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NUEVO MÉTODO REVELA TOXICIDAD DIFERENCIAL DE RANAS VENENOSAS
SOBRE BIOMODELOS VERTEBRADOS E INVERTEBRADOS
LAURA M. TABARES PIEDRAHITA
DIRECTOR:
ADOLFO AMÉZQUITA TORRES, PhD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
OCTUBRE DE 2018
NUEVO MÉTODO REVELA TOXICIDAD DIFERENCIAL DE RANAS VENENOSAS SOBRE BIOMODELOS VERTEBRADOS E INVERTEBRADOS
Laura Tabares-P.1, Adolfo Amezquita Torres1
1Grupo de Ecofisiología, Comportamiento y Herpetología GECOH, Universidad de los Andes,
Bogotá D. C. - Colombia
La toxicidad es quizás una de las estrategias defensivas más extendidas en la naturaleza.
Los anuros son uno de los grupos de vertebrados en los que más se ha estudiado la
toxicidad. Estos estudios incluyen la descripción de los compuestos, su diversidad
estructural, su origen, su modo de acción, sus estructuras diana y los genes asociados a
la resistencia. Sin embargo, las pruebas de toxicidad consisten en métodos desarrollados
en los años sesenta y presentan dos limitaciones; por un lado las pruebas de toxicidad se
basan en maceraciones y extractos metabólicos que podrían extraer de manera
incompleta las toxinas de la piel. Por otro lado, en muchas de esas pruebas se mezclan
las pieles de muchos individuos, lo cual impide estimar la variación en toxicidad entre
ranas de las misma especie y localidad. Finalmente la totalidad de las pruebas consisten
en bioensayos hechos sobre ratones de laboratorio, lo cual genera controversia sobre la
interpretabilidad de los ensayos en términos de los depredadores naturales de las ranas.
Además de las implicaciones éticas asociadas al uso de ratones y ratas como especies
modelo para la realización de estas pruebas. Desarrollamos y estandarizamos una prueba
de toxicidad que resuelve varias de estas limitaciones descritas: Se extrajeron toxinas de
dos especies de anuros (Oophaga histrionica y Oophaga pumilio) utilizando un sonicador
para provocar lisis celular y liberación de toxinas y los bioensayos fueron realizados en dos
especies modelo filogenéticamente distantes (Daphnia magna y Danio rerio). Nuestros
resultados revelan toxicidad diferencial entre el modelo vertebrado e invertebrado y alta
variación intraespecífica en la toxicidad en O. pumilio. Consideramos que este protocolo
es un importante avance en el estudio de la toxicidad en la medida en que considera las
implicaciones éticas de las pruebas realizadas en animales y mejora la resolución del
análisis estadístico, lo que la hace una mejor aproximación.
INTRODUCCIÓN
La toxicidad es quizás una de las estrategias defensivas más extendidas en la naturaleza,
pues le permite a los organismos reducir el riesgo de depredación y protegerse de los
patógenos (Berenbaum 1995, Dumbacher 1999, Breed & Moore 2011, Saporito et al.
2012). Las toxinas son principalmente compuestos secundarios que derivan de los
metabolitos que participan en los procesos fisiológicos primarios (Saporito et al. 2012);
estos pueden ser péptidos y alcaloides, entre otros. Estas sustancias pueden tener un
origen endógeno, es decir, que el mismo organismo es capaz de sintetizarlas (Termonia et
al. 2001), o exógeno, cuando los organismos secuestran los metabolitos secundarios de
su alimento (Saporito 2004, Saporito et al. 2012).
Las toxinas constituyen sustancias nocivas, olorosas o tóxicas que repelen, dañan,
distraen o impiden la detección por parte de los depredadores (Breed & Moore 2011). La
coevolución ha favorecido su diversificación molecular, promoviendo una fuerte actividad y
alta especificidad de sus sitios de acción, asociados a elementos claves para la actividad
fisiológica de los organismos diana (Brodie 2009, Zhang 2015). Un ejemplo son los
alcaloides producidos por las ranas venenosas, como la tetrodotoxina y batracotoxina,
que actúan sobre las membranas celulares afectando su excitabilidad. Tienen su sitio de
acción en los canales iónicos (canales de sodio, calcio, potasio, etc.) provocando su
apertura permanente o su bloqueo (Daly 1995). Otras toxinas pueden actuar sobre los
receptores de membrana bloqueando la respuesta del músculo esquelético a la
acetilcolina (Ballantine & Abbott 1957, Dumbacher 1999). Y otros alcaloides como la
pirrolizidina pueden tener efectos nocivos hepatotóxicos, mutagénicos y deletéreos a largo
plazo (Boppré 1990).
Los estudios de toxicidad incluyen la descripción de los compuestos (ej. Daly et al. 1987,
Daly 1998, Trigo 2000, Mithöfer & Boland 2012), su diversidad estructural, su origen, su
modo de acción, sus estructuras diana y los genes asociados a la resistencia. En este
sentido, se ha tenido particular interés en aquellas toxinas animales que actúan sobre los
canales iónicos y receptores de membrana, y se ha encontrado que un mismo canal
puede ser blanco de toxinas estructuralmente distintas, que también difieren en sus
modos de acción. De igual forma, toxinas con estructuras similares pueden actuar sobre
varios tipos de canales iónicos (Mouhat et al. 2004). Sin embargo, las interpretaciones
sobre la función ecológica de las toxinas requieren invariablemente pruebas de toxicidad,
que estiman sus efectos sobre la la probabilidad de supervivencia, la reproducción y el
desarrollo de organismos modelo; en el primer caso se calculan valores de dosis letal
mínima (DL50) de distintos compuestos químicos, como venenos animales y fármacos (ej.
Kennedy et al. 1986, Mayer et al. 1994, Lilius et al. 1995, Pretti et al. 2009).
Los anuros son uno de los grupos de vertebrados en los que más se ha estudiado la
toxicidad. Muchos usan toxinas como mecanismo de defensa y poseen un color llamativo,
una combinación de características conocida como aposematismo (Cott 1940). Un
modelo clásico de estudio son las ranas en la familia Dendrobatidae (Summer & Clough
2001, Grant et al. 2006), o ranas venenosas, denominas así por su capacidad para
secuestrar alcaloides de la dieta y utilizarlos como defensa química (Saporito et al. 2012).
Este grupo posee gran diversidad de especies y variación ínter e intraespecifica en color,
toxicidad, y comportamiento (Daly et al. 1978, Daly et al. 1992, Daly 1998, Summer &
Clough 2001, Saporito et al. 2012). Se ha observado que en algunas especies hay
divergencia en color y comportamiento, acompañada por cambios en la toxicidad (Pröhl &
Willink, 2015). Precisamente el género Oopahaga es uno de los más conspicuos, con más
alta variación fenotípica y mejor estudiados (Grant et al. 2006).
Los dendrobátidos resultan entonces un modelo particularmente apropiado para estudiar
la toxicidad. En los estudios realizados entre los años 60 y 80, se utilizaba el extracto de
piel de hasta 3200 individuos de cada especie para aislar los alcaloides presentes en sus
pieles y estimar su toxicidad (DL50) en ratones (Daly & Myers 1967, (Daly et al. 1987, Daly
1995). En las siguientes décadas se han desarrollado otras aproximaciones estimando,
por ejemplo el tiempo que los ratones tardan en volver a quedarse dormidos (Darst &
Cummings 2006, Darst et al. 2006 y Maan & Cumings 2012); también se han calculado y
usado hasta 56 variables comportamentales en ratones (Amézquita et al. 2017).
Estas aproximaciones presentan problemas y limitaciones que han generado algunas
críticas (por ejemplo Weldon 2017) y que han llevado a buscar nuevas alternativas. Si bien
nuestro método no resuelve todas las limitaciones, consideramos que soluciona en gran
medida algunas de ellas: (1) la mezcla de pieles de varios individuos para obtener un solo
extracto no permite ver la variación en toxicidad que podría existir entre poblaciones e
individuos. Por el tamaño de los dos biomodelos que se proponen en este estudio, es
posible evaluar la toxicidad de un solo individuo sin necesidad de mezclar varias pieles.
Esto es fundamental porque tiene implicaciones sobre el tipo de preguntas que pueden
responderse con respecto a la variación intrapoblacional en la toxicidad. (2) La estimación
de la toxicidad individual de cada alcaloide obtenido en los extractos de piel, no
necesariamente representan la toxicidad del individuo completo en la naturaleza, pues las
pieles de estos organismos contienen un coctel de compuestos, alcaloides, péptidos u
otras sustancias, que también podrían ser nocivas o tóxicas, y actuar de manera sinérgica
(Speed et al. 2012).
(3) El uso de ratones como biomodelo de prueba ha sido criticado debido a que el ratón
podría no ser un representante adecuado de los depredadores de las ranas venenosas.
En este caso, los peces cebra tampoco son depredadores naturales de las ranas, sin
embargo, dado el mecanismo de acción de las toxinas de las ranas venenosas es posible
que en este sentido la especie utilizada como biomodelo no constituya una limitante, en
cuyo caso, D. rerio como biomodelo de estudio muestra algunas ventajas sobre el uso de
ratones. Segundo, los efectos causados por la inyección peritoneal podrían no ser
equivalentes a los efectos causados por la ingesta de la rana por parte de un depredador
en la naturaleza. Sobre esto, nuestro modelo pez sería más aproximado a la realidad,
dado que los peces son depredadores naturales de renacuajos, de varias especies de
bufonidos (Smith, et al. 2008). Finalmente, proponemos el uso de pez cebra como una
alternativa al uso de ratones y ratas porque es una especie que cumple con los
requerimientos de las tres Rs. Reducción en el número de organismos utilizados (ranas),
para obtener datos suficientes para realizar la investigación y una reducción en la cantidad
de residuos contaminantes producidos durante la realización de las pruebas y el cultivo de
los organismos, lo que permite reducir el impacto ambiental de este tipo de estudios.
En este estudio nos interesa particularmente el efecto de la pertenencia filogenética del
biomodelo en el resultado de las pruebas de toxicidad. Dada la gran distancia filogenética
entre vertebrados e invertebrados, podríamos suponer que existen diferencias moleculares
asociadas, con consecuencias fisiológicas, que llevarían a que los biomodelos vertebrados
fueran más o menos sensibles a ciertas toxinas que los biomodelos invertebrados. Por
ejemplo, en vertebrados existen superfamilias de genes asociadas a los canales iónicos,
mientras que en invertebrados al parece se encuentran uno o pocos genes asociados lo
que Zakon 2012 podría sugerir la posibilidad de que se estuvieran produciendo diferentes
tasas de desarrollo de resistencia a toxinas.
Nuestro estudio pretendió entonces (1) desarrollar un nuevo protocolo para medir la
toxicidad en ranas venenosas, y (2) poner a prueba una hipótesis central: la toxicidad de
los extractos de piel de estas ranas, tiene efectos distintos sobre el riesgo de muerte para
cada tipo de biomodelo; vertebrado (Danio rerio) e invertebrado (Daphnia magna). Para
este propósito, (3) comparamos la toxicidad entre individuos, poblaciones y especies de
ranas del género Oophaga y (4) comparamos los resultados obtenidos en este estudio
con los de otros autores.
MÉTODO
Sistema de Estudio
Las ranas venenosas son un grupo de anuros neotropicales pertenecientes a la familia
Dendrobatidae (Santos 2009). Esta familia esta compuesta por numerosas especies que
se distribuyen desde el norte de Nicaragua hasta el sur de Bolivia y Brasil. Son de hábitos
diurnos y muchas de estas especies poseen colores llamativos y toxicidad (Myers & Daly
1976, Daly et al. 1985, Pröhl & Willink 2015). Dentro de este grupo, estudiamos dos
especies del género Oophaga: O. pumilio que se distribuye desde Nicaragua hasta el
noroeste de Panamá (Daly & Myers 1967, Savage 2002) y O. histrionica que se distribuye
desde el norte del departamento del Chocó hasta Anchicayá en el departamento del Valle
del Cauca.
Oophaga pumilio y O. histrionica representan dos de los casos más extremos de
polimorfismo en ranas venenosas, donde la divergencia en color y comportamiento ha
sido acompañada por cambios en la toxicidad (Myers & Daly 1976, Daly et al. 1985,
Summers et al. 2003, Saporito et al. 2007, Amézquita et al. 2013). Esta divergencia ha
producido poblaciones con estrategias anti-depredadores a lo largo de todo el continuo
entre aposematismo y cripsis (Pröhl et al. 2015, Cummings & Crothers 2013), e incluso en
algunas de estas poblaciones, el rango de variación intrapoblacional en color y patrón
excede en gran medida el rango de divergencia interpoblacional (Amézquita et al. 2013).
Colecta
Se realizaron tres salidas de campo entre octubre y noviembre de 2017; dos salidas en
Colombia, donde se colectaron individuos de tres poblaciones de O. histrionica: cinco
individuos en el corregimiento de La Delfina (Dagua, Valle del Cauca), cinco individuos en
Bahía Solano (Chocó) y tres individuos en el corregimiento de La Victoria (Chocó). Y una
salida en Panamá en la provincia de Chiriquí, donde se colectaron individuos de cuatro
localidades de O. pumilio: Miramar (5 individuos), Rambala (4 individuos), Michilá (5
individuos) y Almirante (5 individuos).
Como modelos de prueba se emplearon pulgas de agua (D. magna) y peces cebra (D.
rerio), en estadio larval (neonatos) de 24 h y 4 días respectivamente. El pez cebra (Danio
rerio, Cyprinidae), se ha utilizado como modelo para la investigación biológica desde la
década de 1930, tradicionalmente en estudios de biología del desarrollo y genética
molecular (Zhang et al. 2003). Es un organismo ampliamente estudiado en morfología,
bioquímica y fisiología en todas las etapas de su desarrollo y en ambos sexos, de modo
que en las últimas décadas se ha convertido en un modelo ideal para estudios
toxicológicos y en el descubrimiento de fármacos (ej. Zon & Peterson 2005, Parng et al.
2002), donde el objetivo es identificar efectos adversos de la exposición química (Zhang et
al. 2003, Hill et al. 2005).
El pez cebra es fácil de criar y económico de mantener (Laale 1977, Roex et al. 2001). Los
adultos crecen de 4 a 5 cm de largo y alcanzan la madurez sexual en 3 ó 4 meses. Cada
hembra puede poner de 200 a 300 huevos por semana y la embriogénesis se completa
cinco días después de la fecundación (Zhang et al. 2003, Barrio et al. 2015). Gracias a
que los embriones son trasparentes los efectos de la toxicidad en los órganos y en el
desarrollo en general pueden evaluarse visualmente o cuantificarse usando colorantes;
además, su permeabilidad facilita el desarrollo de las pruebas, pues es suficiente con
agregar la sustancia tóxica en el agua donde se encuentra el embrión (Zhang et al. 2003,
Belyaeva et al. 2008).
Otro grupo frecuentemente utilizado como organismos de prueba o de referencia en
pruebas de toxicidad son las especies del género Daphnia (orden Cladocera), también
conocidas como pulgas de agua. Su amplia distribución geográfica, su rol fundamental en
las comunidades de zooplanctón, su fácil cultivo en laboratorio y sus características
reproductivas: reproducción por partenogénesis (asegura uniformidad de respuesta en las
pruebas), ciclo de vida corto y alto número de crías, han hecho de este grupo un ideal
para la evaluación de toxicidad, de carácter universal (Koivisto 1995, Díaz et al. 2004).
Dentro de este género, Daphnia magna es la especie “estándar” de las pruebas de
toxicidad en agua (ej. Lilius et al. 1995, Koivistio 1995, Silva et al. 2003) y se ha utilizado
en estudios de tolerancia o toxicidad durante más de un siglo (ej. ASTM 1987, OCDE
1992).
Para la realización de este estudio se estandarizó un protocolo para el mantenimiento de
un cultivo de D. magna a partir de un lote obtenido de un proveedor particular. Las
Daphnias fueron alimentadas con el alga Chlorella vulgaris obtenida de un cultivo
establecido previamente y fueron mantenidas en acuarios pequeños con agua
reconstituida, también conocida como agua dura. Para su preparación nos basamos en el
protocolo de ASTM (1980) con modificaciones. Una vez establecido el cultivo de Daphnias
separamos juveniles de adultos y descartamos las hembras de mas de cinco semanas.
Los principales parámetros que se tuvieron en cuenta para el cultivo fueron la temperatura
(18 - 22 ºC) y el fotoperíodo (Martínez-Jerónimo 2000, Castillo 2004). Por su parte, las
larvas de pez cebra corresponden a cepas silvestres, obtenidas de un cultivo
debidamente establecido en el Laboratorio de Biología del Desarrollo de la Universidad de
los Andes, dirigido por la profesora Zayra Garavito (PhD). Donde tienen un cultivo de
peces cebra debidamente establecido.
Extractos de piel de las ranas
Para obtener el extracto de piel de las ranas, aplicamos eutanasia a los individuos
utilizando bajas temperaturas, colocamos cada individuo en la nevera con un período de
enfriamiento, seguido por un período de congelación (Shine et al. 2015). Luego quitamos
la piel realizando una incisión en el abdomen de los individuos. Colocamos la piel en una
caja de Petri y la dejamos secar durante 1 hora. Para hacer más eficiente el secado y
evitar que se pierda parte de las toxinas, abrimos completamente la piel y dejamos el área
dorsal hacia arriba (es decir que no toque la caja de Petri). Una vez pasada la hora,
pesamos la piel, luego cortamos un área aproximada de 1.5 cm2 y pesamos por separado
la porción y la piel restante. Posteriormente cortamos toda la piel en pedazos muy
pequeños y los mezclamos para tomar nuevamente una porción equivalente en peso al
área de piel de 1.5 cm2 pesada previamente. Almacenamos de manera separada la
porción y la piel restante en 2 mL de metanol dentro de viales de vidrio (si la piel no se va
a utilizar inmediatamente se almacena a una temperatura de -80 ºC). A partir de aquí el
proceso continuó solo para la porción de piel equivalente al área de 1.5 cm2.. Primero la
homogenizamos agregando nitrógeno líquido y macerando con un agitador de vidrio.
Luego la colocamos en un sonicador/baño ultrasónico (Bransonic, MOD 1800) por 20
minutos continuos, la filtramos, utilizando filtros de jeringa y la guardamos en un tubo
microcentrífuga de 2 mL. El filtrado obtenido fue secado en un concentrador (Thermo
Savant SpeedVac, LABCONCO) por un tiempo aproximado entre 4 y 7 horas. Finalmente
almacenamos el pellet a una temperatura de -80 ºC.
Prueba de Toxicidad
Se realizaron 16 pruebas de toxicidad. Para cada prueba se utilizó el extracto de piel de
dos individuos, uno de cada especie o de poblaciones diferentes. El pellet obtenido
durante la extracción fue re-suspendido en 2 mL agua reconstituida y se le aplicó vórtex; a
partir de esta solución se prepararon cuatro diluciones (0, 3, 13, 50 y 100 %), por
duplicado, para cada organismo modelo de prueba (D. magna y D. rerio). Las pruebas de
toxicidad fueron realizadas en microplacas de poliestireno transparente de 96 pozos
(Corning®). Una vez se colocaron las diluciones y el control (agua reconstiutida) en los
pozos, se inicio la prueba pasando los organismos modelo de prueba a la microplaca, un
individuo por dilución. El tiempo de revisión de cada individuo fue de 20 segundos cada
0.5 horas las primeras 3 horas y luego cada hora, hasta cumplir 7 horas. Finalmente se
realizó una última revisión a las 24 horas. En cada revisión se registró si los individuos
estaban vivos (0) o muertos (1). Para ello se les aplicó un estimulo mecánico para verificar
si aún había movimiento y en el caso de los peces también se observó el latido del
corazón.
Análisis Estadístico
Para evaluar el efecto de la toxicidad de los extractos de piel de las ranas en la
supervivencia de los organismos modelo de prueba (pez cebra y pulga de agua) se aplicó
una análisis de regresión Cox. La Regresión de Cox constituye un modelo predictivo para
datos de tiempo hasta el evento, con datos censurados, es decir, aquellos que no
experimentan el evento de interés durante el tiempo de observación (Cox 1972). Es un
método para evaluar el efecto de las covariables sobre el momento en que un evento
específico ocurre. En el contexto de un resultado como la muerte, este se conoce como
regresión de Cox para el análisis de supervivencia (Harrell Jr. 2015).
Para establecer el efecto de las covariables sobre el riesgo de muerte de los organismos
modelo de prueba (pez cebra y pulga de agua), se aplicaron tres modelos estadísticos: un
modelo global y un modelo para cada especie de rana (O. pumilio y O. histrionica). En el
primer caso se evaluó el efecto de las variables: organismo modelo de prueba (pez cebra
y pulga de agua), organismos modelo de toxicidad (especies de ranas) y dosis. En los
otros dos modelos se evaluó ademas el efecto de la variable población.
RESULTADOS
Se realizaron 16 pruebas de toxicidad en las que se evaluaron los extractos de piel de 31
individuos de dos especies del género Oophaga. Trece individuos de O. histrionica, que
corresponden a tres poblaciones: La Delfina (5 individuos), Bahía Solano (5 individuos) y La
Victoria (3 individuos); y 18 individuos de O. pumilio, distribuidos en cuatro poblaciones:
Miramar (5 individuos), Rambala (4 individuos), Michilá (5 individuos) y Almirante (5
individuos). Los resultados obtenidos muestran, como se esperaba, que a medida que la
dosis del extracto de piel aumenta, el riesgo de muerte es mayor. Así mismo, se puede
observar que para todas las dosis (3, 13, 50 y 100 %) el riesgo de muerte aumentó
respecto al control (log-rank test < 0.0001, Figura 1). Respecto a las especies de
Oophaga se puede observar que O. histrionica es 1.4 veces más tóxica que O. pumilio
(log-rank test ≤ 0.001, Figuras 1 y 2). Al comparar la magnitud del efecto de la variable
población, se observó que existe mayor variación en toxicidad entre las poblaciones de O.
pumilio que entre las poblaciones de O. histrionica (log-rank test ≤ 0.0001, Figura 3 y 4).
Esta diferencia está dada principalmente por la alta toxicidad de la población de Michilá
(log-rank test ≤ 0.001, Figura 3 y 4).
Por otro lado, al comparar los biomodelos se encontró que (Danio rerio) es 4.1 veces más
sensible que invertebrado (Daphnia magna) a los extractos de todas las ranas , (log-rank
test < 0.0001, N= 31, Figura 5 y 6). Resultados similares se obtuvieron al construir
modelos para cada especie: O. histrionica (regresión Cox R2= 0.342, p= 0, HR= 3.2, N=
13, Figura 3) y O. pumilio (R2= 0.358, p= 0, HR= 5.6, N= 13, Figura 5).
Figura 1. Análisis de Regresión Cox para datos censurados de sobrevivencia. Se muestra la toxicidad de los extractos de piel de las especies de ranas Oophaga histrionica y Oophaga pumilio, en 5 dosis (0, 3.33, 13.3, 50 y 100 %), para dos biomodelos: Daphnia magna
(invertebrado) y Danio rerio (vertebrado). Magnitud del efecto para el Modelo global (dosis, biomodelos y especie). La línea punteada corresponde a la linea de referencia, que indicaría que no hay efecto sobre la variable y las cajas sobre esta línea son las categorías respecto a las que se
compara. Cada caja representa la proporción de riesgo (HR, por sus siglas en ingles), en este caso “riesgo de muerte”. Intervalo de confianza del 95%.
Figura 2. Curva de supervivencia por especie de rana (Oophaga histrionica, Oophaga pumilio) sin
discriminar entre biomodelos. Se muestra la probabilidad de supervivencia de los biomodelos en el tiempo, para los extractos de piel de las especies de ranas O. histrionica, O. pumilio, en cinco dosis (0, 3.33, 13.3, 50 y 100 %). Los valores p corresponden a una prueba log-rank (prueba de
Mantel-Cox). Intervalo de confianza del 95%.
Figura 3. Análisis de Regresión Cox para datos censurados de sobrevivencia. Se muestra la toxicidad de los extractos de piel de dos especies de ranas (Oophaga histrionica y Oophaga
pumilio) de 7 poblaciones. Compara la toxicidad entre poblaciones para cada especie de rana. Magnitud del efecto para dos modelos: O. histrionica y O. pumilio. La línea punteada corresponde a la linea de referencia, que indicaría que no hay efecto sobre la variable y las cajas sobre esta línea
son las categorías respecto a las que se compara. Cada caja representa la proporción de riesgo (HR, por sus siglas en ingles), en este caso “riesgo de muerte”. Intervalo de confianza del 95%.
Figura 4. Curva de supervivencia por población para cada especie de rana (Oophaga histrionica, Oophaga pumilio) sin discriminar entre biomodelos. Se muestra la probabilidad de supervivencia de los biomodelos en el tiempo, para los extractos de piel de las especies de ranas O. histrionica,
O. pumilio, en cinco dosis (0, 3.33, 13.3, 50 y 100 %). Los valores p corresponden a una prueba log-rank (prueba de Mantel-Cox). Intervalo de confianza del 95%.
Población
Frog: O. histrionica
Frog: O. pum
ilio
Tiempo (Horas)
Prob
abilid
ad d
e So
brev
iven
cia
O. his DelfinaO. his Victoria
O. his BSolanoO. pum Miramar
O. his RambalaO. pum Michila
O. his Almirante
dosis: 0.0 % dosis: 3.0 % dosis: 13.0 % dosis: 50.0 % dosis: 100.0 %
Figura 5. Análisis de Regresión Cox para datos censurados de sobrevivencia. Se muestra la toxicidad de los extractos de piel de las especies de ranas Oophaga histrionica y Oophaga pumilio para dos biomodelos Daphnia magna (invertebrado) y Danio rerio (vertebrado). Evalúa la
sensibilidad de los biomodelos a la toxicidad de los extractos de piel de las dos especies de ranas. Magnitud del efecto para tres modelos: A. Global, B. O. histrionica y C. O. pumilio. La línea punteada corresponde a la linea de referencia, que indicaría que no hay efecto sobre la variable y
las cajas sobre esta línea son las categorías respecto a las que se compara. Cada caja representa la proporción de riesgo (hazard ratio), en este caso “riesgo de muerte”. Intervalo de confianza del 95%.
Figura 6. Curva de supervivencia por biomodelo (Daphnia magna, Danio rerio), sin discriminar
entre especies de ranas. Se muestra la probabilidad de supervivencia en el tiempo de dos biomodelos Daphnia magna (invertebrado) y Danio rerio (vertebrado) expuestos a extractos de piel de dos especies de ranas (O. histrionica y O. pumilio), en cinco dosis. Los valores p corresponden
a una prueba log-rank (prueba de Mantel-Cox). Intervalo de confianza del 95%.
DISCUSIÓN
En la presente investigación se propone un nuevo protocolo para medir la toxicidad de los
extractos de piel de ranas venenosas, utilizando como biomodelos a D. rerio y a D.
magna. Mediante este nuevo protocolo se evidenció que la toxicidad de estos extractos
tiene un efecto diferencial en el riesgo de muerte de vertebrados e invertebrados. Esto se
puso a prueba para distintas poblaciones de dos especies de ranas (O. histrionica y O.
pumilio). El biomodelo vertebrado (D. rerio) fue más sensible que el invertebrado (D.
magna) a los extractos de piel de las ranas, en todas las pruebas realizadas. Por otro lado,
se observó que O. histrionica fue más tóxica que O. pumilio, mientras que esta última
presentó mayor variación entre poblaciones, donde Michilá fue la población más tóxica.
Finalmente, mediante la aplicación de este nuevo protocolo se pudo obtener una mayor
resolución, ya que fue posible evaluar diferencias entre poblaciones y entre individuos.
Un primer resultado obtenido dejó en evidencia el efecto tóxico de los extractos de piel de
las ranas venenosas sobre el biomodelo invertebrado D. magna, al provocar su mortalidad
en las dosis media y alta. Este resultado es consistente con los obtenidos por otros
estudios que muestran que ciertos alcaloides en ranas venenosas también podrían servir
como defensa química contra potenciales depredadores invertebrados (por ejemplo,
Brodie & Tumbarello 1978; Fritz et al. 1981, Szelistowski 1985, Caldwell & Carmozina
1998, Menin et al. 2005, Willink et al. 2014, Murray et al. 2016), microorganismos (Macfoy
et al. 2005), y posiblemente ectoparásitos (Weldon et al. 2006). Asimismo, existen
reportes de depredación de ranas por parte de arañas (Santos & Cannatella 2011),
hormigas (Fritz et al. 1981) y cangrejos (Rojas 2017).
Las toxinas de las ranas venenosas afectan los canales iónicos de los organismos. Por lo
tanto este primer resultado también podría explicarse con base en el origen y la evolución
de los canales iónicos voltaje dependientes (Hill 1989, Jan & Jan 1992, Hille 2001). Lo que
se sabe hasta ahora, es que estos canales tienen un origen común a partir de un canal
con un solo domino, probablemente un canal de potasio ancestral del que luego se derivo
el canal de calcio y a continuación, de este derivo el canal de sodio (Hille 1987, 1988,
1989, Strong et al. 1993, Ranganathan 1994, Spafford et al., 1999, Plummer & Meisler
1999, Anderson & Greenberg 2001, Lopreato et al. 2001). En el caso de la
histrionicotoxina y las pumiliotoxinas, principales toxinas de O. histrionica y O. pumilio
respectivamente, tienen un mecanismo de acción similar. Interactúan con el complejo
formado por los canales iónicos en la placa motora y los receptores de acetilcolina,
bloqueando el paso de iones. Además afectan los canales de potasio y sodio (Myers &
1983, Vandendriessche et al. 2008). Entonces con base esto se podría pensar que los
sitios de acción de las toxinas de las ranas venenosas se encuentren en regiones de los
canales iónicos, que son muy conservadas o similares entre los dos grupos (vertebrados e
invertebrados).
Por otro lado, los resultados mostraron además un mayor efecto tóxico de los extractos
de piel de las ranas, sobre el biomodelo vertebrado (D. rerio) respecto al biomodelo
invertebrado (D. magna), en todas las pruebas realizadas. Esto podría deberse a que en
algunos invertebrados como por ejemplo, en artrópodos y moluscos, se ha reportado que
la acetilcolina no es el principal neurotransmisor en la comunicación neuro-motora (Kandel
et al. 1967, Wang-Bennett et al. 1988, Walker & Holden-Dye 1988). En cangrejos y
langostas (ver Patlak et al. 1979, Pamas et al. 1984, Franke et al. 1986) se ha demostrado
que los transmisores neuromusculares son glutamato y GABA (Cully et al. 1996 Dudel et
al. 2002, Titlow & Cooper 2018). Asimismo, el ion sodio, fundamental en la sinapsis
muscular de vertebrados, en estos organismos es desplazado por el ion calcio que parece
tener el papel protagónico (Hille 2001). Además de explicar las diferencias en la
sensibilidad entre el modelo vertebrado e invertebrado, las particularidades en los
mecanismos de comunicación celular podrían explicar porque no se observó parálisis en
el biomodelo invertebrado, encontraste, con el biomodelo vertebrado donde la parálisis
precedía la muerte en la mayoría de los casos, en las dosis altas. Otra posibilidad para
explicar las diferencias en la sensibilidad entre el modelo vertebrado e invertebrado esta
dada por Zakon 2012, quien sugiere que los invertebrados podrían desarrollar resistencia
fácilmente a partir de una sola sustitución de aminoácidos; dado que poseen pocos genes
asociados a estos canales (Strong et al. 1993, Plummer & Meisler 2000, Littleton &
Ganetzky 2000, Goldin et al. 2000, Anderson & Greenberg 2001, Goldin 2002). Sin
embargo aun falta realizar más investigación sobre la diversidad genética de los canales
iónicos en este grupo.
Nuestra investigación evidenció una mayor toxicidad de los extractos de piel de O.
histrionica respecto a los de O. pumilio. Esto sería diferente a lo registrado por otros
autores (Summers & Clough 2001, Darst et. al. 2005, Daly et. al. 1999, Santos &
Cannatella 2011), sin embargo, este resultado posiblemente se deba a la gran variación en
toxicidad observada entre las poblaciones de O. pumilio (en comparación con las de O.
histrionica), siendo Michilá la población más tóxica y Rambalá la menos tóxica. Esto no es
de sorprender porque diversos estudios han mostrado la gran variación en toxicidad que
puede existir entre poblaciones de una misma especie (Myers et al. 1995, Darst et al.
2006, Maan & Cummings 2012, Stuckert et al. 2014) e incluso se han reportado
diferencias entre individuos (Myers et al. 1995, Stuckert et al. 2014), como se pudo
comprobar en este estudio donde también obtuvimos diferencias entre individuos de las
poblaciones… De este modo pudimos confirmar que nuestro método permite observar la
variación a los tres niveles: individuos, poblaciones y especies.
Nuestro método responde a la imperiosa necesidad, después de casi seis décadas, de
adaptar un nuevo método para estimar la toxicidad de anfibios. Proponemos utilizar los
biomodelos D. magna y D. rerio porque son dos especies que cumplen con los
requerimiento de las tres Rs (Augustine‐Rauch & Panzica‐Kelly 2010, Yunta 2012, Weldon
2017, Leist et al. 2014, Arenas et al. 2015) y poseen las siguientes ventajas: (1) menor
costo en producción y mantenimiento del cultivo, (2) ciclos de vida más cortos, (3)
posturas más numerosas, (4) menor impacto ambiental en términos de residuos tóxicos,
(5) Al igual que ratones y ratas es un modelo tradicionalmente utilizado en pruebas
toxicológicas y estudios de biología del desarrollo por lo que existe mucha información
sobre su biología.
Un aspecto crítico para proponer un nuevo método fue el análisis estadístico, ya que este
suele ser limitado, debido al uso de ratones, e implica restricciones en el numero de
pruebas que se pueden realizar y en la resolución que proveen. Por un lado, la mortalidad
provocada por algunos extractos puede ser muy alta incluso en dosis pequeñas (Daly &
Myers 1967, Daly et al. 1978, Darst & Cummings 2006). En estos casos estudios como
Darst & Cummings 2006 y Darst et al. 2005 estimaron la toxicidad en términos del tiempo
que los ratones tardan en recuperarse (despertar) a partir de la aplicación de la inyección
subcutánea de los extractos de piel, sin embargo, esto no parece una aproximación
precisa de la toxicidad (Weldon 2017). El método propuesto permite estimar toxicidad en
términos del tiempo hasta la muerte con diferencias entre dosis.
Por otro lado, para la mayoría de las especies, los estudios requerían 300 individuos de
ranas o más (ver Daly & Myers 1967, Daly et al. 1978, Daly et al. 1999), debido a que su
toxicidad es tan baja que no tiene efectos visibles o fuertes sobre los ratones, por lo que
se debían mezclar varias pieles para obtener un solo extracto y poder aproximarse a los
efectos de la toxicidad de la especie. Sin embargo, esto no permite ver la variación en
toxicidad que podría existir entre poblaciones e individuos. Por el tamaño de los
biomodelos utilizados en este estudio (D. magna y D. rerio), es posible evaluar la toxicidad
de cada rana y estimar la variación intrapoblacional para cada especie. Esto es
fundamental en la compresión de la evolución de la toxicidad porque nos brinda
información sobre la capacidad de los individuos para obtener sus toxinas, presiones de
depredación y disponibilidad de presas, que esta relacionada a dinámicas climáticas y
heterogeneidad del hábitat. Nuestro método constituye una aproximación más precisa
porque permite realizar más pruebas con un menor numero de ranas y mayor numero de
biomodelos (D. magna y D. rerio).
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer a la Universidad de los Andes por la financiación de mi maestría con la
asistencia graduada. A la Facultad de Ciencias por la financiación de parte de mi trabajo
de grado a través del proyecto semilla.
Gracias al profesor Adolfo Amézquita por sus enseñanzas, por la oportunidad que me dio
de ser parte de Laboratorio de Ecofisiología y Comportamiento en Herpetos de la
Universidad de los Andes, esto constituyó una gran contribución para mi desarrollo
profesional y personal.
Gracias a la profesora Zayra Garavito y los miembros de su grupo Laboratorio de Biología
del Desarrollo de la Universidad de los Andes por su ayuda y apoyo en el desarrollo de las
pruebas de toxicidad.
Gracias al investigador Abel Batista, PhD. de la universidad Autónoma de Chiriquí, David,
Chiriquí, Panamá por su apoyo y acompañamiento en el trabajo de campo.
Gracias a Pablo Palacios por su apoyo en campo, consejos y recomendaciones en el
desarrollo de mi trabajo de campo.
Gracias a mi familia y mis amigos por su apoyo incondicional en esta etapa de mi vida.
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ANEXOS
Comprobación de supuestos
