

SH2 Src‐homology domain 2, dominio 2 de homología con Src.

SH3 Src‐homology domain 3, dominio 3 de homología con Src.

shRNA Interfering short‐hairpin RNA, horquilla de ARN interferente.

viii

siRNA Small interfering ribonucleic acid, oligoribonucleótido de

interferencia.

Src Sarcoma tyrosine‐kinase, tirosín‐quinasa sarcoma.

Stat Signaling transducer and activator of transcription, transductor de

señal y activador de transcripción.

TCR T‐cell receptor, receptor de células T.

TGF‐β Transforming growth factor‐β1, factor de crecimiento transformante

β1.

TNF‐α Tumor necrosis factor‐α, factor de necrosis tumoral �.

UV Ultraviolet light, luz ultravioleta.

VCAM‐1 Vascular cell adhesion molecule‐1, molécula de adhesión de células

endoteliales‐1.

ZF Zinc‐fingers, dedos de zinc.

ix

RESUMEN

RIAM, un miembro de la familia MRL (Mig‐10/RIAM/Lamellipodin),

interacciona con Rap1 activo, una pequeña GTPasa que se encuentra frecuentemente

activada en tumores tales como el melanoma y el cáncer de próstata. En esta tesis

demostramos que RIAM se expresa en muestras de melanoma metastático humano y

en líneas celulares de melanoma, y que tanto RIAM como Rap1 son requeridas para la

invasión de estas células. Asimismo, mostramos que la expresión de RIAM confiere

ventajas en el crecimiento y la metástasis a las células de melanoma BLM, altamente

invasiva, como pudo observarse en modelos de xenografting en ratones SCID.

Nuestros resultados indican que la invasión defectuosa de las células

silenciadas para RIAM es debido a un mantenimiento deficiente de la direccionalidad

durante la migración celular, lo cual está asociado con la activación deficiente de la vía

Vav2‐RhoA‐MLC en estas células. La expresión de formas constitutivamente activas de

Vav2 y RhoA en las células deplecionadas para RIAM se tradujo en la recuperación

parcial de la invasión celular, lo que indica que tanto Vav2 como RhoA contribuyen a

esta invasión dependiente de RIAM. Adicionalmente, los datos sugieren que la

inhibición de la invasión mostrada por estas células puede ser debida a una

contractilidad y a una polarización celular deficientes. Por otra parte, mostramos que

el silenciamiento de RIAM se traduce en una reducción de la adhesión celular

dependiente de la integrina β1, lo cual se correlacionó con una activación deficiente

tanto de Erk1/2 como de la fosfatidil‐inositol‐3‐quinasa, dos moléculas centrales en el

control del crecimiento y la supervivencia celulares. En conjunto, estos datos sugieren

que RIAM podría contribuir a la proliferación y a la diseminación de las células de

melanoma.

Dado que RIAM es una proteína presente en las adhesiones focales, en el

presente trabajo estudiamos si podría regular la dinámica de renovación de las

adhesiones focales, un proceso fundamental para la migración celular. Nuestros

x

resultados mostraron que las células BLM silenciadas para RIAM tienen incrementado

el número de adhesiones focales distribuidas en la parte central de la superficie

celular. Experimentos llevados a cabo con nocodazol y análisis mediante FRAP

revelaron que estas células tienen un desensamblaje defectuoso de las adhesiones

focales. El defecto en la renovación de las adhesiones focales correlacionó con niveles

incrementados de fosforilación en residuos de tirosina de FAK y paxilina. Esto podría

deberse a un mantenimiento anómalo de estas proteínas en las adhesiones focales al

encontrarse inhibido su desensamblaje, o ser la causa directa de dicho defecto.

Asimismo, hemos observado que la señalización mediada por MEK‐Erk1/2 está

implicada en la regulación del desensamblaje de las adhesiones mediado por RIAM.

Así, la expresión de formas constitutivamente activas de MEK en las células

deplecionadas para RIAM rescata la distribución preferentemente periférica de las

adhesiones focales y los niveles normales de fosforilación de FAK y paxilina.

Finalmente, nuestros datos sugieren que RhoA podría estar asimismo relacionado con

el desensamblaje de las adhesiones, ya que la transfección de Rho activo en las células

silenciadas para RIAM recupera parcialmente el fenotipo de las células control.

Globalmente, los datos indican que RIAM es necesario para la dinámica normal de las

adhesiones focales, lo que sugiere que el defecto en la invasión de las células de

melanoma deplecionadas para esta proteína podría basarse en alteraciones de este

proceso.

xi

ABSTRACT

RIAM, a member of the MRL (Mig‐10/RIAM/Lamellipodin) family, interacts

with active Rap1, a small GTPase which is frequently activated in tumors such as

melanoma and prostate cancer. In this thesis project, we show that RIAM is expressed

in metastatic human melanoma and in melanoma cell lines, and that both RIAM and

Rap1 are required for melanoma cell invasion. RIAM expression conferred growth and

metastatic advantages to highly invasive human BLM melanoma cells using a SCID

xenograft model.

Our results indicate that defective invasion of RIAM‐silenced melanoma cells

might arise from an impairment in persistent cell migration directionality, which was

associated with deficient activation of the Vav2‐RhoA‐MLC pathway. Expression of

constitutively active Vav2 and RhoA in cells depleted for RIAM partially rescue their

invasion, indicating that Vav2 and RhoA mediate RIAM function. These results suggest

that inhibition of cell invasion in RIAM‐silenced melanoma cells is likely based on

altered cell contractility and cell polarization. Furthermore, we show that RIAM

depletion reduces β1 integrin activation and β1‐dependent melanoma cell adhesion.

The decreased adhesion correlated with deficient activation of both Erk1/2 MAP

kinase and phosphatidylinositol 3‐kinase, two central molecules controlling cell growth

and cell survival. The data suggest that defective activation of these kinases in RIAM‐

silenced cells might play a role in the inhibition of melanoma cell growth. Altogether,

these results suggest that RIAM might contribute to the dissemination of melanoma

cells.

Due to the presence of RIAM at the focal adhesions, we investigated in this

work its implication in the dynamic turn‐over of the focal adhesions, an essential

process contributing to cell migration. Our results show that RIAM‐silenced BLM cells

have an increased number of focal adhesions distributed over the central cell surface.

Experiments conducted using nocodazol and FRAP analysis revealed that these cells

xii

have a deficiency in the focal adhesions dissasembly. The defective focal adhesion

turn‐over correlated with increased levels of FAK and paxillin tyrosine phosphorylation.

This fact may be due to an unproper recruitment of these proteins at the adhesions

caused by an inhibited focal adhesion‐dissasembly, or on the other hand, might be a

direct cause of this defect. Moreover, MEK‐Erk1/2‐mediated signaling is involved in

the regulation of RIAM‐dependent adhesion dissasembly. Constitutively active MEK

expression rescued the RIAM‐KD cells phenotype, decreasing both the number of

centrally located focal adhesions and tyrosine phosphorylation levels of FAK and

paxillin proteins. Our data suggest that RhoA could also be related to the adhesion

dissasembly, as expression of constitutively active RhoA partially rescued the RIAM KD

cell phenotype. In conclusion, these data indicate that RIAM is required for the focal

adhesion dissasembly in melanoma cells, contributing to their turn‐over and to the

proper phosphorylation of components such as FAK and paxillin. Furthermore, the

defective invasion showed by RIAM KD cells could also be caused by these alterations

in the focal adhesions turn‐over.

Sección I

Introducción

Papel de RIAM en invasión y dinámica de adhesiones focales de células de melanoma

14

Introducción

15

El melanoma maligno

El melanoma maligno es un cáncer producido por la transformación de los

melanocitos, las células de la epidermis encargadas de la producción del pigmento

melanina, que protege al tejido epitelial de los rayos solares ultravioleta. Dicho cáncer

puede ser altamente invasivo, y presentar una alta recurrencia, habiéndose

incrementado su incidencia durante los últimos 30 años. Aunque el melanoma sólo

supone el 5% de los casos de cáncer de piel, es el responsable del 80% de las muertes

por este tipo de cáncer (Howe et al., 2001). Los principales factores de riesgo que

predisponen a los individuos a padecer melanoma maligno son el grado de

pigmentación de la piel, una historia familiar con casos de melanoma, presencia de

pecas y lunares (ya sean benignos o atípicos), hipersensibilidad solar y la exposición a

la radiación ultravioleta.

NevusBenigno

NevusDisplásico

Fase deCrecimiento Radial

Fase deCrecimiento Vertical

MelanomaMetastático

Epidermis

Dermis

MembranaBasal

Mutaciones en B‐RafPérdida de PTEN

Incremento en CD1Pérdida de E‐CadherinaExpresión de MMP2Expresión de αvβ3

Tras sufrir diferentes mutaciones en el DNA, los melanocitos se transforman y

comienza el crecimiento radial del tumor, confinado en la epidermis. Posteriormente

éste se desarrolla verticalmente, internándose en la dermis tras la invasión a través de

Figura 1.‐ Progresión del melanoma: Adaptado de Miller and Mihm, 2006.


16

la lámina basal del epitelio, lo cual correlaciona negativamente con la supervivencia

de los pacientes. Esta transición entre las fases horizontal y vertical está marcada por

el cambio en la expresión de E‐Cadherina por N‐Cadherina asociado a un aumento en

la actividad transcripcional del factor Snail, por la expresión de la metaloproteasa

MMP2, y por la pérdida de función del supresor tumoral PTEN (Dankort et al., 2009;

Ghosh y Chin, 2009). Posteriormente, las células invasivas infiltran el tejido

circundante mediante la degradación de la matriz extracelular, alcanzando finalmente

los vasos linfáticos, desde donde se extienden al ganglio linfático que drena el tejido,

y por último a otros órganos distantes (Figura 1). La formación de metástasis se

produce fundamentalmente en pulmones, hígado, encéfalo y médula ósea (Kim et al.,

2009).

Una vez iniciado el proceso de metástasis, el melanoma adquiere gran

invasividad, disponiéndose actualmente de terapias muy limitadas contra el

melanoma metastático. Las mutaciones adquiridas por los melanocitos son

responsables de la hiperactivación de rutas que controlan la proliferación y la

supervivencia celular, tales como la vía de las MAP‐quinasas y la ruta PI3‐K/Akt

(Rother y Jones, 2009; Lin et al., 2010). Las mutaciones más frecuentes en melanoma

se producen en B‐Raf, siendo detectables hasta en el 67% de los tumores y estando

asociadas al daño causado por la radiación UV. Entre éstas, la mutación más habitual

es la sustitución fosfomimética V600E (B‐RafV600E), que si bien por sí sola no es capaz

de causar la transformación de los melanocitos, en combinación con otras mutaciones

es clave para la transformación y la progresión tumoral (Dankort et al., 2009; Lin et al.,

2010). Por otra parte, se detectan mutaciones puntuales en N‐Ras en un 26% de los

cánceres metastáticos, las cuales son excluyentes de las mutaciones en B‐Raf (Ghosh y

Chin, 2009; Rother y Jones, 2009; Lin et al., 2010). Las alteraciones en la activación de

la ruta PI3‐K/Akt en melanoma se hallan frecuentemente relacionadas con

mutaciones del supresor tumoral PTEN. Estas alteraciones consisten en la pérdida de

función del gen por la deleción de un alelo o por cambios en los niveles de expresión

(en el 20 y el 40% de los casos de los casos de melanoma estudiados,

respectivamente), y que habitualmente se presentan en concurrencia con las

mutaciones en B‐Raf (Dankort et al., 2009; Lin et al., 2010). PTEN modula la actividad

Introducción

17

de la ruta PI3‐K/Akt al desfosforilar PI(3,4,5)P3, por lo que su pérdida de función se

traduce en la sobreactivación de dicha ruta. Se ha descrito asimismo la ganacia en el

número de copias del gen AKT3 en un 40‐60% de los tumores investigados. Otro

mecanismo que conduce al aumento de la actividad de Akt es la poliubiquitinación

excesiva de PTEN mediada por NEDD9, lo cual favorece la transformación celular (Kim

et al., 2006). Finalmente, se han observado mutaciones en receptores tirosín‐quinasa,

tales como EGFR, FGFR2, PDGFR, KIT, o c‐Met (Ghosh y Chin, 2009).

Una vez que el melanoma metastatiza, la prognosis para los pacientes es

pobre. Hasta el momento, los tratamientos quimioterápicos no han tenido éxito

debido a la resistencia mostrada por el tumor, aunque en la actualidad hay dos

tratamientos experimentales en fase 2. El primero de ellos consiste en la

administración de un inhibidor específico de B‐Raf denominado PLX4032

(desarrollado por Plexxikon), el cual ha logrado una respuesta al menos parcial en el

80% de los casos tratados (positivos para B‐RafV600E) (Bollag et al., 2010; Flaherty et al.

2010). El segundo es un tratamiento conjunto con sorafenib, carboplatino y paclitaxel,

que ha obtenido respuestas parciales en un 26% de los pacientes (Rother y Jones,

2009). Para desarrollar nuevos tratamientos y conocer mejor la progresión del

melanoma se ha desarrollado un modelo genético de melanoma metastático en

ratones. En estos animales se ha conseguido la expresión condicional específicamente

en melanocitos de la forma B‐RafV600E en combinación con el silenciamiento de PTEN,

de forma que los animales desarrollaron tumores con un 100% de penetrancia,

detectándose metástasis en ganglios linfáticos y pulmones (Dankort et al., 2009). La

conjunción de las dos mutaciones es capaz de recapitular la progresión del melanoma

metastático en este modelo animal. Además, existen varios modelos disponibles de

xenografting en ratones inmunodeficientes.

Las quimioquinas y sus receptores

Las quimioquinas son una familia de citoquinas quimioatrayentes de bajo

peso molecular (7 a 12 kDa) que presentan un elevado grado de homología

estructural entre sus miembros. Fueron inicialmente descritas por su capacidad para


18

atraer poblaciones leucocitarias en función de sus gradientes de concentración (Kim

et al., 1999).

La disposición de dos residuos de cisteína conservados en el extremo N‐

terminal que establecen puentes disulfuro entre sí, permite establecer 4 familias de

quimioquinas: CC, que presentan ambas cisteínas contiguas; CXC, que tienen un

aminoácido entre las cisteínas; C, en las que se encuentra un único residuo de cisteína;

y CX3C, con tres aminoácidos entre los residuos (Rossi y Zlotnik, 2000; Zlotnik y Yoshie,

2000). Las quimioquinas CXC se han subdividido a su vez en ELR+ (CXCL1 a 8) y ELR‐

(CXCL9 a 16), según la presencia del motivo Glu‐Leu‐Arg en el extremo N‐terminal. Las

primeras son angiogénicas y se unen a los receptores CXCR1 y CXCR2, mientras las

segundas, ligandos de los receptores CXCR3‐6, son angiostáticas. Adicionalmente, las

quimioquinas pueden ser divididas en quimioquinas homeostáticas, producidas y

secretadas constitutivamente, y quimioquinas proinflamatorias, las cuales son

inducibles y producidas por un amplio espectro de tipos celulares cuando se dan

estímulos como el daño tisular o la infección (Gerard y Gerard, 2001; Gerard y Rollins,

2001). Estas últimas permitien el reclutamiento y la activación de monocitos,

neutrófilos, linfocitos y otros efectores en los focos inflamatorios.

Para ejercer su función, las quimioquinas deben unirse a sus

correspondientes receptores en la membrana plasmática de las células diana. Una de

las características de esta unión es su promiscuidad, si bien siempre se mantiene la

especificidad de familia. Los receptores se clasifican en cuatro grupos: CCR, que unen

quimioquinas CC; CXCR, para quimioquinas CXC; CX3CR, específicos de las

quimioquinas CX3C; y XCR1, que tiene como ligandos a XCL1 y 2 (Bacon et al., 2002).

Estos receptores pertenecen a la superfamilia de receptores con siete dominios

transmembrana acoplados a proteínas G heterotriméricas (GPCR: G‐protein coupled

receptor) (Murdoch y Finn, 2000; Murphy, 2000).

Una vez que el ligando se une al receptor se inicia la transducción de señales.

Esta unión supone un cambio conformacional de las regiones intracelulares del

receptor, lo que facilita la interacción con las proteínas G heterotriméricas. La

subunidad Gα de la proteína G cambia GDP por GTP, activándose y disociándose de

las subunidades Gβγ, permitiendo la interacción con sus respectivas moléculas

Introducción

19

efectoras. La señalización finaliza cuando la subunidad Gα hidroliza el GTP a GDP,

quedando inactiva y asociada de nuevo al dímero Gβγ. Estos eventos llevan a la

activación de diferentes rutas de señalización, como las vías Jak/Stat, GRK, MAP‐

quinasas, PI3‐K, fosfolipasa Cβ y las Rho‐GTPasas (Bokoch, 1995; Vicente‐Manzanares

et al., 1999; Mellado et al., 2001).

Las quimioquinas han sido implicadas en procesos biológicos tales como

angiogénesis, hematopoyesis, adhesión celular, desarrollo de tejidos, modulación de

la respuesta Th1/Th2, diferenciación celular e invasión y metástasis de células

tumorales (Rossi y Zlotnik, 2000; Gerard y Rollins, 2001; Strieter, 2001). Las

quimioquinas juegan un papel dual en la progresión del cáncer, ya que pueden

reclutar células NK y linfocitos que desencadenen una respuesta antitumoral (Dilloo et

al., 1996), así como promover respuestas de invasión de las células tumorales, las

cuales expresan receptores de quimioquinas (Luca et al., 1997; Muller et al., 2001;

Robledo et al., 2001; Payne y Cornelius, 2002; Zlotnik, 2004).

La quimioquina CXCL12 y su receptor CXCR4

CXCL12, también denominada SDF‐1 (stromal cell‐derived factor‐1), es una

quimioquina CXC ELR‐ que consta de 67‐71 aminoácidos y que se encuentra altamente

conservada. Su expresión es constitutiva y de amplia distribución, pudiéndose

detectar en gran variedad de órganos y tejidos. El gen que codifica para CXCL12 tiene

cuatro exones, y su ARNm puede dar origen a cuatro isoformas por splicing

alternativo (Shirozu et al., 1995). Inicialmente se describieron CXCL12α y CXCL12β,

presentando esta última cuatro residuos adicionales en el extremo C‐terminal. La

isoforma CXCL12α se expresa preferentemente en ganglios linfáticos, pulmón, hígado

y médula ósea, aunque también se ha descrito su expresión en órganos como

intestino delgado, riñones o piel (Bleul et al., 1996; D'Apuzzo et al., 1997; Pablos et al.,

1999). Posteriormente se han descrito las isoformas CXCL12γ, CXCL12δ, CXCL12ε y

CXCL12φ (Altenburg et al., 2007). Estas isoformas comparten los tres primeros exones

con las isoformas α y β, pero difieren en el cuarto exón. CXCL12γ se expresa en tejido

cardiaco en humanos, mientras que CXCL12δ se encuentra principalmente en hígado

fetal. Además, CXCL12φ se expresa en intestino, páncreas y riñón, tanto en individuos


20

adultos como en tejido embrionario (Yu et al., 2006; Laguri et al., 2007; Rueda et al.,

2008; Franco et al., 2009).

Estructuralmente, CXCL12α, la isoforma empleada en este trabajo y a la que a

partir de ahora se hará referencia como CXCL12, es un polipéptido con una región N‐

terminal que contiene el motivo CXC, seguido de un lazo, tres láminas β antiparalelas

y, finalmente, una α‐hélice en el extremo C‐terminal (Crump et al., 1997). Los ocho

primeros residuos N‐terminales, junto con los residuos 12 a 17 del lazo, componen el

dominio de unión al receptor (Dealwis et al., 1998). Estudios de velocidad de

sedimentación han mostrado que CXCL12 existe en un equilibrio dímero‐monómero

(Veldkamp et al., 2005). Funcionalmente, CXCL12 es un potente quimioatrayente para

diversos tipos celulares, entre los que destacan linfocitos B y T, monocitos y

precursores hematopoyéticos, lo cual sugiere su implicación en la homeostasis del

sistema inmune.

CXCL12 tiene como principal receptor a CXCR4, una proteína de amplia

expresión. Ratones deficientes para la expresión de CXCL12 o CXCR4 muestran

fenotipos similares, con alteraciones en el septo ventricular, en el desarrollo de la

vasculatura y en la arquitectura del cerebelo, así como graves deficiencias en

linfopoyesis y mielopoyesis debido a la dificultad de los progenitores

hematopoyéticos para colonizar la médula (Zou et al., 1998). Todo ello causa la

muerte perinatal de estos ratones. Recientemente se ha descrito que CXCL12 es

también un ligando del receptor CXCR7, aunque la señalización desencadenada tras la

unión al receptor no estimula movilización de calcio ni migración celular (Burns et al.,

2006). La unión de CXCL12 a CXCR4 permite la activación de quinasas Jak (Soriano et

al., 2003), y la transfosforilación en tirosinas de éstas y del propio receptor, lo que

conlleva el reclutamiento de Stat y la exposición de motivos que permiten la unión de

proteínas G heterotriméricas (Mellado et al., 2001). Se inicia así la activación de

numerosas cascadas de señalización, entre las que se encuentra la fosforilación de

Erk1/2, así como de diversos componentes de las adhesiones focales, como Pyk‐2,

p130Cas, FAK (Focal Adhesion Kinase), paxilina y CRK (Ganju et al., 1998). Del mismo

modo, CXCL12 induce la actividad del factor de trascripción NF‐κB (Han et al., 2001b),

de la PI3‐K (Vicente‐Manzanares et al., 1999), y la polimerización del citoesqueleto de

Introducción

21

actina a través de la activación de las GTPasas Rho (Moyer et al., 2007). Asimismo,

CXCL12 contribuye a la activación de integrinas, como α4β1 y α4β7 (Peled et al., 1999;

Hidalgo et al., 2001; Wright et al., 2002), lo que se traduce en la regulación de la

adhesión y de la motilidad celular.

Homing decélulas tumoralesy metástasis

InvasiónTumor primario

Hígado

Pulmón

Cerebro

Médula ósea

Angiogénesis

ReclutamientoLeucocitos mononucleares

infiltrando el tumor

Vasculatura deltumor primario

Quimioquinas ELR+ CXC

Quimioquinas ELR- CXCQuimioquinas CC

Célulastumorales

LeucocitosmononuclearesCélulasestromales

Numerosos trabajos señalan la importancia de CXCL12 y CXCR4 en la

progresión tumoral, tanto en el crecimiento del tumor primario como en la invasión

de células tumorales y en la metástasis. CXCR4 constituye el receptor de quimioquinas

más frecuentemente expresado en células tumorales, existiendo una correlación

entre lugares preferentes de metástasis con la secreción de su ligando en esos

órganos (Figura 2). La señalización dependiente de CXCL12/CXCR4 promueve la

invasión y la migración de células de melanoma mediante la regulación de la actividad

Figura 2.‐ Papel de las quimioquinas CXCL12 y CCL21 en la formación de metástasis: Las quimioquinas CXCL12 y CCL21 son expresadas en los tejidos más frecuentemente metastatizados por células tumorales, como las de melanoma (Adaptado de Strieter, 2001).


22

de las GTPasas Rho y la estimulación de la expresión de la metaloproteasa MT1‐MMP

(Bartolome et al., 2004; Bartolome et al., 2006).

Las integrinas

Las integrinas son moléculas de adhesión que se expresan en prácticamente

todos los tejidos y tipos celulares. Son receptores de superficie que median la

adhesión a la ECM y a componentes del plasma. Estructuralmente, las integrinas son

heterodímeros proteicos formados por la asociación no covalente de subunidades α

(120‐180kDa) y β (90‐110kDa). Se conocen 18 subunidades α, y 8 β, y su combinación

da lugar, al menos, a 24 integrinas diferentes (Hynes, 2002) (Figura 3).

Según un modelo teórico basado en homología de secuencia, se ha

determinado que la zona de unión a ligandos de la región N‐terminal de las

subunidades α forma una estructura en β‐hélice constituida por 7 dominios repetidos

en esta región (Springer, 1997). La región C‐terminal de las integrinas constituye el

dominio citoplasmático, punto de anclaje de proteínas citosólicas tales como talina y

kindlin. Mientras que la primera interacciona con el dominio proximal a la membrana

de la región intracitoplásmica de las cadenas β, kindlin lo hace con el dominio distal a

membrana de las mismas (Moser et al., 2009).

Figura 3.‐ Esquema de la familia de las integrinas. Se muestran las posibles combinaciones entre las subunidades α y β (Hynes, 2002).

Introducción

23

La actividad adhesiva de las integrinas puede ser regulada por cambios en su

afinidad y/o en su avidez (Stewart y Hogg, 1996). Las variaciones en la afinidad se

deben a cambios conformacionales de la integrina que resultan en un incremento de

la interacción integrina‐ligando. Cuando las integrinas se hallan en una conformación

inactiva o de baja afinidad por sus ligandos, las colas citoplásmicas de las cadenas α y

β interaccionan entre sí, mientras que sus dominios extracelulares se encuentran

“curvados”y yuxtapuestos a la membrana, con una topología plegada. Cuando los

dominios extracelulares se despliegan, la integrina adquiere una conformación abierta

que presenta alta afinidad por los ligandos, considerándose activa (Kim et al., 2003;

Luo et al., 2005; Luo et al., 2007) (Figura 4). La talina, probablemente en colaboración

con kindlin, es capaz de romper la interacción entre las colas citoplásmicas de la

integrina, causando el despliegue de sus regiones extracelulares y la mencionada

activación (Tadokoro et al., 2003; Harburger et al., 2009). Este estado de alta afinidad

puede inducirse in vitro mediante la exposición a cationes bivalentes, como el

manganeso, o por estimulación inside‐out por quimioquinas. Los cambios de avidez,

que implican la agrupación de integrinas gracias a la fluidez de la membrana

plasmática, permiten la formación de interacciones adhesivas multivalentes entre las

integrinas y sus ligandos, teniendo como consecuencia una mayor fuerza adhesiva

conjunta (Carman y Springer, 2003).

Subunidad αSubunidad β

Conformacióninactiva cerrada

Conformaciónactiva y abierta

LigandoConformaciónintermedia

Las integrinas promueven la señalización outside‐in tras la adhesión celular,

transmitiendo señales hacia el interior celular (Figura 5). Por otra parte, las integrinas

son receptores de señalización inside‐out procedente del interior celular y que

Figura 4.‐ Disposición de las cadenas α y β de las integrinas en sus conformaciones inactiva y activa (Basado en Luo et al., 2007).


24

conduce a cambios en su afinidad y avidez. Ambas señalizaciones son cruciales para el

control del ciclo celular, la diferenciación celular y la organogénesis, así como para la

homeostasis del sistema inmune y la hematopoyesis (Zhu y Assoian, 1995; Schwartz y

Assoian, 2001; Kim et al., 2003; Kinashi, 2005). Asimismo, estos procesos de

señalización regulan la progresión tumoral y la metástasis, desempeñando su función

en procesos como la adhesión al endotelio, la extravasación hacia tejidos diana y la

proliferación celular (Friedl et al., 1998; Guo y Giancotti, 2004).

Membranaplasmática

ECM

Integrina

Ligando Factor decrecimiento

RTK

Proliferacióncelular

SupervivenciaMigración celular

Figura 5.‐ Señalización outside‐in dependiente de integrinas: Las integrinas controlan la localización y la acción de los RTKs, procurando una integración eficaz de la señalización desencadenada por ambos, que conlleva al control de la proliferación y la migración celular a través de la activación de Erk1/2 y Akt, entre otras (Guo and Giancotti, 2004).

Introducción

25

Las integrinas β1 y sus ligandos

Las integrinas β1 se componen de la asociación de la subunidad β1 con 12

cadenas α diferentes, y se expresan ubicuamente. Los heterodímeros de integrinas β1

interaccionan con varios componentes de la matriz extracelular, tales como el

colágeno tipo I y tipo IV (α1β1, α2β1, α10β1, α11β1), la laminina (α3β1, α6β1, α7β1), la

fibronectina (α3β1, α4β1, α5β1, α8β1, αvβ1) y la vitronectina (αvβ1). Asimismo, α4β1 es

capaz de interaccionar con VCAM‐1 (Vascular Cell Adhesion Molecule‐1), una

protreína del endotelio que es inducida en procesos inflamatorios (Hynes, 2002).

Las integrinas β1 intervienen en procesos dependientes de la adhesión celular

a ECM, como la diferenciación y la determinación del fenotipo celular, la proliferación

celular dependiente de ciclinas, la migración celular, la supervivencia, y el ensamblaje

y remodelación de elementos constituyentes de la ECM (Fassler et al., 1996). En la

señalización outside‐in mediada por las integrinas β1 participan moléculas con las que

β1 se asocia bien directamente a través de su dominio citoplásmico, como talina, o

bien indirectamente, como vinculina, paxilina y α‐actinina, las cuales se asocian a su

vez al citoesqueleto de actina (Hynes, 2002). Además, la quinasa FAK, una molécula

fundamental en la señalización outside‐in generada tras la adhesión celular

dependiente de integrinas, se asocia indirectamente con estas integrinas. La

asociación entre este conjunto de proteínas y las subunidades β1 en la membrana

plasmática permite el ensamblaje de las integrinas con filamentos de actina. La

señalización outside‐in desencadena la activación de Ras y, por tanto de MAP‐

quinasas, así como de PI3‐K, ILK (Integrin‐Linked Kinase), proteín‐quinasa C (PKC), de

canales antiportadores de Na+/H+ y de las GTPasas de la familia Rho (Giancotti y

Ruoslahti, 1999) (Figura 5). En estas plataformas de señalización cabe destacar la

comunicación que existe entre la señalización mediada por integrinas y determinados

receptores de factores de crecimiento, especialmente EGFR e IGFR (Giancotti y

Ruoslahti, 1999; Schwartz, 2001; Cabodi et al., 2004; Saegusa et al., 2009) (Figura 5).

Debido a esta sinergia, la señalización outside‐in es más eficiente cuando las

integrinas se hallan asociadas con estos receptores de factores de crecimiento, si bien

la misma puede ser desencadenada en presencia de una forma inactiva de EGFR

(Moro et al., 1998).


26

La integrina β1 es esencial durante el desarrollo, como demuestra el fenotipo

letal de los ratones knock‐out para esta integrina, los cuales se desarrollan hasta el

estadio de blastocisto, iniciando la implantación, pero muriendo a continuación

(Fassler et al., 1996). El desarrollo de diferentes ratones knock‐out condicionales para

la expresión de esta integrina ha puesto de manifiesto su implicación in vivo en la

migración celular durante el cierre de heridas y la proliferación epitelial, así como en

el mantenimiento de la estructura de la glándula mamaria (Li et al., 2005; Lopez‐

Rovira et al., 2005; Singh et al., 2009).

Además, se ha propuesto un papel relevante para la integrina β1 en la

formación de metástasis en algunos cánceres, incluyendo el de mama, el de páncreas

y el melanoma (Guo y Giancotti, 2004). Se ha descrito que la adhesión de las células

tumorales mediada por β1 incrementa su capacidad de proliferación y supervivencia,

favoreciendo el crecimiento de tumores y la dispersión de las metástasis (Brakebusch

et al., 1997). En un modelo de cáncer pancreático, la ablación condicional de la

expresión de la integrina β1 tras el desarrollo de tumores de células β de los islotes de

Langerhans causó una reducción del tamaño del tumor primario, asociada a la

inhibición de rutas pro‐supervivencia (Kren et al., 2007). Aún así, se favoreció la

dispersión tumoral hacia los vasos linfáticos que rodean el tumor, poniendo de

manifiesto el papel crítico de esta integrina en la diseminación de las metástasis y en

la prevención de la senescencia de las células del tumor (Kren et al., 2007).

La fibronectina es una glicoproteína presente en la matriz extracelular y

soluble en el plasma sanguíneo, que constituye un ligando de las integrinas α3β1, α4β1

y α5β1. Se expresa en el tejido conectivo de todos los órganos en diferentes

proporciones, y está formada por dos cadenas polipeptídicas A y B unidas por puentes

disulfuro, las cuales se originan por mecanismos de procesamiento alternativo a partir

del producto de un único gen. La fibronectina se compone de dominios estructurales

y funcionales alineados a lo largo de las cadenas, que son las responsables de

interaccionar con las mencionadas integrinas, así como con distintos componentes de

la matriz (Hynes, 1986). Experimentos realizados con fragmentos proteolíticos de la

fibronectina han establecido que la adhesión inicial a la fibronectina es mediada por la

unión de la integrina α5β1 al motivo RGD (Arg‐Gly‐Asp) contenido en un dominio de

Introducción

27

unión celular presente en el centro de las cadenas (repeticiones III9‐10), el cual puede

ser también reconocido por la integrina α4β1 activada (Sanchez‐Aparicio et al., 1994).

El dominio III‐CS se localiza en la porción C‐terminal de la cadena A, y contiene el

fragmento CS‐1 que presenta la secuencia EILDVPST, reconocida con alta afinidad por

la integrina α4β1 (Garcia‐Pardo et al., 1990).

Otro ligando importante de las integrinas β1 es el colágeno, el cual constituye

el 25‐35% del contenido proteico del organismo, además de ser el componente

mayoritario de la ECM, siendo especialmente abundante en tejidos conectivos

(Hulmes, 1992). Estructuralmente, las unidades básicas del colágeno son las moléculas

de tropocolágeno, constituidas por tres cadenas polipeptídicas denominadas cadenas

α. Estas cadenas están compuestas por la secuencia aminoacídica Gly‐Pro‐Gly‐X, en la

que X es cualquier residuo aminoacídico, y en la que en multitud de ocasiones la Pro

es sustituida por hidroxi‐prolina (Traub y Piez, 1971; Fraser et al., 1979; Miller et al.,

1985). El colágeno tipo I, ligando de las integrinas β1, es el componente mayoritario

de la ECM, y se encuentra abundantemente en tejido cicatrizal, en músculo, en dermis,

en las paredes arteriales, en tendón, en la córnea, y es el componente principal de la

parte orgánica del hueso y de la dentina. Es sintetizado por fibroblastos,

condroblastos y osteoblastos (Di Lullo et al., 2002).

Señalización intracelular outside‐in dependiente de integrinas

Las MAP‐quinasas

La proliferación celular depende de señales específicas que promueven la

entrada en el ciclo celular. La vía de las MAP‐quinasas (Mitogen Activated Protein

Kinases, MAPKs) es una de las rutas activadas en respuesta a estímulos mitogénicos y

a la adhesión celular dependiente de integrinas, y transmite al núcleo señales de

control de la proliferación celular (Widmann et al., 1999; Schwartz y Assoian, 2001).

La activación de las MAP‐quinasas requiere el desencadenamiento de una cascada de

fosforilaciones en residuos de serina y treonina que implican a MAPK‐quinasa‐

quinasas (MAPKKKs), y en un segundo nivel a MAPK‐quinasas (MAPKKs). Las MAPKs

son activadas por las anteriores por fosforilación dual de residuos de treonina y


28

tirosina contenidos en motivos TXY. La identidad de dicho aminoácido X define las

distintas subfamilias de MAPKs. Así, la familia de las proteín‐quinasas activadas por

señales extracelulares (Erk1/2) presentan el motivo de fosforilación consenso

treonina‐glutámico‐tirosina (TEY) (Seger y Krebs, 1995; Chang y Karin, 2001). Las

proteín‐quinasas JNK (c‐Jun N‐terminal Kinase), activadas por fosforilación en motivos

treonina‐prolina‐tirosina (TPY), son capaces de fosforilar al factor de transcripción c‐

jun (Derijard et al., 1994). El tercer subgrupo de MAPKs corresponde a la familia de

p38, que se activan por fosforilación del motivo treonina‐glicina‐tirosina (TGY) (Cano

et al., 1995; Martin‐Blanco, 2000; Wagner y Nebreda, 2009).

Entre los sustratos de las MAPKs se encuentran otras proteín‐quinasas,

fosfolipasas, factores de transcripción y proteínas del citoesqueleto, las cuales regulan

gran variedad de eventos celulares, incluyendo la transcripción, la progresión del ciclo

celular y la proliferación, la diferenciación, el desarrollo, la apoptosis, la regulación de

la dinámica del citoesqueleto y la respuesta a estrés.

Las MAPKs Erk1 y Erk2

Las MAPKs Erk1 y Erk2 son serín‐treonín quinasas de 42 y 44 kDa,

respectivamente, ubicuamente expresadas en todos los organismos eucariotas (Zhang

et al., 1994). Entre los estímulos que son capaces de activar a Erk1/2 se encuentran

factores de crecimiento (EGF, PDGF, GM‐CSF), citoquinas (IL‐1β, IL‐4, IL‐5, IL‐8, TNFα,

TGFβ), quimioquinas (CXCL12), la adhesión mediada por integrinas a sustratos de la

ECM, y determinados agentes transformantes y carcinógenos.

La activación clásica de las MAPKs se inicia tras la unión de un factor de

crecimiento a un receptor tirosín‐quinasa (RTK), el cual dimeriza, produciéndose la

autofosforilación cruzada de las cadenas en residuos C‐terminales de tirosina, gracias

a la actividad quinasa intrínseca a las mismas. Seguidamente, los receptores se

asocian con proteínas adaptadoras, las cuales contienen dominios SH2, siendo éstas

proteínas también fosforiladas. Entre éstas destaca Grb2, la cual interacciona con las

proteínas Sos, proteínas intercambiadoras de nucleótidos implicadas en la activación

de proteínas Ras. Se constituye así una plataforma de señalización que es capaz de

activar a Ras, gracias a la sustitución de GDP por GTP (Howe et al., 1992; Kolch, 2000).

Introducción

29

Las GTPasas Ras no son sólo activadas en respuesta a la autofosforilación cruzada de

RTKs, sino que también ha sido descrita su activación dependiente de integrinas,

habiéndose propuesto dos vías. En primer lugar, la adhesión mediada por las

integrinas conlleva la activación de las quinasas Src y FAK. La fosforilación de FAK

permite su unión a Grb2, lo que se traduce en la activación de Ras. En segundo lugar,

la activación de Fyn tras la activación de las integrinas β permite el reclutamiento y la

fosforilación de proteínas adaptadoras Shc, que también interaccionan con Sos

(Schlaepfer y Hunter, 1996; Bill et al., 2004) (Figura 5). Adicionalmente, la señalización

conjunta de las integrinas y los receptores de factores de crecimiento actúa

sinérgicamente para activar más eficientemente esta ruta.

Una vez que Ras está activo, puede unirse con gran afinidad a las serín‐

treonín quinasas Raf, (MAPKKKs de la vía Erk1/2) (Hu et al., 1995; Luo et al., 1997; Roy

et al., 1997). En mamíferos se han descrito 3 proteínas Raf diferentes: Raf‐1 (C‐Raf), A‐

Raf y B‐Raf. Mientras que Raf‐1 presenta un patrón de distribución ubicuo, A‐Raf y B‐

Raf muestran un patrón de expresión más restringido (Hagemann y Rapp, 1999; Kolch,

2000). La actividad de las quinasas Raf (MAPKKKs) está estrechamente regulada,

existiendo múltiples bucles de retroalimentación negativa. Tanto Ras como Raf

regulan la proliferación y la supervivencia celular, y han sido consideradas como

proto‐oncogénicas (Karnoub y Weinberg, 2008). Se han observado mutaciones en Ras

en un 15‐30% de todos los cánceres en humanos, y como se ha mencionado

anteriormente, las mutaciones de B‐Raf están implicadas en el 60% de los casos de

melanoma. Asimismo, Ras aparece mutado en el 30‐50% de los cánceres tiroideos, y

en el 5‐20% de los cánceres colorrectales, por lo que constituye una diana terapéutica

para la que se han desarrollado inhibidores que, como PLX4032, actualmente se

encuentran en fase 2 de ensayo (Bollag et al., 2010).

Las quinasas Raf activan a sus sustratos, las MAPKKs, mediante fosforilación

en residuos de serina y treonina, iniciándose una cascada de fosforilaciones

secuenciales. Las MAPKKs, como MEK, son un grupo particular de quinasas que se

caracterizan por poder realizar fosforilaciones duales en residuos de treonina y

tirosina presentes en sus sustratos, las MAPKs Erk1/2 (Howe et al., 1992; Ramos,

2008). Las quinasas MEK son codificadas por cinco genes, MEK1‐MEK5, que dan lugar


30

a otras tantas isoformas, de las cuales MEK1 y MEK2 son las mejor caracterizadas,

presentando un elevado grado de homología estructural (Kolch, 2000; McCubrey et al.,

2008). La activación de MEK1 y MEK2 se produce tras la fosforilación mediada por Raf

de los residuos de serina 218 y 222, respectivamente (Lee y McCubrey, 2002;

McCubrey et al., 2008). Se ha propuesto que MEK podría activar a Erk1/2 tras su

interacción con esta MAP‐quinasa tanto en el citoplasma como en las adhesiones

focales, donde paxilina actúa como plataforma para dicha activación, interaccionando

con MEK y Erk1/2 (Ishibe et al., 2003; Rozengurt, 2007).

Entre las funciones de Erk1/2 se encuentra la regulación de la transcripción

de multitud de genes, bien tras su translocación al núcleo, donde fosforila a factores

de transcripción como Elk‐1, Sap‐1A o c‐Myc, o bien a través de la activación de la

quinasa RSK, la cual es capaz de fosforilar a los factores CREB, ERα, IkBα, NF‐κB, c‐Fos

y GSK3 (Ganju et al., 1998; Aplin et al., 2001). Se ha demostrado que Erk1/2 juega un

papel clave en la progresión del ciclo celular, estando implicado en la mitosis, la

meiosis y la diferenciación celular. Asimismo, regula la transcripción del gen de la

ciclina D1, y promueve el ensamblaje de los complejos ciclina D1‐Cdk4, responsables

de la fosforilación de las proteinas Rb, las cuales son activadoras del factor de

transcripción E2F que es requerido para la transición de la fase G1 a S del ciclo celular

(Schwartz y Assoian, 2001; Zhang y Liu, 2002). Otras ciclinas que pueden ser reguladas

por Erk1/2 son la ciclina E y la ciclina A. También se ha sugerido que Erk1/2

desempeña un papel importante en el control del centro organizador de microtúbulos

(MTOC) (Zhang y Liu, 2002), imprescindible para la división celular. Otra función

fundamental de Erk1/2 es la regulación de la migración celular, modulando la

dinámica del citoesqueleto de actina, de la que participa contribuyendo al

desensamblaje de las adhesiones focales en células adherentes (Ishibe et al., 2004;

Webb et al., 2004; Gao et al., 2006). Erk1/2 puede ser activado en las adhesiones

focales una vez que interacciona con paxilina, aunque también se ha descrito su

incorporación a dichas adhesiones en estado activado (Fincham et al., 2000; Ishibe et

al., 2004). Erk1/2 fosforila a FAK en las adhesiones focales, facilitando la disociación

de la quinasa de los complejos (Webb et al., 2004; Zheng et al., 2009b).

Introducción

31

La Fosfatidil‐inositol‐3 quinasa (PI3‐K) y sus efectores

La PI3‐K fosforila fosfoinosítidos en los grupos hidroxilo del anillo de inositol,

generando fosfatidil‐inositol trifosfato (PI(3,4,5)P3) a partir de su sustrato PI(4,5)P2,

obtenido a su vez a partir de PI(3)P gracias a la actividad de la enzima PIP‐quinasa. La

PI3‐K presenta dos subunidades, una reguladora de 85 kDa, que posee dominios SH2,

y otra catalítica, de 110 kDa (Coffer et al., 1998; Vicente‐Manzanares et al., 1999;

Wymann y Marone, 2005). Entre las moléculas que inducen la activación de PI3‐K se

encuentran los factores PDGF, EGF y bFGF, hormonas como la insulina, citoquinas

hematopoyéticas (IL2, IL3, IL4, IL5,), y algunas quimioquinas (IL8, RANTES, CXCL12)

(Coffer et al., 1998). La adhesión celular mediada por integrinas desencadena la

activación de PI3‐K, mediante su interacción con FAK e ILK (Integrin‐Linked Kinase)

(Koul et al., 2005; Kallergi et al., 2007). Para que se produzca su activación, la PI3‐K

debe interaccionar a través de los dominios SH2 de su región reguladora con residuos

de fosfotirosina presentes en receptores activados, o en proteín‐quinasas fosforiladas

como FAK o ILK, aunque GTPasas como Ha‐Ras también pueden activarla

directamente (Sheng et al., 2001) (Figura 5). De esta forma, la subunidad catalítica se

localiza junto a la membrana plasmática, donde produce PI(3,4,5)P3.

Akt es una quinasa regulada por PI3‐K que muestra homología estructural con

las proteín‐quinasas PKA y PKC, por lo que también se denomina PKB (Coffer et al.,

1998; Wymann y Marone, 2005). Su expresión en mamíferos es ubicua, habiéndose

identificado tres genes que codifican para Akt, denominados α para Akt‐1, β para Akt‐

2 y γ para PKB‐γ. El análisis estructural de Akt revela la existencia de un dominio PH N‐

terminal, un dominio catalítico central, y una región C‐terminal reguladora, similar a la

de PKC (Bellacosa et al., 1991; Konishi et al., 1995; Wymann y Pirola, 1998; Datta et al.,

1999). Los lípidos PI(3,4)P2 y PI(3,4,5)P3 pueden asociarse con Akt a través del dominio

PH de la quinasa, permitiendo el reclutamiento de la misma en la membrana

plasmática y su fosforilación en serina y treonina por quinasas dependientes de

PI(3,4,5)P3 (PDK1 y 2). Los residuos fosforilados en Akt‐1 son T308 y S473, en Akt‐2 son

T309 y S474, mientras que en PKBγ sólo está presente el residuo T305. Akt fosforila a

sus efectores en serinas y treoninas presentes en el motivo consenso RxRxxS/T (Datta

et al., 1999).


32

Entre las funciones de Akt destaca la regulación del metabolismo de la

glucosa, participando en la señalización desencadenada por insulina (Ueki et al., 1998).

Akt también regula la síntesis proteíca, controlando Raptor/mTOR, y previene la

apoptosis fosforilando proteínas pro‐apoptóticas como Bad, caspasa 9, y factores de

transcripción de la familia Forkhead, lo que favorece la supervivencia celular

(Downward, 2004; Meier y Vousden, 2007). Asimismo, Akt interacciona con la quinasa

IKK, la cual regula al factor NF‐κB, un regulador crítico en el control de la muerte

celular (Datta et al., 1999).

Por otra parte, la activación de la vía PI3‐K/Akt induce proliferación celular,

controlando la entrada en los segmentos activos del ciclo celular a través de la

inhibición de GSK3‐β, de p27 y de las proteínas Forkhead, e incrementando la

actividad de la ciclina D1 (Liang y Slingerland, 2003). De este modo, su sobreactivación

se ha relacionado con la progresión tumoral en numerosos cánceres, tales como los

de mama, pulmón y el melanoma (Kennedy et al., 1997; Skorski et al., 1997; Wymann

y Marone, 2005).

La migración celular: Las Rho GTPasas y la dinámica de las adhesiones focales

Las GTPasas monoméricas de pequeño tamaño

Las GTPasas son proteínas G monoméricas con un tamaño molecular

comprendido entre 20 y 40kDa, que regulan una gran cantidad de respuestas

biológicas. La superfamilia Ras de GTPasas se divide en varias subfamilias: Rho, Ras,

Rab, Sar1/Arf y Ran (Bar‐Sagi y Hall, 2000). Estas proteínas presentan dos

conformaciones: la inactiva, en la que están unidas a nucleótidos de guanosina

difosfato (GDP), y la activa, unida a nucleótidos de guanosina trifosfato (GTP). Estos

ciclos están regulados por proteínas GEF (Guanine‐nucleotide Exchange Factor), las

cuales favorecen la activación de las GTPasas al cambiar GDP por GTP, que se une a su

centro activo, y por proteínas GAP (GTPase‐Activating Proteins), que las inactivan al

catalizar la hidrólisis del GTP, estimulando la actividad GTPasa intrínseca de estas

GTPasas. Además, las proteínas reguladoras GDI (GDP‐Dissociation Inhibitor) inhiben

Introducción

33

el recambio de GDP por GTP, manteniendo inactivas a las GTPasas (Schwartz y Shattil,

2000; Schmidt y Hall, 2002; Raftopoulou y Hall, 2004; Rossman et al., 2005) (Figura 6).

Efectores

Señales“upstream”

La migración celular

La migración celular es crucial para procesos biológicos como el desarrollo

embrionario, la respuesta del sistema inmune, la cicatrización de heridas, y la

metástasis, entre otros. Las características morfológicas de las células determinan la

forma en que migran. Por un lado, las células redondeadas y altamente protrusivas,

de tipo ameboide, tales como los linfocitos, migran estableciendo adhesiones débiles.

Por otro lado, las células de tipo fibroblastoide presentan grandes adhesiones focales,

las cuales están sometidas a la tensión generada por la actomiosina y tienen un ciclo

altamente regulado de ensamblaje y desensamblaje, lo que se traduce en un tipo de

migración que ha sido definida como mesenquimal (Webb et al., 2002; Parsons et al.,

2010). En función de diversos factores, como la rigidez del sustrato y su propia

contractilidad, las células presentarán preferencia por uno u otro tipo de migración

(Parsons et al., 2010).

La migración direccional es desencadenada por multitud de estímulos, tales

como los gradientes de concentración de factores de crecimiento o de quimioquinas,

y señales mecánicas, como la rigidez de la ECM. Para iniciar la migración, las células

deben polarizarse, definiéndose el frente de avance en la parte anterior de la célula

en el que se extienden las nuevas protrusiones en respuesta a diversos estímulos, y un

área posterior que tiene que retraerse (Parsons et al., 2010). Para que dicha

Figura 6.‐ Ciclo de activación e inactivación de las GTPasas de la familia Rho: Las proteínas GEF favorecen el intercambio de GDP por GTP, llevando a la activación de las Rho GTPasas, las cuales interaccionan con sus efectores, produciéndose diferentes respuestas biológicas. Las proteínas GAP hidrolizan el GTP, inactivando las Rho GTPasas, mientras que las proteínas GDI inhiben el intercambio de GDP por GTP (Raftopoulou and Hall, 2004).


34

polarización sea posible es necesario que las diferencias sutiles existentes en los

gradientes de los estímulos físicos o químicos sean amplificadas, lo que se consigue

gracias al efecto multiplicador de la transducción de señales desencadenada por los

propios estímulos. Asimismo, ha de producirse la reorientación del aparato de Golgi y

del centro organizador de los microtúbulos hacia el frente de avance (Bisel et al., 2008;

Tomar y Schlaepfer, 2009). Las extensiones de la membrana plasmática en el frente

de anace pueden ser de pequeño tamaño (ruffles y filopodios) o de gran extensión

(lamelipodios) (Parsons et al., 2010). La formación de estas protrusiones en el frente

de avance de la membrana está dirigida por la polimerización de filamentos de actina,

los cuales son estabilizados gracias a la formación de contactos y adhesiones focales

en la membrana a través de los cuales interaccionan con las integrinas (Ridley et al.,

2003; Zaidel‐Bar et al., 2003; Parsons et al., 2010) (Figura 7). Estos filamentos de

actina se organizan en dos zonas diferentes, el lamelipodio y la lamela. En el

lamelipodio, la polimerización de los filamentos de actina es catalizada por el

Protrusión

Núcleo

Adhesión focal

Complejo focal

Adhesión que sedesensambla

Filamento de actinaAdhesión naciente

Adhesión en la basedel filopodio

Filopodio

Filamento de actinadorso‐ventral

Filopodios

Lamelipodio

Lamela

Zona detransición

Figura 7.‐ Esquema de la participación de la dinámica de las adhesiones focales y del citoesqueleto de actina en la migración celular. (Adaptado de Parsons et al., 2010).

Introducción

35

complejo ARP2/3, obteniéndose una estructura dendrítica o ramificada bajo la

membrana, la cual presenta un rápido desplazamiento retrógrado debido a la

resistencia de la membrana a la polimerización de actina en el frente de avance. En la

lamela, los filamentos de actina se disponen paralelamente, y experimentan un

desplazamiento retrógrado más lento debido fundamentalmente a la actividad

contráctil de la miosina II. En la zona de transición entre el lamelipodio y la lamela la

actina dendrítica se organiza en filamentos más organizados. Los filamentos de actina

de las regiones central y trasera de las células migratorias pueden ser gruesos y

longitudinales, denominándose fibras de estrés. Estas estructuras contienen miosina II,

y su contractilidad es dependiente de efectores de RhoA (Webb et al., 2002; Parsons

et al., 2010).

Tras la formación inicial de las adhesiones nacientes, las cuales contienen

integrinas, talina, vinculina y paxilina (Zimerman et al., 2004), éstas pueden tener dos

destinos: su desensamblaje inmediato, o su estabilización y maduración gracias a la

actividad contráctil de la actomiosina que genera fuerzas de tracción sobre el sustrato.

Tras la maduración, las adhesiones nacientes dan lugar a estructuras mayores, de tipo

puntual, denominadas contactos focales. Éstos residen en posiciones más alejadas de

la membrana plasmática que las adhesiones nacientes, y pueden progresar para

formar estructuras alargadas más estables, organizadas y complejas, que se localizan

al final de las fibras de estrés que se extienden longitudinalmente por la célula,

denominadas adhesiones focales. Una vez que las adhesiones focales se desplazan

retrógradamente localizándose en la parte posterior de la célula, se desensamblan, lo

que permite que el cuerpo celular se proyecte hacia delante permitiendo el avance de

la célula, proceso también dirigido por la tensión (Horwitz y Parsons, 1999; Smilenov

et al., 1999; Parsons et al., 2010).

La miosina II es una molécula clave en la regulación de la migración celular, ya

que dirige la tensión celular (Vicente‐Manzanares et al., 2008). La miosina II se localiza

entre los filamentos de actina formando oligómeros. La miosina II está compuesta por

dos cadenas pesadas, dos cadenas ligeras reguladoras (MLCs), y dos cadenas ligeras

esenciales. La miosina II presenta tres isoformas diferentes, que se diferencian por la

cadena pesada que contienen (miosina IIA, IIB y IIC). Las miosinas IIA y IIB son de


36

amplia expresión, mientras que la miosina IIC tiene un patrón restringido de expresión,

y podría tener un papel en cáncer (Parsons et al., 2010). La actividad de la miosina II

está regulada por la fosforilación de la treonina 18 y la serina 19 de la MLC. La acción

de la miosina II es dependiente de ATP y provoca el desplazamiento de las fibras de

actina, lo que genera la tensión necesaria para promover la maduración de las

adhesiones nacientes y de los contactos focales. Así, aunque la miosina no se

encuentra en el lamelipodio, su actividad modula la formación de protrusiones en el

frente de avance y la polimerización de actina (Webb et al., 2004; Parsons et al., 2010).

Además, en la regulación de la dinámica de los filamentos de actina, la proteína α‐

actinina tiene un papel importante, ya que es capaz de formar homodímeros

antiparalelos que unen dos filamentos de actina distintos, contribuyendo a la

modulación de la tensión independientemente de la actividad de la miosina II (Choi et

al., 2008; Parsons et al., 2010).

Las GTPasas de la familia Rho y su implicación en la migración celular

La generación de protrusiones en la periferia celular, la formación de nuevas

adhesiones, y la estabilización de las existentes está regulada por miembros de la

familia de GTPasas Rho (Figura 7). Las proteínas Rho son GTPasas monoméricas

pertenecientes a la superfamilia Ras. Existen 20 genes que codifican para proteínas

con el dominio consenso de las GTPasas Rho, siendo las más estudiadas RhoA, Rac1 y

Cdc42 (Wherlock y Mellor, 2002). En base a sus funciones y secuencia, los miembros

de la familia Rho se han clasificado en 5 grupos y 3 miembros independientes (Figura

8) (Burridge y Wennerberg, 2004).

La subfamilia de GTPasas Rho está formada por proteínas que contribuyen a

la contractilidad celular, a la formación de fibras de estrés, y a la generación de

protrusiones del frente de avance (como filopodios y lamelipodios) y de adhesiones

focales. Los miembros de la subfamilia tipo Rac estimulan la formación de

lamelipodios y ondulaciones de la membrana tras la interacción con sus efectores,

como WASP, WAVE y los miembros de la familia PAK (p‐21 Activated Kinase), los

cuales regulan la estabilidad de los filamentos de actina modulando la actividad del

complejo Arp2/3 (Kimura et al., 1996; Sells et al., 1997; Watanabe et al., 1999;

Introducción

37

Schmitz et al., 2000). A su vez, la asociación de las proteínas Cdc42 activadas con sus

efectores, como Drf3 y las proteínas PAK4, 5 y 6, promueve la formación de filopodios

(Peng et al., 2003; Kumar et al., 2009). Por otra parte, la GTPasa RhoA ejerce

preferentemente sus funciones en la parte posterior de la célula, donde a través de la

activación de la quinasa efectora Rho‐quinasa (ROCK) favorece la fosforilación de MLC,

lo que se traduce en un aumento de la contractilidad, que contribuye a la retracción y

al desplazamiento neto del cuerpo celular (Riento y Ridley, 2003; Parsons et al., 2010).

El efector de RhoA mDia1 también induce nucleación de filamentos de actina.

Mediante éstas y otras moléculas efectoras, las GTPasas Rho promueven procesos

tales como la regulación de la migración y la adhesión celular, tras la reorganización

del citoesqueleto de actina. Otros miembros de la familia de GTPasas Rho son las

proteínas de tipo Rnd, los cuales tienen dominios GTPasa constitutivamente activos,

aparentemente antagonizando la señalización de las proteínas de la subfamilia Rho,

siendo reguladas a nivel de la expresión génica (Chardin, 2006). Las RhoBTB son poco

conocidas, aunque parecen servir como adaptadoras para proteínas implicadas en la

ubiquitinación, ya que no unen GTP (Berthold et al., 2008).

Tipo Rac

Tipo Cdc42

Tipo RhoBTB

Tipo Rnd

Tipo Rho

Diversos estímulos pueden desencadenar la activación de las GTPasas Rho,

entre los que se incluyen las quimioquinas y factores de crecimiento como PDGF, EGF

Figura 8.‐ Dendrograma que representa la distribución de los miembros de la familia de GTPasas Rho (Burridge and Wennerberg, 2004).


38

y TGF‐β1. Asimismo se ha descrito que la unión de diversas moléculas de adhesión

(cadherinas, integrinas, miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas) a sus

ligandos puede regular el estado de activación de estas GTPasas (Braga, 2002; DeMali

et al., 2003).

Las proteínas Rac juegan un papel clave en la extensión del frente de avance,

mientras que las proteínas Rho participan principalmente en la retracción del urópodo

(Worthylake y Burridge, 2003). De este modo se mantiene un equilibrio necesario

para la motilidad celular y el control del recambio de las adhesiones focales. Mientras

que Rac activo favorece el ensamblaje de estas adhesiones focales al promover la

polimerización de filamentos de actina, la actividad de RhoA promueve su maduración

mediante la generación de tensión a través de MLC. Por el contrario, la retracción de

la parte posterior de la célula mediada por RhoA induce el desensamblaje de las

adhesiones focales, contribuyendo a la renovación de las mismas y facilitando el

desplazamiento del cuerpo celular (Webb et al., 2002; Ridley et al., 2003; Parsons et

al., 2010). Asimismo, elementos de las adhesiones focales como paxilina y FAK

reclutan GEFs (como CRK, PKL y p190RhoGEF) y GAPs (tales como p120RasGAP y

p190RhoGAP) para las distintas GTPasas Rho (Webb et al., 2002), modulando su

actividad, lo que a su vez se traduce en la regulación de la dinámica de estas

adhesiones y de la migración celular. Las GTPasas Rho y Rac también regulan el tráfico

de membrana y el aumento de la adhesión celular mediado por integrinas, así como la

polarización celular (Laudanna et al., 1997; del Pozo et al., 1999; Bartolome et al.,

2003; Ridley et al., 2003; Burridge y Wennerberg, 2004; Garcia‐Bernal et al., 2005).

Los procesos biológicos que requieren migración celular son dependientes de

la actividad de las GTPasas Rho. Por ello, estas GTPasas controlan procesos de gran

importancia fisiológica como el desarrollo embrionario, la reparación de heridas, la

inflamación y la fagocitosis, la contracción muscular, el mantenimiento de la

morfología celular. Adicionalmente pueden participar en situaciones patológicas,

como la invasión y el crecimiento tumoral o en patologías inflamatorias (Etienne‐

Manneville y Hall, 2002).

Las GTPasas Rho mantienen relaciones funcionales entre sí y con otras

GTPasas de la superfamilia Ras a través de diversas moléculas con actividad GEF o

Introducción

39

GAP. Así, se ha descrito que las proteínas tipo Rac pueden ser activadas por Ras, Arf6,

RhoG y Cdc42 e inhibidas por RhoH (Ridley y Hall, 1992a; Ridley, 2001; Burridge y

Wennerberg, 2004). A su vez, las proteínas Rac pueden activar o inactivar a las de tipo

Rho, que también son inactivadas por Arf6, RhoD, RhoE y Rnd3, (Ridley y Hall, 1992b;

Ridley et al., 1992; Sander et al., 1998; Bustelo, 2000; Chardin, 2003; Burridge y

Wennerberg, 2004). También se ha descrito la activación de Rac1 por Rap1, una

GTPasa de la familia Ras, lo que implicaría a su vez a moléculas como Tiam y Vav2

(Arthur et al., 2004).

Los GEF de las GTPasas Rho; Familia Vav

En las células eucariotas se han descrito tres familias de GEFs de las GTPasas

de la familia Rho: Dbl, Dock y SWAP70. La familia Dbl (Difuse B‐cell lymphoma)

comprende 69 proteínas diferentes, las cuales poseen dominios DH (de homología a

Dbl) y PH (de homología a pleckstrina) contiguos (Hart et al., 1991; Soisson et al.,

1998). El primero es el dominio catalítico que media el intercambio de GDP por GTP.

El dominio PH tiene actividad reguladora, modulando su actividad por unión de PIP2 y

PIP3 en membrana, lo cual favorece su actividad y la unión a las GTPasas (Rossman et

al., 2003). La interacción del GEF con la GTPasa unida a GDP produce un cambio

conformacional que aumenta la tasa de liberación del GDP, pudiendo entrar GTP en

su lugar. Entonces la GTPasa activa se libera del GEF (Boriack‐Sjodin et al., 1998).

Los GEFs de la familia Dbl se clasifican en 33 subfamilias en función de su

homología. Una de las subfamilias de Dbl es la representada por las proteínas Vav. El

primer miembro de esta familia, Vav1, fue descubierto debido a su actividad

transformante en células NIH‐3T3 (Katzav et al., 1989). Posteriormente fueron

clonados Vav2 y Vav3. Estas 3 proteínas son GEFs específicos que activan las GTPasas

de la familia Rho (Bustelo, 2000; Zugaza et al., 2002). Mientras que Vav2 y Vav3

tienen una expresión ubicua, Vav1 se expresa predominantemente en células de

origen hematopoyético (Adams et al., 1992; Schuebel et al., 1998; Movilla y Bustelo,

1999; Moores et al., 2000), aunque también se ha detectado su expresión en células

de melanoma (Bartolome et al., 2006), entre otros cánceres.


40

Se ha descrito que Vav1 actúa preferentemente como GEF sobre Rac1, Rac2 y

RhoG, mientras que Vav2 lo hace sobre RhoA, nov y RhoG. Vav3 activa

preferentemente a RhoA y RhoG (Crespo et al., 1997; Schuebel et al., 1998; Movilla y

Bustelo, 1999).

Estructuralmente las proteínas Vav se componen de los dominios CH

(dominio de homología a calponina), Ac (dominio rico en residuos ácidos), DH

(domino catalítico), PH, ZF (dedos de zinc), PR (dominio rico en residuos de Prolina),

SH2 y SH3 (dominios ‐2 y ‐3 de homología a Src). Estos dominios proporcionan a las

proteínas Vav el potencial para participar en diferentes interacciones (Figura 9)

(Bustelo, 2000; Turner y Billadeau, 2002). La fosforilación de residuos de tirosina

localizados en el dominio Ac produce un cambio conformacional que expone el

dominio DH, desbloqueándolo y activando al GEF (Crespo et al., 1997). Los dominios

PH, ZF y PR participarían de la unión del GEF a la GTPasa. Adicionalmente el dominio

PH puede modular la actividad GEF gracias a la unión de fosfolípidos producto de la

PI3‐K (Moores et al., 2000). Finalmente, los dominios SH3‐SH2‐SH3 del extremo C‐

terminal de Vav interaccionan con tirosín‐quinasas como Jak, Syk, Src y Zap70, así

como con proteínas adaptadoras, lo que se traduce en la activación de Vav. Además,

diversos receptores transmembrana con actividad tirosín‐quinasa, entre los que se

incluyen EGFR, IGF‐1R, PDGFR, c‐Kit y Flk2, así como receptores de quimioquinas tales

como CXCR4 y CCR7, pueden promover la actividad de las proteínas Vav tras la unión

de los ligandos a sus correspondientes receptores, transduciéndose de este modo

señales procedentes de estos receptores hacia las GTPasas Rho (Bustelo, 2000; Turner

y Billadeau, 2002; Tybulewicz et al., 2003; Bartolome et al., 2006).

Y Y Y

Regulación de laactividad GEF

Dominiocatalítico

Unión a lasGTPasas Rho

Regulación porfosforilación

Regulaciónpor PIP3

Unión a tirosín‐quinasas activadorasy a proteínas adaptadoras

Modulaciónpor Ca2+ ?

Interacción conresiduos fosforilados

Interaccióncon PR

Figura 9.‐ Estructura de las proteínas Vav, basado en Bustelo, 2000 y en Zugaza et al., 2002.

Introducción

41

El ensamblaje y el desensamblaje de las adhesiones focales

Se ha descrito que las adhesiones focales pueden incorporar hasta 50

proteínas (Webb et al., 2002; Geiger et al., 2009) (Figura 10). Estudios de la cinética

de incorporación de estas proteínas a las adhesiones revelan su reclutamiento

secuencial de forma individual o constituyendo complejos preformados (Webb et al.,

2002; Zaidel‐Bar et al., 2003; Zaidel‐Bar et al., 2007). El clustering de las integrinas tras

la adhesión celular induce el reclutamiento de talina, vinculina, tensina, FAK y Src

(Miyamoto et al., 1995a; Miyamoto et al., 1995b), mientras PAK y PIX (PAK Interacting

Exchange Factor) podrían incorporarse al complejo conjuntamente con paxilina

(Manabe et al., 2002). Las quinasas FAK y Src median la fosforilación de diversas

proteínas de las adhesiones focales, regulando su asociación. El ensamblaje y la

maduración de las adhesiones focales requieren la generación de tensión en el frente

de avance, lo que, como ha sido mencionado anteriormente, depende de la actividad

de GTPasas Rho y de la contractilidad celular (Lock et al., 2008). La fuerza generada

por la interacción de la miosina II con los filamentos de actina anclados a las integrinas

es trasmitida a los componentes de las adhesiones, y está directa y positivamente

regulada por la MLC‐quinasa (MLCK), o por la quinasa ROCK (Parsons et al., 2010). La

maduración de las adhesiones es facilitada por la exposición de motivos crípticos de

las moléculas constituyentes de los complejos adhesivos. Esto se debe a los cambios

conformacionales causados por la tensión, lo cual modifica las interacciones entre

diferentes proteínas como talina y vinculina (Ridley et al., 2003; Parsons et al., 2010),

alterando la composición de las adhesiones focales.

El desensamblaje de las adhesiones puede observarse tanto en el frente de

avance, donde sucede conjuntamente con la formación de nuevas protrusiones y

adhesiones nacientes, como en la parte posterior de la célula (Ridley et al., 2003;

Parsons et al., 2010). Al avanzar la célula, las adhesiones focales se desplazan hacia la

parte posterior de la misma, y debido a la pérdida de la unión entre las integrinas y la

ECM, desaparece la tensión y se desensamblan, permitiendo su retracción.

La actividad quinasa de miembros de la familia Src (c‐Src, Fyn, Yes) y de FAK

resulta fundamental para mantener la dinámica de las adhesiones (Cary et al., 1996;

Hsia et al., 2003). Estudios llevados a cabo con fibroblastos deficientes para Src


42

muestran una migración celular y una extensión (spreading) deficientes, y un

incremento en el número y tamaño de las adhesiones periféricas. Asimismo,

fibroblastos knock‐out para FAK presentan un fenotipo similar, resultado de la

inhibición del recambio de las adhesiones (Ilic et al., 1995). Se ha demostrado que FAK

es capaz de regular a Rac tras reclutar a p130CAS, y CRK, GEFs para la GTPasa, así

como de fosforilar a paxilina en tirosinas, favoreciendo el recambio de las adhesiones

y la migración celular (Chodniewicz y Klemke, 2004). Además, esta quinasa también

modula la actividad de RhoA, reclutando GEFs como p190RhoGEF y GAPs como

p190RhoGAP para esta GTPasa, afectando al desensamblaje de las adhesiones focales.

Integrinas

Membranaplasmática

Fibras de estrés

Adhesiónfocal

Las proteín‐fosfatasas calcineurina, PTP‐PEST y PTPα también tienen un papel

importante en el proceso de desensamblaje de las adhesiones, ya que su inhibición

causa un fenotipo similar al de las células deficientes para FAK (Retta et al., 1996;

Zeng et al., 2003; Zheng et al., 2009b). De hecho, PTP‐PEST desforforila a FAK,

limitando las interacciones con otras moléculas y disminuyendo su actividad (Angers‐

Loustau et al., 1999). Asimismo, la proteasa dependiente de calcio calpaína degrada

componentes de dichas adhesiones, incluyendo talina, paxilina y FAK, lo que

Figura 10: Esquema de la arquitectura de las adhesiones focales, Adaptado de Mitra et al., 2005.

Introducción

43

promueve la salida de estos componentes de las adhesiones y el desensamblaje de

estos complejos (Franco y Huttenlocher, 2005; Chan et al., 2010). Notablemente,

experimentos llevados a cabo en fibroblastos deficientes para calpaína presentaron

grandes adhesiones focales distribuidas periféricamente, fenotipo asimismo similar al

de las células deficientes para FAK.

Los microtúbulos son reguladores de la polaridad de las células eucariotas. La

activación de Cdc42 contribuye a localizar el centro organizador de los microtúbulos

(MTOC) y el aparato de Golgi frente al núcleo para orientar el frente de avance,

implicando a PAR3, PAR6 y a la PKC atípica (aPKC) (Ridley et al., 2003; Small y Kaverina,

2003). Además, los microtúbulos tienen un papel fundamental en el desensamblaje

de las adhesiones focales, de manera que, al contactar temporal y transitoriamente

las adhesiones focales, liberan algún elemento relajante no conocido que causa su

desorganización, un proceso dependiente de de FAK y de dinamina (Ezratty et al.,

2005). A este proceso también puede contribuir la señalización mediada por RhoA‐

mDia, que favorece la estabilización de los microtúbulos y el desensamblaje de las

adhesiones, independientemente de su participación en la nucleación de filamentos

de actina (Bartolini et al., 2008).

La paxilina

La paxilina es una proteína citoplasmática de 68 kDa que forma parte de las

plataformas de adhesión dependientes de integrinas, y que a través de interacciones

directas o indirectas con otras proteínas señalizadoras y estructurales, juega un papel

en la adhesión celular, la reorganización del citoesqueleto de actina y la expresión

génica, procesos necesarios para la migración celular, la proliferación y la

supervivencia celular (Deakin y Turner, 2008). La paxilina es una de las proteínas que

forman parte de las adhesiones nacientes en el frente de avance de la célula (Digman

et al., 2008). Así, participaría en el ensamblaje de estas adhesiones y las estabilizaría

al proveer, gracias a la interacción con vinculina, de un vínculo temprano con la red de

actina cortical del frente de avance. Este proceso estaría regulado positivamente por

la fosforilación de paxilina, evento que acontece en los sitios iniciales de adhesión y


44

cuya formación es dirigida por mecanimos relacionados con la tensión celular (Zaidel‐

Bar et al., 2007).

Paxilina es una proteína de expresión ubicua y constitutiva, y los ratones

deficientes para paxilina no son viables, muriendo durante el desarrollo embrionario

temprano (Hagel et al., 2002). Estructuralmente, presenta una región C‐terminal con

cuatro dominios LIM, los cuales contienen dedos de zinc que son esenciales para la

asociación con tubulina y con la tirosín‐fosfatasa PTP‐PEST (Brown et al., 1998;

Jamieson et al., 2005). En su región N‐terminal, la cual soporta la mayor parte de su

actividad señalizadora, contiene cinco dominios ricos en leucina y aspartato LD,

constituyendo α‐hélices anfipáticas que actúan como módulos de unión con otras

proteínas que, como ILK (Integrin‐Linked Kinase), FAK y vinculina, contienen la

secuencia aminoacídica consenso LDXLLXXL. Asimismo, en la región N‐terminal de la

paxilina se halla un motivo rico en prolina, que ha sido identificado como el punto de

interacción con el dominio SH3 de las proteínas Src (Perez‐Alvarado et al., 1994;

Brown et al., 1998; Turner et al., 1999) (Figura 11). Se han identificado diferentes

residuos de tirosina, serina y treonina en paxilina que son fosforilados por quinasas

como PAK, FAK, Src, JNK, Erk1/2, p38, c‐Abl y CDK5 (Deakin y Turner, 2008). La

fosforilación modifica sitios de anclaje para otros componentes de las adhesiones,

encontrándose la mayoría de estos residuos en los dominios reguladores de paxilina

(Webb et al., 2005). La fosforilación dependiente de FAK y Src en las tirosinas 31 y 118,

localizadas entre los dominios LD, constituye un lugar de anclaje para proteínas con

dominios SH2. La fosfatasa PTP‐PEST, una vez que es reclutada en las adhesiones

focales tras su asociación con paxilina, elimina la fosforilación en estos residuos,

inhibiendo la señalización mediada por el dominio LD4, lo que se traduce en el control

de la actividad de la GTPasa Rac y del desensamblaje de las adhesiones focales

(Turner et al., 1999; Jamieson et al., 2005). De hecho, experimentos llevados a cabo

con células deficientes para esta fosfatasa mostraron una hiperfosforilación de

paxilina asociada con un mayor spreading celular (Angers‐Loustau et al., 1999).

La paxilina interacciona con la región FAT (C‐terminal Focal Adhesión

Targeting) de FAK a través de sus dominios LD2 y LD4 (Brown et al., 1998; Hoellerer et

al., 2003; Deakin y Turner, 2008). Aunque FAK puede ser reclutado a las adhesiones

Introducción

45

focales en ausencia de paxilina, la interacción de esta quinasa con ambos motivos LD

es esencial para optimizar la señalización hacia sus efectores, sugiriendo además que

ambas moléculas se asocian con estequiometría 1:1 (Hoellerer et al., 2003; Bertolucci

et al., 2005).

Aunque se ha descrito que Erk1/2 activo puede ser reclutado en las

adhesiones focales tras la activación de las integrinas o de v‐Src (Fincham et al., 2000),

también se ha propuesto que la paxilina podría contribuir a la activación de esta MAP‐

quinasa en las adhesiones (Ishibe et al., 2004), de modo que esta proteína formaría

parte de una plataforma para la activación de Erk1/2. Como se ha mencionado

anteriormente, la adhesión celular dependiente de integrinas promueve la activación

de FAK‐Src en las adhesiones focales, lo que conduce a la fosforilación de paxilina en

la tirosina 118 por parte de estas quinasas en las adhesiones focales. Este evento

permite el reclutamiento y la consecuente activación de Erk1/2 mediada por MEK

(Webb et al., 2004), al localizarse éstas conjuntamente en los complejos. A su vez,

Erk1/2 activo es capaz de fosforilar a paxilina en el residuo Ser83, lo que se traduce en

un aumento de la asociación FAK‐paxilina. La interacción paxilina‐Erk1/2 ha sido

también relacionada con el desensamblaje de las adhesiones focales (Ishibe et al.,

2003; Ishibe et al., 2004; Webb et al., 2004), lo que facilita la migración celular (Ishibe

et al., 2004).

La paxilina ejerce un control importante en la activación de las GTPasas de la

familia Rho, mediante el reclutamiento de GEFs y GAPs para las mismas, regulando la

protrusión del frente de avance. Por un lado, la paxilina interacciona con los GEFs CRK

(que se une a los residuos fosforilados Y31 e Y118 de paxilina) y PKL (Paxillin‐Kinase

Linker) (que se asocia al dominio LD4 y que incorpora a PAK al complejo) (Valles et al.,

2004), regulando positivamente a Rac. Por otra parte, RhoA es regulado

negativamente, ya que los residuos Y31 e Y118 de paxilina permiten el reclutamiento

de p120RasGAP, disminuyendo la asociación de esta proteína con p190RhoGAP en

membrana, lo que se traduce en un incremento de la actividad de p190RhoGAP sobre

RhoA (Tsubouchi et al., 2002).


46

La quinasa de las adhesiones focales FAK

FAK (PTK2) es una proteína de expresión constitutiva y ubicua, de 125 kDa de

tamaño, que fue inicialmente identificada como un sustrato de Src (Mitra et al., 2005).

La fosforilación de FAK tiene lugar tras la adhesión celular, así como tras la

estimulación con factores de crecimiento, y ocurre en asociación con la formación de

contactos focales (Parsons, 2003). Si bien FAK no es necesario para la formación de

estos complejos (Ilic et al., 1995), sí es capaz de promover tanto la maduración de las

adhesiones como su desensamblaje. Como ya se ha indicado, los fibroblastos

deficientes para FAK presentan grandes adhesiones focales distribuidas

periféricamente y con una dinámica alterada (Schlaepfer et al., 2004; Webb et al.,

2004; Mitra et al., 2005). Los embriones de ratones deficientes para FAK son inviables,

y mueren tras 8,5 días de gestación (Furuta et al., 1995; Schlaepfer et al., 2004).

FERM Dominio quinasa PR PR FAT

Y925Y861Y577Y576Y397

Src p130CAS Paxilina Grb2FAK

1 2 3 4 5 Dominios LIM (1 a 4)

PaxilinaFAK, ILK, Vinculina, Erk1/2

Motivos LD (1 a 5)

Tubulina, PTP‐PESTY118

S910

Y31N C

N C

FERM

N C

Actina2º sitio de unióna integrinas β

Corte por calpaína

FAKIntegrinas β

VBS VBS VBS

PIP‐quinasa

ActinaVBS: sitios de unión a vinculina

Talina

Figura 11.‐ Esquema de la estructura de paxilina, FAK y talina: Se muestran los dominios de estas proteínas, y los sitios de unión de algunos componentes de las adhesiones focales. Asimismo, se presenta la localización de algunos residuos susceptibles de ser fosforilados.

Introducción

47

El extremo N‐terminal de FAK presenta un dominio FERM (protein 4.1, Ezrin,

Radixin, Moesin Homology), que facilita la interacción con receptores tirosín‐quinasa

como EGFR o PDGFR (Tomar y Schlaepfer, ; Mitra et al., 2005). Por otra parte, en el

extremo C‐terminal se halla un dominio FAT (Focal Adhesion Targeting), de

interacción con paxilina y talina, constituido por cuatro hélices hidrofóbicas, y que

asocia a la quinasa indirectamente con las integrinas (Chen et al., 1995; Bertolucci et

al., 2005; Mitra et al., 2005). Entre ambos extremos se localiza el dominio catalítico

quinasa altamente conservado, y varias regiones ricas en prolina, las cuales

constituyen sitios de unión para proteínas que presentan dominios SH3 (Schlaepfer et

al., 1999; Sieg et al., 1999; Hoellerer et al., 2003; Bertolucci et al., 2005) (Figura 11).

FAK puede ser fosforilada en mútiples residuos de serina, treonina y tirosina.

Tras la adhesión mediada por integrinas, tiene lugar la autofosforilación en el residuo

de tirosina Y397, lo que permite la creación de un motivo reconocido por los dominios

SH2 de otras proteínas, como quinasas de la familia Src, la fosfolipasa Cγ (PLCγ), Grb7,

la proteína adaptadora Shc, p120RasGAP, y la subunidad p85 de la PI3‐K (Hamadi et

al., 2005). Se ha establecido un modelo secuencial para la activación de FAK y el

reclutamiento sucesivo de otras proteínas: una vez que FAK es reclutado en las

adhesiones focales gracias a su interacción con talina, su propio dominio catalítico

promueve la fosforilación del residuo Y397 (Mitra et al., 2005), permitiendo el anclaje

de quinasas Src a través de su dominio SH2. Entonces se produce un incremento de la

actividad de Src sobre FAK (Mitra et al., 2005; Provenzano y Keely, 2009; Zhao y Guan,

2009), lo que se traduce en la fosforilación de los residuos Y576 e Y577 del dominio

quinasa ésta. Dichos residuos forman parte de un bucle estructural que sufre un

cambio conformacional, incrementando la actividad quinasa. A continuación, Src

fosforila los residuos C‐terminales de FAK Y861, el cual permite la interacción con

p130CAS a través de su dominio SH3, y de Y925, presente en el dominio FAT e

importante para la interacción con los dominios LD2 y LD4 de paxilina. Asimismo,

dicha fosforilación constituye un nuevo punto de anclaje para proteínas con dominios

SH2, como Grb2. Por tanto, la autofosforilación de FAK en la tirosina Y397 es un

evento fundamental, ya que puede modular la actividad de esta quinasa previamente

a la fosforilación de los residuos Y576 e Y577 por Src (Zheng et al., 2009b). Tras la


48

interacción de FAK con paxilina, los residuos Y31 e Y118 de esta última son

seguidamente fosforilados por el complejo FAK‐Src (Schlaepfer et al., 2004; Webb et

al., 2004; Mitra et al., 2005).

Ya sea a través de la unión de Grb2 o de la interacción con Shc, FAK puede

iniciar la cascada de activación de Ras y, por tanto, de las MAP‐quinasas (Schlaepfer et

al., 1994; Schlaepfer y Hunter, 1996; Mitra et al., 2005). De esta forma, FAK

contribuye tanto a la regulación de la dinámica de las adhesiones focales como a la

transducción de señales de proliferación y supervivencia celular generadas por la

adhesión mediada por integrinas. Por otra parte, la serina 910 del dominio FAT de FAK

es susceptible de ser fosforilada por Erk1/2, lo que se traduce en un debilitamiento de

la asociación entre FAK y el dominio LD2 de paxilina, un mecanismo que contribuye a

la salida de FAK del complejo y al desensamblaje de las adhesiones (Zheng et al.,

2009b).

FAK es capaz de secuestrar a p120RasGAP, lo que se traduce en un

incremento de la actividad de Ras. Asimismo, como ya se ha indicado anteriormente,

FAK promueve la fosforilación en tirosinas de p190RhoGAP, disminuyendo los niveles

de activación de RhoA en el frente de avance de la célula (Mitra et al., 2005). Por el

contrario, la asociación de FAK con p190RhoGEF a través de su dominio FAT pone de

relieve la posibilidad de que ante determinados estímulos FAK contribuya a la

activación de la GTPasa (Zhai et al., 2003).

FAK ha sido relacionado con el cáncer y la invasión tumoral. Su ARNm se halla

incrementado en tumores malignos, y las funciones de FAK como regulador de las

GTPasas de la familia Rho, afectando a la motilidad celular, también juegan un papel

en la diseminación tumoral. Asimismo, FAK puede inducir cambios morfológicos y la

formación de podosomas e invadopodios, lo cual conlleva la adquisición de un

fenotipo invasivo (Hsia et al., 2003; Avizienyte y Frame, 2005; Provenzano y Keely,

2009; Luo y Guan, 2010).

Talina

La talina es un componente de las adhesiones focales implicado en la

activación de las integrinas tras la unión a los dominios citoplásmicos de las diferentes

Introducción

49

subunidades β (Tadokoro et al., 2003; Moes et al., 2007). Estructuralmente, la talina

presenta un dominio N‐terminal globular denominado “head domain” (47 KDa) y un

dominio C‐terminal filamentoso o “rod domain” (190 KDa) (Hayashi et al., 1999; Yan

et al., 2001) (Figura 11). El dominio globular es el responsable de la interacción con las

integrinas, pudiendo interaccionar además con FAK, layilina y PIP‐quinasa‐I‐γ90 (Chen

et al., 1995; Borowsky y Hynes, 1998; Calderwood et al., 1999; Xing et al., 2001). Al

estar enriquecido en aminoácidos básicos, también interacciona con fosfoinosítidos

como PI(4,5)P2, los cuales son producidos por la PIPquinasa‐I‐γ90 y que, al forzar el

despliegue de la molécula (Goksoy et al., 2008), favorecen la interacción de talina con

las integrinas, facilitando la activación de estas últimas (Di Paolo et al., 2002; Ling et

al., 2002). Por otro lado, el dominio filamentoso interacciona con vinculina

(Calderwood et al., 1999; Xing et al., 2001). Así, la talina hace de puente entre las

integrinas y el citoesqueleto de actina (Horwitz et al., 1986; Chen et al., 1995; Gilmore

y Burridge, 1996; Hemmings et al., 1996; Bass et al., 1999; Xing et al., 2001; Shattil et

al., 2010). La unión de talina a las integrinas promueve la transición al estado de alta

afinidad de estas moléculas de adhesión mediante la separación espacial de las colas

citoplásmicas de las subunidades α y β (Garcia‐Alvarez et al., 2003; Tadokoro et al.,

2003), dentro de la señalización “inside‐out” (Kim et al., 2003).

Se ha propuesto un papel dual para la talina en el recambio de las adhesiones

focales. Por una parte, contribuye al establecimiento de nuevas adhesiones al

participar en la nucleación inicial de estos complejos. Gracias a la exposición de

motivos crípticos de la molécula a causa de la transmisión de la tensión celular tras la

activación de las integrinas, se facilita la interacción con vinculina y otras moléculas

que estabilizan las adhesiones nacientes (Parsons et al., 2010). Por otra parte, juega

un papel en el desensamblaje de las adhesiones focales, ya que al ser un sustrato de

calpaína puede ser degradada por la proteasa facilitando su salida de los complejos.

Notablemente, una mutación puntual que hace a la talina resistente a la acción de

esta proteasa bloquea el desensamblaje de las adhesiones, indicando asimismo que la

salida de otras moléculas como paxilina, vinculina y zyxina del complejo de las

adhesiones focales es dependiente de la degradación de talina (Franco et al., 2004).


50

Las GTPasas de la subfamilia Ras y sus efectores

La familia de GTPasas Ras está constituída por 36 miembros, entre los que se

incluyen Ras (H‐Ras, K‐Ras y N‐Ras), R‐Ras, Ral y Rap, entre otras. Estas GTPasas

monoméricas regulan diversos procesos celulares como la progresión del ciclo celular,

la supervivencia, la reorganización del citoesqueleto de actina, la polaridad celular y la

motilidad, así como el transporte de vesículas. Dada la relevancia de algunos de estos

procesos biológicos en la malignización celular y la progresión tumoral, estas GTPasas

son consideradas como oncogénicas, habiéndose descrito mutaciones en alguno de

sus miembros hasta en el 33% de los tumores humanos (Vigil et al., 2010).

Rap1, una GTPasa de la subfamilia Ras

La subfamilia Rap (Ras associated protein) está compuesta por las proteínas

Rap1a, Rap1b, Rap2a y Rap2b. Rap1 fue inicialmente identificada en fibroblastos

como un posible supresor oncogénico capaz de revertir la morfología de células

transformadas por K‐Ras. Ensayos in vitro han puesto de manifiesto que Rap1 y Ras

tienen afinidades distintas por las mismas moléculas efectoras, ya que ambas GTPasas

son muy similares en cuanto a su secuencia aminoacídica, especialmente en las

regiones catalítica y de unión a moléculas efectoras. Estos datos hicieron pensar que

Rap1 podría secuestrar proteínas efectoras de Ras, revirtiendo sus efectos

oncogénicos. Sin embargo, actualmente se atribuyen a Rap1 funciones

independientes de la actividad de Ras, y ha sido implicada en progresión tumoral (Bos

et al., 1997; Bos, 1998; Zwartkruis y Bos, 1999; Raaijmakers y Bos, 2009). La actividad

de Rap1 está regulada por GEFs tales como C3G, Dock4 y Epac, y GAPs como RapGAP,

que activan o inhiben su actividad GTPasa, respectivamente (Kooistra et al., 2007)

(Figura 12).

Entre las funciones en las que Rap1 está involucrada se incluyen la

morfogénesis, fagocitosis, adhesión célula‐célula, migración celular y spreading. En

estudios realizados con ratones deficientes para Rap1a se ha visto que dicha GTPasa

es importante para la viabilidad embrionaria (Li et al., 2007). Rap1 regula la activación

de varias integrinas, especialmente αLβ2 y αIIbβ3, y en menor medida α4β1, y

Introducción

51

contribuye a localizar a talina en áreas próximas a la membrana (Kinashi y Katagiri,

2004; Han et al., 2006; Lafuente y Boussiotis, 2006; Boettner y Van Aelst, 2009; Lee et

al., 2009; Lim et al., 2010). Asimismo, se ha implicado a Rap1 en la regulación de las

adhesiones intercelulares mediadas por E‐cadherina, de modo que la actividad de

esta GTPasa promueve la internalización de la cadherina y su renovación en distintos

tipos celulares, tales como fibroblastos y células epiteliales (Balzac et al., 2005;

Hoshino et al., 2005; Sato et al., 2006).

CadherinaActinaIntegrinas Complejo PAR

Por otro lado, Rap1 puede regular el crecimiento y la proliferación celular en

respuesta a adhesión celular, activando la ruta de las MAPKs en algunas líneas

celulares y tumores (Pizon y Baldacci, 2000; Gao et al., 2006), si bien en otras podría

tener el efecto contrario (Bos et al., 2001). La regulación ejercida por Rap1 sobre

Erk1/2 podría controlar la proliferación celular en determinados tumores, ya que ha

sido documentado en estudios indirectos que la depleción de RapGAP en células de

melanoma incrementa la actividad de Erk1/2 y su crecimiento (Zheng et al., 2009a).

Figura 12.‐ Reguladores y efectores de Rap1: Se muestra el interactoma de Rap1, incluyendo sus GEFs y GAPs, y sus efectores, así como las moléculas diana de éstos. Adaptado de Kooistra et al., 2007.


52

Asimismo, Rap1 regula la actividad de la PI‐3K, uniéndose directamente a ésta a

través de su dominio de asociación a Ras, incrementando los niveles de PIP3 (Kortholt

et al., 2010). También se ha propuesto un papel para Rap1 en la regulación de la

actividad de las Rho GTPasas, ya que a través de su efector Tiam1 regula la actividad

de Vav2, un GEF para RhoA y Rac1 (Birukova et al., 2008).

Recientemente se ha investigado el papel de Rap1 en la progresión tumoral.

Así, se ha observado un incremento de la actividad de esta GTPasa en melanoma y en

cáncer de próstata, lo cual podría estar relacionado con una mayor proliferación de

las células tumorales (Gao et al., 2006; Bailey et al., 2009). Asimismo, ha sido

implicado en invasión celular, al regular la actividad de las GTPasas Rho en cáncer

escamoso de cabeza y cuello, tumores tiroideos, cáncer de ovario, y cáncer

pancreático (Gao et al., 2006; Tsygankova et al., 2007; Bailey et al., 2009; Zheng et al.,

2009a).

RIAM, un efector de Rap1

Las proteínas de la familia MRL (Mig‐10/RIAM/Lamelipodina) están

estructuralmente relacionadas con las proteínas asociadas a receptores de factores de

crecimiento (Growth factor Receptor Bound protein) Grb7, Grb10 y Grb14 (Han et al.,

2001a). Tanto la familia MRL como las proteínas Grb comparten los dominios RA de

asociación a GTPasas de la familia Ras, el dominio PH de homología con Pleckstrina (a

través del cual interaccionan con varios efectores y que es adyacente al dominio RA

conformando un módulo funcional), y una región C‐terminal que presenta un dominio

SH2 (Depetris et al., 2009). Las proteínas MRL tienen por función general el asociar a

las GTPasas de la familia Ras con las proteínas reguladoras del citoesqueleto de actina

Ena/VASP, alterando la relación entre G y F actina. El ortólogo de RIAM en Drosophila

melanogaster, pico, es requerido para el crecimiento de tejidos y órganos (Lyulcheva

et al., 2008). Una reducción en los niveles de pico causa una disminución de la tasa de

división celular, un retraso del crecimiento, un incremento de G‐actina frente a F‐

actina y letalidad embrionaria. Por el contrario, su sobre‐expresión promueve un

sobrecrecimiento tisular dependiente de la señalización a través de EGFR, y en

respuesta a suero a través de SRF (Serum Response Factor) (Lyulcheva et al., 2008). En

Introducción

53

Caenorhabditis elegans, la proteína MIG‐10 está implicada en la migración celular

durante el desarrollo embrionario y en la orientación y el crecimiento axonal (Han et

al., 2001a; Chang et al., 2006). La proteína lamelipodina está implicada en la

formación de lamelipodios y filopodios, regulando la localización de Ena/VASP en

estas zonas de extensión de la membrana plasmática (Chang et al., 2006; Michael et

al., 2010), contraponiéndose a la actividad de la proteína supevillina.

RIAM (Rap1 Interacting Adaptor Molecule) consta de 666 aminoácidos, y es

un miembro de la familia MRL que se expresa en diferentes tejidos, especialmente en

leucocitos y plaquetas (Lafuente et al., 2004). Como el resto de proteínas de su familia,

RIAM contiene un dominio PH, y regiones ricas en prolina que contienen múltiples

motivos XPPPP de asociación a profilina, y FPPPP de unión a Ena/VASP. Además del

dominio SH2 presente en la región C‐terminal, contiene un motivo coiled‐coiled de 27

aminoácidos adyacente al extremo N‐terminal del dominio RA (Lafuente et al., 2004)

(Figura 13). RIAM fue descrita inicialmente como una molécula que interacciona con

Rap1 en linfocitos T y plaquetas, y con otras proteínas de la familia Ras aunque con

menor afinidad, según ha sido demostrado por ensayos de asociación Yeast‐two‐

hybrid e inmunoprecipitación (Lafuente y Boussiotis, 2006). RIAM es uno de los

efectores principales de Rap1, interaccionando directamente con la GTPasa cuando

ésta se encuentra unida a GTP, y contribuyendo a la activación de las integrinas β1 y β2

en linfocitos T, y de β3 en plaquetas (Lafuente et al., 2004; Han et al., 2006; Mor et al.,

2007). Dicha unión se produce a través del dominio RA de RIAM, facilitando la

activación de las integrinas al interaccionar con talina a través de su región N‐terminal.

Dicha región de RIAM (aminoácidos 1 a 103) contiene el motivo coiled‐coiled

(aminoácidos 63‐90), excluyendo de la interacción a los dominios RA, PH y a las

regiones ricas en prolina (Lee et al., 2009). Se ha demostrado que esta triple

interacción establecida entre Rap1‐GTP, RIAM y talina favorece la activación de las

integrinas, ya que tanto fragmentos de RIAM capaces de unirse a talina pero que no

contienen el dominio RA, como aquéllos que contienen el dominio de asociación a

Rap1 pero que carecen del motivo de unión a talina, son incapaces de activar a las

integrinas β3 (Han et al., 2006; Lee et al., 2009). El complejo Rap1‐RIAM‐talina sólo es

capaz de activar eficientemente a dichas integrinas cuando la GTPasa se adhiere a la


54

membrana. Esto es posible gracias a la isoprenilación de los motivos CAAX presentes

en el extremo C‐terminal de Rap1 (residuos 165‐184), permitiendo la localización del

complejo en la membrana (Watanabe et al., 2008; Lee et al., 2009).

CC RA PH Proline-Rich

Unióna talina

Unióna Rap1

Sitios de interaccióncon ENA/VASP

N C

La activación de integrinas en linfocitos T mediada por RIAM puede estar

desencadenada tanto por la activación del TCR, como por la estimulación de

receptores de quimioquinas como CXCR4, de manera que las proteínas ADAP y SKAP‐

55 conforman un módulo que une Rap1 y RIAM (Horn et al., 2009). Asimismo, RIAM

participa en la regulación de la polimerización de los filamentos de actina gracias a la

asociación con sus moléculas efectoras Ena/VASP, a través de sus regiones ricas en

prolina. Estas proteínas tienen función anti‐capping, evitando la terminación de la

polimerización de los filamentos de F‐actina, extendiéndolos y favoreciendo el

spreading celular (Lafuente et al., 2004). En linfocitos T, la asociación de RIAM con las

quinasas ZAP‐70, Lck y Fyn ha sido demostrada mediante experimentos de co‐

inmunoprecipitación. RIAM es un sustrato de estas quinasas, siendo fosforilada tras la

activación del TCR, si bien aún no es conocida la relevancia de esta fosforilación

(Patsoukis et al., 2009). Asimismo, RIAM interacciona con PLC‐γ constitutivamente a

través de su dominio SH2, el cual se une al dominio SH3 de la fosfolipasa, pudiendo

modular así la síntesis de PIP3 y de diacil‐glicerol, la movilización de Ca++, y la actividad

del factor de transcripción NFAT (Patsoukis et al., 2009).

Figura 13.‐ Estructura de RIAM

Sección II

Objetivos


56

Objetivos

57

En la presente Tesis nos hemos propuesto desarrollar los siguientes objetivos:

1.‐ Determinar el posible papel de RIAM en la invasión, la proliferación y la

metástasis de células de melanoma humano.

2.‐ Establecer la posible implicación de RIAM en la dinámica de las adhesiones

focales.


58

Sección III

Material y Métodos


60

Material y Métodos

61

Líneas celulares empleadas

En este trabajo se ha empleado como modelo la línea de melanoma

metastático humano BLM (BRO Lung Metastasis), así como las líneas celulares Mel57,

MeWo, SK‐Mel‐147, SK‐Mel‐173, MV3 y HEK293FT, que se han cultivado en medio

DMEM (Gibco Invitrogen, Paisley, Reino Unido) suplementado con un 10% de suero

bovino fetal (FBS) (Biowhittaker, Verviers, Bélgica), 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml

de estrptomicina (Gibco Invitrogen) (medio completo). Los diferentes transfectantes

estables derivados de esta línea (Mock, D11, F7, F8‐Luc, pcDNA4‐RIAM‐His y

pcDNA3.1‐RIAM‐Myc) fueron cultivados de la misma manera, incorporando al medio

Geneticina G418 (500 μg/ml) (Gibco Invitrogen) o Puromicina (3 μg/ml) (Gibco

Invitrogen), en los casos necesarios.

La línea de células T humanas Molt‐4 fue cultivada en medio RPMI (Gibco

Invitrogen) con los mismos suplementos.

Anticuerpos

Los anticuerpos utilizados para el desarrollo del presente trabajo se

presentan en la Tabla 1.

Reactivos

La quimioquina CXCL12 fue adquirida de R&D Systems (Minneápolis, MN),

mientras que el Matrigel se obtuvo de BD Diosciences Clontech (Palo Alto, CA). La

fibronectina humana fue de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania), y el colágeno

tipo I se obtuvo de Sigma Aldrich (Saint‐Louis, MO). Los reactivos de transfección

empleados han sido Lipofectamina (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), Xtreme‐gene

(Roche Diagnostics) y Jet‐Prime (Poly‐Plus, Berkeley, CA).


62

ANTICUERPO ESPECIFICIDAD TIPO PROCEDENCIA 15/7 β1 Integrina β1 activa IgG1 de ratón Dr. R. Alon (Weizmann Science Institute, Israel) Anti‐Akt Akt Policlonal de conejo Cell Signalling Tech (Danvers, MA) Anti‐Pro‐Caspasa3

Pro‐Caspasa3 total IgG2a de ratón Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)

Anti‐Caspasa3 Cleaved Caspasa3 IgG1 de conejo Cell Signalling Tech (Danvers, MA) Anti‐CXCR4 Receptor CXCR4 IgG1 de ratón R&D (Minneapolis, MN) Anti‐Erk Erk1/2 Policlonal de conejo Cell Signalling Tech (Danvers, MA) Anti‐FAK FAK Policlonal de conejo Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)

Anti‐Fosfo‐Akt Fosfo‐Ser 473 de

Akt IgG1 de conejo Cell Signalling Tech (Danvers, MA)

Anti‐Fosfo‐Erk Fosfo‐Thr202, fosfo‐Tyr204 de Erk1/2

Policlonal de conejo Cell Signalling Tech (Danvers, MA)

Anti‐FosfoFAK Y925

Fosfo‐Tyr925 de FAK

Policlonal de conejo Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)

Anti‐FosfoFAK Y397

Fosfo‐Tyr397 de FAK

IgG1 de ratón Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)

Anti‐FosfoMLC Fosfo‐Ser19 de MLC Policlonal de conejo Invitrogen (Paisley, Reino Unido)

Anti‐Fosfo‐p38 Fosfo‐Thr180, fosfo‐

Thr182 de p38 Policlonal de conejo Cell Signalling Tech (Danvers, MA)

Anti‐Fosfo‐Paxilina‐Y118

Fosfo‐Tyr118 de Paxilina

Policlonal de conejo Millipore (Billerica, MA)

Anti‐PY20 Fosfo‐Tirosinas IgG2b de ratón Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)

Anti‐GFP Green Fluorescent

Protein Policlonal de conejo Molecular Probes/Invitrogen (Carlsbad, CA)

Anti‐HA Ag de la

Hemaglutinina Ascites de ratón

IgG1 Sigma‐Aldrich (St. Louis, MO)

Anti‐H‐Ras H‐Ras Policlonal de conejo Dr. J.M. Rojas (CN Microbiologia, Madrid)

Anti‐MLC Cadenas ligeras de

la miosina Ascites de ratón

IgM Sigma‐Aldrich (St. Louis, MO)

Anti‐p38 p38 Policlonal de conejo Cell Signalling Tech (Danvers, MA)

Anti‐PARP PARP total y fragmentado

Policlonal de conejo Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)

Anti‐Paxilina Paxilina IgG1 de ratón Cell Signalling Tech (Danvers, MA) Anti‐Rap1 GTPasa Rap1 Policlonal de conejo Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA) Anti‐RhoA GTPasa RhoA IgG1 de ratón Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)

Anti‐RIAM RIAM humano Policlonal de conejoDra. E.M. Lafuente (Universidad Complutense, Madrid); Dr. Carlos Cabañas (CBM, Madrid)

Anti‐Talina Talina Ascites de ratón Sigma‐Aldrich (St. Louis, MO) Anti‐Tubulina Tubulina IgG2a de ratón Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA) Anti‐Vav2 Vav2 Policlonal de conejo Dr. X. Bustelo (CIC, Salamanca)

Anti‐Vinculina Vinculina Ascites de ratón

IgG1 Sigma‐Aldrich (St. Louis, MO)

Anti‐β1a Integrina β1 Policlonal de conejo Dr. Guido Tarone (Universitá Torino, Italia)

Anti‐β‐Actina β‐Actina Ascites de ratón IgG1

Sigma‐Aldrich (St. Louis, MO)

LEM2/15 MT1‐MMP IgG1 de ratón Dra. Alicia García Arroyo, (CNIC, Madrid) Lia1/2.1 Integrina β1 IgG1 de ratón Dr. F. Sánchez‐Madrid (Hptal la Princesa, Madrid)

P3X63 Ag8 de la proteína murina P3X63

IgG1 de ratón Dr. F. Sánchez‐Madrid (Hptal la Princesa, Madrid)

TS2/16 Integrina β1 IgG1 de ratón Dr. F. Sánchez‐Madrid (Hptal la Princesa, Madrid)

Tabla 1.‐ Lista de anticuerpos empleados, ordenados alfabéticamente. Se indica isotipo y origen.

Material y Métodos

63

Vectores de expresión y siRNAs

• Obtención de transfectantes estables: Para el desarrollo de este trabajo resultó

fundamental el desarrollo de sublíneas que tuvieran silenciada establemente la

expresión de RIAM. Para lograrlo, se recurrió al sistema lentiviral de transferencia

génica Lentilox, que permite expresar shRNAs (Rubinson et al., 2003).

Brevemente, las células empaquetadoras HEK293FT fueron cotransfectadas, junto

con los plásmidos que codifican para la retrotranscriptasa viral (pNGVL‐gag‐pol) y

para las proteínas de la envuelta (pNGVL‐VSV‐G), con la construcción vacía

pLL3.7‐GFP, o bien con la construcción pLL3.7‐GFP‐shRIAM, que codifica para el

shRNA específico para RIAM. Transcurridas 36 horas tras la transfección, se

cambió el medio de las células por nuevo medio completo, y se mantuvo el

cultivo durante 48 horas más. Este medio fue recolectado, centrifugado y

alicuotado para ser empleado como sobrenadante viral. Las células BLM diana

fueron cultivadas hasta alcanzar una confluencia aproximada del 60%, momento

en el que fueron infectadas empleando el sobrenadante previamente recolectado,

diluido 1:3 en el medio habitual de cultivo. La infección se prolongó durante 48

horas. A continuación se retiró el medio con el sobrenadante viral, y se sustituyó

por nuevo medio completo antes de analizar la expresión de GFP en las células

efectivamente infectadas. La expresión de GFP se empleó entonces para

seleccionar los transfectantes estables mediante cell‐sorting, utilizando para ello

un citómetro FACS Vantage (BD, San José, CA). Seguidamente al proceso de

selección de los clones GFP‐positivos, se procedió a analizar por western‐blot y

PCR el silenciamiento de RIAM en las nuevas sublíneas, hallándose los menores

niveles de expresión en los clones D11 y F7, que fueron elegidos para la

realización de los experimentos.

Asimismo se procedió a infectar con los mismos sobrenadantes virales a

células de la sublínea BLM‐Luc, que habían sido previamente infectadas con el

sistema retroviral pLZRS para que expresasen establemente la proteína luciferasa

(Hernández‐Varas et al., manuscrito en revisión). Tras repetir el protocolo de

infección y selección, se obtuvieron clones pLZRS‐Luc‐pLL3.7‐GFP y pLZRS‐Luc‐


64

pLL3.7‐GFP‐shRIAM (clon F8, en el cual se comprobó por western‐blot el

silenciamiento de la expresión de RIAM). Estas sublíneas que expresan luciferasa

se han diseñado para poder desarrollar futuros experimentos de crecimiento y

dispersión tumoral in vivo, empleando técnicas de bioluminiscencia que

permitirán evalular el desarrollo de los tumores in situ.

Para obtener sublíneas que sobreexpresan RIAM, el cDNA de la proteína fue

clonado en los vectores pcDNA3.1‐Myc y pcDNA4‐MaxC‐His. Las células BLM

fueron electroporadas con pcDNA3.1‐RIAM‐Myc, o cotransfectadas con pcDNA4‐

MaxC‐RIAM‐His y el vector pBabe‐puro en proporción 20:1, usando lipofectamina.

Tras 48 horas, las células fueron seleccionadas durante 3 semanas con geneticina

(500 μg/ml) y puromicina (3 μg/ml), respectivamente. Las poblaciones

policlonales resultantes en ambos casos fueron testadas tanto por western‐blot

como por PCR para comprobar la sobre‐expresión estable de RIAM.

• siRNAs empleados: Los siRNAs empleados para interferir la expresión de

diferentes proteínas empleados en este trabajo se hallan en la Tabla 2. Todos

ellos fueron obtenidos de Ambion Inc. (Austin, TX).

DENOMINACIÓN mRNA DIANA SECUENCIA (5' ‐ 3') BASES DIANA Control ‐ AUUGUAUGCGAUCGCAGACtt ‐ Rap1 A Rap1A, Rap1B GAUAGAAGAUUCCUACAGAUUtt 378‐399 Rap1 B Rap1A, Rap1B GAACAACUGUGCAUUCUUAUUtt 412‐432

Rap1 Anar Rap1A AUCAUGUCUGCUGCUCUAGtt 534‐554 RIAM #125 RIAM GGACAACCUUUUCGAGAAAtt 933‐951 RIAM #124 RIAM GGAAGACUCUCUAUGAUAAtt 1580‐1598 RIAM #126 RIAM CUAUGGGACUCAGCAUAAAtt 1416‐1434 Talina1 Talina GGAGGAAAUAACAGGGACCtt 768‐786

• Vectores de expresión: Los vectores de expresión que han sido utilizados durante

el desarrollo de este trabajo se han recogido en la Tabla 3.

Tabla 2.‐ Relación de siRNAs empleados en el silenciamiento transitorio de proteínas. Se indica su secuencia sentido y las bases del mRNA diana con las que interaccionan.

Material y Métodos

65

NOMBRE COMPLETO

EMPLEO PROCEDENCIA

Paxilina‐DsRed Expresión de paxilina

marcada con un fluoróforo Dr. Roberto Parrilla, CIB, CSIC, Madrid

pcDNA3.1

Control Invitrogen (Paisley, Reino Unido)

pcDNA3.1 MEK CA

Expresión de la forma CA de MEK1 fusionado con HA

Dr. Staffan Strömblad, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia

pcDNA3.1 MEK DN

Expresión de la forma DN de MEK1 fusionado con HA

Dr. Staffan Strömblad, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia

pcDNA3.1 Rap1 V12‐HA

Expresión de la forma CA de Rap1 fusionado con HA

Missouri S&T cDNA Resource Center, Rolla, EEUU

pcDNA3.1 Rap1 WT‐HA

Expresión de la forma WT de Rap1 fusionado con HA

Missouri S&T cDNA Resource Center, Rolla, EEUU

pcDNA3.1 RIAM‐Myc

Expresión de RIAM‐Myc Dra. Esther M. Lafuente, Facultad de

Medicina, UCM, España pcDNA4‐MaxC

RIAM‐His Expresión de RIAM‐His

Dra. Vassiliki Boussiotis, Harvard Medical School, Boston, EEUU

pEGFP‐RhoA V14 Expresión de la forma CA de RhoA, fusionada con

GFP

Dr. Francisco Sánchez‐Madrid, Hospital de la Princesa, Madrid,

España

pEGFP‐RhoA WT Expresión de la forma WT de RhoA, fusionada con

GFP

Dr. Francisco Sánchez‐Madrid, Hospital de la Princesa, Madrid,

España

pEGFP‐Vav2 CA Expresión de la forma CA de Vav2 fusionada con GFP

Dr. Xose Bustelo, Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca,

España

pEGFP‐Vav2 WT Expresión de la forma WT de Vav2, fusionada con GFP

Dr. Xose Bustelo, Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca,

España

pLL3.7 Control Dr. Andrés Hidalgo, CNIC, Madrid,

España pLL3.7‐shRNA

RIAM Inhibición transitoria y

estable de RIAM Dra. Vassiliki Boussiotis, Harvard Medical School, Boston, EEUU

pRetroSuper Control Dr. Reuven Agamí, National Cancer Institute, Ámsterdam, Países Bajos

pRetroSuper‐shRNA Rap1

Interferencia estable de Rap1

Este trabajo

pRetroSuper‐shRNA‐RIAM

Interferencia estable de RIAM

Este trabajo

Tabla 3.‐ Listado de los vectores de expresión utilizados, indicándose su función y procedencia en cada caso.


66

Transfección

Las células BLM fueron transfectadas usando el agente lipocatiónico

lipofectamina (Invitrogen) para encapsular vectores de expresión, de acuerdo a las

instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubó durante 20 minutos a

temperatura ambiente una mezcla de lipofectamina con 1.5 μg del correspondiente

vector de expresión en medio Optimem (Invitrogen), la cual fue añadida a

continuación a las células (con una confluencia aproximada del 70%) en presencia de

medio Optimem sin suero. Tras 3,5 horas se añadió medio DMEM al 10% FBS,

prosiguiéndose la incubación durante 16 horas. Seguidamente, se cambió el medio a

las células por medio completo nuevo, manteniéndose el cultivo otras 24 horas antes

de realizar los distintos ensayos funcionales.

En algunos experimentos se empleó Jet‐Prime (Poly‐Plus) como agente

lipocatiónico de transfección. En estos casos, 2 μg del vector de expresión en cuestión

fueron encapsulados en presencia del reactivo, incubándose la mezcla durante 20

minutos a temperatura ambiente en la solución de la casa comercial. Después, la

mezcla de transfección se añadió a las células cultivadas en medio DMEM al 10% de

FBS con una confluencia aproximada del 60%. Tras una incubación inicial de 16 horas,

y al igual que en la transfección con lipofectamina, el medio fue sustituido por medio

completo nuevo, y el cultivo se mantuvo otras 24 horas antes de proceder a realizar

los ensayos funcionales.

Para transfectar siRNAs se empleó el reactivo para células adherentes

Xtreme‐gene (Roche Diagnostics). Siguiendo el protocolo del fabricante, los siRNAs

fueron incubados con el reactivo en medio Optimem (Invitrogen) durante 20 minutos

a temperatura ambiente, para a continuación añadir esta mezcla a las células con una

confluencia del 50‐60%. La concentración final de siRNA alcanzada en dicho cultivo

fue de 100 nM. Tras la incubación inicial de 16 horas, el medio fue renovado con

medio completo, y los transfectantes fueron testados a diferentes tiempos post‐

transfección, optimizándose la eficiencia del silenciamiento de cada siRNA,

empleando las técnicas de western‐blot o RT‐PCR, según el caso.

Material y Métodos

67

En las transfecciones con vectores GFP, una parte de las células fue analizada

por citometría de flujo para valorar la eficiencia de la transfección. Cuando se

emplearon siRNAs, vectores codificantes para shRNAs o vectores de sobre‐expresión,

parte de los transfectantes fueron analizados mediante western‐blot o RT‐PCR para

evaluar los niveles de expresión de las proteínas o de los ARN mensajeros de interés,

respectivamente.

Western blotting

Las células (0,5‐2x106) en placas de cultivo, adheridas a un sustrato, o en

suspensión, fueron lavadas con PBS y solubilizadas a 4 ºC en solución de lisis GST‐FISH

[1% Nonidet P‐40, 50 mM Tris‐HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10% Glicerol, 1

mM PMSF y 1 μg/ml de cóctel de inhibidores de proteasas (Roche Applied Science,

Indianápolis, IN)]. Tras hervir las muestras en solución de carga (2% SDS, 10% glicerol,

5% 2‐β‐mercaptoetanol, 0.0625% Tris‐HCl), las proteínas fueron separadas en

condiciones reductoras mediante electroforesis en geles de poliacrilamida,

utilizándose porcentajes de entre el 8 y el 15% (según el tamaño de las proteínas a

analizar), en presencia de SDS (SDS‐PAGE) y electrotransferidas a membranas de PVDF

(Hybond‐P, Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia). Las membranas fueron

bloqueadas con TBS al 5% de leche desnatada durante 1 hora, incubadas 2 horas a

temperatura ambiente (o 16 horas a 4 ºC) con los anticuerpos primarios

correspondientes en solución de bloqueo, y tras ser lavadas (0,1% de Tween20 en TBS)

fueron finalmente incubadas 1.5 horas con anticuerpos secundarios conjugados con

HRP (Jackson InmunoResearch, West Grove, PA). Las proteínas se visualizaron usando

el substrato quimioluminiscente SuperSignal (Pierce, Rockford, IL). Las bandas así

obtenidas fueron densitometradas en un escáner GS‐800 de Bio‐Rad Laboratories

(Hercules, CA) para su cuantificación.

En determinados ensayos fue necesario eliminar los anticuerpos unidos a las

membranas para reincubarlas con otros primarios diferentes. En estos casos las

membranas fueron sometidas a un proceso de stripping durante 30 minutos a 50 ºC,

en una solución que contiene 100 mM 2‐β‐mercaptoetanol, 2% SDS y 62,5 mM de


68

Tris‐Hcl pH 6,7. A continuación, las membranas fueron lavadas y bloqueadas de nuevo,

para ser incubadas con los correspondientes anticuerpos siguiendo el mismo proceso.

En los experimentos en los que se estudian cambios en la fosforilación de

proteínas, las células fueron sometidas a privación de FBS (starving) al menos 3 horas

antes de realizar el experimento. Para solubilizarlas se empleó una solución de lisis

modificada, conteniendo 1% Nonidet P‐40, 50 mM Tris‐HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 2

mM MgCl2, 10% Glicerol, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptina, 1 μg/ml Aprotinina, 10 μM

Na3VO4 y 2 μM NaF (Sigma‐Aldrich, Saint Louis, MO), para inhibir la acción de las

fosfatasas.

• Ensayos de actividad de GTPasas: Las proteínas de fusión GST‐C21 (cedida por el

Dr. John G. Collard, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, Países Bajos),

Ral‐GDS (donada por el Dr. Johannes L. Bos, Universidad de Utrecht, Países Bajos)

y Raf‐GDS (obsequio del Dr. José M. Rojas, Centro Nacional de Microbiología,

Majadahonda, Madrid) para detección de RhoA‐GTP y Rap1‐GTP respectivamente,

fueron generadas como se ha descrito previamente (Sander et al., 1998). Las

células BLM (2‐5 x 106) fueron mantenidas durante 4 horas en medio DMEM sin

suero, siendo a continuación despegadas con PBS 2 mM EDTA. Tras lavarlas con

PBS, éstas fueron resuspendidas en 1 ml de medio DMEM al 0,5% de BSA.

Seguidamente se añadió a la suspensión la quimioquina CXCL12 (150 ng/ml),

incubándose la mazcla durante diferentes tiempos a 37 ºC. Para detener la

rección y lavar las células, se añadió PBS a 4 ºC. Tras centrifugar, las células fueron

lisadas a 4 ºC en 300 μl de solución de lisis GST‐FISH, y tras la clarificación de los

lisados, se tomó una alícuota (15 μl) de cada sobrenadante como control del

lisado total, siendo el resto incubado 16 horas a 4 ºC con las proteínas de fusión

en presencia de esferas de glutation‐sefarosa (Sigma‐Aldrich). Tras la incubación,

dichas esferas fueron centrifugadas y lavadas, y las proteínas de fusión eluídas en

solución de Laemmli. Las proteínas fueron resueltas en geles de poliacrilamida al

12% en presencia de SDS, y transferidas a membranas de PVDF, las cuales fueron

incubadas con anticuerpos anti‐RhoA o anti‐Rap1.

• Inmunoprecipitación: Las células de melanoma BLM y sus sublíneas fueron

sometidas a ensayos de co‐inmunoprecipitación para estudiar las posibles

Material y Métodos

69

asociaciones entre proteínas. Las células (2 x 106) fueron lavadas con PBS y

solubilizadas a 4 ºC en una solución de lisis que contiene 20 mM trietanolamina

(Sigma‐Aldrich), 300 mM NaCl, 2mM EDTA, 20% glicerol, 10 μM Na3VO4, 1 μg/ml

de cóctel de inhibidores de proteasas (Roche Applied Science) y al 1% de

digitonina (Sigma‐Aldrich). Para eliminar las uniones inespecíficas, los lisados

fueron clarificados y preincubados 3 horas a 4 ºC con proteína A‐sefarosa

(Amersham Pharmacia) o G‐sefarosa (Sigma‐Aldrich), dependiendo de la especie y

del isotipo del anticuerpo a utilizar. Posteriormente los lisados se incubaron con

los anticuerpos específicos durante 16 horas a 4 ºC. Seguidamente, se añadió la

proteína A o G sefarosa durante al menos 2 horas para permitir el acoplamiento

específico entre las esferas y los anticuerpos. Finalmente, las proteínas unidas

fueron eluídas en solución de Laemmli, resueltas por SDS‐PAGE y analizadas por

western‐blot.

Trascripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las células (1x106) fueron lisadas con el reactivo TriPure (Roche Diagnostics).

El ARN celular fue extraído con cloroformo y precipitado con isopropanol,

obteniéndose a partir de éste los cDNAs mediante retrotranscripción (RT) utilizando la

trascriptasa inversa M‐MLV (Promega, Madison, WI), siguiendo el protocolo del

fabricante. Para la reacción de amplificación (PCR) de RIAM, se empleó la polimerasa

de ADN GoTaq (Promega), y los primers 5'‐AAAGCGCCCACTGACTATTG‐3' y 5'‐

CGTTGCCTCTCTTCTTTTGC‐3'. El protocolo térmico consistió en una desnaturalización

inicial de 1 minuto de duración del cDNA a 94 ºC, seguida de 38 ciclos consistentes en

30 segundos de desnaturalización a 94 ºC, 30 segundos de hibridación a 61 ºC, y 45

segundos de elongación a 72 ºC. Finalmente se realizó una extensión de hebras no

finalizadas durante 10 minutos a 72 ºC. Alícuotas de cada muestra fueron

amplificadas bajo las mismas condiciones con los oligonucleótidos 5’‐

GGCTGAGAACGGAAGCTTGTCA‐3’ y 5’‐CGGCCATCACGCCACAGTTTC‐3’ para la

gliceraldehído‐3‐fosfato deshidrogenasa humana (hGAPDH), como control de carga

del cDNA.


70

La amplificación de RAPL se realizó empleando las condiciones y primers ya

descritos (Parmo‐Cabanas et al., 2007).

Ensayo de invasión celular a través de matrigel

Los ensayos de invasión celular a través de matrigel hacia la quimioquina

CXCL12 fueron realizados como se ha descrito previamente (Bartolome et al., 2004;

Bartolome et al., 2006). Brevemente, 2.5‐4x104 células BLM o transfectantes fueron

depositadas en la parte superior de cámaras de invasión con filtros de 8 μm (Costar

Corning Life Sciences, Cambridge, MA) cubiertos por 35‐40 μl de una dilución 1:3 de

matrigel en medio DMEM sin suero. En la parte inferior de la cámara se cargó medio

sin suero, con o sin CXCL12 (300 ng/ml). Tras una incubación de 22 horas a 37 ºC, se

retiraron las células no invasivas y los restos de Matrigel que permanecían en la parte

superior de la cámara, y se procedió a fijar con PBS 4% paraformaldehído las células

invasivas, que por tanto quedaban en su parte inferior. Posteriormente las células

fueron teñidas con una solución de cristal violeta, y fueron contadas bajo un

microscopio de campo claro.

Ocasionalmente se añadió medio con suero al 10% en la parte inferior de la

cámara, cuando los experimentos así lo requirieron.

Ensayos de Adhesión celular

Los ensayos de adhesión celular fueron realizados en placas de 96 pocillos

High binding (Costar Corning Life Sciences) tapizadas a 4ºC durante 16 horas con

Fibronectina humana (8.75 μg/ml) o Colágeno tipo I (10 μg/ml) en solución NaHCO3

0,1 M pH 8.8, que a continuación se incubaron durante una hora a 37 ºC, para

después proceder a bloquear su superficie con BSA 0.5% en solución NaHCO3 0,1 M

pH 8.8. Previamente, las células a emplear fueron marcadas con 2’,7’‐bis(carboxietil)‐

5 (6’)‐carboxifluoresceín‐acetoximetil éster (BCECF‐AM, Molecular Probes, Leiden,

Países Bajos) durante 30 minutos a 37ºC. Tras el marcaje, las células fueron

resuspendidas en medio de adhesión (DMEM 0.5% BSA), e incubadas con los

Material y Métodos

71

correspondientes anticuerpos en cada caso. Seguidamente, un volumen final de 100

μl/pocillo que contenía las células (3x104) fue cargado en pocillos por triplicado. Tras

incubar las placas de adhesión a 37ºC durante diferentes tiempos, se procedió a lavar

con medio de adhesión tres veces para eliminar las células que no habían quedado

adheridas a los sustratos. Finalmente, las células adheridas fueron lisadas con PBS

0.1% SDS, determinándose la fluorescencia con un lector de fluorescencia para placas

(PolarStar Galaxy, BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemania).

Citometría de Flujo

Las células establemente transfectadas con construcciones GFP fueron

despegadas con PBS 2 mM EDTA y resuspendidas en PBS a una concentración de

5x105 células/ml, para ser analizadas en un citómetro Coulter Epics XL (Beckman‐

Coulter, Brea, CA).

Cuando se hubo de marcar alguna proteína de membrana, se procedió a

despegar las células con PBS 2 mM EDTA y tras lavarlas con PBS, se resuspendieron en

PBS a 4 ºC. Seguidamente, se incubaron en hielo durante 30 minutos con los

anticuerpos primarios (concentración final 10 μg/ml) en presencia de

PBS/gammaglobulinas humanas (10 μg/ml). Tras un lavado con PBS a 4 ºC, las células

se incubaron otros 30 minutos con anticuerpos secundarios conjugados con

fluoresceína (FITC) o Rhodamina (Dako, Glostrup, Dinamarca). A continuación se

analizó el marcaje empleando el mismo citómetro.

• Ensayos de activación de la integrina β1: En estos ensayos, las células fueron pre‐

incubadas con CXCL12 (200 ng/ml), MnCl2 (1 mM) o con medio DMEM sin FBS. El

ensayo de citometría de flujo subsiguiente se realizó utilizando el anticuerpo

primario anti‐β1 15/7 (Dr. R. Alon), y un secundario conjugado con Rhodamina

(Dako), siguiendo métodos establecidos (Garcia‐Bernal et al., 2009).

• Ensayos de ciclo celular: Tras los tratamientos, las células fueron despegadas con

PBS 2 mM EDTA y resuspendidas en etanol al 70% en PBS frío. Tras una

incubación de 2 horas, las células fijadas y permeabilizadas fueron centrifugadas,


72

lavadas y resuspendidas en solución de marcaje (PBS, 10 ng/ml RNasa A, 50 μg/ml

yoduro de propidio), y vueltas a incubar durante 30 minutos a 37 ºC. Finalmente,

tras un nuevo lavado, las células fueron resuspendidas en PBS y analizadas con el

mismo citómetro.

Ensayos de cierre de heridas (wound‐healing)

Estos experimentos están diseñados para evaluar la capacidad migratoria de

células en monocapas, y se llevaron a cabo tapizando placas de 24 pocillos con

matrigel (10 μg/ml) en solución NaHCO3 0,1 M pH 8.8 a 4º C durante 16 horas. A

continuación se sembraron las células (5x104) en los pocillos y se dejaron crecer hasta

la confluencia. Seguidamente se procedió a realizar una herida en la monocapa de

aproximadamente 1 mm de anchura. A partir de este momento las células fueron

incubadas a 37 ºC durante 24 horas, evaluando el grado de cierre de la herida debido

a la migración celular, tomándose imágenes para ello con un microscopio Leica

AF6000 tipo DMI 6000B.

Ensayos de quimiotaxis

Para establecer las capacidades migratorias de las células, se emplearon

cámaras μ‐slide de migración celular (Ibidi, Martinsried, Alemania). Las cámaras

fueron tapizadas durante 16 horas a 4 ºC con matrigel (10 μg/ml) en solución NaHCO3

0,1 M pH 8.8, y seguidamente se cargaron las células (5x103) resuspendidas en medio

Figura 14.‐ Diagrama de una cámara μ‐slide de Ibidi. Se muestra el momento de la carga de las células en su reservorio con una punta de pipeta p200 (1). Además se indican las cámaras que contienen el compuesto quimioatrayente (2) y el medio (3).

1

3

2

Material y Métodos

73

DMEM sin FBS. La quimioquina CXCL12 (150 ng/ml) se cargó en el reservorio superior

(Figura 14). Se tomaron imágenes cada 2 minutos durante 5 horas con un microscopio

Leica AF6000 tipo DMI 6000B acoplado a una cámara termostatizada con suministro

de CO2. En estos experimentos se analizó la direccionalidad de la migración (tracking),

la Distancia Media Euclídea (EMD) y la velocidad, con el software informático ImageJ.

Zimografía

Para detectar la acividad de la metaloproteasa MT1‐MMP sobre la MMP2 se

realizaron ensayos de Zimografía. Los sobrenadantes de células cultivadas durante 48

hr en medio DMEM sin suero fueron recogidos y resueltos en condiciones no

reductoras mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% en presencia de

1 mg/ml de gelatina (Sigma‐Aldrich). Posteriormente, los geles fueron lavados tres

veces con 2.5% de Tritón X‐100 en agua, y se incubaron 16 horas a 37 ºC en solución

de reacción enzimática (50 mM Tris‐HCl pH 7.5, 10 mM CaCl2, 200 mM NaCl).

Finalmente, la actividad gelatinolítica de MMP2 fue detectada mediante tinción del

gel con una solución de Coomasie/Ácido Acético.

Microscopía confocal

Las células (2x104) fueron adheridas a cubreobjetos tapizados previamente

con fibronectina (10 μg/ml), e incubadas durante 4‐16 horas a 37 ºC. Tras realizar los

tratamientos corrspondientes, éstas fueron lavadas con PBS y fijadas durante 15

minutos con paraformaldehído al 4% en PBS. Al ser necesario marcar proteínas

intracelulares, las células fueron permeabilizadas con 0.1% de Tritón X‐100 en PBS

durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras lavar tres veces con PBS y bloquear

las muestras con PBS al 1% BSA, éstas se incubaron durante 30 minutos a

temperatura ambiente con los correspondientes anticuerpos primarios (10 μg/ml), en

presencia de gammaglobulinas. Seguidamente los cubreobjetos se volvieron a lavar, y

se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con los

correspondientes anticuerpos secundarios (Alexa 488, Alexa 568 y/o Alexa 633, Dako)


74

y, en su caso, con Faloidina‐Rhodamina (Sigma‐Aldrich). Finalmente las muestras

fueron lavadas y montadas con Mowiol. Las imágenes de las mismas fueron

adquiridas con un microscopo Leica TCS‐SP2‐AOBS‐UV con un objetivo 63x de

inmersión en aceite.

• Tratamiento con Nocodazol: Para estudiar la dinámica de los complejos de

adhesión, recurrimos a inmunofluorescencia de células BLM tratadas con

nocodazol (Sigma‐Aldrich), siguiendo protocolos establecidos, debido al control

que ejercen los microtúbulos sobre estas estructuras (Kaverina et al., 1998;

Ezratty et al., 2005). Una vez adheridas las células a los cubreobjetos tapizados

con fibronectina (10μg/ml), estas fueron sometidas a privación de suero durante

16 horas, para a continuación ser tratadas con nocodazol (10 μM) durante 4 horas.

Las células fueron posteriormente lavadas con medio DMEM sin suero y fijadas a

diferentes tiempos de lavado.

• Estudio cuantitativo de la distribución y tamaño de las adhesiones focales: El

número de adhesiones, su tamaño e intensidad fueron variables extraídas de

imágenes de confocal empleando el software informático Patch Morphology

Analysis (PMA) (Digital Cell Imaging Laboratories, Bruselas, Bélgica). Para tomar

las imágenes se recurrió a la técnica de microscopía confocal IRM (Interference of

the Reflection Microscopy), para identificar el plano focal de interés, en el cual se

encuentran las adhesiones focales. Dichas adhesiones fueron detectadas y

segmentadas automáticamente empleando algoritmos basados en el umbral de

intensidad y la densidad de los elementos. Se emplearon idénticas condiciones

tanto para tomar las imágenes como para segmentar las adhesiones, obteniendo

matrices de datos comparables entre las distintas condiciones.

Time‐lapse microscopy

Para el estudio de la dinámica de las protrusiones de las membranas celulares

se tomaron imágenes secuenciales de microscopía confocal, utilizando células GFP

positivas. Para ello se tapizaron previamente placas de 96 pocillos con fondo de vidrio

Material y Métodos

75

(MatTek Corp., Ashland, MA) con fibronectina (10 μg/ml) en solución NaHCO3 0,1 M

pH 8.8. Las células (GFP positivas) fueron despegadas con PBS 2 mM EDTA y, tras

lavarlas con PBS, fueron resuspendidas en medio al 10% de FBS (5x104 células/ml). Se

cargaron 100 μl de medio con las células por pocillo, y se incubaron durante 30

minutos para permitir su adhesión. A continuación se tomaron imágenes secuenciales

cada 10 minutos durante 6 horas usando un microscopio confocal Nikon A1R con

objetivo 60x de inmersión en aceite, acoplado a una cámara termostatizada y con

suministro de CO2.

Experimentos de FRAP (fluorescente recovery after photobleaching)

Para el estudio de la dinámica de las adhesiones celulares se recurrió a

experimentos de extinción y recuperación de la fluorescencia, como se ha descrito

previamente (von Wichert et al., 2003) (Figura 15). Las células fueron transfectadas

con la construcción Paxilina‐DsRed2, para 48 horas después ser despegadas con PBS 2

mM EDTA, lavadas con PBS y adheridas a placas con fondo de vidrio (MatTek Corp.),

las cuales habían sido tapizadas anteriormente con fibronectina (5 μg/ml), como ya se

ha descrito. Las células fueron cultivadas sobre dichas placas durante 24 horas a 37ºC

antes de proceder a tomar las imágenes. Sobre las células, se seleccionaron sectores

rectangulares próximos a la periferia celular, en los que se midió la fluorescencia

inicial usando bajas intensidades de láser (λ 571nm). Se extinguió la fluorescencia

(photobleaching) de forma efectiva usando una alta intensidad de láser durante 4.5

segundos, alcanzándose niveles de intensidad similares a los del fondo tras la

irradiación. La recuperación de la fluorescencia se midió tomando imágenes durante 5

minutos con bajas intensidades de láser, hasta que la intensidad alcanzó una meseta.

La fluorescencia fue estandarizada respecto de los niveles de intensidad anteriores a

la extinción. El microscopio empleado fue un Leica TCS‐SP5‐AOBS‐UV, con objetivo de

inmersión en aceite 63X, acoplado a una cámara termostatizada y con suministro de

CO2.


76

Extinción Recuperación

Tiempo de recuperación

Intensidad

de Fluo

rescencia

Extinción

Recuperación

Fracción inmóvil

Fracción móvil

Cultivos en geles de colágeno tipo I

Para llevar a cabo los ensayos en los que las células se encuentran embebidas

en una estructura similar a la matriz extracelular se generaron geles de colágeno,

utilizándose 20‐25 μl de colágeno tipo I de cola de rata (3,6 mg/ml) (Millipore,

Billerica, MA) tamponados con solución NaOH (10 mM)/NaHCO3 (0,15%) para alcanzar

un pH neutro. Inmediatamente después se añadieron 10 μl de medio DMEM 10x y 20

μl de medio con las células (5x103), para alcanzar una mezcla final de DMEM 3x al

2,5% de FBS. Gotas de 20‐25 μl de dicha mezcla fueron depositadas sobre placas con

fondo de vidrio (MatTek Corp.) o sobre portaobjetos con cámaras de cultivo (Lab‐Tek™

chamber slides, Fisher ThermoScientifeic, Roskilde, Dinamarca), dejándose

polimerizar a 37 ºC durante 1 hora. Seguidamente, los geles fueron cubiertos con

medio al 10% FBS, e incubados a 37 ºC durante los tiempos requeridos.

Para el análisis de estas muestras, se emplearon técnicas de microscopía

confocal. Brevemente, en los experimentos en los que las células no fueron fijadas, los

geles se tiñeron con DAPI (0.3 μM) o con el marcador de lípidos de membrana Cell‐

Mask Membrane‐dye (Invitrogen) y, las imágenes se tomaron tras lavar con medio. En

Figura 15.‐ Experimento de FRAP. Se muestra cómo un área de la célula que expresa el fluoróforo sufre la extinción de la fluorescencia al aplicar una elevada potencia de láser, y cómo ésta se recupera, a continuación, con el tiempo. La fluorescencia es medida en cada punto del experimento y normalizada, generándose gráficas que representan las diferentes fases. La parte de fluorescencia recuperada se denomina fracción móvil.

Material y Métodos

77

el caso de los marcajes con anticuerpos, se procedió a fijar los geles con

paraformaldehído al 4% en PBS. Tras bloquear con PBS‐1% BSA, las células se

permeabilizaron con PBS‐0.1% Tritón X‐100 y se incubaron durante 30 minutos con

dichos anticuerpos primarios a temperatura ambiente. A continuación, las muestran

fueron lavadas tres veces con PBS, marcadas durante 30 minutos en oscuridad con los

anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos apropiados, y nuevamente

lavadas y montadas usando Mowiol‐DAPI. En todos los casos, las imágenes se

obtuvieron empleando un microscopio confocal Leica TCS‐SP2‐AOBS‐UV con un

objetivo de inmersión en agua de 63x.

Ensayos de tumorigénesis y metástasis in vivo

Para estudios de xenografting se empleó la cepa de ratones (Mus musculus)

inmunodeficientes BALB/c SCID (Harlan, Indianápolis, IN). Los animales fueron

mantenidos bajo condiciones de esterilidad, libres de patógenos, con alimento y agua

ad libitum, y sometidos a un fotoperiodo 12/12. Todas las prácticas realizadas con

animales vivos se han hecho siguiendo las directrices y protocolos del comité de ética

del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Para cada serie de inoculaciones

se emplearon al menos 8 animales por condición.

Para los estudios de tumorigénesis, las células (1x106) fueron resuspendidas

en 200 μl de PBS e inoculadas subcutáneamente en la región dorsolateral de los

animales. Los ratones fueron evaluados diariamente tras la inoculación para detectar

el crecimiento del tumor. Cuando los tumores subcutáneos alcanzaron un volumen

mayor que 2 cm3 los animales fueron sacrificados y los tumores extraídos.

Para los estudios de dispersión y crecimiento de metástasis, los animales

fueron inoculados en la vena de la cola con 1x106 células resuspendidas en 200 μl de

PBS. Se realizó un seguimiento diario de los animales hasta detectar la aparición de

síntomas de estrés respiratorio, indicativos de metástasis pulmonar. En este

momento se procedió al sacrificio de los animales, evaluándose mediante necropsia el

grado de dispersión de los tumores, analizando todos los órganos internos de los


78

animales. Las metástasis pulmonares fueron extirpadas y cultivadas en medio DMEM

al 10% de FBS.

Ensayos de proliferación celular MTT

Este método fue elegido para determinar viabilidad celular y proliferación de

manera indirecta, evaluando la actividad mitocondrial. Las células (8x103 por pocillo)

fueron cargadas por triplicado en placas de 96 pocillos, y fueron cultivadas en 100 μl

de medio completo durante 16 horas a 37 ºC. A continuación se añadieron 20 μl de

una solución de bromuro de 3‐(4,5‐dimetiltiazol‐2‐il)‐2,5‐difenil tetrazolio (0,5 mg/ml)

(Sigma‐Aldrich) en PBS, y incubándose durante 3 horas a 37 ºC. Tras eliminar el

contenido de los pocillos, los resultantes cristales de formazán fueron resuspendidos

con 200 μl de DMSO por pocillo. La densidad óptica del color violeta resultante se

midió con un lector de placas (Multiskan Bichromatic, Labsystems, Helsinki, Finlandia)

a λ 540nm.

Ensayos de citotoxicidad

Para estudiar los efectos de determinados agentes químicos en la viabilidad

celular, se sembraron 8x103 células/pocillo en placas de 96 pocillos, y se cultivaron

durante 24 horas a 37ºC en medio DMEM al 10% de FBS. A continuación las células

fueron sometidas a los tratamientos con diferentes concentraciones de los agentes

citotóxicos cisplatino (Sigma Aldrich) y H2O2 durante 16 horas. Las células no

adherentes fueron retiradas mediante un lavado con PBS, y la monocapa de células

supervivientes fue fijada con paraformaldehído al 4% en PBS, lavada, y teñida con

cristal violeta. Tras un nuevo lavado, la tinción fue resuspendida empleando una

solución de ácido acético al 33% en agua, y la densidad óptica del color violeta

resultante evaluada con un lector de placas (Multiskan Bichromatic) a λ 570nm.

Material y Métodos

79

Ensayos de formación de colonias en Soft Agar

Para determinar la capacidad de las células de melanoma de crecer

independientemente de anclaje a una matriz, las células fueron suspendidas en geles

tridimensionales de agarosa en placas de 6 pocillos. Para ello, se preparó agarosa de

bajo punto de fusión estéril al 3% en PBS, y se llevó a 40 ºC, para a continuación

diluirla 1:2 con medio DMEM al 10% de FBS y dejarla polimerizar en los pocillos

durante 30 minutos, formando una capa inicial base. Sobre esta capa al 1% de agarosa

se creó un segundo gel al 0,4% que contiene el cultivo celular, resultado de mezclar

medio DMEM 10x al 0,8% de agarosa y medio DMEM al 10% de FBS con las células

(2x104 células/ml) a 40 ºC. La mezcla se dejó polimerizar a 37ºC de forma inmediata.

Las células se cultivaron durante 3 semanas en presencia de medio completo, y

finalmente se procedió al lavado de los geles con PBS, a su fijado con

paraformaldehído al 4% en PBS, y a su tinción con cristal violeta. Tras un lavado final

se realizó una determinación del número de colonias de diámetro superior a 50 μm

utilizando un microscopio de campo claro.

Estudios estadísticos

La prueba T‐Student fue utilizada para analizar diferencias estadísticamente

significativas entre pares de datos. Para comparar tres o más grupos se empleó el test

de análisis de la varianza ANOVA de doble vía, seguido de un análisis de comparación

múltiple de Tukey‐Kramer. En ambos casos el nivel mínimo de significación aceptable

fue p<0.05. Se muestran los siguientes niveles de significación: * p<0.05; ** p<0.01;

*** p<0.001. En el caso de que los experimentos hayan sido repetidos un número ‘n’

de veces, se presenta la media y la desviación típica del conjunto, o de un

experimento representativo.


80

Sección IV

Resultados


82

Resultados

83

I. DETERMINACIÓN DEL PAPEL DEL EJE DE SEÑALIZACIÓN RAP1‐RIAM EN LA

INVASIÓN DE CÉLULAS DE MELANOMA. CARACTERIZACIÓN DE LOS MECANISMOS

MOLECULARES IMPLICADOS.

Rap1 y RIAM son requeridos para la invasión de células de melanoma en respuesta a

CXCL12

Para analizar la expresión de Rap1 en células de melanoma BLM, se

obtuvieron lisados de las mismas, los cuales fueron sometidos a ensayos de western‐

blot. Los resultados mostraron un nivel de expresión similar al de las células T Molt‐4,

que se utilizaron como control positivo (Figura 16A). A continuación, estudiamos la

capacidad de respuesta de esta GTPasa a la quimioquina CXCL12, la cual es nuestro

modelo de estímulo invasivo. Para ello llevamos a cabo inicialmente experimentos de

actividad GTPasa empleando la proteína de fusión Ral‐GDS, los cuales indicaron que

Rap1 es capaz de activarse en respuesta a la quimioquina (Figura 16B).

Con el fin de determinar el posible papel de Rap1 en la invasión de células

BLM en respuesta a CXCL12, éstas fueron transfectadas con siRNA para Rap1 para

silenciar la expresión de esta GTPasa. Para comprobar el silenciamiento, los lisados de

los transfectantes fueron sometidos a análisis por western‐blot, los cuales mostraron

una notable interferencia en la expresión de la GTPasa (Figura 16C, izquierda). Estos

transfectantes fueron testados a ensayos de invasión a través de matrigel, el cual está

formado por un extracto de membranas basales, representando una herramienta útil

para el estudio de la invasividad de células tumorales. El silenciamiento de Rap1 se

tradujo en una inhibición significativa de la invasión a CXCL12, en comparación con las

células transfectadas con siRNA control, poniéndose de relieve la implicación de Rap1

en la invasión celular (Figura 16C, derecha).

Para confirmar todavía más esta observación, las células BLM fueron

transfectadas con una construcción que codifica para shRNA de Rap1 (pSuper‐shRap1),

o con un vector vacío. Tras comprobar la disminución en los niveles de expresión de

Rap1, los transfectantes se sometieron a ensayos de invasión, los cuales mostraron un


84

decremento significativo de la invasión de las células silenciadas para Rap1 en

comparación con su control (Figura 16D).

Además de su implicación en invasión, estudiamos el papel de Rap1 en la

adhesión de las células BLM estimulada por CXCL12. Los resultados indicaron que el

Figura 16.‐ Expresión de Rap1 en células BLM y su implicación en invasión: A) Determinación por western‐blot de la expresión de Rap1 en células BLM utilizando anticuerpos anti‐Rap1. B) Ensayo de actividad GTPasa en células BLM incubadas en presencia o ausencia de CXCL12 (150 ng/ml). C) Células transfectadas con los siRNAs indicados para Rap1, o con siRNA control, fueron sometidas a análisis por western‐blot (izquierda) para comprobar el silenciamiento (se muestran los resultados del análisis densitométrico, expresados en unidades relativas), o empleadas en ensayos de invasión a través de matrigel hacia CXCL12 (n=4). D) Células BLM fueron transfectadas con el vector pSuper‐shRap1 o con el vector vacío (pSuper). Los transfectantes fueron lisados y los extractos analizados por western‐blot, o sometidas a invasión hacia CXCL12 (n=2). La inhibición de la invasión fue significativa (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001).

siRNA

Rap1A.1 Rap1A.2

Ctrl

Rap1

β‐Actina

Molt‐4

BLM

A B

C

1 3.2

CXCL12 (min): 0’ 15’

Rap1 Activo

Rap1 Total

0

250

500

750

Control Rap1A.1

MedioCXCL12

**

siRNA

Células Invasivas

Rap1A.2

*

Rap1

β‐Actina

1 0.12 0,06 0,18

0

500

1000

1500

2000

pSuper pSuper‐Rap1A

Células Invasivas

***

MedioCXCL12

Rap1

β‐Actina

1 0.18

pSuper

pSuper‐shRap1

D

24 h 48 h 48 h

Resultados

85

silenciamiento de la expresión de esta GTPasa se traduce en una reducción parcial

pero significativa de la adhesión celular a fibronectina, tanto basalmente como en

presencia de la quimioquina, respecto de los transfectantes control (Figura 17).

0

200

400

600

BSA Medio CXCL12

Células ad

herida

s/mm

2

siRNA ControlsiRNA Rap1A.1

**

***

A continuación estudiamos el efecto de la sobre‐expresión de formas

constitutivamente activas de la GTPasa en invasión. Para ello, las células fueron

transfectadas con un vector vacío, o con construcciones que codifican para Rap1 WT o

Rap1 constitutivamente activo (CA). Tras verificar la expresión de las formas

transfectadas por western‐blot, los transfectantes fueron sometidos a experimentos

de invasión. Los resultados indican un incremento significativo de la invasión de los

transfectantes Rap1 CA en relación a las células transfectadas con la forma Rap1 WT

(Figura 18). Estos datos indican que la invasión de células de melanoma en respuesta

0

250

500

750

1000

Células Invasivas

^^

Mock

Rap1 wt

Rap1 CA

MedioCXCL12

β‐Actina

Rap1Rap1‐HA

Rap1‐HA HA

Rap1

Mock

Rap1 WT

Rap1 CA

WB

Figura 18.‐ La sobre‐expresión de RIAM se traduce en un aumento de invasión de las células de melanoma: Células BLM fueron transfectadas con una forma wild type de Rap1 (Rap1 WT), con la forma activa Rap1 12V (Rap1 CA), o con el vector vacío (Mock). Tras analizar la expresión de las proteínas por western‐blot empleando anticuerpos anti‐Rap1 y anti‐HA, las células fueron empleadas en ensayos de invasión hacia la quimioquina a través de matrigel (n=3). La invasión fue significativamente incrementada (^^ p<0,01).

Figura 17.‐ El silenciamiento de Rap1 en células BLM causa una inhibición de la adhesión celular a fibronectina: Células BLM transfectadas con siRNA control o con siRNA para RIAM fueron sometidas a ensayos de adhesión a fibronectina (10 minutos, 37 ºC) en presencia o ausencia de CXCL12 coinmobilizado (850 ng/ml). Las diferencias fueron significativas (** p<0,01; *** p<0,001).


86

a CXCL12 precisa de la función de Rap1.

Anteriormente se había demostrado que Rap1‐GTP activo interacciona con su

efector RIAM en linfocitos T (Lafuente et al., 2004). Para estudiar si RIAM es

expresado en células de melanoma humano, y en colaboración con la Dra. Sánchez

Mateos (Hospital Universitario Gregorio Marañón, Madrid), muestras quirúrgicas de

melanoma metastático de pacientes fueron analizadas mediante inmunohistoquímica,

empleando anticuerpos frente a RIAM y frente al marcador específico de melanoma

HMB‐45. El análisis de las imágenes obtenidas reveló una expresión moderada o baja

de RIAM en 7 de 8 nódulos linfáticos infiltrados macroscópicamente por células de

melanoma. El patrón de distribución celular de RIAM y su localización en los tumores

resultó ser heterogénea. Así, algunas células de melanoma mostraron una localización

predominantemente citoplásmica de RIAM, mientras que en otras se encontraba

principalmente en regiones próximas a la membrana. Más aún, las células de

melanoma positivas para RIAM se detectaron por toda la masa tumoral, y en algunas

muestras también en los bordes invasivos de los tumores (Figura 19).

Además de su expresión en tejido metastático de melanoma, la expresión de

RIAM fue detectada en las líneas celulares de melanoma BLM, MeWo, MV3, SK‐Mel‐

Figura 19.‐ Expresión de RIAM en muestras de melanoma metastático humano: Análisis inmunohistoquímico de la expresión de RIAM en metástasis de melanoma en nódulos linfáticos. Los cortes del tejido fueron teñidos con anticuerpos para el marcador específico de melanoma HMB‐45 (tumor) o con anticuerpos anti‐RIAM. La tinción con DAPI fue empleada para visualizar los núcleos. Se presenta la muestra #82. (Ver en el anexo la expresión de RIAM en muestras adicionales de melanoma, Figura suplementaria 1).

Resultados

87

147 y SK‐Mel‐173, mientras que su expresión fue indetectable en las células Mel‐57

(Figura 20A).

AGST

GST‐Ral

CXCL12

RIAM

β‐Actina

Rap1

SK‐Mel‐147

SK‐Mel‐173

Mel57

MeW

oMV3

RIAM

β‐Actina

BLM B

Una vez que la expresión de Rap1 y RIAM fue detectada en células BLM,

quisimos estudiar si ambas moléculas se asocian en estas células. Para ello se

realizaron experimentos basados en una variante del ensayo de actividad GTPasa, en

la que tras la exposición de las células a CXCL12, éstas se lisaron, y los lisados se

incubaron con la proteína de fusión Ral‐GDS. El análisis mediante western‐blot reveló

que RIAM se asocia a Rap1‐GTP tras la activación de esta GTPasa con la quimioquina

(Figura 20B).

Con el fin de investigar si RIAM es requerido para la invasión de células de

melanoma, estudiamos los posibles efectos de su silenciamiento sobre este proceso.

Células BLM fueron transfectadas transitoriamente con tres secuencias diferentes de

siRNA para RIAM, denominadas siRIAM #1, siRIAM #2 y siRIAM #3, y con un siRNA

control. Tras la comprobación del silenciamiento de RIAM (Figura 21, superior), los

distintos transfectantes fueron sometidos a ensayos de invasión hacia CXCL12. Estos

experimentos mostraron una fuerte inhibición de la invasión en células transfectadas

con los siRNAs de RIAM #2 y #3, mientras que los resultados obtenidos con las células

transfectadas con el siRIAM #1 fueron más modestos (Figura 21, inferior).

Figura 20.‐ RIAM se expresa en células de melanoma y se asocia a Rap1: A) Análisis mediante western‐blot de la expresión de RIAM en las líneas celulares de melanoma indicadas utilizando anticuerpos anti‐RIAM. B) Tras la exposición a la quimioquina durante 15 minutos, las células BLM fueron lisadas e incubadas con la proteína de fusión Ral‐GDS, y los lisados posteriormente sometidos a análisis por western‐blot con anticuerpos anti‐Rap1 y anti‐RIAM. Un anticuerpo anti‐β‐actina fue empleado como control negativo.


88

1 0.46 0.18 0.26

siRNA: Control

#1 #2 #3

RIAM

β‐Actina

0

300

600

900

siCtr 1

MedioCXCL12

2siRIAM (#)

Células inva

siva

s

**

***

3

***

Dada la inhibición de la invasión causada por el silenciamiento transitorio de

RIAM, y para poder desarrollar posteriormente experimentos de metástasis in vivo,

decidimos generar transfectantes establemente silenciados para la expresión de la

proteína. Para la generación de sublíneas establemente silenciadas para RIAM,

recurrimos a un sistema lentiviral de transferencia génica (Rubinson et al., 2003) (ver

sección Material y Métodos). Tras la infección, las células BLM fueron seleccionadas

por cell‐sorting en función de su expresión de GFP, obteniéndose las sublíneas D11 y

F7, infectadas con virus que portan la construcción pLL3.7 shRIAM, y la sublínea Mock,

infectada con virus que portan el correspondiente vector vacío (Figura 22A).

Para analizar si las células D11 y F7 tenían silenciada la expresión de RIAM,

realizamos experimentos de western‐blot y RT‐PCR, los cuales indicaron una

disminución del 80‐90% en los niveles de RIAM, en relación con el nivel de expresión

en células Mock (Figura 22B). A continuación, las células Mock, D11 y F7 fueron

sometidas a ensayos de invasión en respuesta a CXCL12, los cuales revelaron un

bloqueo en la invasividad a través de matrigel de las células silenciadas para RIAM, en

comparación con células Mock (Figura 22C). Como control de estos experimentos de

Figura 21.‐ El silenciamiento transitorio de RIAM se traduce en la inhibición de la invasión de células BLM: Células BLM fueron transfectadas con los siRNAs RIAM #1, #2 y #3, o con un siRNA control. Los transfectantes fueron analizados por western‐blot con anticuerpos anti‐RIAM (superior), o sometidos a ensayos de invasión a través de matrigel (n=3) (inferior) (** p<0,01; *** p<0,001).

Resultados

89

invasión, se comprobó mediante citometría de flujo que los niveles de expresión de

CXCR4 y de β1 no habían cambiado en las células D11 respecto de las Mock (no

mostrado).

0

800

1600

2400

Mock D11

MedioCXCL12

*** ***

F7shRIAM

Células Invasivas

BLM Mock D11 F7

0 100 101 102 103

Expresión de GFP (Intensidad de la Fluorescencia)

1% 99% 99% 98%

1 0.2 0.13

RIAM

β‐Actina

BLM

Mock

D11

F7shRIAM

D11

F7

shRIAM

Mock

BLM

RIAM

GAPDH

A

B C

100 101 102 103 100 101 102 103 100 101 102 103

De modo similar, células BLM que expresan establemente la proteína

luciferasa y que habían sido infectadas con virus pLL3.7shRIAM para silenciar RIAM, y

obtener así transfectantes (F8‐Luc) para ser utilizados en experimentos de análisis in

vivo de bioluminiscencia en modelos de metástasis, mostraron un bloqueo de la

invasión hacia CXCL12 (Figura 23).

Figura 22.‐ Inhibición de la invasión de células BLM establemente silenciadas para RIAM: A) Análisis por citometría de flujo de las células infectadas con los vectores pLL3.7 y pLL3.7shRIAM, seleccionadas en base a su expresión de GFP. B) Los transfectantes fueron lisados y analizados mediante western‐blot con anticuerpos frente a RIAM (superior), y RT‐PCR (inferior). C) Los transfectantes fueron sometidos a ensayos de invasión hacia CXCL12 (n=4). Se muestra la media y la desviación típica de un experimento representativo. La invasión fue inhibida significativamente (*** p<0,001).


90

0

800

1600

2400

Mock‐Luc

Células Invasivas

MedioCXCL12

***

F8‐Luc

Mock‐Luc

F8‐Luc

RIAM

β‐Actina

Con el fin de estudiar si el defecto en invasión hacia CXCL12 observado en las

células silenciadas para RIAM (RIAM KD) pudiera darse empleando otros estímulos,

decidimos analizar la invasión hacia suero tanto de los transfectantes establemente

silenciados para la expresión de RIAM como de células BLM transfectadas con siRNA

para la misma. Estos experimentos mostraron asimismo una inhibición significativa de

la invasión de las células silenciadas, en comparación con sus respectivos controles

(Figura 24).

Medio Suero

0

2500

5000

7500

Células invasivas

Mock D11siRNA

Control RIAM

*** ***

Trabajos anteriores han demostrado que las metaloproteasas MT1‐MMP y

MMP2 juegan un papel importante en la invasión y metástasis de células de

melanoma (Bartolome et al., 2004; Bartolome et al., 2006; Bartolome et al., 2009),

Figura 24.‐ El silenciamiento de RIAM en células BLM inhibe su invasión a través de matrigel estimulada por suero: Los transfectantes estables Mock y D11, o células BLM transfectadas con siRNA para RIAM o siRNA control, fueron sometidas a ensayos de invasión en respuesta a suero (10%) (n=2) (*** p<0,001).

Figura 23.‐ Las células F8‐Luc tienen inhibida la invasión hacia CXCL12. La interferencia estable de RIAM en células BLM‐pLZRS‐Luc se verificó mediante western‐blot con anticuerpos anti‐RIAM. La invasión promovida por la quimioquina (n=2) resultó inhibida en las células silenciadas de manera significativa (*** p<0,001).

Resultados

91

por lo que fueron objeto de estudio dado que el defecto en invasión causado por el

silenciamiento de RIAM en células BLM podría deberse a alteraciones en la expresión

y actividad de estas proteínas. Lisados de células BLM, Mock, D11 y F7 fueron

analizados por western‐blot para estudiar los niveles totales de expresión de MT1‐

MMP, no hallándose diferencias significativas entre los mismos. Asimismo, el análisis

de la secreción y procesamiento de MMP‐2 por zimografía gelatinolítica no reveló la

existencia de diferencias entre los sobrenadantes recolectados de estas células (Figura

25).

BLM

Mock

D11

F7

Pro MMP‐2MMP‐2 Activa

MT1‐MMP

β‐Actina

Para apoyar con más datos la importancia del papel de RIAM en la invasión

de células BLM, decidimos realizar experimentos de invasión empleando

transfectantes que sobreexpresan establemente esta proteína. Los niveles de sobre‐

expresión de RIAM en las sublíneas transfectadas con los vectores pcDNA3.1 RIAM‐

Myc (RIAM‐Myc) o pcDNA4‐MaxC RIAM‐His (RIAM‐His) fueron verificados tras los

procesos de transfección y selección de las células, analizando lisados de las mismas

mediante western‐blot (Figura 26, izquierda). Cuando estos transfectantes fueron

testados en ensayos de invasión celular hacia CXCL12, se observó un incremento

significativo de su capacidad invasiva respecto del nivel de invasión de las células

control (Figura 26, derecha).

Figura 25.‐ La expresión de MT1‐MMP y MMP‐2 no se ve afectada por el silenciamiento de RIAM: Células BLM, Mock, D11 y F7 fueron lisadas y analizadas por western‐blot con anticuerpos anti‐MT1‐MMP. Sobrenadantes recolectados de estas células se analizaron por zimografía gelatinolítica. La degradación de gelatina se corresponde con la actividad de MMP2 (inferior).


92

Células Invasivas

0

2000

4000

6000

Control Control RIAM‐Myc

Medio

CXCL12

RIAM‐His

^^^

^^^Control

RIAM

‐His

Control

RIAM

‐Myc

RIAM

β‐Actina

Para determinar que el silenciamiento de la expresión de RIAM era la causa

específica de la inhibición de la invasión celular, las células Mock y D11 fueron

transfectadas con la construcción pcDNA4‐MaxC‐RIAM‐His, para restaurar la

expresión de la proteína en estas últimas. Tras verificar mediante western‐blot los

niveles de expresión de RIAM en las células D11 después de la transfección con RIAM‐

His o RIAM‐Myc (Figura 27, izquierda), los transfectantes fueron testados en ensayos

de invasión hacia CXCL12. Los experimentos revelaron que el defecto en la invasión

mostrado por las células D11 había sido totalmente rescatado al recuperar la

expresión de RIAM, lográndose niveles de invasión similares a los de las células Mock

(Figura 27, derecha).

Para analizar si el silenciamiento de RIAM causaba la inhibición de la invasión

en otra línea de melanoma positiva para la expresión de esta proteína, empleamos las

células MV3. Dichas células fueron transfectadas con siRNA control o con siRNA para

RIAM, y tras confirmar el silenciamiento de esta proteína, los transfectantes fueron

testados en ensayos de invasión hacia suero (Figura 28). Los resultados indicaron que

Figura 26.‐ La sobre‐expresión de RIAM aumenta la invasión celular hacia CXCL12: Células BLM transfectadas establemente con las construcciones pcDNA4‐MaxC‐RIAM‐His (RIAM‐His) o pcDNA3.1‐RIAM‐Myc (RIAM‐Myc) y sus respectivos controles fueron analizados por western‐blot con anticuerpos anti‐RIAM (izquierda). Los transfectantes fueron testados en ensayos de invasión hacia CXCL12 (n=3) (derecha), encontrándose diferencias significativas (^^^ p<0,001).

Resultados

93

los transfectantes silenciados para RIAM mostraban una inhibición significativa de la

invasión en comparación con las células control.

Todos estos resultados, considerados en conjunto, indican que la invasión de

las células de melanoma requiere tanto de la actividad de Rap1 como de RIAM.

Control

RIAM

‐His

Control

RIAM

‐His

RIAM

β‐Actina 1200

2400

3600

Control

RIAM‐His

D11Mock

0

Control

RIAM‐His

ΔΔΔ

Células invasivas

Mock D11

RIAM

Control

siRNA:

RIAM

β‐Actina

1 0,35

MedioSuero

0

1000

2000

3000

Células invasivas

Control RIAM

siRNA

***

Figura 27.‐ La restauración de la expresión de RIAM en células D11 recupera su capacidad de invasión hacia CXCL12: Células Mock y D11 fueron transfectadas con el vector pcDNA4‐MaxC‐RIAM‐His, o con el vector vacío, y posteriormente fueron sometidas a análisis de la expresión de RIAM por western‐blot (izquierda), o a ensayos de invasión hacia CXCL12 (derecha). La invasión fue significativamente incrementada (^^^ p<0,001).

Figura 28.‐ El silenciamiento de RIAM en células de melanoma MV3 se traduce en inhibición de su invasión: Las células MV3 fueron transfectadas con siRNA RIAM#2 o con siRNA control, y los transfectantes fueron analizados por western‐blot (izquierda) para evaluar la expresión de RIAM, o empleados en ensayos de invasión hacia CXCL12 (derecha). La invasión fue significativamente inhibida (*** p<0,001).


94

Dado que Rap1 y RIAM interaccionan entre sí en las células BLM y que ambas

proteínas son requeridas para la invasión de estas células, decidimos estudiar las

relaciones entre ellas en la ruta de señalización desencadenada en respuesta a

CXCL12. Para ello, las células BLM fueron cotransfectadas con siRNAs para Rap1 o

para RIAM, y con vectores que codifican para RIAM‐His o para la forma activa de Rap1

(Rap1 CA), respectivamente. Los ensayos de invasión hacia CXCL12 llevados a cabo

con los transfectantes muestran que el defecto en la invasión observado en las células

silenciadas para Rap1 puede ser recuperado con la sobre‐expresión de RIAM, pero no

al revés, lo que indica que Rap1 se encontraría por encima de RIAM en la vía de

señalización (Figura 29).

*

*

**

N.S.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Mock Rap1 CA RIAM‐His Mock RIAM‐His Mock Rap1 CA

Control siRNA Rap1 siRNA RIAM siRNA

Células invasivas Medio

CXCL12

RIAM

Rap1

β‐actina

RIAM‐His

Rap1

Rap1

RIAM

RIAM

Control

Control

Control

Mock Rap1 CA

siRNA:

Figura 29.‐ La sobre‐expresión de RIAM en células silenciadas para Rap1 es capaz de recuperar el defecto en la invasión de estas células: Las células BLM fueron cotransfectadas con los siRNAs y los vectores indicados, y los transfectantes fueron sometidos a ensayos de invasión hacia CXCL12 a través de matrigel. La invasión fue significativamente estimulada (* p<0,05; ** p<0,01). Una parte de las células fue lisada y analizada mediante western‐blot empleando los anticuerpos indicados.

Resultados

95

La direccionalidad y la persistencia de migración se encuentran afectadas en células

BLM silenciadas para RIAM

Para explorar los mecanismos subyacentes al defecto en invasión a través de

geles tridimensionales de matrigel observado en las células silenciadas para RIAM,

decidimos estudiar sus propiedades migratorias en dos dimensiones. En primer lugar,

se efectuaron ensayos de cierre de herida, los cuales constituyen un modelo útil para

el estudio de la migración celular bidimensional, y que han sido empleados para

determinar las capacidades migratorias de líneas celulares de melanoma (Moyano et

al., 2003). Los experimentos mostraron que, mientras las células Mock cerraron la

herida en 24 horas en presencia de CXCL12, la migración de las células D11 fue

deficiente, no pudiendo cerrar la herida en dicho periodo de tiempo (Figura 30A), lo

que sugiere un defecto en la migración de las células silenciadas para la expresión de

RIAM.

A continuación, realizamos ensayos de migración dirigida por un gradiente de

concentración de CXCL12 generado en cámaras de quimiotaxis, tomando imágenes

secuenciales a tiempo real de las células dispuestas en las mismas. El análisis de los

trazados recorridos por dichas células durante la migración (cell tracking), mostró que

las células Mock son capaces de migrar con alto grado de persistencia direccional,

preferentemente hacia la quimioquina. Contrariamente, las células D11 presentaron

una migración deficiente, recorriendo una distancia media Euclídea de

aproximadamente la mitad que la observada para las células Mock (Figura 30B). Esta

observación indicaría la existencia de defectos en la diraccionalidad y en la

persistencia de la migración bidimensional en las células silenciadas para RIAM.


96

F8‐Luc

0h

24h

Mock D11

500 µm

CXCL12

EMD66.16 ± 45.2 mM

EMD150.08 ± 95.2 mM

Mock D11

100

200

300

‐200

‐300

‐100

0

A

B

Figura 30.‐ La persistencia direccional de la migración es deficiente en células de melanoma silenciadas para RIAM: A) Ensayos de wound‐healing realizados sobre matrigel en presencia de CXCL12 (50 ng/ml). Las imágenes mostradas se corresponden con las de un experimento representativo a las 0 y a las 24 horas tras haberse realizado la herida (n=3). B) Los transfectantes fueron sometidos a experimentos de quimiotaxis dirigida por CXCL12 en cámaras tapizadas con matrigel. CXCL12 (150 ng/ml) fue añadido en el reservorio superior de las cámaras, y las células (n=15 por grupo) migraron en el canal central. Se tomaron imágenes secuenciales de la migración (Time‐lapse microscopy), que fueron analizadas trazando las trayectorias en los ejes X e Y, empleando un punto central común de origen. Se muestra el resultado de un experimento representativo (n=3). EMD: Distancia Media Euclídea (Euclidean mean distance).

Resultados

97

Un examen detallado de la formación de protrusiones celulares durante la

migración, realizado tomando imágenes secuenciales de las células, reveló que las

células Mock extienden dinámicamente multitud de pseudópodos, lamelipodios y

filopodios (Figura 31, superior). Por el contrario, en las células D11 pudo observarse la

formación de ondas periódicas de extensión de la lamela, que generan una morfología

redondeada y no polarizada (Figura 31, inferior).

La activación de Vav2, RhoA y MLC está inhibida en células BLM silenciadas para

RIAM

Ha sido descrito que el eje de señalización Vav2‐RhoA está implicado en la

regulación de la motilidad celular y en la invasión de células de melanoma dirigida por

CXCL12 (Bartolome et al., 2006). La deficiencia en la persistencia direccional de la

migración en las células RIAM KD podría tener origen en una polarización celular

Figura 31.‐ Formación de protrusiones de membrana en células RIAM KD: Células transfectadas con paxilina‐dsRed adheridas a fibronectina fueron grabadas durante 6 horas, tomándose imágenes secuenciales de microscopía confocal de las mismas. Se muestran dos células representativas de los grupos Mock y D11, presentándose marcos temporales de 1 hora de duración. * indica zonas de extensión de membrana.

Mock

D11

* * * * *

1 2 3 4 5 6

Tiempo sobre Fibronectina (h)

* * * * * *

* * * * ** * * * **

* * **

*

*

*

*

*

*

*

* * *

* * * * *

* *

*

*

**

** *

* * *

*


98

deficiente, causada a su vez por una falta de contractilidad celular (Amano et al., 1996;

Gomes et al., 2005). Dado que la formación de fibras de estrés y la contractilidad

requieren de la actividad de las cadena ligeras de la miosina (MLC, Myosine light

chains) de la miosina II, dependiente de la actividad de la GTPasa RhoA, decidimos

examinar si la señalización a través de estas moléculas está afectada en las células

deficientes para RIAM.

En primer lugar, analizamos la fosforilación de Vav2, un GEF que activa a

RhoA en células BLM (Bartolome et al., 2006). Los experimentos revelaron que tanto

la fosforilación en tirosina de Vav2 como su unión a RhoA tras la estimulación con

CXCL12, fueron menores en las células D11 que en las células Mock (Figura 32A). Sin

embargo, los niveles de fosforilación de p190‐RhoGAP, un GAP de RhoA, fueron

similares en células Mock y D11 (datos no mostrados). Los resultados sugieren que la

activación de RhoA pudiera estar afectada en las células silenciadas para RIAM, por lo

que analizamos los niveles de activación de esta GTPasa en estas células. Dichos

ensayos indicaron que RhoA es activado por CXCL12 en las células Mock, mientras que

en las células D11 dicha activación es deficiente (Figura 32B).

Ha sido documentado que RhoA es capaz de activar a su efector ROCK, que,

en última instancia, fosforila a MLC (Amano et al., 1996). La miosina II fosforilada es

entonces capaz de ensamblarse en los filamentos de miosina que se asocian con los

filamentos de actina, generándose las fibras de estrés contráctiles necesarias para la

migración. Experimentos de western‐blot dirigidos a estudiar la fosforilación de MLC

indicaron la existencia de niveles menores de fosforilación de esta proteína en células

D11 que en Mock, lo cual correlaciona con el defecto en la activación de RhoA en

células RIAM KD (Figura 32C). Todos estos datos sugieren que la activación del eje de

señalización Vav2‐RhoA‐MLC está alterada en células de melanoma deficientes para

RIAM.

Resultados

99

0 1.5 5 0 1.5 5

Mock D11

CXCL12 (min):

RhoA activo

RhoA total

RhoA unido

CXCL12 (min): 0 1 5 0 1 5

Mock D11

anti‐p‐Tyr

WB

anti‐Vav2

anti‐RhoA

1 3.3 2.1 0.8 0.7 0,8

IP: anti Vav2

Vav2 total

Fosfo‐Vav2

Mock D11

CXCL12 (min): 0 5 15 0 5 15

Fosfo‐MLC

MLC total

β‐Actina

A

B

C

Para determinar si la inhibición en la activación de Vav2‐RhoA observada en

células D11 contribuía a la inhibición de su invasión en respuesta a CXCL12,

transfectamos formas constitutivamente activas tanto de Vav2 como de RhoA (Vav2

CA y RhoA CA, respectivamente), en células Mock y D11, y analizamos los

transfectantes en ensayos de invasión (Figura 33A, derecha).

Figura 32.‐ El silenciamiento de RIAM en células de melanoma causa una activación deficiente del eje de señalización Vav2‐RhoA‐MLC: A) Células Mock y D11 fueron expuestas a CXCL12 (150 ng/ml) durante los tiempos indicados, y lisadas a continuación. Los extractos fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti‐Vav2, y a inmunoblotting con los anticuerpos indicados. Los números bajo el western‐blot indican el resultado del análisis densitométrico de los niveles de fosforilación de Vav2, en unidades relativas. B) La actividad de RhoA en respuesta a CXCL12 fue determinada por ensayos de actividad GTPasa. C) Las células fueron estimuladas con CXCL12, y tras lisarlas, los extractos se analizaron mediante western‐blot utilizando los anticuerpos anti‐MLC total y anti‐fosfo‐MLC.


100

Vav2 wt

Vav2 wt

Vav2 CA

Vav2 CA

Mock D11

WBanti‐Vav2

Control

Vav2‐GFPVav2

RhoA

wt

RhoA

wt

0

100

200

300

RhoA

wt

Mock D11

Células Invasivas Medio

CXCL12

RhoA

wt

RhoA

CA

RhoA

CA

**

0

250

500

750

Vav2 wt

Mock D11

Células Invasivas

MedioCXCL12

Vav2 CA

**

Vav2 wt

Vav2 CA

Mock D11

Vav2 wt Vav2 CA Vav2 wt Vav2 CA‐ + ‐ + ‐ + ‐ +CXCL12:

RhoA activo

RhoA total

A

Mock D11

RhoA

CA

RhoA

CARhoA‐GFP

RhoA

B

La sobre‐expresión de Vav2 CA en células D11 rescató la activación de RhoA

en respuesta a la quimioquina en las mismas, como demuestran los experimentos de

actividad GTPasa, conllevando además una recuperación parcial pero significativa del

potencial invasivo de estas células (Figura 33A). Más aún, la sobre‐expresión de la

forma constitutivamente activa de RhoA en las células D11 condujo asimismo a una

recuperación parcial de la invasión, en comparación con las células Mock y D11

transfectadas con la forma RhoA WT (Figura 33B).

Figura 33.‐ La activación deficiente de Vav2‐RhoA está implicada en la inhibición de la invasión de células de melanoma silenciadas para RIAM: A) Células Mock y D11 fueron transfectadas con formas WT o CA de Vav2 fusionadas con GFP, y los transfectantes fueron lisados para analizar la expresión de las formas transfectadas de Vav2 (superior), o para realizar ensayos de actividad GTPasa tras estimular las células con CXCL12. Los transfectantes se testaron en ensayos de invasión (n=2) (** p<0,001). B) Las células Mock y D11 fueron transfectadas con vectores de expresión que codifican para formas WT o constitutivamente activas (CA) de RhoA fusionadas con GFP, y la expresión de estas formas se analizó mediante western‐blot con anticuerpos anti‐RhoA. Los transfectantes fueron sometidos a ensayos de invasión (n=3) (** p<0,01).

Resultados

101

De manera similar, células F8‐Luc en las que se expresó la forma activa de

RhoA (Figura 34, izquierda) mostraron una recuperación parcial de la invasión en

comparación con sus correspondientes controles transfectados con la forma WT de

RhoA (Figura 34). Globalmente, estos resultados indican que el defecto en la invasión

observado en las células de melanoma silenciadas para RIAM implica un defecto en la

activación del eje de señalización Vav2‐RhoA‐MLC.

0

200

400

600

RhoA

wt

Mock‐Luc F8‐Luc

Células invasivas

MedioCXCL12

RhoA

wt

RhoA

CA

RhoA

CA

^^

RhoA‐GFP

RhoA wt

RhoA CA

RhoA CA

RhoA wt

RhoA

Mock‐Luc F8‐Luc

La asociación de talina y β1 se encuentra reducida en células RIAM KD

Dado que los anticuerpos anti‐RIAM no fueron capaces de detectar por

inmunofluorescencia el RIAM endógeno expresado en células BLM, decidimos

sobreexpresar esta proteína utilizando el vector RIAM‐His para estudiar la distribución

celular de RIAM. El análisis mediante microscopía confocal reveló que esta proteína se

localiza difusamente por todo el citoplasma, apareciendo asimismo acúmulos de la

misma en los extremos de las protrusiones celulares (Figura 35A).

Figura 34.‐ El defecto en la invasión de células F8‐Luc es parcialmete recuperado al transfectar RhoA CA: Las células Mock‐Luc y F8‐Luc fueron transfectadas con vectores de expresión que codifican para RhoA WT o RhoA CA. La expresión de estas formas se analizó mediante western‐blot con anticuerpos anti‐RhoA (izquierda). Los transfectantes fueron sometidos a ensayos de invasión estimulada por CXCL12 (n=3) (derecha), (^^ p<0,01).


102

IP: Anti‐HisCtrlmAb

Anti‐talina

Anti‐His

WB

LisadoTotal

Mock

MockRIA

M‐His

RIAM‐His

Talina

RIAM‐His

B

A Anti‐RIAM Anti‐His Superposición

**

* *

10 μm

Se ha descrito previamente que un fragmento N‐terminal de RIAM

interacciona directamente con talina (Lee et al., 2009), por lo que estudiamos en

primer lugar si RIAM y talina podían asociarse en células BLM que expresaban RIAM‐

His. Ensayos de co‐inmunoprecipitación revelaron que dichas proteínas eran capaces

de asociarse en estas células (Figura 35B). Dado que el dominio rod de talina

interacciona con la región citoplásmica de la subunidad β de las integrinas, lo cual es

un evento fundamental en el proceso de activación de estas últimas (Tadokoro et al.,

2003), analizamos si el silenciamiento de RIAM en las células BLM pudiera haber

afectado a esta asociación. Para ello llevamos a cabo experimentos de co‐

inmunoprecipitación de talina y β1, empleando lisados de células Mock y D11, así

como de células que sobreexpresan RIAM. Estos ensayos mostraron una reducción de

la asociación talina‐β1 en las células D11 en relación con las células Mock, mientras

Figura 35.‐ Distribución de RIAM en células BLM, y su asociación con talina: Las células BLM fueron transfectadas con el vector pcDNA4‐MaxC‐RIAM‐His (RIAM‐His), y tras su adhesión a fibronectina, los transfectantes fueron analizados mediante microscopía confocal con anticuerpos anti‐RIAM y anti‐His (A), o fueron lisados para realizar experimentos de co‐inmunoprecipitación con anticuerpos anti‐His. El western‐blot fue realizado con los anticuerpos indicados (B).

Resultados

103

que en los experimentos realizados con los transfectantes que sobreexpresan RIAM‐

His, se detectaron niveles mayores de asociación respecto de los observados en las

células control (Figura 36A). Estos resultados indican que RIAM regula la asociación de

talina con β1.

Notablemente, el defecto en la asociación talina‐β1 en las células D11 fue

recuperado al sobreexpresar RIAM‐His en dichas células (Figura 36B).

1 0.33

Mock

D11

Talina

β11 2.8

Control

RIAM

‐His

IP: Ctrl anti‐β1 Ctrl anti‐ β1

LisadoTotal

A BMo

ckMo

ck/Control

Mock/RIAM

‐His

D11/RIA

M‐His

D11/Control

IP: Ctrl anti‐β1

Talina

β1

Talina

Mock

Control

Las células deficientes para RIAM tienen alterada la adhesión mediada por

integrinas β1

Dado el defecto observado en la interacción talina‐β1 en células RIAM KD, y

debido a la relevancia de la misma en la activación de las integrinas (Tadokoro et al.,

2003; Moes et al., 2007), analizamos la activación de β1 y la capacidad de adhesión de

estas células a diferentes sustratos dependiente de esta integrina. En primer lugar,

realizamos experimentos de citometría para investigar el estado de activación de β1

cuando se silencia la expresión de RIAM o, por el contrario, cuando ésta se

sobreexpresa, empleando el anticuerpo 15/7, el cual reconoce específicamente la

Figura 36.‐ RIAM regula la asociación talina‐β1: A) Lisados de los transfectantes Mock, D11, Control y RIAM‐His fueron sometidos a inmumoprecipitación con el anticuerpo anti‐β1 Lia1/2.1. El inmunoblotting subsiguiente fue realizado con anticuerpos anti‐talina y anti‐β1. Se muestra la densitometría correspondiente a estos geles. B) Células Mock y D11 fueron transfectadas con un vector vacío o con la construcción RIAM‐His, y se lisaron para la realización de los ensayos de inmunoprecipitación con el anticuerpo Lia1/2.1. Una parte de los lisados se sometió a western‐blot para comprobar los niveles de expresión de talina.


104

conformación activa de esta integrina (Yednock et al., 1995). La activación de β1 en las

células D11 resultó estar moderadamente disminuída, en comparación con las células

Mock (Figura 37A). Experimentos realizados tras la exposición de estas células a Mn++,

un control positivo para la regulación de la afinidad de la integrina, mostraron una

capacidad de unión del anticuerpo similar en células Mock y D11 (Figura 37A).

Contrariamente, las células que sobreexpresan la proteína RIAM‐His unieron

cantidades mayores de 15/7 respecto de las células control (Figura 37B).

Conjuntamente con los resultados mostrados en los experimentos de asociación

talina‐β1 (Figura 36), estos datos sugieren que RIAM contribuye a la activación de la

integrina β1.

Control mAb

101100 102 103

MockD11

104‐Mn2+

RIAM‐His(10.9)

Control(6.9)

Intensidad de Fluorescencia0

15/7 mAb

+ Mn2+

RIAM‐His(26.8)Control

(29.6)

100 101 102 103

Intensidad de Fluorescencia

CXCL12 (30 sec)

(59.6)(31.8)MockD11

Mn++

D11(143.2)(140.7)

100 101 102

Mock

15/7 mAb

(31.0)D11

(41.4)Mock

CXCL12 (60 sec)

103 104

A B

Figura 37.‐ Activación de la integrina β1 en células BLM silenciadas para RIAM, o que sobreexpresan esta proteína: A) Células Mock y D11 fueron incubadas con CXCL12 (200 ng/ml) o MnCl2 (1 mM), y a continuación analizadas por citometría de flujo empleando el anticuerpo anti‐β1 15/7 o el anticuerpo control P3X63, seguido de detección con un anticuerpo secundario acoplado a rodamina. Los números muestran la intensidad media de fluorescencia (n=3). B) Los transfectantes fueron anlizados por citometría de flujo con el anticuerpo anti‐ β1 15/7, en presencia o ausencia de MnCl2 (n=2).

Resultados

105

Con el fin de investigar la capacidad de adhesión de las células establemente

silenciadas para RIAM, decidimos realizar experimentos de adhesión estática a

distintos sustratos. La adhesión de las células D11 tanto a fibronectina como a

colágeno tipo I resultó estar significativamente reducida respecto de lo observado en

células Mock (Figura 38A, y 38B, izquierda, respectivamente). De modo similar, las

células BLM transfectadas transitoriamente con siRNA para RIAM mostraron una

disminución de su adhesión a colágeno tipo I, en comparación con los transfectantes

siRNA control (Figura 38B, derecha).

MockRIAM‐His

Δ

200

400

600

mAbControl

Anti‐β1

Adhesión a Colágeno I

A

B

Células ad

herida

s/mm

2

MockD11

Anti‐β1mAbControl

**

Células ad

herida

s/mm

2

200

400

Adhesión a Fibronectina

BSA BSA

150

300

1 2 2

Col I (μg/ml)

MockD11

**

0

Células ad

herida

s/mm

2

mAbControl

Anti‐β1

***

***

*

0

100

200

300

Col I (μg/ml)

1 2

siRNAControlRIAM

Células ad

herida

s/mm

2

BSA

Figura 38.‐ Caracterización de la adhesión celular en los transfectantes de RIAM: Los transfectantes silenciados para RIAM y sus controles fueron testados en ensayos de adhesión a fibronectina (A) o colágeno tipo I (10 minutos 37 ºC) (B), en presencia del anticuerpo control anti‐ β1 Lia1/2.1. La adhesión fue significativamente inhibida (** p<0,01; *** p<0,001) o estimulada (^ p<0,05).


106

Cuando los ensayos fueron efectuados empleando células que sobreexpresan

RIAM‐His, se observó que éstas se adherían más firmemente a fibronectina que las

células control (Figura 38A, derecha). Todos estos datos indican que RIAM regula la

adhesión celular dependiente de las integrinas β1, y sugieren que la reducción en los

niveles de activación de estas integrinas en las células silenciadas para RIAM pudiera

representar un mecanismo implicado en su menor capacidad de adhesión a sustratos

de las integrinas β1.

Las células de melanoma silenciadas para RIAM tienen una activación deficiente de

las vías de señalización Ras‐Erk1/2 y PI3‐K/Akt

La adhesión celular dependiente de integrinas β1 desencadena una

señalización intracelular, denominada outside‐in (Giancotti y Ruoslahti, 1999;

Schwartz y Assoian, 2001), que conduce a la activación de las vías Ras/Raf/MEK/

Erk1/2 y PI3‐K/Akt, las cuales regulan la proliferación y la supervivencia celular. Dado

que las células BLM silenciadas para RIAM tienen disminuida su adhesión celular

mediada por estas integrinas, investigamos si la fosforilación basal de Erk1/2 y de Akt

se hallaba alterada en las células RIAM KD. Los resultados indicaron que la activación

de estas quinasas era menor en las células D11 en comparación con las células Mock

(Figura 39A, izquierda).

A continuación, investigamos los efectos de la adhesión celular sobre la

activación de Erk1/2 y Akt. Los resultados mostraron un defecto en la activación,

tanto de Erk1/2 y de Akt, en respuesta a la adhesión a fibronectina y a colágeno en las

células D11 frente a células control (Figura 39A, centro y derecha). De modo similar,

tras la adhesión a colágeno tipo I, la fosforilación de Erk1/2 y de Akt resultó estar

disminuida en las células silenciadas transitoriamente para RIAM, en comparación con

las células transfectadas con siRNA control (Figura 39B).

Resultados

107

Erk1/2 total

Control

RIAMsiRNA:

Fosfo‐Akt

Fosfo‐Erk1/2

Erk1/2 total

Akt total

Vinculina

B

Fosfo‐Akt

Fosfo‐Erk1/2

Akt total

A

Mock

D11

CondiciónBasal

Erk1/2 total

Fosfo‐Erk1/2

Control

RIAM

‐His

Control

RIAM

‐His

C

4 8 24 4 8 24

Mock D11

Adhesión a FN (h)2 4 6 2 4 6

D11Mock

Adhesión a Col I (h)

Mock D11

Col I (6h)

Para analizar si la reducción en la activación de Erk1/2 en las células

silenciadas establemente para RIAM podía ser revertida al re‐expresar RIAM,

transfectamos estas células con el vector RIAM‐His, y determinamos la activación de

esta quinasa. Los resultados indicaron que la sobre‐expresión de RIAM‐His en las

células D11 se tradujo en una recuperación de la activación de Erk1/2 a niveles

similares a los de las células Mock (Figura 39C). Además, las células Mock que

Figura 39.‐ Análisis de la fosforilación de Erk1/2 y de Akt en células RIAM KD. (A y B) Los transfectantes, procedentes directamente del cultivo (Condición Basal), o adheridos a fibronectina o a colágeno tipo I durante los tiempos indicados, y tras la obtención de lisados de los mismos, los extractos fueron sometidos a western‐blot con anticuerpos contra Erk1/2, fosfo‐Erk1/2, Akt y fosfo‐Akt. C) Células Mock y D11 fueron transfectadas con vectores control o RIAM‐His, y seguidamente analizadas mediante western‐blot con anticuerpos frente a Erk1/2 y fosfo‐Erk1/2.


108

sobreexpresan RIAM presentaron niveles de fosforilación basal de la MAP quinasa

mayores que los de su control.

Estudiamos asimismo si la activación de la GTPasa H‐Ras, una proteína

implicada en los eventos iniciales de la activación de Erk1/2, estaba alterada en las

células interferidas para la expresión de RIAM. Experimentos de actividad GTPasa

indicaron que las células D11 presentan un menor grado de activación de H‐Ras en

comparación con lo observado en células Mock, tanto basalmente como tras la

estimulación con CXCL12 (Figura 40), lo que correlaciona con el defecto en la

activación de Erk1/2 ya descrito.

Considerados globalmente, los resultados indican que el silenciamiento de

RIAM en células de melanoma afecta a la activación de moléculas que participan en la

señalización outside‐in dependiente de las integrinas β1, y que regulan la proliferación

celular y la supervivencia, entre las que se encuentran Erk1/2 y de PI3‐K.

Mock

D11

Mock

D11

Mock

D11

H‐Ras Activo

H‐Ras Total

0 1 5 CXCL12 (min)

Trabajos previos destacan la relación funcional (cross‐talk) entre las integrinas

y los receptores de factores de crecimiento como EGF (Epidermal Growth Factor)

(Schwartz, 1997; Giancotti y Ruoslahti, 1999; Schwartz, 2001; Schwartz y Assoian,

2001; Cabodi et al., 2004). Así, las integrinas cooperan con estos receptores para

incrementar o mantener la activación de las rutas de señalización, como es el caso de

las vías MEK/Erk1/2 y PI3‐K/Akt. Dado que las células silenciadas para RIAM presentan

una disminución de la capacidad de adhesión asociada a un defecto en la activación

de Erk1/2 y de Akt, investigamos si dicho defecto podía ser rescatado por la

estimulación con EGF. Para ello, células Mock y D11 en placas de cultivo se

mantuvieron durante 8 horas en medio sin suero, y a continuación fueron incubadas

en presencia o ausencia de EGF. Los resultados mostraron que el defecto inicial en la

Figura 40.‐ El silenciamiento de RIAM causa una inhibición de la actividad de H‐Ras. Células Mock y D11 fueron incubadas en presencia o ausencia de CXCL12 y lisadas a continuación. Posteriormente, se realizó un ensayo GTPasa con los mismos, empleando anticuerpos anti‐H‐Ras.

Resultados

109

activación de Erk1/2 y de Akt en las células D11 se tradujo en un retraso en la

activación de estas quinasas en respuesta a EGF, aunque posteriormente dicha

activación fue parcialmente recuperada (Figura 41).

Fosfo‐Akt

Fosfo‐Erk1/2

Erk1/2 total

Akt total

Vinculina

0 30” 1´ 5´ 0 30” 1´ 5´

EGF 100ng/mlMock D11

Crecimiento y propiedades metastáticas de las células de melanoma silenciadas

para RIAM

Dada la relevancia de RIAM en los procesos de adhesión, de migración y de

invasión de células de melanoma in vitro, investigamos su papel en el crecimiento

tumoral y en la metástasis in vivo. Ratones de la cepa Balb/c SCID fueron inoculados

con los transfectantes Mock, D11 y F7 por vía subcutánea para analizar el desarrollo

tumoral. En el periodo de tiempo comprendido entre los días 25 y 75 tras la

inoculación con células Mock, todos los animales (n=13) desarrollaron tumores de 1,5

a 2 cm3, mientras que sólo 3 de un total de 10 inoculados con células D11 y 1 de 10

inoculados con células F7, presentaron tumores de ese tamaño. La proporción de

animales que no desarrolló ningún tumor a día 125 post‐inoculación fue del 60% y del

90% de los inoculados con células D11 y F7, respectivamente (Figura 42).

Figura 41.‐ Estudio de la fosforilación de Erk1/2 y de Akt en células RIAM KD en respuesta a EGF. Células Mock y D11 fueron estimuladas con el factor EGF (100 ng/ml) durante los tiempos indicados. Los lisados obtenidos fueron resueltos por western‐blot, empleándose anticuerpos frente a las formas fosforiladas de Erk1/2 y de Akt, como se indica.


110

Mock (n=13)D11 (n=10)F7 (n=10)

Inoculación subcutánea

0

20

40

60

Ratone

s con tumores (%

)

25 50 75 100 125Días post‐inoculación

0

20

40

60

80

100

Ratones sin tumores (%

)

125

Para el estudio de la formación de metástasis, los animales fueron inoculados

por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Tres semanas tras la inoculación con

células Mock, los ratones desarrollaron síntomas de estrés respiratorio asociados a la

aparición de metástasis pulmonares, presentando una supervivencia media de 32 días.

Al cabo de 6 semanas tras la inoculación, no quedó ningún superviviente de esta serie

de ratones (Figura 43A). Por el contrario, el periodo libre de enfermedad de los

retones inoculados con células D11 y F7 fue de 5,5 y 8 semanas, respectivamente, y su

vida media de aproximadamente 50 y de 65 días. Los análisis tras el sacrificio de los

animales revelaron la existencia de metástasis pulmonares masivas y multinodulares,

independientemente de si habían sido inoculados con células Mock, D11 o F7. Estos

resultados indican un incremento significativo de la supervivencia de los ratones

inyectados con células silenciadas para RIAM respecto de los inoculados con células

Mock.

Figura 42.‐ Crecimiento tumoral de las células Mock y RIAM KD en ratones SCID: Los ratones Balb/c SCID fueron inoculados subcutáneamente con células Mock, D11 y F7. Se evaluó diariamente el desarrollo tumoral en la pared lateral de la caja torácica, hasta que alcanzó un tamaño de alrededor de 2cm3. Los datos muestran la correlación entre días post‐inoculación y el porcentaje de ratones que desarrollaron tumores de dicho tamaño (izquierda), o aquéllos que a día 125 no desarrollaron tumor (derecha).

Resultados

111

El análisis de las células de melanoma obtenidas de cultivos de las metástasis

pulmonares determinó que éstas eran GFP positivas, confirmándose así que las

células responsables de la metástasis eran aquéllas que habían sido inoculadas. Las

mismas células fueron sometidas a ensayos de invasión hacia CXCL12, los cuales

mostraron que los transfectantes recuperados tenían niveles de invasión similares a

los de los transfectantes originales, indicando que estas células habían mantenido sus

propiedades invasivas durante la diseminación tumoral (Figura 43B y C). Todos estos

datos indican que RIAM controla el crecimiento de células de melanoma in vivo, y que

contribuye a la metástasis de estas células a los pulmones.

Figura 43.‐ El silenciamiento de RIAM en células de melanoma causa un retraso en la formación de metástasis: A) Curvas de supervivencia de ratones Blab/c SCID inoculados con los transfectantes indicados. La supervivencia de los ratones inoculados con células RIAM KD fue significativamente mayor que la de los inoculados con células Mock (*** p<0,001). B) La expresión de GFP de las células tumorales recuperadas de los pulmones fue analizada por citometría de flujo. C) Las células recuperadas de metástasis pulmonares y posteriormente cultivadas fueron sometidas a ensayos de invasión (n=2).

Inoculación intravenosa

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100Días

Supe

rviven

cia (%

)

Mock (n=14)D11 (n=12)F7 (n=8)

***

***

MedioCXCL12

0

500

1000

1500

2000Cé

lulas Invasivas

Mock D11Intensidad de Fluorescencia (GFP)

1030 100 101 102

BLM Mock

1030 100 101 102

F7

1030 100 101 102

D11

1030 100 101 102

A

B C


112

Las células de melanoma silenciadas para RIAM tienen inhibida su capacidad de

proliferación in vitro

Dado que las células silenciadas para RIAM que habían sido inoculadas

subcutáneamente presentaban una inhibición de su crecimiento in vivo, investigamos

su capacidad de proliferación independiente de anclaje, realizándose ensayos de

proliferación en soft‐agar (Figura 44A). Los resultados revelaron una capacidad

prácticamente nula de formación de colonias en las células D11 y F7 en este medio,

en comparación con las células Mock. A continuación se realizaron ensayos de MTT,

medida indirecta de proliferación que está íntimamente relacionada con el

metabolismo mitocondrial (Heo et al., 1990). Los experimentos llevados a cabo con

células Mock, D11 y F7 revelaron una disminución significativa en la tasa de actividad

mitocondrial, y por tanto en la proliferación, en las células silenciadas para RIAM

respecto de las células Mock (Figura 44B, izquierda). Por el contrario, cuando se

valoró en estos ensayos la tasa de proliferación de células BLM que sobreexpresan

RIAM‐His, se observó un aumento con respecto a las células control.

Asimismo, se realizaron curvas de crecimiento de los transfectantes Mock,

D11 y F7, las cuales mostraron una mayor proliferación de las células Mock que de las

células silenciadas para RIAM, incrementándose las diferencias con el tiempo, como

se observa en la gráfica de la Figura 44C. Globalmente, estos datos sugieren que el

defecto en el crecimiento tumoral in vivo de las células silenciadas para RIAM está

basado en su deficiente capacidad proliferativa, lo cual pudiera estar basado en la

inhibición de la activación de la MAP‐quinasa Erk1/2 y de Akt.

Resultados

113

0

40

80

120

0 2 3Núm

ero de

células (x10

3 )

MockD11

Días en cultivo41

Ensayo de proliferación

0

0,2

0,4

0,6

Mock D1

1 F7

Unida

des de

absorba

ncia

**

ΔΔΔ

0

0,2

0,4

0,6

0,8

RIAM‐HisCo

ntrol

Ensayos MTT

Mock F7D11

Núm

ero de

colon

ias

Soft‐agar

B C

A

1

0

800

1600

Mock D11 F7

Las células en las que se ha silenciado la expresión de RIAM son más propensas a la

apoptosis tanto en ambientes bidimensionales como tridimensionales

Dado que las células RIAM KD muestran una capacidad proliferativa menor

que las células control, tanto in vivo como in vitro, estudiamos si las mismas eran

también más proclives a la apoptosis. Para ello se realizaron, en primer lugar, curvas

de supervivencia celular tras tratar a las células Mock y RIAM KD con distintas dosis de

compuestos con efectos citotóxicos como el cisplatino, un agente alquilante del DNA

empleado en el tratamiento de tumores sólidos (Go y Adjei, 1999). Estos

Figura 44.‐ Análisis de la proliferación celular en células RIAM KD. A) Se muestran campos representativos del ensayo de formación de colonias en soft‐agar, tras 28 días de incubación (izquierda). Se muestra la media del recuento de aquellas colonias mayores de de 50 μm (derecha) (n=3, duplicados). B) Los transfectantes Mock, D11 y F7, y transfectantes control o sobreexpresando RIAM‐His fueron analizados en ensayos de MTT (n=3) para evaluar su capacidad proliferativa. La proliferación fue significativamente inhibida (* p<0,05), o aumentada (^^^p<0,001). C) Para determinar la capacidad de crecimiento de las células Mock y D11, las mismas concentraciones de éstas fueron sembradas y cultivadas durante los tiempos indicados, realizándose un recuento a cada tiempo (n=2).


114 experimentos mostraron que la tasa de supervivencia de las células D11 y F7 fue

Figura 45.‐ Estudio de la susceptibilidad a la apoptosis en células RIAM KD. A) Tras un tratamiento de los transfectantes con diferentes dosis de cis‐platino (0‐100 μM) (superior), se evaluó el porcentaje de células supervivientes empleando métodos colorimétricos, o se obtuvieron lisados, los cuales fueron analizados por western‐blot, utilizando los anticuerpos anti PARP‐1 (CF, cleaved fragment) y anti‐pro‐caspasa‐3. B) Células Mock, D11 y F7 fueron tratadas con H2O2 (5 μm), empleándose métodos colorimétricos para determinar el porcentaje de células viables. C) Valoración por western‐blot de la fosforilación de la MAP‐quinasa p38 en respuesta a cisplatino (50 μM), empleando extractos de células Mock y D11 obtenidos tras los tiempos indicados de tratamiento. Se emplearon anticuerpos frente a las formas total y fosforilada de dicha MAP‐quinasa.

0

40

80

100 50 25 12,5 6,25 0

Cisplatino (μM)

Supe

rviven

cia celular (%

)

MockD11F7

20

60

100

*

0

20

40

60

80

100

Mock D11 F7Supe

rviven

cia celular (%

)

H2O2

β‐Actina

Cisplatino (μM): 0 50 75 0 50 75

Mock D11

Pro‐Caspasa 3

PARP‐1

CF

Cisplatino (h): 0 8 24 0 8 24

Mock D11

Fosfo‐p38

p38 total

A B

C

Resultados

115

experimentos mostraron que la tasa de supervivencia de las células D11 y F7 fue

significativamente menor que en células Mock, para las mismas concentraciones de

cisplatino (Figura 45A, superior). Esta observación correlacionó con una reducción de

los niveles de pro‐caspasa3 y con un aumento del procesamiento de PARP‐1, sustrato

último de la cascada de las caspasas (Figura 45A, inferior). Asimismo, cuando las

células fueron sometidas a dosis subletales de H2O2, se observó una supervivencia de

las células D11 y F7 significativamente menor que la de células Mock (Figura 45B).

La activación de las MAP‐quinasas p38 juega un papel clave en el control de la

proliferación y la supervivencia celular (Wagner y Nebreda, 2009). Las proteínas p38

son activadas principalmente por citoquinas proinflamatorias y por estrés osmótico,

térmico u oxidativo, así como por el daño al ADN. p38 está implicada en la regulación

de la apoptosis, la respuesta inmune, la proliferación, la diferenciación y la

supervivencia celular (Zechner et al., 1997; Vanden Berghe et al., 1998; Zechner et al.,

1998; Ono y Han, 2000). Para estudiar la posible alteración de la activación de esta

MAP‐quinasa en células RIAM KD, investigamos su nivel de fosforilación cuando los

transfectantes eran incubados en presencia de cisplatino. Los resultados indicaron un

aumento de la fosforilación de p38 en células D11 en relación a las células Mock

(Figura 45C).

Dado que las células de melanoma invaden a través del tejido conectivo de la

dermis, rico en colágeno tipo I, estudiamos la posibilidad de que las células

silenciadas para RIAM pudieran sufrir apoptosis en estos entornos. Para ello,

evaluamos la integridad nuclear de las células Mock y D11 embebidas en matrices de

colágeno tipo I, obteniendo imágenes de las mismas mediante microscopía confocal,

tras teñir los núcleos con el colorante DAPI. Como puede apreciarse en la Figura 46A,

cerca del 75% de los núcleos de las células D11 se presentan saturados, y en función

del grado de progresión de la apoptosis, compactados o fragmentados, en

comparación con los de las células Mock, que muestran una apariencia normal, no

saturada, en el 85% de los casos. Además, el marcaje de estas muestras con

anticuerpos anti‐caspasa 3 fragmentada mostró claramente la existencia de procesos

apoptóticos por vía mitocondrial en las células D11 que no se aprecian en las células

control (Figura 46B). Estos resultados, considerados globalmente, sugieren que las


116

células defectivas para la expresión de RIAM sufren apoptosis en ambientes

tridimensionales, posiblemente debido a una falta de señalización outside‐in como

consecuencia de adhesión celular deficiente mediada por integrinas β1.

Colágeno

I 3D Mock

D11

DAPI GFPA

B

Integridad nuclear, 72 hr

0

20

40

60

80

100

Mock D11

% del total de nú

cleo

s

Núcleosnormales

Núcleosrotos/compactos

DAPI Caspasa‐3

Mock

D11Co

lágeno

I 3D

Figura 46.‐ Las células RIAM KD sufren apoptosis en entornos tridimensionales: Células Mock y D11 cultivadas durante 72 horas en geles de colágeno I fueron teñidas con DAPI (A), para evaluar la integridad nuclear en base a las imágenes de confocal obtenidas (se presenta la cuantificación porcentual), o con anticuerpos anti‐caspasa3 fragmentada (B), para evaluar la apoptosis (derecha) (se muestra un campo representativo en cada caso).

Resultados

117


118

II. REGULACIÓN DE LA DINÁMICA DE LAS ADHESIONES FOCALES POR RIAM.

MECANISMOS BIOQUÍMICOS IMPLICADOS.

Las células de melanoma silenciadas para la expresión de RIAM muestran

alteraciones en el número y distribución de las adhesiones focales

Tal y como hemos mostrado, el silenciamiento de RIAM en células de

melanoma causa alteraciones en la adhesión y la migración celular, lo que se traduce

en en una invasión celular deficiente. Las adhesiones focales, de las que las integrinas

y talina son elementos constituyentes, conforman los puntos de anclaje de la célula a

la matriz extracelular, siendo un vínculo entre dicha matriz y el citoesqueleto de

actina (Webb et al., 2002; Parsons et al., 2010). La migración celular requiere una

renovación dinámica de las adhesiones focales para que pueda producirse el

movimiento polarizado de las células (Horwitz y Parsons, 1999). Dado que RIAM se

asocia con talina y colocaliza con otras proteínas de las adhesiones focales, nos

planteamos la hipótesis de que el silenciamiento de RIAM pudiera afectar a la

dinámica de estas adhesiones. Para estudiar dicha hipótesis, las células establemente

silenciadas para la expresión de RIAM (D11 y F8‐Luc), así como células BLM

transitoriamente interferidas para la expresión de esta proteína con siRNAs, fueron

adheridas a fibronectina y sus adhesiones focales analizadas mediante microscopía

confocal utilizando anticuerpos frente a paxilina, una proteína fundamental en la

formación de estos complejos. Estos análisis mostraron que, mientras que las células

Mock presentaban una distribución fundamentalmente periférica de los complejos de

las adhesiones que contienen paxilina, las células deplecionadas para RIAM mostraron

una importante acumulación de dichas adhesiones focales en la parte central de la

superficie celular (Figura 47A, B y C).

Un abordaje cuantitativo e integrativo, empleando el programa informático

PMA, permitió diseccionar la información contenida en las imágenes de microscopía

confocal, indicando que las células D11 tenían un mayor número de adhesiones y una

proporción mayor de área celular cubierta por adhesiones que lo observado en

células Mock (Figura 48A).

Resultados

119

Figura 47.‐ Las células BLM silenciadas para RIAM presentan alteraciones en la localización de las adhesiones focales: Células Mock y D11 (A), Mock‐Luc y F8‐Luc (B) y BLM transfectadas con siRNA control o con los siRNAs indicados para RIAM (C) fueron analizadas mediante microscopía confocal empleando anticuerpos anti‐paxilina (rojo). Los núcleos fueron teñidos utilizando DAPI (azul). Las barras indican la escala de tamaño (20 μm).

A

D11

Mock

na

B

C

Mock‐Luc F8‐LucPaxilina

siControl siRIAM#3siRIAM#2

Paxilina


120

Más aún, como confirmaron los correspondientes análisis cuantitativos, las células

silenciadas para RIAM presentaban un mayor número de adhesiones focales

localizadas más distantemente respecto de la periferia celular que lo observado en

células Mock (Figura 48B). El silenciamiento de RIAM no sólo alteró la distribución de

paxilina en la superficie de las células BLM, sino que también condujo a un

enriquecimiento en el número de adhesiones que contenían la integrina β1 presentes

en la parte central de la superficie celular, en comparación con las células Mock, como

revelaron los experimentos de inmunofluorescencia de la Figura 49A y su

correspondiente cuantificación (Figura 49B).

p<0.001

% de área

celularcubierta

porad

hesion

es

Mock D11

p<0.05

Núm

erode

adh

esione

s/célula

Mock D11

4 5 6 7 8 9 10

MockD11

Distancia media a la periferia celular (μm)

Núm

erode

adh

esione

s/Cé

lula

50

100

150

200

7,7

6,4

p<0.001

A B

50

100

150

200

Figura 48.‐ Análisis cuantitativos muestran alteraciones en el número y en la distribución de las adhesiones focales de las células BLM silenciadas para RIAM: Análisis cuantitativos e integrativos realizados con el programa informático PMA determinaron los los parámetros Número de adhesiones por célula y Porcentaje del área celular cubierta por adhesiones focales (A), y Distancia media a la que dichas adhesiones se encuentran localizadas respecto de la periferia celular (B), a partir de imágenes de microscopía confocal de células Mock y D11 (n>16). Las diferencias halladas fueron significativas.

Resultados

121

Mock

D11

Distancia media a la periferia celular (μm)

Núm

erode

adh

esione

s/Célula

p<0.01

150

300

100

200

250

50

4 5 6 7 8 9 10 11 12

MockD11

7,7

9,4

150

300

100

200

250

50

A B

Para comprobar que estas alteraciones eran específicamente debidas al

silenciamiento de RIAM, recuperamos la expresión de RIAM en células D11 tras la

transfección de vectores RIAM‐His, lo cual condujo al rescate del patrón de

distribución preferentemente periférico de las adhesiones focales observado en

células Mock (Figura 50).

Con el fin de iniciar el estudio de la dinámica de las adhesiones focales en los

transfectantes Mock, D11 y F8‐Luc, se obtuvieron imágenes secuenciales (Time‐lapse

microscopy) de las células tras la transfección de la proteína fluorescente de fusión

paxilina‐DsRed2, la cual se incorpora in vivo a las adhesiones focales. La paxilina‐

DsRed2 se localizaba principalmente en la periferia de las células Mock, mientras que

estaba presente tanto en la periferia como en áreas centrales de las células D11 y F8‐

Figura 49.‐ La distribución de las adhesiones focales que contienen la integrina β1 está alterada en células de melanoma deficientes para RIAM: A) Células Mock y D11 adheridas fibronectina fueron analizadas mediante microscopía confocal empleando anticuerpos anti‐β1. B) Las imágenes fueron procesadas con el software PMA para determinar cuantitativamente la distancia media a la que las adhesiones focales se encuentran respecto al la periferia celular en los mismos transfectentes. Las diferencias halladas fueron significativas.


122

Luc. Un exámen más detallado de estas adhesiones reveló que éstas eran mayores y

más estables en las células deficientes para RIAM que en las células Mock (Figura 51).

Mock+RIAM‐His

D11+RIAM‐His

Mock+Control

D11+Control

Paxilina

0

20

40

60

80

100

Células con feno

tipo

Mock (%

)

n=20

Control

RIAM

‐His

Control

RIAM

‐His

Mock D11

0 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min

Mock

F8 ‐Luc

D11

*** *

** *

** *

** *

***

**

*

**

Figura 50.‐ La re‐expresión de RIAM en células silenciadas para esta proteína recupera el patrón normal de distribución periférica de las adhesiones focales: Células Mock y D11 transfectadas con un vector vacío (control) o con el vector que codifica para RIAM‐His fueron adheridas a fibronectina y analizadas mediante microscopía confocal, empleando anticuerpos anti‐paxilina (rojo, izquierda). El fenotipo de las células fue evaluado (derecha), determinándose el porcentaje de células que presentan una distribución preferentemente periférica de las adhesiones. La barra (20 μm) indica la escala.

Figura 51.‐ El silenciamiento de RIAM en células BLM causa un incremento de la estabilidad de las adhesiones focales: Células Mock, D11 y F8‐Luc fueron transfectadas con el vector paxilina‐DsRed2, y la dinámica de las adhesiones contenidas en las regiones seleccionadas fue analizada a los tiempos indicados.

Resultados

123

Para investigar si las alteraciones observadas en la distribución y el número

de adhesiones tras el silenciamiento de RIAM en células BLM se daban asimismo en

otras líneas celulares de melanoma, decidimos transfectar células de la línea MV3,

positivas para la expresión de RIAM, con un siRNA para esta proteína. Los

transfectantes fueron empleados en experimentos de inmunofluorescencia,

analizándose la localización de paxilina. Estos ensayos revelaron que las células MV3

control muestran una distribución periférica de las adhesiones focales que contienen

paxilina, mientras que aquellas transfectadas con el siRNA para RIAM presentan un

incremento en el número de adhesiones localizadas en la parte central de la superficie

celular, de manera similar a lo observado en células BLM (Figura 52). Adicionalmente,

la depleción de RIAM en células de melanoma MV3 conlleva la adquisición de una

morfología más redondeada, con acumulación de actina cortical en la periferia celular.

Este fenotipo es especialmente evidente en estas células MV3, ya que

morfológicamente presentan un fenotipo más mesenquimal que el observado en las

células BLM (Figura 52).

Control

RIAM

siRNAF‐actinaPaxilina

Figura 52.‐ El silenciamiento de RIAM en células MV3 altera el patrón de distribución de las adhesiones focales: Células MV3 fueron transfectadas con siRNA control o siRNA para RIAM, y sometidas a análisis por microscopía confocal empleando anticuerpos anti‐paxilina (rojo). Se muestra la tinción de actina con faloidina (verde).


124

Estos datos indican que el silenciamiento de RIAM afecta al patrón de

distribución y a la dinámica de las adhesiones focales, sugiriendo la posibilidad de que

el recambio de las mismas pudiera estar afectado en las células deficientes para la

expresión de RIAM.

Las células de melanoma silenciadas para RIAM tienen un desensamblaje deficiente

de las adhesiones focales

Tras su ensamblaje y maduración, las adhesiones focales necesitan

desensamblarse para permitir la migración celular (Webb et al., 2002; Ridley et al.,

2003; Parsons et al., 2010). Una posible explicación para la acumulación de las

adhesiones focales en áreas predominantemente centrales de la superficie de células

silenciadas para RIAM, tal y como se ha mostrado en las anteriores figuras (Figuras 46

a 51), podría ser un incremento de la estabilidad de las adhesiones focales, resultado

del desensamblaje deficiente de las mismas.

Se ha descrito anteriormente que el desensamblaje de las adhesiones focales

depende del contacto de los microtúbulos con estos complejos (Ezratty et al., 2005).

Dado que el nocodazol inhibe la polimerización de los microtúbulos, y que por tanto

detiene el desensamblaje de las adhesiones focales, decidimos emplearlo para

investigar el proceso de desensamblaje de las mismas tras retirar dicho inhibidor,

siguiendo protocolos previamente establecidos (Kaverina et al., 1998). De esta

manera pudimos seguir la renovación de las adhesiones tras la eliminación del

nocodazol, tomando imágenes secuenciales mediante microscopía confocal. Como

era de esperar, el tratamiento con nocodazol inhibió la polimerización de los

microtúbulos tanto en células Mock como en D11, tal y como se observó mediante la

utilización de anticuerpos anti‐tubulina, de manera que los mismos comenzaron a

reorganizarse gradualmente tras eliminar el inhibidor (Figura 53A). Asociado con el

bloqueo en la polimerización de los microtúbulos debido al tratamiento

Resultados

125

Nocodazol

Tiempo de lavado de Nocodazol (min)

60 120 200

Mock

D11

Paxilina

Nocodazol

Tiempo de lavado del Nocodazol (min)

60 120 200

Tubulina

Mock

D11

A

B

con nocodazol, so observó un incremento en el número de adhesiones que contenían

paxilina en células Mock y D11 (Figura 53B). Una vez que se permitió la reorganización

de los microtúbulos al retirar el inhibidor, pudo observarse el desensamblaje de las

Figura 53.‐ Las células de melanoma RIAM KD presentan un defecto en el desensamblaje de las adhesiones focales: Células Mock y D11 crecidas fibronectina (10 μg/ml) fueron sometidas a un tratamiento con nocodazol (50 μM), que fue lavado a continuación. Las células fueron marcadas con anticuerpos frente a tubulina (A) o frente a paxilina (B) (rojo), y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Se tomaron imágenes de microscopía confocal de las diferentes condiciones. Se muestran imágenes representativas en cada caso.


126

adhesiones focales en las células Mock, siendo claramente visibles en la periferia

celular tras 200 minutos de incubación después de la eliminación del nocodazol. Sin

embargo, la mayor parte de las adhesiones focales presentes en células D11 fueron

resistentes al desensamblaje forzado por la reorganización de los microtúbulos,

permaneciendo estables durante todo el periodo de lavado del compuesto (Figura

53B).

Notablemante, los experimentos de FRAP (Fluorescence Recovery After

Photobleaching), llevados a cabo tomando adhesiones focales periféricas como diana

en células Mock y D11 transfectadas con el vector paxilina‐DsRed2, confirmaron la

existencia de alteraciones en la dinámica de las adhesiones. Mientras que en las áreas

de las células Mock cuya fluorescencia había sido extinguida, ésta fue recuperada

dinámicamente por moléculas vecinas de paxilina‐DsRed2, presentando un tiempo

medio de recuperación de 28 segundos, la recuperación de la fluorescencia estaba

inhibida en las células D11 (Figura 54). Además, de forma importante, la expresión de

RIAM‐His en células D11 condujo a la obtención de tiempos medios y perfiles de

recuperación similares a los de las células Mock, recuperándose el defecto debido al

silenciamiento de RIAM, e indicando el rescate de la dinámica de las adhesiones

focales (Figura 54, inferior). Estos resultados indican que el recambio de las

adhesiones focales está afectado en las células silenciadas para la expresión de RIAM.

RIAM es necesario para la correcta asociación de talina‐FAK y de FAK‐Paxilina en

células de melanoma

La talina contribuye al reclutamiento de FAK a las adhesiones focales (Chen et

al., 1995), y las interacciones entre estas moléculas son necesarias para la correcta

dinámica de renovación de las adhesiones focales (Webb et al., 2002; Webb et al.,

2004; Mitra et al., 2005). Dado que las células silenciadas para RIAM presentan un

defecto en el desensamblaje de las adhesiones focales, y la menor asociación de

talina‐β1 observada en las mismas (Figura 36), decidimos estudiar la eficiencia de la

asociación de talina y FAK en células Mock y D11.

Resultados

127

Figura 54.‐ Las células de melanoma silenciadas para RIAM presentan una inhibición en el recambio de paxilina en las adhesiones focales: Células Mock y D11 fueron transfectadas con el vector paxilina‐dsRed y, tras adherirlas a fibronectina, fueron sometidas a ensayos de FRAP, tomando como diana preferentemente adhesiones periféricas, marcadas como áreas de interés (rectángulo verde). Se presentan imágenes representativas de células Mock y D11, así como series temporales en las que se muestra la fluorescencia antes de la extinción (bp), después de la misma (ap), y su recuperación a distintos tiempos en dichas áreas (superior). Células Mock y D11 cotransfectadas con el vector paxilina‐dsRed2 y con un vector vacío (control) o con el vector para RIAM‐His fueron sometidas a FRAP empleando las condiciones anteriores, y la fluorescencia fue posteriormente evaluada (inferior). Tras su cuantificación y normalización, los perfiles de recuperación de la fluorescencia en cada transfectante se muestran en la gráfica (inferior, izquierda). Las diferencias halladas, tomando como referencia el tiempo medio de recuperación de la fluorescencia de las células Mock control (28 segundos), fueron significativas (*** p<0,001, derecha).

D11

Mock

D11

bp ap 25” 50” 100” 150” 200” 250” 300”

Mock

Tiempo

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 50 100 150 200

Tiempo de recuperación (sg)

Mock

Mock‐RIAM‐HisD11‐RIAM‐His

D11

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Mock+ctrol

Mock+RIAM

‐His

D11+ctrol

D11+RIAM

‐His

Intensidad

norm

alizada

***

n=21 n=12

n=15

n=20

τ1/2=22τ1/2=28τ1/2=38

Intensidad

normalizada


128

Mediante ensayos de co‐inmunoprecipitación realizados tanto con anticuerpos anti‐

talina como con anticuerpos anti‐FAK en las células silenciadas para RIAM,

observamos una menor asociación de FAK y talina, en comparación con lo observado

en células control (Figura 55A).

Dado que FAK se asocia asimismo con paxilina (Deakin y Turner, 2008),

quisimos estudiar si los niveles de asociación entre FAK y paxilina eran alterados por

el silenciamiento de RIAM. Experimentos de co‐inmunoprecipitación llevados a cabo

empleando anticuerpos anti‐FAK mostraron que mientras que los niveles de

asociación entre FAK y paxilina se incrementan tras la adhesión a fibronectina en

células Mock, la asociación entre estas proteínas en las células D11 fue menor

independientemente del tiempo de adhesión al sustrato (Figura 55B). Estos resultados

sugieren que RIAM es necesario para mantener el correcto ensamblaje de las

adhesiones focales, siendo requerido para la correcta interacción de los elementos

que las forman.

Mock

D11

anti‐Talina

Mock

Ac Ctrl

FAK

Talina

A

BIP:

Mock

D11

Mock

anti‐FAKAc CtrlIP:

FAK

Talina

Mock 0 30 60 120 0 30 60 120

Mock D11

Ac Ctrl anti‐FAK

FAK

Paxilina

Adhesión a FN (min)

IP:

Figura 55.‐ La asociación de FAK con talina y paxilina en células de melanoma se ve afectada por el silenciamiento de RIAM: A) La asociación de talina y FAK fue determinada en expermentos de co‐inmunoprecipitación llevados a cabo con lisados de células Mock y D11, las cuales fueron incubadas con anticuerpos anti‐talina o anti‐FAK. El inmunoblotting fue realizado con los anticuerpos indicados. B) Se obtuvieron lisados de los transfectantes tras mantenerlos en suspensión (tiempo 0) o tras adherirlos a fibronectina durante los tiempos indicados (30‐120 minutos), que se incubaron con anticuerpos anti‐FAK antes de resolverse por western‐blot empleando anticuerpos frente a FAK y frente a paxilina.

Resultados

129

El silenciamiento de RIAM conduce a un incremento de la fosforilación de FAK y

paxilina en residuos de tirosina

Para mantener un control adecuado de la dinámica de las adhesiones focales,

las células deben poseer una estrecha regulación de la fosforilación en residuos de

tirosina presentes en proteínas como FAK y paxilina, las cuales son elementos

constituyentes de las mismas (Webb et al., 2002; Parsons et al., 2010). Dado que la

asociación entre estas proteínas en las células silenciadas para RIAM se encuentra

alterada, investigamos su fosforilación en residuos de tirosina. Análisis mediante

western‐blot revelaron la existencia de un mayor grado de fosforilación en tirosina de

una banda predominante que migra con un peso molecular de alrededor de 125 kDa

en células D11, respecto de lo observado en células Mock (Figura 56A).

Adicionalmente, aunque tanto células Mock como D11 marcadas con anticuerpos

anti‐fosfotirosina y analizadas mediante inmunofluorescencia presentaron marcaje de

las adhesiones focales periféricas, sólo en las células silenciadas para RIAM pudo

observarse asimismo un enriquecimiento de las adhesiones localizadas en la parte

central de la superficie celular (Figura 56B), de manera similar al patrón ya observado

para la distribución de las adhesiones cuando éstas son marcadas con anticuerpos

anti‐paxilina.

A

Mock

100

150

D11

F8‐Luc

Mock D11

Fosfo‐tirosina

BWB

Fosfo‐tirosina

β‐Actina

kDa

1 1,6 1,5

Figura 56.‐ Las células BLM silenciadas para RIAM presentan mayores niveles de fosforilación en residuos de tirosina: A) Los transfectantes indicados fueron analizados por western‐blot empleando anticuerpos anti‐fosfo‐tirosina. Se muestra una región del blot comprendida entre 100 y 150 kDa. B) Células Mock y D11 fueron analizadas mediante microscopía confocal empleando anticuerpos anti fosfo‐tirosina.


130

La banda de 125 kDa detectada mediante western‐blot podría corresponder a

FAK, por lo que analizamos el grado de fosforilación de esta proteína. Análisis

bioquímicos de la fosforilación de FAK indicaron que, tras la adhesión a fibronectina,

las células D11 presentan un incremento gradual en el nivel de fosforilación de esta

quinasa en los residuos de tirosina Y397 e Y576, en comparación con los niveles de las

células Mock (Figura 57A). Más aún, cuando los transfectantes fueron empleados en

ensayos de inmunofluorescencia marcando las formas fosforiladas de FAK en las

tirosinas Y397 e Y576, pudo observarse que la tinción era más intensa en la parte

central de la superficie de las células D11 que en la de las células Mock (Figura 57B).

Mock

D11

Fosfo‐FAK (Y397)B Fosfo‐FAK (Y576)FAK

Fosfo‐FAK (Y397)

20 120 20 120

Mock D11

Adhesión a FN (min)

FAK

Fosfo‐FAK (Y576)

A

Figura 57.‐ La fosforilación de FAK está incrementada en células BLM silenciadas para RIAM: A) Células Mock y D11 fueron adheridas a fibronectina durante los tiempos indicados, y analizadas por western‐blot (A) o mediante microscopía confocal (B) empleando anticuerpos frente a FAK y sus formas fosforiladas (Y576 e Y397). La barra (20 μm) indica la escala.

Resultados

131

La fosforilación de paxilina en los residuos de tirosina Y118 e Y31 ha sido

previamente implicada en el control del recambio de las adhesiones focales y en

migración celular (Deakin y Turner, 2008). La fosforilación de estos residuos de

tirosina en paxilina resultó ser notablemente mayor en las células silenciadas para

RIAM que en los transfectantes Mock, ya fueran éstos cultivados sobre fibronectina o

sobre colágeno tipo I, como muestran los western‐blots de la Figura 58A, y B.

2 4 6 2 4 6

Adhesión a FN (h)

Mock D11

Paxilina

Fosfo‐Paxilina(Y118)

A

B2 4 6 2 4 6

Adhesión a FN (h)

Mock D11

Paxilina


B

2 4 6 8 2 4 6 8

Mock D11

Adhesión a Col I (h)

Paxilina


Análisis de estos mismos transfectantes mediante microscopía confocal

revelaron asimismo una acumulación del marcaje anti‐fosfopaxilina‐Y118 en áreas

centrales de la superficie de las células silenciadas para RIAM (Figura 59A). De manera

coincidente con los resultados bioquímicos, tras extraer de las imágenes obtenidas

información relativa a la intensidad del marcaje gracias al programa informático PMA,

se pudo detectar la existencia de un mayor ratio de intensidad de marcaje de

Figura 58.‐ La fosforilación de paxilina en residuos de tirosina se encuentra incrementada en células RIAM KD: Células Mock y D11 fueron adheridas a fibronectina o colágeno tipo I durante los tiempos indicados, y posteriormente analizadas por western‐blot con anticuerpos anti‐paxilina total, anti‐fosfo‐paxilina Y118 (A), o frente a la paxilina fosforilada en el residuo Y31 (B).


132

fosfopaxilina‐Y118 frente al marcaje de paxilina total en las células D11 respecto de

Figura 59.‐ Análisis de la distribución de fosfo‐paxilina en células BLM silenciadas para RIAM: A) Células Mock y D11 adheridas a fibronectina fueron analizadas en ensayos de inmunofluorescencia, empleando anticuerpos anti‐paxilina (verde) y anti‐fosfo‐paxilina Y118 (rojo). En la superposición de las imágenes se muestran asimismo los núcleos teñidos con DAPI (azul). La barra (20 μm) indica la escala. B) Las imágenes obtenidas (n>20) fueron analizadas cuantitativa e integrativamente con el programa informático PMA, determinándose los parámetros indicados.

B

Intensidad

(Fosfo‐Paxilina

Y11

8/Paxilin

a Total) MockD11 Mock

D11

0 10 20 µM

0,9

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,48 0,73

1,6

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

2,4

1,8

2

2,6 MockD11

X=Distancia de las adhesiones a la

periferia celular

Paxilina Fosfo‐Paxilina (Y118)

Mock

D11

SuperposiciónA

Resultados

133

fosfopaxilina‐Y118 frente al marcaje de paxilina total en las células D11 respecto de

las Mock, siendo las diferencias significativas (Figura 59B). Dichas diferencias en el

ratio de intensidades resultaron ser más pronunciadas en la periferia que en las

regiones centrales de la superficie celular (Figura 59B, derecha). Todo esto se traduce

en la presencia de una mayor proporción de moléculas de paxilina fosforiladas en las

adhesiones focales de las células silenciadas para RIAM que en el control.

Para confirmar más aún que el incremento en la fosforilación de paxilina en la

tirosina Y118 era específicamente debido al silenciamiento de RIAM, decidimos

interferir transitoriamente la expresión de RIAM en las células BLM, lo que se tradujo

en niveles mayores de fosforilación de paxilina en esta tirosina (Figura 60A). Asimismo,

Figura 60.‐ La expresión de RIAM regula los niveles de fosforilación de paxilina en células BLM: A) Células BLM transfectadas con siRNA control o con siRNA para RIAM fueron sometidas a análisis mediante western‐blot empleando los anticuerpos indicados. B) Estos mismos transfectantes fueron adheridos a fibronectina y empleados en ensayos de inmunofluorescencia con anticuerpos anti‐paxilina total (verde) y anti‐fosfo‐paxilina‐Y118 (rojo). Los núcleos se muestran teñidos con DAPI (azul).

Paxilina Fosfo‐Paxilina (Y118) Superposición

siRNAControl

siRNARIAM

B

siContro

l

siRIAM

2

ß‐Actina

Paxilina

Fosfo‐Paxilina (Y118)

A


134

las células transfectadas con el siRNA para RIAM mostraron una acumulación de las

adhesiones marcadas con anti‐fosfopaxilina‐Y118 en la parte central de la superficie

celular comparado con las células control, como se muestra en las imágenes de

microscopía confocal de la Figura 60B.

A continuación analizamos si los cambios en los niveles de fosforilación

observados en FAK eran específicamente debidos al silenciamiento de RIAM. Así, el

incremento en la fosforilación de FAK en la tirosina Y576 observado en las células D11

fue revertido al restaurar la expresión de RIAM tras transfectar el vector RIAM‐His,

alcanzándose niveles semejantes al de las células Mock (Figura 61A). Esta observación

Figura 61.‐ La re‐expresión de RIAM en células RIAM‐KD revierte la alteración en los niveles de fosforilación de FAK y el patrón de distribución periférico de las adhesiones que contienen esta quinasa: Células Mock y D11 fueron transfectadas con los vectores control o RIAM‐His, y sometidas a análisis mediante inmunoblotting empleando anticuerpos frente a fosfo‐FAK Y576 o frente a FAK total (A), o empleadas en ensayos de inmunofluorescencia con anticuerpos anti‐FAK (B). Se muestra la cuantificación de las células que presentan una distribución preferentemente periférica de las adhesiones focales, expresada en porcentaje (n>100) (B, derecha).

Control

Control

RIAM

‐His

FAK

Fosfo‐FAK(Y576)

A

Mock D11

RIAM

‐His

Mock

RIAM‐HisB

D11

Control

0

20

40

60

80

100

Control

RIAM‐His

Control

RIAM‐His

Células con feno

tipo

Mock(%

)

Mock D11

Resultados

135

bioquímica correlacionó con una localización preferentemente periférica de las

adhesiones que contenían FAK en las células D11 transfectadas con RIAM‐His, tal y

como se muestra en la Figura 61B.

De manera similar a lo observado con FAK, el incremento en la fosforilación

de paxilina en la tirosina 118 resultó asimismo ser dependiente de RIAM, ya que la

expresión de RIAM‐His en células D11 se tradujo en la disminución de los niveles de

fosforilación de este residuo de tirosina, alcanzándose niveles similares a los de las

células Mock (Figura 62A). Adicionalmente, ensayos de inmunofluorescencia

mostraron que la sobre‐expresión de RIAM‐His en las células D11 era asimismo capaz

de rescatar el patrón de distribución fundamentalmente periférico de las adhesiones,

ya sean éstas marcadas con anti‐paxilina total o con anti‐fosfo‐paxilina Y118, en

contraste con las células D11 empleadas como control (Figura 62B).

A

Paxilina


Mock D11

Control

Control

RIAM

‐His

RIAM

‐His

D11+RIAM‐His

Fosfo‐Paxilina (Y118)

Mock+RIAM‐HisB

Figura 62.‐ La restauración de la expresión de RIAM en células RIAM KD revierte a niveles normales la fosforilación de paxilina y restaura la distribución periférica de las adhesiones focales que contienen paxilina: Células Mock y D11 fueron transfectadas con los vectores control o RIAM‐His, y analizadas mediante western‐blot empleando anticuerpos frente a fosfo‐paxilina Y118 o frente a paxilina total (A), o sometidas a ensayos de inmunofluorescencia empleando anticuerpos anti‐fosfo‐paxilina Y118 (B).


136

Considerados globalmente, todos estos resultados indican que RIAM es

necesario para mantener una correcta distribución celular de FAK y paxilina, y una

regulación adecuada de su fosforilación. Aún así, nuestros datos no permiten

diferenciar entre la posibilidad de que el aumento en la fosforilación de FAK y paxilina

sea la causa de las alteraciones observadas en el recambio de las adhesiones focales

observada en las células silenciadas para RIAM, o una consecuencia de la misma,

quedando estas proteínas reclutadas, fosforiladas y atrapadas en las adhesiones

focales más estables.

El defecto en la activación de la MAP quinasa Erk1/2 en las células deficientes para

RIAM es responsable del desensamblaje deficiente de sus adhesiones focales

Se ha descrito previamente que Erk1/2 juega un papel importante en el

proceso de desensamblaje de las adhesiones focales (Ishibe et al., 2004; Webb et al.,

2004; Zheng et al., 2009b). Dado que en las células BLM silenciadas para RIAM

habíamos observado una activación deficiente de Erk1/2 (Figura 39), investigamos si

dicho defecto en la activación pudiera afectar al recambio de las adhesiones focales

en las células D11. El tratamiento de las células Mock con el inhibidor de MEK UO126

causó un bloqueo de la activación de Erk1/2, lo cual se tradujo en una importante

acumulación de las adhesiones focales en posiciones centrales de estas células,

adquiriendo un patrón similar al de las células silenciadas para la expresión de RIAM

(Figura 63). Más aún, como se muestra en las imágenes de microscopía confocal de la

Figura 64 y en su correspondiente cuantificación (Figura 65), la expresión de una

forma dominante negativa de MEK (MEK DN) en células Mock causó asimismo un

incremento en el número de adhesiones que contienen paxilina. Estas adhesiones se

localizaron preferencialmente en áreas centrales de la superficie celular, lo que

sugiere la existencia de una alteración en la dinámica de las adhesiones focales

asociada a la menor actividad de Erk1/2 en estos transfectantes. Por el contrario, la

expresión de una forma constitutivamente activa de MEK (MEK CA) en las células D11

se tradujo en la recuperación de la fosforilación de Erk1/2 hasta alcanzar niveles

Resultados

137

similares a los de las células Mock y, de forma importante, condujo a una

disminución en el número de adhesiones focales, obteniéndose un número

similar al observado para los transfectantes control (Figuras 64 y 65). Finalmente,

la transfección de MEK CA en células Mock, o la expresión de MEK DN en células

D11, no condujeron a cambios en la distribución de las adhesiones respecto de las

células Mock y D11 transfectadas con vectores vacíos (Figura 64).

La posibilidad de revertir recíprocamente los fenotipos de las células Mock y

D11 transfectando una forma dominante negativa o constitutivamente activa de MEK,

respectivamente, sugiere fuertemente la implicación de esta quinasa en la regulación

de la distribución y el número de las adhesiones dependiente de RIAM en las células

BLM.

Figura 63.‐ La inhibición de MEK en células BLM afecta a la distribución de las adhesiones focales: Células Mock y D11, incubadas en presencia o ausencia de UO126 (5 μM), fueron analizadas mediante inmunofluorescencia empleando anticuerpos anti‐paxilina (superior), o mediante western‐blot, comprobando el efecto del inhibidor sobre la fosforilación de Erk1/2, utilizando los anticuerpos correspondientes (inferior).

Mock + UO126

Mock

D11

β‐Actina

Fosfo‐Erk1/2

Erk1/2 total

Mock D11Mock + UO126

Paxilina


138

Mock

D11

Control MEK DNMEK CA

MEK

Vinculina

Ctrl

MEK CA

MEK DN

Ctrl

MEK CA

MEK DN

A

B MEK CA

Fosfo‐Erk1/2

Erk1/2

β‐Actina

Ctrl

Ctrl

Mock D11

MEK CA

Mock D11

Dado que la disminución en la activación de Erk1/2 y el incremento en la

fosforilación de paxilina en el residuo de tirosina 118 son distintas alteraciones

observadas en las células BLM deplecionadas de RIAM, lo cual correlaciona con un

recambio defectuoso de las adhesiones focales, decidimos investigar si dichos

cambios bioquímicos se hallan funcionalmente interconectados. Notablemente, la

incubación de las células Mock con el inhibidor UO126 condujo a un incremento en

Figura 64.‐ La expresión de una forma constitutivamente activa de MEK se traduce en la adquisición de un patrón preferentemente periférico de distribución de las adhesiones focales en células BLM silenciadas para RIAM: Células Mock y D11 transfectadas con las formas MEK CA y MEK DN, o con los vectores vacíos (Control), fueron marcadas con anticuerpos anti‐paxilina y analizadas mediante inmunoflourescencia (A), o sometidas a análisis por western‐blot (B), empleando los anticuerpos indicados.

Resultados

139

los niveles de fosforilación de paxilina en la tirosina 118 (Figura 66A), mientras que la

expresión de la forma MEK CA en las células D11 redujo los niveles de fosforilación de

este mismo residuo alcanzando niveles semejantes a los de las células Mock

transfectadas con un vector vacío (Figura 66B). La expresión de MEK CA en las células

Mock es asimismo capaz de reducir notablemente la fosforilación de la paxilina Y118

respecto de su control. Todos estos datos indican que en células BLM la vía MEK‐

Erk1/2 regula la fosforilación en tirosina de paxilina y el recambio de las adhesiones

focales. Adicionalmente, ensayos de western‐blot revelaron que en células RIAM KD

que sobreexpresan MEK CA no sólo se produce la reversión de la fosforilación de

paxilina en la tirosina 118, sino que también se produce una disminución de la

fosforilación de FAK en los residuos de tirosina Y397 e Y576, recuperándose los

niveles de las células Mock (Figura 66B).

50

100

150

200

250

300

350

Núm

erode

adh

esione

s/célula

Control MEK DN Control MEK CA

Mock D11

Tamaño medio de las adhesiones (μm2)0 10 20 10 20 10 20 10 20

n=24x =118

n=25x =199

n=20x =164

n=25x =101

Figura 65.‐ La expresión de las formas MEK DN y MEK CA en células Mock y D11, respectivamente, afecta al número de adhesiones focales presentes: Las imágenes de microscopía confocal obtenidas de las células Mock y D11 transfectadas con un vector control, o con las construcciones MEK CA o MEK DN, fueron procesadas con el programa PMA, para determinar cuantitativamente el número de adhesiones por célula.


140

A

Mock+UO126

Paxilina

Mock

D11


Control

MEK CA

Mock

Control

MEK CA

D11

Fosfo‐FAK Y576

FAK

Fosfo‐FAK Y397

B

Paxilina


A continuación, examinamos las relaciones existentes entre la activación de

Erk1/2 y el desensamblaje de las adhesiones focales, para lo cual se llevaron a cabo

tratamientos con nocodazol empleando protocolos establecidos. Los resultados

indicaron que la activación de Erk1/2 fue mayor en las células Mock que en las D11

tras el tratamiento con nocodazol y su posterior lavado (Figura 67A). Seguidamente

transfectamos las formas MEK DN y MEK CA en las células Mock y D11, analizando el

desensamblaje de las adhesiones focales tras el lavado del agente despolimerizador

de los microtúbulos. Para ello, realizamos inmunofluorescencia empleando

anticuerpos anti‐paxilina para marcar las adhesiones focales, y tomando imágenes

IRM que fueron analizadas con el programa informático PMA (Figuras 67B y 68). Estos

análisis mostraron que el rescate de la distribución periférica de las adhesiones

focales observado en las células D11 que expresan la forma MEK CA se mantuvo tras

la eliminación del nocodazol, indicando un eficiente desensamblaje en estas células,

en contraste con lo obtenido para las D11 transfectadas con vectores control. Por el

contrario, la acumulación de adhesiones focales localizadas en la parte central de la

Figura 66.‐ La expresión de la forma constitutivamente activa de MEK revierte el incremento en la fosforilación de paxilina y FAK observado en las células RIAM KD: A) Los transfectantes fueron incubados en presencia o ausencia de UO126 y analizados mediante inmunoblotting, empleando anticuerpos para paxilina. B) Células Mock y D11 transfectadas con vectores vector control o MEK CA fueron lisadas y resueltas mediante western‐blot, empleándose los anticuerpos indicados frente a las formas fosforiladas de paxilina y FAK.

Resultados

141 superficie de las células Mock que expresan la forma MEK DN se observó central

Sin tratar Nocodazol Lavado 120 min

Mock+Control

D11+Control

Sin tratar Nocodazol Lavado 60 min Lavado 120 min

Mock+MEK DN

D11+MEK CA

Erk1/2

Fosfo‐Erk1/2

β‐Actina

N/T 0 60 120 N/T 0 60 120

Mock D11

Lavado (min) Lavado (min)A

B

Figura 67.‐ El defecto en la activación de Erk1/2 en las células RIAM KD es responsable del desensamblaje deficiente de sus adhesiones focales: A) Células Mock y D11 no tratadas (N/T), expuestas a nocodazol (t=0) o incubadas durante los tiempos indicados tras la eliminación de dicho compuesto fueron analizadas mediante western‐blot con los anticuerpos indicados. B) Células Mock y D11 transfectadas con un vector vacío o con las formas MEK DN y MEK CA (respectivamente) de MEK, fueron sometidas a tratamientos con nocodazol y analizadas mediante inmunofluorescencia tras lavar el inhibidor, empleando anticuerpos anti‐paxilina (rojo).


142

superficie de las células Mock que expresan la forma MEK DN se observó incluso tras

el tratamiento con nocodazol y su posterior lavado, sugiriendo la existencia de un

bloqueo en el desensamblaje de estas adhesiones, y, de esta manera, presentando un

fenotipo similar al de las células D11 (Figura 67B). Estos efectos fueron determinados

cuantitativamente, obteniéndose un incremento significativo del número de

adhesiones focales detectadas en las células Mock transfectadas con la forma MEK DN,

respecto de los transfectantes D11 que expresan la construcción MEK CA (Figura 68).

D11 D11 D11

Control

MEK DN

Control

MEK CA

Control

MEK DN

Control

MEK CA

Control

MEK DN

Control

MEK CA

Mock Mock Mock

x:116

x:153

x:165

x:100

x:169

x:179

x:160

x:187

x:134

x:179

x:177

x:103

Sin tratar Nocodazol Lavado 120 min

0

100

200

300

400

500

Núm

erode

adh

esione

s/célula

* *** ** * ** *** *** ***

Figura 68.‐ La transfección de MEK CA en las células RIAM KD recupera el desensamblaje de las adhesiones focales: Las imágenes de microscopía confocal mostradas anteriormente (n>20, Figura 66) fueron sometidas a análisis cuantitativos e integrativos para determinar el número medio de adhesiones por célula para los tratamientos indicados. Las diferencias halladas fueron significativas respecto del grupo Mock control sin tratar (* p>0,05; ** p>0,01; *** p>0,001).

Resultados

143

Estos ensayos correlacionan directamente al eje MEK‐Erk1/2 con el desensamblaje

deficiente de los contactos focales causado por el silenciamiento de RIAM en las

células de melanoma.

Finalmente, dado que el recambio de las adhesiones focales es vital para que

las células tumorales migren e invadan adecuadamente (Horwitz y Parsons, 1999), y

dado el bloqueo en la invasión celular hacia CXCL12 observado en las células BLM

deficientes para RIAM, estudiamos la posible relación entre el defecto en la

señalización del eje MEK‐Erk1/2 y la incapacidad de estas células de invadir en

respuesta a esta quimioquina. Las células Mock y D11 transfectadas con las formas

activa y dominante negativa de MEK, fueron analizadas en ensayos de invasión a

través de matrigel. Como se observa en la Figura 69, la transfección de la forma MEK

DN causó un bloqueo de la invasión de las células Mock comparado con su control,

mientras que aquéllas transfectadas con la forma MEK CA presentaron un incremento

modesto en la invasión. Notablemente, la expresión de MEK CA en células D11

conllevó la recuperación de la invasión de las mismas hasta alcanzar niveles cercanos

a los observados para las células Mock transfectadas con un vector vacío. Además,

experimentos control indicaron que la expresión de las formas DN o CA de MEK no

afectaba significativamente a la supervivencia celular a los tiempos ensayados (Datos

no mostrados).

0

400

800

1200

Células invasivas

Medio

CXCL12

Control

MEK CA

MEK DN

Control

Mock D11

MEK CA

MEK DN

**

∆∆

Figura 69.‐ La expresión de MEK CA recupera la invasión de las células silenciadas para RIAM: Células Mock y D11 transfectadas con las formas MEK CA y MEK DN, o con un vector control, fueron sometidas a ensayos de invasión a través de matrigel hacia CXCL12 (n=2). La invasión fue significativamente inhibida (** p<0,01) o incrementada (^^ p<0,01).


144

Conjuntamente, estos resultados indican que una activación defectuosa de la

MAP‐quinasa Erk1/2 debida al silenciamiento de RIAM afecta al adecuado

desensamblaje de las adhesiones focales, causando su acumulación en la parte central

de la superficie celular, lo cual correlaciona con una desregulación de la fosforilación

en residuos de tirosina de paxilina y FAK. Más aún, nuestros datos sugieren que la

recuperación del recambio de las adhesiones focales en las células RIAM KD cuando se

expresan formas activas de MEK constituye un posible mecanismo implicado en el

rescate de su capacidad invasiva.

La expresión de formas activas de Rho se traduce en una recuperación parcial del

recambio de las adhesiones focales en células BLM silenciadas para la expresión de

RIAM

El silenciamiento de RIAM en células BLM se traduce en una activación

deficiente de RhoA, como consecuencia de una disminución de la fosforilación de su

GEF Vav2 (Figura 32). Así, la expresión de una forma constitutivamente activa de RhoA

(RhoA CA) en las células silenciadas para RIAM condujo a una recuperación parcial

pero significativa de la invasión de estas células en respuesta a CXCL12 (Figura 33).

Por todo ello, tratamos de relacionar este defecto en la invasión debido a la falta de

activación de RhoA con el defecto en el recambio de las adhesiones focales,

imprescindible para la migración celular. Con este objetivo, investigamos si la

deficiencia en el recambio de las adhesiones focales observado en las células RIAM KD

podía ser recuperado mediante la expresión de Rho CA. Los resultados revelaron un

rescate modesto pero significativo de la distribución periférica de las adhesiones

focales en estos transfectantes (Figura 70A y B). Estos resultados sugieren una

recuperación del recambio de las adhesiones focales en células D11 y F8‐Luc que

expresan la forma RhoA CA. Estos resultados sugieren que la falta de activación de

RhoA causada por el silenciamiento de RIAM en células BLM podría participar, en el

recambio de las adhesiones focales.

Resultados

145

Mock

D11

RhoA wt RhoA CA

RhoA wt RhoA CA

0

20

RhoA

wt

Mock D11

Células con feno

tipo

Mock(%)

RhoA

wt

RhoA

CA

RhoA

CA

40

60

80

100

**

A

0

20

RhoA

wtCélulas con feno

tipo

Mock(%

)

RhoA

wt

RhoA

CA

RhoA

CA

40

60

80

100**

Mock‐Luc F8‐Luc

Mock‐Luc

F8‐Luc

RhoA wt RhoA CAB

Figura 70.‐ La expresión de una forma constitutivamente activa de RhoA rescata parcialmente el bloqueo en el recambio de las adhesiones focales observado en las células BLM silenciadas para RIAM: Células Mock y D11 (A) y Mock‐Luc y F8‐Luc (B) fueron transfectadas con vectores para las formas RhoA WT y RhoA CA, y analizadas por microscopía confocal empleando anticuerpos anti‐paxilina. Los paneles de la derecha muestran el porcentaje de estos transfectantes que presentan un fenotipo de las adhesiones focales similar al de las células Mock.


146

Sección V

Discusión


148

Discusión

149

En esta tesis doctoral hemos abordado la identificación de moléculas

implicadas en la señalización intracelular que regulan la motilidad celular y la invasión

de células de melanoma humano. Utilizando como modelo la línea celular de

melanoma humano BLM, altamente metastática, se ha demostrado que la invasión de

estas células tumorales requiere la actividad de Rap1 y RIAM, que conforman un eje

de señalización en estas células. Asimismo, mediante el empleo de modelos de

xenografting en ratones SCID demostramos que la expresión de RIAM confiere a las

células de melanoma ventajas en su capacidad de proliferación y metástasis.

El defecto en la invasión celular observado en las células BLM silenciadas para

RIAM puede ser debido, entre otras causas, a la incapacidad que estas células

presentan para mantener la direccionalidad de la migración celular, lo cual se halla

asociado con la inhibición de la activación del eje de señalización Vav2‐RhoA‐MLC.

Además, nuestros datos indican que el silenciamiento de RIAM reduce

moderadamente la activación de la integrina β1, así como la adhesión de las células de

melanoma dependiente de esta integrina. Este defecto en la adhesión correlaciona

con una activación deficiente tanto de la MAP‐quinasa Erk1/2 como de la vía PI3‐

K/Akt, rutas centrales que controlan el crecimiento y la supervivencia celulares.

Además de inhibir la proliferación celular, el silenciamiento de RIAM causó un

incremento de la susceptibilidad de estas células a sufrir apoptosis.

Las células BLM silenciadas para RIAM presentaron una morfología

predominantemente redondeada, lo cual se encuentra asociado con su incapacidad

para adquirir un fenotipo polarizado, el cual es requerido para mantener la

direccionalidad durante la migración celular (Parsons et al., 2010). La contractilidad

generada por la actividad de la miosina II produce la fuerza necesaria para que se

produzca el desplazamiento del cuerpo celular, y por tanto para la migración.

Asimismo, esta tensión contribuye a polarizar la célula, habiéndose relacionado con el

mantenimiento de la direccionalidad durante la migración celular (Vicente‐

Manzanares et al., 1999; Ridley et al., 2003; Gomes et al., 2005). El hecho de que en

las células BLM silenciadas para RIAM se haya observado una inhibición de la

fosforilación de MLC, componente regulador de la miosina II, apoya la tesis de que el

defecto en la invasión celular pudiera ser debido a una polarización celular deficiente,


150

lo cual se traduce en una capacidad migratoria reducida. La fosforilación deficiente de

MLC correlacionó asimismo con una inhibición de la activación del eje Vav2‐RhoA, lo

cual sugiere que ROCK, un efector de RhoA, no puede activar eficientemente a la MLC

(Amano et al., 1996). Es importante destacar que la expresión de formas

constitutivamente activas tanto de Vav2 como de RhoA se tradujo en una

recuperación parcial de la invasión de las células BLM silenciadas para RIAM, lo que

indica que Vav2 y RhoA contribuyen a la regulación de la invasión celular dependiente

de RIAM. De esta forma, nuestros datos indican que la inhibición de la invasión

observada en las células RIAM KD está asociada a una alteración de la contractilidad

celular, y a una inhibición de la polarización celular, debido a la activación deficiente

del eje de señalización Vav2‐RhoA‐MLC. Las conexiones estructurales y funcionales de

RIAM con esta ruta no son conocidas en la actualidad y debieran ser objeto de

estudios futuros. Una posible explicación se basa en el hecho de que Rap1 activo

contribuye a la localización celular de Vav2 (Arthur et al., 2004). Por ello es posible

especular que el complejo Rap1‐GTP/RIAM pudiera reclutar a Vav2 en la membrana

celular, lo que podría favorecer su activación. Un potencial mecanismo implicado en

dicha activación podría basarse en la posible asociación de Vav2 y talina dentro del

complejo Rap1/RIAM/talina, de forma análoga a lo que ha sido descrito para la

activación de Vav en linfocitos T (Garcia‐Bernal et al., 2009). Así, este complejo podría

representar una plataforma para la posterior activación de dicho GEF por parte de

quinasas específicas.

Trabajos recientes han demostrado que la translocación de RIAM a áreas de

la membrana celular modula la activación de las integrinas, a través del reclutamiento

de talina (Watanabe et al., 2008; Lee et al., 2009). Asimismo, RIAM puede ser

responsable de la activación en membrana de la señalización celular dependiente de

Ras y de PLC‐γ en células T (Patsoukis et al., 2009). El silenciamiento o la sobre‐

expresión de RIAM se tradujeron, respectivamente, en moderadas disminuciones o

incrementos de la activación de la integrina β1 en las células BLM. Esta respuesta

correlacionó a su vez con una inhibición o con un aumento, respectivamente, de la

asociación talina‐β1 en estas células. Dicha asociación es funcionalmente relevante, ya

que constituye un evento clave en la activación de las integrinas (Tadokoro et al.,

Discusión

151

2003). Asociado a la reducción de la activación de integrinas β1 en células en las que

se ha interferido la expresión de RIAM, observamos que la adhesión celular tanto a

fibronectina como a colágeno tipo I dependiente de estas integrinas resultó estar

parcial pero significativamente inhibida en dichas células. Esta disminución en la

adhesión celular constituye, probablemente, uno de los mecanismos implicados en la

activación deficiente tanto de Erk1/2 como del efector de la PI3‐K Akt que

observamos en las células RIAM KD. Estas moléculas son elementos importantes en la

señalización outside‐in desencadenada por la adhesión mediada por las integrinas, la

cual controla la proliferación y la supervivencia celulares, implicando al menos a la

ciclina D1 (Schwartz y Assoian, 2001; Assoian y Klein, 2008). Nuestros resultados

sugieren que, como consecuencia del defecto observado en la adhesión celular, la

inhibición de la activación de las rutas de señalización que implican a las vías

controladas por Erk1/2 y PI3‐K, pudiera conducir a la inhibición de la proliferación de

las células de melanoma silenciadas para RIAM. Por todo ello, uno de los posibles

mecanismos que explican el crecimiento deficiente de las células RIAM KD inoculadas

subcutáneamente en ratones SCID puede estar basado en la activación deficiente de

la señalización outside‐in dependiente de las integrinas β1, que es necesaria para la

proliferación celular.

Se ha demostrado recientemente que Ras controla la activación de la MAP‐

quinasa Erk1/2 en respuesta a la señalización dependiente de RIAM tras la activación

de linfocitos T a través del TCR (Patsoukis et al., 2009). Nuestros datos indican que la

activación de Ras se encuentra afectada en las células de melanoma silenciadas para

RIAM, por lo que es probable que este defecto sea la causa de la menor activación de

Erk1/2 observado en estas células. A diferencia de lo descrito en linfocitos T, en los

que RIAM modula la activación de Erk1/2 dependiente de Ras en respuesta a la

activación del TCR, la menor actividad de Ras detectada en las células BLM RIAM KD

puede encontrarse relacionada con la menor adhesión celular mostrada por las

mismas, ya que la activación de las integrinas es un evento que conduce a la

activación de Ras (Schlaepfer et al., 1994; Schlaepfer y Hunter, 1996; Wary et al.,

1996).


152

Además de presentar una inhibición de la proliferación celular, las células de

melanoma silenciadas para RIAM también mostraron una mayor susceptibilidad a la

apoptosis inducida por cisplatino en comparación con las células control, así como

niveles mayores de fosforilación de la MAP‐quinasa p38, lo que sugiere un incremento

de la respuesta de estrés celular. La mayor tendencia de las células RIAM KD a sufrir

apoptosis fue detectada tanto en cultivos bidimensionales, tras su exposición a

cisplatino, como en cultivos tridimensionales, una vez que dichas células fueron

embebidas en geles de colágeno tipo I que reproducen el ambiente de los tejidos

conectivos que han de ser atravesados por las células de melanoma durante la

invasión celular. Estas respuestas pudieran ser, asimismo, una consecuencia de la

activación deficiente de cascadas de señalización dependientes de Erk1/2 y PI3‐K, y

que son a su vez activadas al desencadenarse la señalización outside‐in tras la

activación de las integrinas β1. Como consecuencia, tanto la disminución en la

proliferación como la mayor sensibilidad a la apoptosis mostrada por las células BLM

silenciadas para RIAM pudieran estar contribuyendo a la inhibición del crecimiento

tumoral en los ratones inoculados con estas células. Aunque la integrina αvβ3 ha sido

implicada en la supervivencia de las células de melanoma (Montgomery et al., 1994;

Bao y Stromblad, 2004), es poco probable que pueda estar jugando un papel en la

supervivencia de las células BLM, dado que esta línea celular expresa niveles casi

indetectables de esta integrina.

Cuando las células de melanoma silenciadas para RIAM fueron inoculadas por

vía intravenosa en ratones SCID se detectó que el periodo medio de supervivencia de

estos animales fue más prolongado que el observado en aquellos ratones inoculados

con células BLM control, lo que se asoció con un aumento del periodo de latencia de

la diseminación pulmonar. Basándonos en la inhibición de la invasión celular

mostrada por las células RIAM KD, un incremento de este periodo de latencia puede

reflejar un homing deficiente a los pulmones, por lo que el defecto en esta invasión

podría retrasar los pasos iniciales de la colonización pulmonar. Alternativamente, la

llegada de las células de melanoma a los pulmones pudiera estar tan sólo

moderadamente afectada por el silenciamiento de RIAM, de forma que el incremento

en la supervivencia de los ratones inoculados con estas células pudiera indicar una

Discusión

153

inhibición de su proliferación, como ya se ha discutido anteriormente. Sin embargo,

un ambiente más rico en factores de crecimiento en los pulmones en comparación

con el del tumor primario en piel pudiera favorecer posteriormente el crecimiento de

las células de melanoma RIAM KD en estos órganos, desarrollándose finalmente las

metástasis. Nuestros datos sobre el papel de RIAM en la regulación de la proliferación

de células de melanoma está de acuerdo con resultados previos obtenidos con el

ortólogo de las proteínas MRL en Drosophila, pico, el cual es requerido para el

crecimiento tisular, y su silenciamiento se traduce en una disminución de la tasa de

división celular (Lyulcheva et al., 2008), poniendo de manifiesto el papel de estas

proteínas en la proliferación celular. Dado que hemos observado la expresión de

RIAM en siete de un total de ocho muestras de melanoma metastático humano, los

resultados sugieren que RIAM podría contribuir a la diseminación de las células de

melanoma.

Nuestros resultados indican, asimismo, que RIAM regula la dinámica de las

adhesiones focales, de modo que la interferencia en su expresión se traduce en un

defecto en la renovación de las adhesiones focales. Dado que una correcta renovación

de estas adhesiones es imprescindible para una adecuada migración celular (Parsons

et al., 2010), nuestros datos sugieren que el defecto observado en la renovación de

las adhesiones focales de las células RIAM KD podría representar un mecanismo

implicado en la inhibición de la invasión de estas células. Así, las células silenciadas

para RIAM presentaron un elevado número de adhesiones focales localizadas en

áreas preferentemente centrales de la superficie celular, mientras que en las células

control la distribución de dichas adhesiones focales es predominantemente periférica.

El análisis mediante microscopía confocal de células tratadas con nocodazol, y los

experimentos de FRAP, revelaron que el desensamblaje de las adhesiones focales de

las células BLM está inhibido por el silenciamiento de RIAM, lo que se traduce en una

mayor estabilidad y en la acumulación de dichas adhesiones. Sin embargo, no

podemos excluir la posibilidad de que el correcto ensamblaje de las adhesiones

focales se encuentre afectado, ya que los resultados revelan una disminución de los

niveles de asociación entre talina y FAK y entre FAK y paxilina en las células BLM

silenciadas para RIAM. De esta manera, la ausencia de RIAM en las adhesiones focales


154

puede ser causa de un ensamblaje inadecuado de los elementos que componen las

mismas, lo que a su vez podría estar relacionado con un incremento en la estabilidad

de los complejos adhesivos y con un defecto en el desensamblaje de dichas

adhesiones.

Las fosforilaciones en residuos de tirosina de componentes de las adhesiones

focales como FAK y paxilina son eventos clave en la regulación de la dinámica de estas

adhesiones (Webb et al., 2004; Mitra et al., 2005; Abou Zeid et al., 2006). Uno de los

pasos iniciales en la formación de las adhesiones focales tras la adhesión mediada por

integrinas es la autofosforilación de FAK en el residuo Y397, seguido de la fosforilación

mediada por Src en el aminoácido Y576 de FAK. Posteriormente, la paxilina es

fosforilada en los residuos de tirosina Y31 e Y118, un evento dependiente de la

actividad de FAK y Src (Mitra et al., 2005). La fosforilación de estos residuos ha sido

relacionada con la regulación del recambio de las adhesiones focales y con la

motilidad celular (Webb et al., 2004). Nuestros resultados indican que las células BLM

silenciadas para RIAM tienen aumentados los niveles de fosforilación en tirosinas de

FAK (Y397, Y574, Y576) y paxilina (Y31, Y118), lo cual, como hemos mencionado

anteriormente, se asocia con una inhibición de la renovación de las adhesiones

focales y a una disminución de la direccionalidad de la migración celular. Se plantean

así dos posibilidades: o bien el incremento en la fosforilación de FAK y paxilina es una

causa que conduce a la alteración de la dinámica de las adhesiones focales, o bien es

una consecuencia del desensamblaje defectuoso que se traduciría en la acumulación

de FAK y paxilina en las adhesiones focales. Uno de los planteamientos que

abordaremos en un futuro inmediato será transfectar mutantes de paxilina en el

residuo de tirosina Y118, con el objetivo de obtener resultados que aclaren estas dos

posibilidades. Otra línea de trabajo consistirá en la sobre‐expresión de la tirosín‐

fosfatasa PTP‐PEST, la cual regula los niveles de fosforilación de los constituyentes de

las adhesiones focales, permitiendo su salida de los complejos y el desensamblaje de

los mismos (Angers‐Loustau et al., 1999; Jamieson et al., 2005).

La MAP‐quinasa Erk1/2 tiene un papel fundamental en la dinámica de las

adhesiones focales. Si bien ha sido descrito que Erk1/2 activado previamente puede

entrar a formar parte de las adhesiones focales, contribuyendo a la fosforilación de

Discusión

155

los elementos que las conforman, y favoreciendo su ensamblaje (Fincham et al., 2000),

se ha propuesto asimismo que paxilina facilita la activación de esta MAP‐quinasa en

las adhesiones focales (Ishibe et al., 2004). Entre las funciones descritas para Erk1/2

en las adhesiones focales destaca la fosforilación de FAK en la serina 910, un evento

que facilita la interacción de FAK con PTP‐PEST, lo que causa la desfosforilación de

FAK contribuyendo a su salida del complejo y el desensamblaje de la adhesión (Zheng

et al., 2009b). La menor activación de Erk1/2 observada en las células silenciadas para

RIAM, posiblemente causada por un defecto en la activación de la señalización

outside‐in dependiente de integrinas, como ya ha sido discutido previamente, podría

constituir un vínculo funcional entre RIAM y el desensamblaje de las adhesiones

focales. Así, la expresión en células BLM de formas constitutivamente activadas de

MEK, la quinasa responsable de la fosforilación de Erk1/2, se traduce en una

recuperación del desensamblaje de las adhesiones focales en las células RIAM KD. Sin

embargo, la expresión de formas dominantes negativas de MEK conduce a un

fenotipo de las adhesiones focales similar al de las células RIAM KD, lo que sugiere la

implicación del eje de señalización MEK‐Erk1/2 en la regulación de la dinámica de las

adhesiones focales dependiente de RIAM. Adicionalmente, hemos observado que, en

paralelo a la recuperación de la dinámica normal de las adhesiones focales en células

RIAM KD transfectadas con MEK CA, se restauran en estos transfectantes los niveles

de fosforilación de FAK y paxilina, alcanzándose niveles similares a los de las células

control. De nuevo estos resultados nos llevan a la hipótesis causa‐consecuencia, la

cual va a ser estudiada inmediatamente, tal y como se ha expuesto anteriormente.

Como ya se ha indicado, el recambio de las adhesiones focales es requerido

para que se produzca la migración celular, y en consecuencia, la invasión. Los

resultados de los experimentos de invasión han puesto de manifiesto que la

recuperación de la señalización a través del eje MEK‐Erk1/2 en las células BLM

silenciadas para RIAM restaura su potencial invasivo, sugiriendo que el defecto en la

activación de Erk1/2 observado en estas células puede ser, al menos en parte,

responsable del bloqueo de la invasión al impedir el recambio de las adhesiones

focales (Webb et al., 2004).


156

Un mecanismo adicional que podría estar alterando la dinámica de las

adhesiones focales de las células RIAM KD puede estar basado en la fosforilación

reducida de la serina S910 de FAK. La fosforilación en este residuo juega un papel

clave en el desensamblaje de las adhesiones focales (Zheng et al., 2009b). Una menor

fosforilación de este residuo de serina de FAK en las células silenciadas para RIAM

podría traducirse en un desensamblaje deficiente de las adhesiones focales, por lo

que éstas se acumularían establemente en la superficie central de las células. Dado

que éste es el fenotipo observado en las células RIAM KD, analizaremos en

experimentos futuros el grado de fosforilación de este residuo de serina de FAK.

Además de su contribución al control de la contractilidad celular, RhoA regula

la renovación de las adhesiones focales (Tomar y Schlaepfer, 2009). Dado que la vía

Vav2‐RhoA‐MLC está afectada en las células de melanoma RIAM KD, estudiamos en

este trabajo si el defecto en la renovación de las adhesiones focales en estas células

estaba asociado a la alteración en la activación de esta vía de señalización. Los

experimentos de transfección de una forma activa de RhoA mostraron una

recuperación parcial de de la distribución preferentemente periférica de las

adhesiones focales en estos transfectantes. Todos estos resultados indican que, tanto

la vía de señalización Ras/MEK/Erk1/2, así como la vía Vav2‐RhoA‐MLC, están

reguladas por RIAM, por lo que el silenciamiento de esta proteína se traduce en las

alteraciones de la dinámica de las adhesiones focales mostradas en este trabajo, y que

constituyen probablemente la base del defecto en la invasión celular. Desconocemos

por el momento las relaciones entre estas dos vías de señalización en las células RIAM

KD, un punto que estudiaremos en el futuro. En la Figura 71 se presenta un modelo

hipotético sobre el papel de RIAM en la migración y la proliferación celular.

Discusión

157

ECM

Integrina

α βADHESIÓNA LA ECM

Vav2

RhoA

F‐Actina

ROCK

Miosina II

Pi

Pi

CXCL12

βγ α

CXCR4

Miosina II

Membrana Plasmática

CONTRACTILIDADCELULAR, MIGRACIÓN

Src

F‐Actina

Vinculina

PROLIFERACIÓN CELULARSUPERVIVENCIA

Talina

FAK

Paxilina

Pi

Pi

Y

Y

DESENSAMBLAJEDE ADHESIONES

FOCALES,MIGRACIÓN

PI3‐K

Akt

INVASIÓNCELULAR

?

?

GTPRap1RIAM

METÁSTASIS

?

MEK

Ras

Erk1/2

Figura 71.‐ Modelo del papel de RIAM en la invasión y en la dinámica de las adhesiones focales de células de melanoma. Tras la unión de CXCL12 a CXCR4 se inicia una cascada de señalización que, a través de mecanismos aún desconocidos, lleva a un incremento en los niveles de Rap1‐GTP en las células. Rap1‐GTP es capaz de interaccionar con RIAM, reclutándola y localizándola en áreas próximas a la membrana plasmática (Lee et al., 2009), de manera que podría constituirse una plataforma de señalización. RIAM contribuiría a la activación de Vav2 inducida por CXCL12, lo que lleva a la activación secuencial de RhoA, su quinasa efectora ROCK y, finalmente, de la miosina II. Este proceso participaría en el control de la contractilidad celular, de la polaridad y, por tanto, de la migración y la invasión celular en respuesta a la quimioquina. Además, el complejo Rap1‐RIAM participa en la estimulación de la adhesión celular a sustratos de la ECM facilitando la interacción de talina con los dominios citoplásmicos de la integrina β1. La adhesión celular desencadena la señalización outside‐in, produciéndose la activación de las vías PI3‐K/Akt y Ras/MEK/Erk1/2, la cual regula la proliferación celular y la supervivencia, procesos que contribuyen a la metástasis. La activación de Erk1/2 en las adhesiones focales es dependiente de la adhesión celular, y por tanto de RIAM, lo que sería requerido para mantener el recambio de estas adhesiones. Tras su interacción con paxilina, Erk1/2 activo fosforila a FAK, facilitando su salida de la adhesión focal y el desensamblaje de la misma. De este modo, el correcto mantenimiento de la dinámica de renovación de las adhesiones focales dependiente de RIAM es necesario para la invasión celular.


158

Estos datos en conjunto sugieren un papel relevante para RIAM en la invasión

y la metástasis de células de melanoma, por lo que estudios futuros debieran explorar

la posible relación de RIAM con la prognosis de los pacientes de este tipo de cáncer,

pudiendo constituir una diana terapéutica o un marcador pronóstico. Sin duda los

mecanismos a través de los cuales RIAM controla estos procesos no son aún bien

conocidos, por lo que serán objeto de futuros trabajos.

Sección VI

Conclusiones


160

Conclusiones

161

De los datos expuestos en esta Tesis Doctoral, podemos concluir que:

1. Rap1 y RIAM constituyen un eje de señalización requerido para la

invasión de células de melanoma estimulada por CXCL12.

2. RIAM participa en la regulación de la activación del eje de señalización

Vav2‐RhoA‐MLC en células de melanoma, y por tanto contribuye a la

polarización y la contractilidad celular.

3. RIAM regula la adhesión celular mediada por integrinas β1. El

silenciamiento de RIAM altera la señalización outside‐in dependiente de

integrinas, lo que se traduce en una inhibición de la activación de las vías

Ras/MEK/Erk1/2 y PI3‐K/Akt.

4. RIAM controla la proliferación y la supervivencia celular, lo que se

traduce en una supervivencia más prolongada de los ratones inoculados

con células de melanoma silenciadas para RIAM.

5. La dinámica de las adhesiones focales de células de melanoma es

dependiente de RIAM, de manera que su silenciamiento causa una

inhibición del desensamblaje de las mismas. Esto conduce a una

acumulación de las adhesiones focales en la parte central de la superficie

celular.

6. Asociado a la acumulación de adhesiones focales en células silenciadas

para RIAM, se produce un aumento en la fosforilación en residuos de

tirosina de FAK y paxilina.

7. La señalización mediada por MEK‐Erk1/2 está implicada en el control del

desensamblaje de las adhesiones focales dependiente de RIAM en células

de melanoma.


162

Sección VII

Bibliografía


164

Bibliografía

165

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Anexo

Anexo


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Anexo

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RIAM controls invasion and growth of melanoma cells Pablo Hernández-Varas‡1, Georgina P. Coló‡1, Ruben A. Bartolomé‡, Andrew Paterson§, Iria Medraño-Fernández¶, Carlos Cabañas║, Paloma Sánchez-Mateos**, Esther M. Lafuente¶, Vassiliki A. Boussiotis♦, Staffan Strömblad§ and Joaquin Teixidó‡* From ‡Department of Cellular and Molecular Medicine, Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), 28040 Madrid, Spain; §Karolinska Institutet, Center for Biosciences, Department of Biosciences and Nutrition, SE-141 83 Huddinge, Sweden; ¶Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Medicina, Department of Microbiology, 28040 Madrid, Spain, and Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre; ║Centro de Biología Molecular (CSIC), 28049 Madrid, Spain; **Servicio de Inmuno-Oncología, Hospital Universitario Gregorio Marañón, 28007 Madrid, Spain; ♦Department of Medicine; Division of Hematology and Oncology, Harvard Medical School, Boston, MA 02115

Running Head: Rap1 and RIAM in melanoma cell invasion 1These authors equally contributed to this work

*To whom correspondence should be addressed. Joaquin Teixidó. Centro de Investigaciones Biológicas. Ramiro de Maeztu 9. 28040 Madrid. Spain. Phone: 34-91-

8373112; Fax: 34-91-5360432; e-mail: [email protected]

The MRL (Mig-10/RIAM/Lamellipodin) family member RIAM interacts with active Rap1, a small GTPase that is frequently activated in tumors such as melanoma and prostate cancer. We show here that RIAM is expressed in metastatic human melanoma and that both RIAM and Rap1 are required for melanoma cell invasion. RIAM expression conferred growth and metastatic advantages to highly invasive human BLM melanoma cells using a SCID xenograft model. Defective invasion of RIAM-silenced melanoma cells arose from impairment in persistent cell migration directionality, which was associated with deficient activation of the Vav2-RhoA-MLC pathway. Expression of constitutively active Vav2 and RhoA in cells depleted for RIAM partially rescued their invasion, indicating that Vav2 and RhoA mediate RIAM function. These results suggest that inhibition of cell invasion in RIAM-silenced melanoma cells is likely based on altered cell contractility and cell polarization. Furthermore, we show that RIAM depletion reduces β1 integrin activation and β1-dependent melanoma cell adhesion. The decreased adhesion correlated with deficient activation of both Erk1/2 MAP kinase and phosphatidylinositol 3-kinase, two central molecules controlling cell growth and cell survival. In addition to inhibit cell proliferation, RIAM silencing led to higher susceptibility to cell apoptosis. The data suggest that defective activation of these kinases in RIAM-silenced cells could account for inhibition of melanoma cell growth. Together, these results suggest that RIAM might contribute to the dissemination of melanoma cells.


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Rap1 belongs to the Ras family of small GTPases, which are molecular switches that couple extracellular signals with a variety of cellular responses, such as cell proliferation and survival, cell adhesion and cell polarity (1-3). Rap1 activation is regulated by guanine-nucleotide exchange factors (GEFs), which stimulate exchange of bound GDP by GTP, and by GTPase activating proteins (GAPs), which promote GTP hydrolysis (4). The GTP-associated form of Rap1 is responsible for interaction with its effectors, which then transmit the signalling necessary to generate cell responses. RIAM (Rap1-GTP-interacting adaptor molecule) is an effector protein for Rap1 that belongs to the MRL (Mig-10/RIAM/Lamellipodin) family of adaptor proteins (5). RIAM contains an N-terminal coiled-coil region, a central Ras association and pleckstrin homology domains, a C-terminal region rich in prolines, as well as several FPPP motifs with the potential of interacting with ENA-VASP proteins. RIAM is broadly expressed, and it was first characterized as a molecule that promotes Rap1-dependent β1 and β2 integrin activation on T lymphocytes (5). Subsequent work demonstrated that Rap1-RIAM association favours talin targeting to the plasma membrane through direct talin interaction with an N-terminal segment of RIAM, a process that contributed to integrin activation (6,7). Furthermore, RIAM co-localizes with talin in lamellipodia (6), representing a mechanism that could help to localize activated integrins at these cell membrane protrusions. In addition, recent data indicated that a MRL ortholog in Drosophila called pico is required for tissue growth (8), therefore widening the functional potential of MRL proteins in the control of different cellular responses.

RIAM also regulates T cell receptor-mediated signalling. RIAM is recruited to immunological synapses during T cell-antigen presenting cell interactions (9). Notably, the T cell kinases ZAP-70, Fyn and Lck can associate to RIAM and promote its tyrosine phosphorylation (10). Moreover, RIAM silencing leads to impairment in Ras-dependent signalling, and to defective translocation of PLC-γ1 to the actin cytoskeleton, resulting in inhibition of T cell activation (10). Rap1 was shown to be activated in human melanoma cell lines and metastatic melanoma tissue, and it was proposed that its activation might control melanoma cell adhesion and migration (11). Similarly, Rap1 activation correlates with high metastatic potential in prostate cancer cell lines, which was associated with a decrease in the expression of Rap1GAP (12). Examination of the cancer transcriptome profiles from the Oncomine database reveals that RIAM mRNA is found in a significant proportion of metastatic melanoma samples. Therefore, the potentially expressed RIAM protein might regulate tumor cell motility upon binding to activated Rap1. Here we show that RIAM protein is expressed in human metastatic melanoma tissue and in melanoma cell lines, and we have used highly invasive human melanoma cell lines as models to study the role of RIAM in melanoma cell invasion. The results indicated that RIAM is required during melanoma cell invasion, and that it controls melanoma cell growth and metastasis in an in vivo xenograft model.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Cells, antibodies and reagents. The human melanoma cell lines BLM and MV3 were cultured as previously described (13). The human T cell line

Anexo

193

Molt-4 was grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Biowhittaker, Verviers, Belgium). Anti-RIAM antibodies have been earlier reported (5), anti-Vav2 antibodies were from Dr. Xosé Bustelo (Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca), control P3X63 and Lia1/2.1 integrin anti-β1 from Dr. Francisco Sánchez-Madrid (Hospital de la Princesa, Madrid, Spain), and 15/7 anti-β1 from Dr. Ronen Alon (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Anti-CXCR4 was from R&D Systems (Minneapolis, MN), and Rap1, PARP, RhoA, phosphotyrosine and myc 9E10 antibodies were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-β-actin, anti-talin, anti-MLC, anti-HA and anti-His were from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), anti-Erk1/2, anti-phospho-Erk1/2, anti-Akt, anti-phospho-Akt (Ser473) and anti-cleaved caspase 3 (Asp 175) from Cell Signalling Tech (Danvers, MA), anti-procaspase-3 from (BD Biosciences, Bedford, MA), and anti-MLC antibodies from Invitrogen (Camarillo, CA). Anti-human melanoma HMB-45 was from Dako (Glostrup, Denmark). Fibronectin was from Roche Diagnostics (Penzberg, Germany) and collagen I and cisplatin from Sigma-Aldrich. Vectors, RNA interference, transfections and PCR. HA-fused pcDNA3.1 vectors coding for wild type and constitutively active Rap1 (G12V) were from The Missouri S&T cDNA Resource Center (Rolla, MO). To obtain BLM cells stably overexpressing RIAM, its cDNA (5) was cloned into pcDNA3.1-Myc or pcDNA4MaxC-His vectors. Cells were either electroporated with pcDNA3.1-RIAM-Myc, or cotransfected with pcDNA4MaxC-RIAM-His and pBabe-puro vectors using lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Transfectants were selected and maintained in the

presence of G418 or puromycin, respectively. Vectors coding for GFP-fused forms of wild-type RhoA and Vav2, and activated V14-RhoA and Vav2 have been reported. To interfere with Rap1 expression we used the following siRNA: siRap1A.1, sense strand: GAUAGAAGAUUCCUACAGAdTdT; siRap1A.2, sense strand: AUCAUGUCUGCUGCUCUAGdTdT, or a pSuper-Rap1 shRNA vector based on the Rap1A.1 siRNA sequence. siRNA for RIAM had the following sequences: siRIAM #1, sense strand: GGAAGACUCUCUAUGAUAAdTdT; siRIAM #2, sense strand: GGACAACCUUUUCGAGAAAdTdT; siRIAM #3, sense strand: CUAUGGGACUCAGCAUAAAdTdT. Control siRNA was as previously described (14). Cells were transfected with siRNAs using X-tremeGENE (Roche Diagnostics), or with pSuper vectors using lipofectamine, and transfectants tested in the different assays 48 hours post-transfection. To detect RIAM expression by PCR we used the primers 5'-AAAGCGCCCACTGACTATTG-3' and 5'-CGTTGCCTCTCTTCTTTTGC-3', and GoTaq DNA polymerase (Promega, Madison, WI). Human GAPDH primers were as reported (13). Lentiviral gene transfer and animal studies. pLL3.7 or pLL3.7-shRIAM (5) vectors were used to obtain mock or RIAM-silenced cells. Packaging was performed with HEK293T cells, and viral supernatants were used to infect target cells which were selected by cell sorting based on their GFP expression. BALB/c SCID mice (Harlan, Indianapolis, IN) maintained under specific pathogen-free conditions were employed for xenograft studies. The Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Ethics Committee (Madrid, Spain) approved the protocols used for experiments with mice. Mice were injected subcutaneously in the


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lateral thoracic wall or intravenously into the tail vein with 1x106 cells. Mice were daily inspected for tumor growth, and were killed when signs of respiratory stress were noted, or when subcutaneous tumors reached volumes between 1.5-2 cm3. Invasion, migration and adhesion assays. Invasions across Matrigel were done as established (13). The lower compartments of chambers were filled with invasion medium with or without CXCL12 or fetal bovine serum (10%; Sigma-Aldrich), and invasive cells were counted under a microscope. To study cell migration we used wound healing assays. For this, 1 mm-wide wounds were done across confluent cell monolayers on Matrigel-coated plates, and cultures incubated with or without CXCL12. For adhesion assays, cells were labelled as previously shown (15) and loaded in triplicates on 96-wells dishes (Costar, Cambridge, MA) coated with fibronectin (8 μg/ml) or collagen I (1-2 μg/ml). Cells were allowed to adhere for different times, and following washing to remove unbound cells, adhesion was quantified using a fluorescence analyzer (POLARstar Galaxy; Offenburg, Germany). Time-lapse videomicroscopy. Time-lapse analyses in migration experiments were performed using chemotaxis chambers (Ibidi, Martinsried, Germany) coated with Matrigel. CXCL12 was added in upper reservoir and cell movement was tracked (2 min each frame for 5 h) using a Live Cell Imaging microscope (Leica AF6000 LX type DMI6000B) (16). Euclidean Mean Distance (EMD) was assessed with ImageJ software. For protrusion dynamics, paxillin-dsRed2-transfected cells were seeded at 5000 cells/well on fibronectin-coated (10μg/ml) glass-bottom 96-well plates. Cells were allowed to attach for 45 min, and

subsequently images were taken every 10 min using a Nikon A1R confocal microscope with a 60x oil-immersion objective. 3-D gel cultures, confocal microscopy and immunohistochemistry. Rat tail collagen I (3.6 mg/ml) (Millipore, Billerica, MA) was equilibrated with NaHCO3/NaOH buffer to meet neutral pH, and immediately mixed with 10x DMEM medium and cells to have a final 0.8 mg/ml collagen I, 2x DMEM/2.5% FBS suspension (2x105 cells/ml). 20 μl drops of the mixture were allowed to polymerize at 37ºC, and resulting gels were covered with DMEM/serum and incubated for 24-72 hours. Cells were stained for DAPI (0.3 μM) and imaged using a LEICA TCS-SP2-AOBS-UV and Nikon A1R confocal microscope with 63x water-immersion and 60x oil-immersion objectives. Nuclei were classified depending on chromatin compactation. The Ethical Committee from Hospital Universitario Gregorio Marañón approved the protocols and process involving melanoma samples. For immunohistochemistry, melanoma metastases from lymph nodes were immediately frozen, and acetone-fixed 4-µm-thick sections were first incubated with 10% non-immune goat serum. Samples were then incubated for 1 h at 23°C with the appropriated antibodies or isotype-matched control antibodies. All antibodies were first tested for reactivity on lymphoid tissue and skin. The slides were mounted using an aqueous permanent mounting medium (DAKO). Confocal microscopy images were captured using a Leica SP2-AOBS confocal microscope. Immunoprecipitation, immunoblotting and GTPase assays. For immunoprecipitation, melanoma cells were lysed (17) and extracts incubated with antibodies followed by specific coupling to protein A- or G-Sepharose beads, as established (18). After SDS-

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PAGE, proteins were subjected to immunoblotting with primary antibodies, followed by incubation with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies and detection with chemiluminiscent substrate (Pierce, Rockford, IL). Rap1 and RhoA GTPase assays were performed on cells incubated in suspension with CXCL12 (13). Upon cell lysis, aliquots from extracts were kept for total lysate controls and remaining volume incubated with GST-Ral-GDS (for active Rap1) or GST-C21 (for active RhoA) fusion proteins in the presence of glutathione-agarose beads. Eluted proteins were subjected to immunoblotting with Rap1 or RhoA antibodies. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Flow cytometry. Cell proliferation was assessed with the MTT assay. Cells (8x103/well) were seeded in 96-well plates, incubated for 16 h, and subsequently stained with 0.5 mg/ml thiazolyl blue tetrazolium bromide (Sigma-Aldrich). Resulting formazan was resuspended with 200 µl DMSO/well, and optical density read at 540 nm. Soft agar assays were performed as described (19). For cytotoxicity assays, cells were treated with cisplatin or H2O2, non-adherent cells were removed and monolayers of surviving cells fixed with paraformaldehyde. Upon staining with crystal violet, cells were washed and resuspended in acetic acid (33%), and absorbance determined at 570 nm. For flow cytometry, cells were sequentially incubated with primary antibodies and fluorochrome-tagged secondary antibodies, followed by analysis in a Coulter Epics XL cytofluorometer. Statistical analyses. Data were analyzed by one-way ANOVA followed by Tukey-Kramer multiple comparisons. In both analyses, the minimum acceptable level of significance was p<0.05.

RESULTS

Rap1 and RIAM are required for invasion of melanoma cells. Rap1 in the highly metastatic human BLM melanoma cell line was found to be basally activated, but its activation was further increased upon exposure to CXCL12 (Fig. 1A), a chemokine that promotes melanoma cell invasion following binding to its receptor CXCR4 (13,20). Rap1 silencing with two different siRNA and with shRap1 led to defective invasion across 3-D Matrigel layers in response to CXCL12 (Fig. 1B, C). Conversely, cells transfected with constitutively active Rap1 exhibited an increase in invasion compared to Rap1 wt or mock counterparts (Fig. 1D). These data indicate that chemokine-promoted melanoma cell invasion needs Rap1 function. Earlier work demonstrated that GTP-bound active Rap1 interacts with RIAM (5). To study if RIAM was expressed in human melanoma cells, we performed immunohistochemistry on metastatic melanoma surgical specimens using anti-RIAM antibodies and antibodies to the specific melanoma marker HMB-45. The analyses revealed low to medium RIAM expression on melanoma cells from macroscopically infiltrated lymph nodes (7 out of 8 cases) (Fig. 2A; and supplemental Fig. S1). The pattern of cellular RIAM distribution and localization inside the tumors was heterogeneous. Thus, some melanoma cells displayed a predominant cytoplasmic localization of RIAM, whereas in other cells RIAM was also found on cell membrane regions. Furthermore, melanoma cells positive for RIAM expression were detected across the tumoral mass, but also on the invasive borders of the tumors. In addition to its expression on metastatic melanoma tissue, RIAM was found to be expressed at different levels on the melanoma cell lines BLM, MeWo, SK-Mel-147 and SK-Mel-173, whereas its expression was undetectable in Mel57 cells (Fig. 2B, top


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panel; and supplemental Fig. S2, A). Pull-down assays using the GST-Ral-GDS fusion protein showed that RIAM binds to Rap1-GTP in chemokine-stimulated BLM melanoma cells (supplemental Fig. S2, B). To investigate if RIAM is needed for melanoma cell invasion, BLM cells were infected with lentiviral vectors designed for stable RIAM silencing (5). Two different transfectants, D11 and F7, displayed between 80-90% decrease in RIAM expression compared to mock transfectants (Fig. 2B, top panel; and supplemental Fig. S2, C). Control experiments revealed no alterations in CXCR4 or β1 integrin expression levels in these transfectants (not shown). Invasion in response to CXCL12 was blocked in D11 and F7 cells (Fig. 2B, bottom panel), as well as in an additional RIAM-depleted subline, F8-luc, engineered to express luciferase for future in vivo bioluminescence studies (supplemental Fig. S2, D). Moreover, transient knockdown of RIAM by siRNA RIAM #2 and #3 led to strong inhibition of invasion toward CXCL12, whereas partial RIAM depletion by siRNA RIAM #1 resulted in a modest inhibition of invasiveness (Fig. 2C). To test if defective invasion in response to CXCL12 shown by RIAM-silenced BLM cells could also be detected using other stimuli, we analyzed cell invasion toward serum. Results revealed that both D11 stable transfectants and cells transfected with RIAM siRNA had a blockade of invasiveness in response to serum (Fig. 2D). Further support for the important role of RIAM in melanoma cell invasion came from experiments using BLM cells overexpressing His- or myc-tagged RIAM, which exhibited a remarkable upregulation of invasiveness compared to mock transfectants (Fig. 2E). Importantly, defective invasion of RIAM-depleted D11 cells was rescued by RIAM-His

overexpression (Fig. 2F). To analyze if RIAM silencing in another RIAM-positive invasive melanoma cell line led to deficient invasion, we used MV3 cells, which displayed impaired invasiveness following RIAM depletion (Fig. 2G). Together, these results indicate that melanoma cell invasion requires Rap1 and RIAM activities. Directional persistence of migration is defective in RIAM-silenced melanoma cells. In addition to their deficient invasion across 3-D matrigel layers, RIAM-depleted BLM melanoma cells displayed a significant inhibition of 2-D migration in the presence of CXCL12 using wound closure assays (Fig. 3A). To investigate the mechanisms behind impaired migration of RIAM-silenced melanoma cells, we first analyzed migration by time-lapse microscopy in chemotaxis chambers. Mock cells displayed Euclidean Mean Distance (EMD) migratory values that were more than two-fold higher than those from RIAM knockdown transfectants, indicating that RIAM depletion affected persistent migration directionality (Fig. 3B; see also supplemental videos 1 and 2). A close examination at membrane protrusions during migration revealed that while mock cells exhibited dynamic ruffle and filopodia extensions, cells depleted for RIAM showed periodic waves of lamellae protrusions that lead to a non-polarized rounded morphology (Fig. 3C; and supplemental videos 3 and 4). Activation of Vav2-RhoA and MLC is impaired in RIAM-depleted melanoma cells. The deficiency in persistent migration directionality of RIAM-silenced cells might reflect a defective cell polarization, which could arise from alterations in cell contractility (21). As stress fiber formation and contractility requires Rho GTPase-dependent activation of the myosin light chain (MLC) of myosin II (22,23), we examined whether activation of RhoA

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and MLC may be altered in RIAM-silenced cells. We first analyzed phosphorylation of Vav2, which is a GEF activator molecule for RhoA (24,25). Both Vav2 tyrosine phosphorylation and Vav2 binding to RhoA following CXCL12 stimulation was defective in D11 cells compared to mock cells (Fig. 4A), which were associated with impairment of RhoA activation (Fig. 4B). Instead, the degree of tyrosine phosphorylation of p190RhoGAP, a GAP for RhoA, was similar in mock and D11 cells (not shown). RhoA activates its downstream effector ROCK, which in turn phosphorylates MLC (23). Phosphorylated myosin II then assembles into myosin filaments and associates with actin filaments for generation of contractile stress fibers that are needed for cell migration (26). We found that the defect in RhoA activation in D11 cells was associated with a decrease in MLC phosphorylation levels (Fig. 4C), suggesting that activation of the Vav2-RhoA-MLC pathway is impaired in RIAM-silenced melanoma cells. To determine if altered Vav2-RhoA activation in RIAM knockdown cells accounted for inhibition of melanoma cell invasion, we expressed constitutively active forms of Vav2 and RhoA (Vav2 CA and RhoA CA, respectively) in mock and D11 cells, and tested transfectants in invasion assays. Overexpression of Vav2 CA in D11 cells led to rescue of RhoA activation as well as to a partial recovery of invasion (Fig. 4D). Furthermore, overexpression of RhoA CA in D11 cells also led to a partial rescue of invasion compared to the same cells transfected with RhoA wt (Fig. 4E). Similarly, F8-Luc cells transfected with RhoA CA displayed higher invasion than the same cells transfected with RhoA wt forms (supplemental Fig. S3). These results indicate that impaired invasiveness shown by RIAM-silenced

BLM melanoma cells involves a defect in Vav2-RhoA-MLC activation. Association between talin and β1 integrin and β1-mediated adhesion are reduced in RIAM-depleted melanoma cells. Analyses of cell distribution of endogenous and transfected RIAM revealed that it was found at the edges of cell protrusions, usually showing a patchy distribution, as well as diffusely in the cytoplasm of BLM cells (supplemental Fig. S4, A). Furthermore, RIAM-His coprecipitated with talin in these cells (Supplemental Fig. S4, B). As talin interaction with the cytoplasmic tails of integrin β subunits represents a key event for integrin activation (27), we analyzed β1 integrin activation, talin-β1 association and cell adhesion in RIAM-depleted and RIAM-overexpressing cells, and compared them with control transfectants. RIAM-silenced BLM cells displayed a modest but consistent decrease in β1 integrin activation in response to CXCL12, as binding of 15/7, an anti-β1 antibody that detects high-affinity β1 integrin conformations (28), was lower on D11 than mock cells (Fig. 5A). Control experiments showed that mock and D11 cells retained a similar degree of 15/7 mAb binding upon exposure to Mn2+, a positive control for integrin affinity regulation. These results correlated with decreased talin-β1 association in RIAM knockdown cells (Fig. 5B). Conversely, cells overexpressing RIAM displayed higher 15/7 mAb binding and increase in talin-β1 assembly (Fig. 5C, D). Importantly, impaired talin-β1 association in D11 cells was rescued following RIAM-His overexpression (Fig. 5E). RIAM-silenced cells displayed a partial reduction in β1 integrin-dependent cell adhesion to fibronectin compared to control transfectants (Fig. 5F). On the contrary, RIAM overexpression resulted in upregulated cell adhesion to


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fibronectin (Fig. 5F). Moreover, RIAM knock down led to β1-integrin dependent decrease in transfectant adhesion to type I collagen (Fig. 5G), together indicating that RIAM depletion in melanoma cells results in impairment in both β1 integrin activation and β1-dependent cell adhesion. RIAM-silenced melanoma cells have defective Erk1/2 and Akt activation. Investigation of downstream activation signaling events following β1 integrin-mediated adhesion to fibronectin and type I collagen showed that activation of both Erk1/2 MAP kinase and the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) downstream effector Akt was impaired in RIAM-silenced BLM melanoma cells (Fig. 6A, B). Notably, Erk1/2 MAP kinase activation in RIAM knockdown cells was rescued following transfection of RIAM-His (Fig. 6C). These results indicate that RIAM depletion in melanoma cells affects activation of β1 integrin-mediated outside-in molecular signaling that regulates cell growth and survival, such as Erk1/2 MAP kinase and PI3-K activation. Growth and metastatic properties of RIAM knockdown melanoma cells. RIAM-silenced and mock melanoma cells were inoculated into SCID mice to follow their growth and dissemination. Between days 25 and 75 after subcutaneous inoculation with mock cells, all mice (n=13) displayed tumor volumes between 1.5-2.0 cm3, whereas only 3 out of 10 or 1 out of 10 mice inoculated with D11 or F7 cells, respectively, showed these tumor volumes (Fig. 7A). No subcutaneous tumor growth was detected in 60% and 90% of mice inoculated with D11 and F7, respectively, up to day 125. Three weeks after intravenous inoculation with mock melanoma transfectants, mice rapidly developed lung metastases, and after 6 weeks there were not surviving mock animals (Fig. 7B). D11 and F7 mice had a significantly

longer disease-free period (5.5-8 weeks), which was linked to a prolonged survival (Fig 7B). Melanoma cells derived from lung metastases retained GFP expression and displayed invasiveness to matrigel comparable to their original transfectants (supplemental Fig. S5, A, B), indicating that they retained their invasive properties during dissemination. Inhibition of in vivo tumor growth shown by RIAM knockdown melanoma cells correlated with abolishment in their capacity to form colonies in soft-agar cultures compared to mock cells (Fig. 7C). Furthermore, D11 and F7 cells displayed a reduction in cell proliferation, and conversely, cells overexpressing RIAM-His had higher proliferation rates than mock transfectants (Fig. 7D). Together these data indicate that RIAM expression confers growth and metastatic advantages to BLM melanoma cells in a xenograft model. RIAM-silenced melanoma cells have increased susceptibility to apoptosis. As inhibition of in vivo growth of RIAM-depleted melanoma cells could also involve cell apoptosis, we first analyzed whether they might have increased sensitivity to apoptosis-inducing agents. As a model for induction of cell apoptosis, we used cisplatin, a pro-apoptotic DNA alkylating agent used in the treatment of solid tumours (29). Cisplatin induced a dose-dependent decrease in cell survival that was of significantly higher extent in D11 and F7 than mock cells (Fig. 8A, left). This observation was associated with reduced levels of procaspase-3 and with higher PARP cleavage in D11 transfectants (Fig. 8A, right). In addition, D11 and F7 transfectants were more susceptible than mock cells to apoptosis by the hydroxyl radicals generated from excess H2O2 (Fig. 8B). As p38 MAP kinase activation is linked to cell stress and plays key roles in the control of cell proliferation and survival (30), we assessed its

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phosphorylation levels in mock and RIAM knockdown cells. The results showed that p38 MAP kinase was phosphorylated to higher levels in D11 than in mock cells when they were exposed to cisplatin (Fig. 8C). Given that melanoma cells invade across type I collagen-rich dermal connective tissue layers, we embedded mock and D11 cells in 3-D collagen I gels, and analyzed nuclei integrity following 72 h of incubation, as an indication of cell apoptosis. The results indicated that RIAM-silenced cells have higher proportion of compact/broken nuclei than mock cells (70% and 15%, respectively) (Fig. 8D, left and middle panels). Moreover, staining of D11 cells with an antibody to cleaved caspase-3 was substantially stronger than mock cells (Fig. 8D, right panel), again pointing to enhanced apoptosis in cells depleted for RIAM.

DISCUSSION We have used highly metastatic human melanoma cell lines to demonstrate that their invasion requires RIAM and its binding partner Rap1, and that RIAM expression confers growth and metastatic advantages to melanoma cells using a SCID xenograft model. Defective invasion of RIAM-silenced melanoma cells arose from impairment in sustained cell migration directionality, which was associated with inhibition in the activation of the Vav2-RhoA-MLC pathway. Furthermore, our data indicate that RIAM depletion reduces β1 integrin activation and β1-dependent melanoma cell adhesion. The decrease in this adhesion correlates with deficient activation of both Erk1/2 MAP kinase and PI3-K, two central molecules that control cell growth and cell survival. In addition to inhibit cell proliferation, RIAM silencing led to higher susceptibility to cell apoptosis.

BLM cells knockdown for RIAM displayed a predominant rounded morphology linked to impairment in the acquisition of a polarized phenotype. Myosin II-based contractility generates the force needed for cell migration, and contributes to cell polarity and to persistent cell migration (21,26,31). In support for defective polarization in cells knocked-down for RIAM that have impaired migration is the finding that they have deficient activation of the regulatory MLC component of myosin II. Deficient MLC phosphorylation correlated with inhibition of Vav2-RhoA activation, suggesting that the RhoA downstream effector ROCK (22,23) can not efficiently activate MLC. Importantly, expression of constitutively active Vav2 and RhoA forms partially rescued invasion of RIAM-depleted melanoma cells, indicating that Vav2 and RhoA mediate RIAM functions. Therefore, the data suggest that inhibition of invasion in RIAM-silenced BLM melanoma cells involves altered cell contractility and cell polarization due to deficient activation of the Vav2-RhoA-MLC pathway. The structural and functional connections of RIAM with this pathway are not known at present and should be the subject of future studies. A possible explanation is based on the fact that active Rap1 contributes to cell localization of Vav2 (32). Therefore, it is tempting to speculate that a Rap1-GTP/RIAM complex might recruit Vav2 to the cell membrane for subsequent Vav2 activation. Recent work has reported that RIAM translocation to the cell membrane modulates the activation of integrins through recruitment of talin (6,7), as well as the activation of Ras- and PLC-γ1-dependent signalling in T cells (10). Silencing or overexpression of RIAM led to reduction or increase, respectively, of β1 integrin activation in BLM melanoma


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cells. This response was linked to an impairment or increase, respectively, of talin-β1 association, an event associated to integrin activation (27). Notably, cell adhesion to fibronectin and collagen I was decreased in RIAM-silenced cells, and these adhesions were totally dependent on β1 integrins, as they were blocked by anti-β1 antibodies. This reduction in adhesion is likely the basis for the defective activation of Erk1/2 and the PI3-K downstream effector Akt, which are well-known downstream targets in outside-in signalling from integrins, involving at least cyclin D1 (33,34). Our results suggest that the impairment in β1 integrin-dependent activation of signalling pathways such as those controlled by Erk1/2 and PI3-K, may lead to the inhibition of cell proliferation that is observed in BLM melanoma cells depleted for RIAM. Therefore, one of the possible mechanisms behind the defective growth shown by RIAM-knockdown BLM melanoma cells subcutaneously inoculated into SCID mice may be based on deficient activation of β1 integrin-dependent outside-in signalling necessary for cell proliferation. An upstream candidate mediating integrin-dependent Erk1/2 MAP kinase activation that is regulated by RIAM activity is Ras, as recent data demonstrated that RIAM depletion in T cells results in failure of Ras-dependent Erk1/2 activation in response to TCR stimulation (10). Concomitant with the inhibition of proliferation shown by RIAM-silenced melanoma cells, they also displayed an increase in susceptibility to apoptosis and stress than their mock counterparts. Their higher apoptosis responses were detected in 2-D-cultured RIAM-depleted cells exposed to cisplatin, as well as when they were embedded in 3-D type I collagen gels, a condition that mimicks connective tissue environments that must be crossed

during invasion of melanoma cells. These responses might be a consequence of their defective activation of proliferation and survival signals mediated by Erk1/2 and PI3-K, and dependent on signalling from β1 integrins. Although the αvβ3 integrin has been shown to be involved in melanoma cell survival (35,36), it is unlikely that it could be playing a role in BLM cell survival, given that these cells express only background levels of this integrin. Therefore, decrease in proliferation and higher sensitivity to apoptosis of RIAM-depleted melanoma cells might contribute to inhibition of tumor growth of subcutaneously-injected cells. When RIAM-silenced BLM melanoma cells were intravenously inoculated, we detected significantly longer survival of SCID mice, associated with delayed latency of lung dissemination, than in those mice injected with mock cells. Based on the impaired cell invasiveness displayed by RIAM knockdown cells, a delay in the latency could reflect a defective lung homing and invasion capacity of these cells that could retard the initial steps of lung colonization. Alternatively, melanoma cell arrival to lungs might be only modestly affected by RIAM depletion, and extended mice survival might reflect the reduction of melanoma cell growth due to RIAM silencing. A more permissive lung environment compared to that of primary skin tumor could later favour the growth of RIAM-depleted melanoma cells involving lung growth factors. Consequently, these results indicate that RIAM contributes to cell growth and metastasis of BLM melanoma cells. Importantly, the Drosophila MRL protein ortholog pico is required for tissue growth, and its silencing leads to reduced cell division rates (8), thus stressing the important role of MRL proteins in cell proliferation. As we found

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201

RIAM expression on 7 out of 8 metastatic melanoma specimens, together the data suggest that RIAM might contribute to the dissemination of melanoma cells. Future studies should address the possible relationships between RIAM expression and prognostic values.

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FOOTNOTES

We thank Drs. Angeles García-Pardo, Marisol Soengas, Johannes L. Bos and David García-Bernal for reagents and helpful discussions, and Nohemí Arellano-Sánchez for expert technical assistance. María Teresa Seisdedos and Dr. Rafael Samaniego (Unidad de Microscopía Confocal, Hospital General Universitario Gregorio Marañón) is acknowledged for confocal microscopy, Dr. Pedro Lastres for cell sorting, and Manuel Moreno-Calle and Cristina Pintos-Maestro for assistance in the Animal Facility. This work was supported by grants SAF2008-00479 from Ministerio de Ciencia e Innovación (MCINN) to J.T.; SAF2007-60578 (MCINN) and CCG08-UCM/SAL-4259 to E.M.L.; by grants RETICS RD06/0020/0011 from MCINN to J.T. and BFU2007-66443 to C.C; by a grant from Fundación Ramón Areces (2006) to P.S-M; by grant EU-FP7-MetaFight, European Union HEALTH-2007-201862 to J.T and S.S.; by a grant from The Swedish Cancer Society and The Swedish Research Council to S.S.; by grant 2RO1 AI43552 to V.A.B.; and by a grant from the Fundación de Investigación Científica de la Asociación Española contra el Cáncer (to RAB). Part of the imaging was performed at the Live

Anexo

203

Cell Imaging facility, Department of Biosciences and Nutrition at Karolinska Institutet, supported by grants from the Knut & Alice Wallenberg foundation, the Swedish Research council and the Center for Biosciences.


204

FIGURE LEGENDS

Figure 1. CXCL12-promoted melanoma cell invasion is dependent on Rap1. (A) BLM melanoma cells were incubated with or without CXCL12 and subsequently subjected to Rap1 GTPase assays. Numbers under gel represent densitometer analyses in arbitrary units. (B) BLM cells were transfected with control or the indicated Rap1 siRNA, and transfectants analyzed by immunoblotting with anti-Rap1 antibodies (left), or tested in invasion assays across Matrigel in response to CXCL12 (right). (C) BLM cells were transfected with pSuper or pSuper-Rap1 vectors, and transfectants analyzed by immunoblotting (left), or tested in invasion assays (right). (D) BLM cells were transfected with wild type Rap1 (Rap1 wt), constitutively active Rap1 (Rap1 CA) or empty vectors (Mock), and transfectants analyzed by western blotting with anti-Rap1 or anti-HA antibodies (left), or subjected to invasion assays across Matrigel (right). ***Invasion was significantly inhibited, p<0.001, **p<0.01, or *p<0.05. All invasion experiment were done with duplicate samples. (B, n=4; C, n=3). ΔΔInvasion was upregulated compared to invasion by mock cells, p<0.01 (n=2). Anti-β-actin antibodies were used to control protein loading in western blots. Figure 2. RIAM is required for melanoma cell invasion. (A) Immunohistochemical analysis of RIAM expression on melanoma lymph node metastasis. Sections were stained with the melanoma specific marker HMB-45 (tumor) or with anti-RIAM antibodies, or with DAPI to visualize nuclei. Sample #82 is shown. Additional analyses of melanoma specimens are shown in supplemental Fig. S1. (B) Expression of RIAM in untransfected BLM cells, and in Mock and stable RIAM knockdown cells (D11 and F7), was analyzed by immunoblotting with anti-RIAM antibodies (top). Numbers under gel represent densitometer analyses in arbitrary units. (Bottom) Transfectants were tested in invasion assays across Matrigel (C) BLM cells were transfected with control or with the indicated RIAM siRNA, and transfectants analyzed by immunoblotting (top), or tested in invasion assays (bottom). (D) Stable or transient RIAM-silenced transfectants were subjected to invasion assays in response to fetal bovine serum (10%). (E) BLM cells were transfected with His- or myc-tagged RIAM vectors, and transfectants analyzed by immunobloting to examine RIAM-His or RIAM-myc expression (left), or subjected to invasion assays (right). (F) Mock and D11 cells were transfected with control or RIAM-His vectors and their invasion to CXCL12 was compared to that of mock cells. (G) MV3 melanoma cells were transfected with control or siRNA RIAM #2, and transfectants analyzed by western blotting for RIAM expression (left), or tested in invasion assays (right). ***Invasion was significantly inhibited, p<0.001 or **p<0.01. (B, n=5; C, n=3; D, n=2; F, n=3; G, n=2). ΔΔΔInvasion was upregulated compared to invasion by mock cells, p<0.001 (E, n=3). Anti-β-actin antibodies were used to control protein loading in western blots. Figure 3. Directional persistence of migration is deficient in RIAM-silenced melanoma cells. (A) Cells in culture were tested in wound healing assays in the presence of CXCL12 (50 ng/ml). A representative result from three experiments is shown. (B) Transfectants were subjected to time-lapse microscopy experiments on Matrigel. CXCL12 (150 ng/ml) was added on the top reservoir of chambers, and migration of individual cells (n=15) was tracked and represented in μm (X and Y axis) using a common starting point in the middle of the graph. Shown is a representative result of three independent experiments. EMD: Euclidean mean distance. (C) Cells

Anexo

205

were transfected with DsRed-paxillin, and membrane protrusions analyzed for the indicated times by time-lapse microscopy. Shown are two representative individual cells from each mock and D11 transfectants. Figure 4. Impaired invasion of RIAM-silenced melanoma cells involves defective Vav2-RhoA-MLC activation. (A) Mock or D11 cells were incubated for the indicated times with CXCL12 and subjected to immunoprecipitation with anti-Vav2 antibodies and immunoblotting with the indicated antibodies. Numbers under gel represent densitometer analyses in arbitrary units showing Vav2 tyrosine phosphorylation levels. (B, C) Cells were tested for GTPase assays to detect active RhoA (B), or analyzed by western blotting for phospho-MLC or total MLC expression (C). (D) Mock and D11 cells were transfected with GFP-fused wild type (wt) or constitutively active (CA) forms of Vav2, and transfectants analyzed by immunoblotting with anti-Vav2 antibodies (top), or subjected to RhoA GTPase and invasion assays (middle and bottom). (E) Mock and D11 cells were transfected with GFP-fused wild type (wt) or constitutively active (CA) forms of RhoA, and transfectants analyzed by immunoblotting with anti-RhoA antibodies (left), or subjected to invasion assays (right). **Invasions of D11-Vav2 CA or D11-Rho CA transfectants were significantly higher than D11-Vav2 wt or D11-Rho wt cells, respectively, p<0.01. Figure 5. RIAM-silenced melanoma cells have reduced β1 integrin activation and talin-β1 integrin association, and defective β1 integrin-mediated adhesion. (A) Mock and D11 cells were incubated with CXCL12 (200 ng/ml) or with MnCl2 (1 mM), and subsequently subjected to flow cytometry with 15/7 anti-β1 or control P3X63 mAb, followed by detection with a rhodamine-conjugated secondary antibody. Numbers indicate mean fluoresecence intensity values. (B, D) Transfectants were subjected to immunoprecipitation with control (Ctr) or Lia 1/2.1 anti-β1 antibodies, followed by immunoblotting with anti-talin or anti-β1 antibodies. (C) Transfectants were assayed by flow cytometry with 15/7 anti-β1 mAb, in the absence or presence of MnCl2. (E) Mock and D11 cells were transfected with control or RIAM-His vectors, and subjected to immunoprecipitation and western blotting as in B) and D). Total talin loading is also shown. (F, G) Transfectants were tested in adhesion assays (10 min, 37ºC) to fibronectin or type I collagen, in the presence of control or Lia 1/2.1 anti-β1 mAb. Basal adhesion to BSA is also displayed. ***Adhesion was significantly inhibited, p<0.001, ** p<0.01, or p<0.05, or stimulated Δp<0.05; (n=4). Figure 6. RIAM-silenced melanoma cells have defective Erk1/2 and Akt activation. (A, B) Transfectants were plated for the indicated times on fibronectin or collagen I, and following cell lysis, extracts were subjected to western blotting with antibodies to phosphoErk1/2, Erk1/2, phosphoAkt or Akt. (C) Mock and D11 cells were transfected with control or RIAM-His vectors and subsequently analyzed by immunoblotting with phosphoErk1/2 and Erk1/2 antibodies. Figure 7. RIAM silencing in melanoma leads to inhibition of tumor growth and delayed metastasis. (A) SCID mice were subcutaneously inoculated with the indicated melanoma BLM transfectants. Data show the correlation between days post-inoculation and percentage of mice having tumor volumes between 1.5-2.0 cm3 (left), or free-tumor mice (right). (B) Shown are survival curves of SCID mice intravenously inoculated with the indicated melanoma transfectants (***Survival was significantly higher than mice inoculated with mock transfectants, p<0.001). (C) Displayed are representative fields of anchorage-independent colony formation on soft agar (left), and quantification in mean colony numbers (right, n=3; duplicates). Only colonies larger


206

than 50 μm were counted. (D) Cell proliferation was determined using the MTT assay (left). *Proliferation was inhibited, p<0.05, or augmented ΔΔΔp<0.001 (n=4). (Right) Cells (5x103) were cultured in complete medium for the indicated times and counted in Newbauer chambers (n=3). Figure 8. RIAM-silenced melanoma cells have increased susceptibility to apoptosis. (A) Melanoma transfectants were incubated for 24 h in the presence of the indicated concentrations of cisplatin, and cell survival was measured as indicated in the Methods (left), or cell extracts subjected to immunoblotting using antibodies to the indicated proteins (right). The PARP antibody recognizes both the intact and cleaved fragment (CF). (B) Cells were treated for 14 h with 3 μM H2O2 and cell survival was measured as above. (C) Cells were exposed for the indicated times to cisplatin (50 μM) and subsequently subjected to western blotting for detection of phosphorylated (pp38) or total p38 MAP kinase. (D) Mock and D11 cells were embedded in 3-D type I collagen gels, and stained with DAPI or GFP-visualized by microscopy (left). Middle panel shows quantification of nuclei showing normal or compact/broken DAPI staining. (Right) Cells were stained with DAPI or with an antibody to cleaved caspase-3 and analyzed by confocal microscopy.

Anexo

207

SUPPLEMENTAL DATA

Supplemental Figure 1. Expression of RIAM on melanoma metastases. Five different lymph node melanoma metastases were analyzed by immunohistochemistry. Sections were stained with the melanoma specific marker HMB-45 (tumor) or with anti-RIAM antibodies, or with DAPI to visualize nuclei. Supplemental Figure 2. Expression and functional analyses of RIAM in melanoma cells. (A) Expression of RIAM in the melanoma cell lines BLM, Mel57, MeWo, SK-Mel-147 and SK-Mel-173 was assessed by immunobloting with anti-RIAM antibodies. (B) Lysates from BLM cells exposed for 15 min to CXCL12 were incubated with GST or GST-Ral-GDS, and bound Rap1 and RIAM were detected by immunoblotting. (C) BLM cells were infected with pLL3.7 or pLL3.7-shRIAM vectors, and upon cell sorting based on GFP expression, transfectants were analyzed by flow cytometry. (D) Generation and characterization of F8-Luc RIAM knockdown and mock-luc transfectants. HEK-293FT packaging cells were co-transfected using lipofectamine (Invitrogen Corp.) with pSFG-GFP-Luc vector (a gift from Dr. Vladimir Ponomarev, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY), and vectors coding for gamma-retrovirus proteins gag and pol (pNGVL-MLV-gag-pol) and vesiculovirus envelope glycoprotein (pNGVL-VSV-G) (gifts from Dr. Rafel Delgado, Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain). Conditioned media containing viral particles were used to infect BLM cells, which were sorted based on GFP expression. Subsequently, selected cells were subjected to in vitro luciferase activity assays to assess their luciferase expression (TD20/20 luminometer, Turner Biosystems, Sunnyvale, CA) (not shown). This protocol established the parental BLM-luc cells. Viruses from supernatants of HEK-293FT cells transfected either with pRetroSuper or with pRetroSuper-shRIAM (Origene, Rockville, MD) vectors were used to infect BLM-luc cells, which upon selection with puromycin gave rise to the mock-Luc and F8-Luc transfectants, respectively. These transfectants were analyzed by western blotting with anti-RIAM antibodies (left), or subjected to invasion assays (right). ***Invasion was significantly inhibited, p<0.001. Supplemental Figure 3. Constitutive active RhoA partially rescues invasion of RIAM-silenced melanoma cells. Mock-Luc or F8-Luc cells were transfected with RhoA wild type (wt) or constitutively active (CA) vectors, and analyzed by immunoblotting using anti-RhoA antibodies (left), or subjected to invasion assays (right). ΔΔInvasion of F8-Luc-Rho CA transfectants was significantly higher than F8-Luc-Rho wt counterparts, p<0.01. Supplemental Figure 4. RIAM distribution on melanoma cells, and RIAM co-precipitation with talin. BLM cells were transfected with His-tagged RIAM vectors, and transfectants attached on fibronectin were analyzed by confocal microscopy (LEICA TCS-SP2-AOBS-UV) using anti-RIAM or anti-His antibodies (A), or subjected to immunoprecipitation and immunoblotting with the indicated antibodies (B). Supplemental Figure 5. Lung metastases from mock and RIAM knockdown melanoma cells. Melanoma cells isolated from lung metastases and cultured for 6 days were tested by flow cytometry for GFP expression (A), or subjected to Matrigel invasion assays (B).


208

SUPPLEMENTARY MOVIES

1A. Migration of Mock cells on Matrigel. CXCL12 is located on the top reservoir (see Methods). Shown is 1 frame/4 min. 1B. Dots and lines depicting migration of 15 selected mock cells from movie 1A. 2A. Migration of D11 cells on Matrigel. CXCL12 is located on the top reservoir (see Methods). Shown is 1 frame/4 min. 2B. Dots and lines depicting migration of 15 selected D11 cells from movie 2A. 3A, B. Dynamics of membrane protrusions of Mock cells during migration on fibronectin. Shown is 1 frame/10 min. 3C, D. Dynamics of membrane protrusions of D11 cells during migration on fibronectin. Shown is 1 frame/10 min.

Anexo

209

Total

Rap1

Active

Rap1

0 15C

XC

L12 (min)

A

1 3,2

0

250

500

750

Control

Rap1A

.1 Medium

CX

CL12

**

siRN

A

Invasive cells

Rap1A

.2

*

B

CtrlR

ap1A.1

β-actin

Rap1

siRN

A

1 0.12 0.06 0.18

Rap1A

.2

24 h 48 h 48 h

WB

anti-HA

anti-Rap1

Rap1-H

A-

Rap1-H

A

D

Mock

Rap1 wtRap1 CA

β-actin

Rap1-

0

250

500

750

1000

Invasive cells

MockRap1 wtRap1 CA

Medium

CX

CL12

ΔΔ

Fig. 1

β-actin

Rap1

pSuperpSuper-

Rap1A

C

0

500

1000

1500

2000

pSuperpSuper-R

ap1A

Invasive cells

***

Medium

CX

CL

12


210

0

800

1600

2400

Mock

D11 M

ediumC

XC

L12

******

F7shR

IAM

Invasive cells

shRIA

M

RIA

MBLM

Mock

D11F7

β-actin

1 0.20 0.13

BCβ-actin

RIA

M

siRIA

M(#)

siCtr

12

3

1 0.46 0.18 0.26

0

300

600

900

siCtr

1

Medium

CX

CL

12

2siR

IAM

(#)

Invasive cells

**

***

3

***

Fig. 2

Medium

Serum

0

2500

5000

7500

Invasive cells

Mock

D11

siRN

AC

ontrolR

IAM

D

******

A

ERIA

Mβ-actin

ControlRIAM-His

RIA

M

ControlRIAM-Myc

β-actin

Invasive cells

0

2000

4000

6000Control

RIA

M-M

ycR

IAM

-His

ΔΔΔ

ΔΔΔM

ediumC

XC

L12

Control

Anexo

211

Medium

Serum

0

1000

2000

3000

Invasive cells

Control

RIA

MsiR

NA

MV

3

ControlRIAM

MV

3

siRN

A:

RIA

M

β-actin

G

1 0.35

1200

2400

3600

Control

RIAM-His

D11

Mock

0Control

RIAM-His

ΔΔΔ

Invasive cells

Mock

D11

ControlRIAM-His

ControlRIAM-His

F

RIA

M

β-actin***


212

D11

Mock

CXCL12

B

EMD

66.16±45.2 μMEM

D150.08±95.2 μM

A0 h

24 h

D11

Mock

F8-Luc

*

Mock

D11

**

**

*

12

34

56

Time on Fibronectin (h)

**

**

**

**

**

**

**

**

**

**

*

*

*

*

**

*

**

*

**

**

*

**

*

*

**

**

**

** *

Anexo

213


214

Anexo

215

Fig. 5

B

Talinβ1

Anti-β1

Ctr

IP:

Mock

D11M

ock

1 0.33

Talinβ1

RIAM

-His

Anti-β1

Ctr

IP:

Control Control

1 2.8

Talinβ1

Anti-β1

Ctr

IP:

MockM

ock/Control

Mock/RIAM

-His

D11/RIAM-His

D11/Control

Total

Talin D

A

FluorescenceIntensity

Control m

Ab

101

CX

CL

12 (30 sec)

(59.6)(31.8)

Mock

D11

100

102

103

Mock

D11M

n++

D11

(143.2)(140.7)

100

101

102

Mock

15/7 m

Ab

(31.0)D

11(41.4)M

ockC

XC

L12 (60 sec)

103

104

104

C-M

n2+

RIA

M-H

is(10.9)

Control(6.9)

FluorescenceIntensity

0

+ Mn

2+

RIA

M-H

is(26.8)

Control(29.6)

100

101

102

103

15/7 m

Ab

E

Adhesion

toFibronectin

Mock

D11

Anti-β1

Controlm

Ab

Cells bound/mm2200

400**

FM

ockR

IAM

-His

Anti-β1

Controlm

Ab Δ

200

400

60000

Anti-β1

150

300

12

2C

ol I (μg/ml)

Controlm

Ab

Adhesion

toC

olagenI

Mock

D11

***

**

0

***

*Col I (μg/m

l)1

2

siRN

AC

ontrolR

IAM

Cells bound/mm2

G

BSA

BSA

BSA


216

Anexo

217


218

Anexo

219

Suppl. Fig. S1


220

Anexo

221


222

Anexo

223

GFP expression

(FluorescenceIntensity)

101

102

103

101

102

101

102

010

010

110

210

310

010

010

310

010

3

BL

M

Mock

D11

F7

AM

ediumC

XC

L12

0

500

1000

1500

2000

Invasive cells

Mock

D11

B


224

tesis pablo hernÁndez varasdigital.csic.es/bitstream/10261/148937/1/tesis_pablo... ·...

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