tese_9765_elizângela monteverde ogawa.pdf
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Perfil químico associado aos diferentes estádios de
maturação do abacaxi cv. Vitória por
ESI(-)-FT-ICR MS e estudo de suas atividades biológicas na
quimioprevenção de câncer
Elizângela Monteverde Ogawa
Dissertação de Mestrado em Química
Vitória
2016
2
Elizangela Monteverde Ogawa
Perfil químico associado aos diferentes estádios de
maturação do abacaxi cv. Vitória por
ESI(-)-FT-ICR MS e estudo de suas atividades biológicas na
quimioprevenção de câncer
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química do Centro de
Ciências Exatas da Universidade Federal do
Espírito Santo como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Wanderson Romão
Co-orientador: Dr. Helber Barcellos Costa
VITÓRIA
2016
3
Perfil químico associado aos diferentes estádios de
maturação do abacaxi cv. Vitória por
ESI(-)-FT-ICR MS e estudo de suas atividades biológicas na
quimioprevenção de câncer
Elizângela Monteverde Ogawa
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção
do grau de Mestre em Química.
Aprovado em 23/03/2016 por:
__________________________________________ Prof. Dr. Wanderson Romão
Instituto Federal do Espírito Santo Orientador
__________________________________________ Prof. Dr. Helber Barcellos Costa
Universidade Federal do Espírito Santo Co-orientador
__________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Machado Kuster
Universidade Federal do Espírito Santo
__________________________________________
Prof. Dr. José Aires Ventura Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural
Universidade Federal do Espírito Santo Vitória - ES, Março de 2016
4
Dedico este trabalho
a minha família.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todos os dias da minha vida.
Ao meu esposo Paulo Cézar por dar a mim o apoio na medida que eu precisava em
todos os momentos dessa caminhada e de todos os outros em nossas vidas.
A minha filhinha Ana Beatriz que dividiu com meus estudos o seu tempo comigo.
Ao prof. Dr. Wanderson Romão, pela oportunidade oferecida, pelo seu tempo a mim
dispensado e por todo o conhecimento adquirido nesse período que agora levo para
os meus dias..
Ao professor Dr. Helber Barcellos da Costa pelos conhecimentos transmitidos.
Aos Professores Dr. Ricardo Machado Kuster, Dra. Denise Coutinho Endringer e
Dr.José Aires Ventura por aceitarem participar da banca de dissertação, colaborando
para o crescimento desse trabalho.
Ao INCAPER, pelo fornecimento das amostras, e de maneira especial ao professor
Dr. José Aires Ventura pelo cuidado e apoio a essa pesquisa.
A equipe do Laboratório Nupecfarma em especial a professora Denise Endringer e a
mestranda Maria Eduarda Souza pela participação e apoio nessa pesquisa.
Aos amigos do Laboratório de Petroleômica e Forense: Lilian, Bruno, Radigya,
Nayara, Fernanda, Heloá, Eliane, Flávia, Heloísa, Rayana, Jade, Letícia, Izabela,
Larissa, Gabriela, Lindamara, Eloilson, Silvana, Daniel, Natwrie e Vitor. Todos, de
alguma forma, contribuíram para esse trabalho.
Aos professores do programa de pós-graduação em química pelos ensinamentos
compartilhados.
A CAPES, CNPQ E FAPES pelo auxílio nesse período.
6
“Somos o que fazemos, mas somos, principalmente, o que fazemos para mudar o
que somos” (Eduardo Galeano)
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.Sintomas da fusariose, doença causada pelo fungo Fusarium subglutinas f. sp. ananas, no fruto (A) e na base da folha (B). ........................................................ 15
Figura 2.Produção de abacaxi do Espírito Santo em relação a região sudeste em 2015. .................................................................................................................................. 17
Figura 3. Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas. ........................ 21
Figura 4. Ilustração do FT-ICR MS. ........................................................................... 23
Figura 5. Esquema do processo da carcinogênese. ................................................. 25
Figura 6. Curva de calibração obtida utilizando soluções do padrão de ácido gálico. .................................................................................................................................. 32
Figura 7. Abacaxi cv. Vitória nos seis estádios de maturação .................................. 38
Figura 8. Ensaios físico–químicos utilizando metodologias convencionais: (a) SS, (b) ATT, (c) Razão SS/ATT. ........................................................................................... 40
Figura 9. ESI(-)-FT-ICR MS: (a) estádio 0, (b) estádio 1, (c) estádio 2 e (d) estádio 3, (e) estádio 4 e (f) estádio 5........................................................................................ 42
Figura 10. ESI (-) MS/MS dos íons m/z (a) 341, (b) 431, (c) 521, (d) 533, (e) 683 e (f) 1025. ......................................................................................................................... 46
Figura 11. Variação da razão entre a soma dos sinais gerados pela presença de açúcares pela soma dos sinais produzidos pela presença do padrão de glicose deuterada em função dos estádios de maturação. .................................................... 47
Figura 12. ESI(-)-FT-ICR MS do extrato: (a) estádio 0, (b) estádio 1, (c) estádio 2, (d) estádio 3, (e) estádio 4 e (f) estádio 5. ...................................................................... 48
Figura 13. Variação do conteúdo de compostos fenólicos em função dos estádios de maturação. ................................................................................................................ 51
Figura 14. Razão entre a intensidade absoluta dos compostos fenólicos pela soma da intensidade absoluta dos sinais gerados pelo padrão em função dos estádios de maturação. ................................................................................................................ 53
Figura 15. Determinação da concentração de compostos fenólicos no extrato. ....... 54
Figura 16. Determinação da concentração de compostos fenólicos no suco. ........... 55
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Produção de abacaxi em 2015 .................................................................. 16
Tabela 2. Alguns analisadores de massa usados em MS.26 ..................................... 22
Tabela 3. Ensaios Físico–químicos utilizando metodologias convencionais: SST, AT e Razão SS/ATT. ......................................................................................................... 39
Tabela 4. Compostos Químicos Propostos dos Espectros de Massas ESI(-)-FT-ICR MS dos estádios de maturação. ................................................................................ 43
Tabela 5. Compostos Químicos Propostos dos Espectros de Massas ESI (-) FT-ICR do extrato. ................................................................................................................. 49
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
α-MEM Meio de cultura mínimo essencial, modificação α
APCI - Ionização química a pressão atmosférica
APPI - Fotoionização a pressão atmosférica
AT - Acidez total titulável.
BSA - Albumina sérica bovina
C18 – Octadecil.
CID – Dissociação induzida por colisão (do inglês, Collision Induced Dissociation)
CI - Índice de quimioprevenção.
CI50 - Concentração inibitória.
DC - Concentração necessária para duplicar a atividade da enzima em relação a
atividade basal.
DMSO – Dimetilsulfóxido.
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária.
ESI (-) - Eletrospray no modo negativo.
ESI (+) - Eletrospray no modo positivo.
EtOH – Etanol.
FAD - Dinucleótido de flavina e adenina.
FT – Transformada de Fourier (do inglês, Fourier transformation).
FT-ICR MS – Espectrometria de Massas de Ressonância Ciclotrônica de Íons por
Transformada de Fourier (do inglês, Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass
Spectrometry).
G-6-P - Glicose-6-fosfato
G-6-PH - Glicose-6-fosfato-desidrogenase
10
GC – Cromatografia gasosa.
HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência.
ICR – Ressonância Ciclotrônica de Íons (do inglês, Ion Cyclotron Resonance).
INCAPER - Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural.
MALDI - Dessorção/ionização por matriz assistida por laser.
MTT - Brometo de 3-(4,5- dimetiltiazo-2-il)-2,5-difeniltetrazolio.
MS – Espectrometria de Massa ((do inglês, Mass Spectrometry).
m/z– Razão massa-carga
NADPH - β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.
PBS - Tampão fosfato salina.
PSF Penicilina G- estreptomicina-fungizona
pH - Potencial hidrogeniônico.
ppm – Partes por milhão.
QR - Quinona-redutase
SDS - Dodecil-sulfato de sódio
SEAG - Secretaria de Estado da Agricultura, Abastecimento, Aquicultura e Pesca.
SPE - Extração em fase sólida
SST - Sólidos solúveis totais.
TOF – Tempo de vôo.
UV/Vis - Ultravioleta-visível.
11
LISTA DE SÍMBOLOS
C6 - Anel benzênico
N - Número total de observações.
A1 - Absorbância da solução na presença do indutor, lido na placa “QR ensaio”. AT -
Absorbância da solução na presença do indutor, lido na placa “Proteína”.
AA - Absorbância da solução na presença da amostra, lida na placa “Proteína”.
Ac - Absorbância da solução na presença do controle negativo, lido na placa
“Proteína”.
12
Sumário
1.INTRODUÇÃO 14
1.1 O Fruto Abacaxi 14
1.1.1 A Cultivar Vitória 14
1.2 Produção 15
1.3 Estádios de Maturação 17
1.4 Características Físico-químicas do Abacaxi 17
1.5 Compostos Fenólicos 18
1.6 Espectrometria de Massas 19
1.6.1 Analisador de Massas com Ressonância Ciclotrônica de Íons 21
1.6.2 Ionização por Electrospray (ESI) 23
1.7 Ensaio de indução enzima NADPH: quinona redutase (QR) 25
2.OBJETIVOS 26
2.1 Objetivo Geral 26
2.2 Objetivos Específicos 26
2 MATERIAIS E MÉTODOS 28
2.1 Amostras e Reagentes 28
3.1.1 Preparo do Suco das Amostras 28
3.1.2 Preparo do Extrato Fenólico das Amostras 28
3.2 Análises Físico–Químicas 29
3.3 Análise ESI FT-ICR MS e ESI (-) FT - ICR MS/MS 30
3.3.1 Semiquantificação de Açúcares 30
3.3.2 Semiquantificação de Compostos Fenólicos 31
3.4 Quantificação de Polifenóis Totais por Folin-Ciocalteau 31
3.5 Ensaios de Atividade da Quinona-Redutase 32
3.5.1 Soluções empregadas nos ensaios de quimioprevenção de câncer 32
3.5.2 Re-Estabelecimento das Linhagens Celulares Mantidas em N2 Líquido 33
3.5.3 Preparo das Células para Ensaio 33
3.5.4 Determinação da Indução da Quinona – Redutase 34
3.6 Análise Estatística 37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 37
4.1 Análises físico – químicas 37
4.2 ESI-FT-ICR MS E ESI (-) FT - ICR MS/MS 40
13
4.2.1 Análise dos Açúcares 40
4.2.3 Análise de Compostos Fenólicos 47
4.3 Quantificação de Polifenóis Totais por Folin-Ciocauteau 54
4.3.1 No extrato 54
4.3.2 No suco 55
6 REFERÊNCIAS 56
14
1.INTRODUÇÃO
1.1 O Fruto Abacaxi
O abacaxi é o fruto do abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merril), uma planta
de clima tropical, perene, monocotiledônea, pertencente à família Bromeliaceae.1 O
fruto é constituído por 100 a 200 frutilhos fundidos entre si sobre um eixo central. O
sabor característico doce/azedo o torna amplamente apreciado pelos consumidores
em todo o mundo. Além disso, ele também é usado por seus efeitos medicinais por
apresentar a bromelina, uma enzima proteolítica com atividades farmacológicas, tais
como anti-inflamatórias e inibição da agregação plaquetária. Além dessa protease,
polissacarídeos são outras macromoléculas responsáveis pelos benefícios do
abacaxi. A fibra da casca do fruto pode encurtar o tempo de trânsito gastrointestinal e
melhorar o crescimento de pro-bióticos no intestino.2
Trata-se de uma fruta que possui elevado teor energético, devido à sua alta
composição de carboidratos, e valor nutritivo pela presença de sais minerais (cálcio,
potássio, fósforo, magnésio, sódio, cobre e iodo) e de vitaminas, principalmente ácido
ascórbico, niacina, tiamina, riboflavina.1
O fruto é utilizado tanto para o consumo in natura quanto industrializado, em
diferentes formas: pedaços em calda, suco, pedaços cristalizados e geleias.1
1.1.1 A Cultivar Vitória
O abacaxi cv. Vitória, fruto do cruzamento entre o parental feminino a cv.
Primavera e o parental masculino a cv. Smooth Cayenne é o resultado de anos de
pesquisas desenvolvidas pelo Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e
Extenção Rural (INCAPER) em parceria com a Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA).3,4
Essa cultivar apresenta como principal característica a resistência a fusariose,
doença causada pelo fungo Fusarium subglutinans f.sp. ananas (Sin.: F. guttiforme),
principal problema fitossanitário da cultura no país, que causa em média 30 a 40% de
15
perdas na produção de frutos e aproximadamente 20% de mudas.5,6 Além disso,
apresenta características agronômicas semelhantes ou superiores em relação às cvs.
Pérola e Smooth Cayenne, usadas como referência.5 As plantas apresentam folhas
de cor verde-claro e têm como vantagem a ausência de espinhos, o que facilita os
tratos culturais, sendo que as recomendações técnicas de cultivo são as mesmas
atualmente usadas pelos produtores para as variedades de referência. Apresenta
plantas vigorosas, com bom perfilhamento, bom desenvolvimento e crescimento. Os
frutos têm polpa branca, formato cilíndrico, casca de cor amarela na maturação e
pesam em torno de 1,5 kg. Apresentam ainda elevado teor de açúcares (média de
15,8 °Brix) e excelente sabor nas análises químicas e sensoriais, além disso, são mais
resistentes ao transporte e em pós-colheita que as variedades de referência.5
Devido a essas características, os frutos podem ser destinados ao mercado de
consumo in natura e para a agroindústria.6 Por ser resistente à fusariose, dispensa a
utilização de fungicidas para o controle da doença, possibilitando a redução nos
custos de produção por hectare, referente à aquisição de fungicidas e de aplicação,
além de reduzir também os riscos de impacto ambiental e aumentar a produtividade
comparativamente em, pelo menos, 30%. 5
Figura 1.Sintomas da fusariose, doença causada pelo fungo Fusarium subglutinas f. sp. ananas, no fruto (A) e na base da folha (B).1
1.2 Produção
16
O Brasil foi o segundo maior produtor mundial de abacaxi em 20137, a safra
em 2014 foi de 1.713.515.000 frutos e a previsão para 2015 é que esse montante
aumentasse 1,4%.8 As regiões Nordeste e Sudeste são as responsáveis pela maior
parte dessa produção, entretanto, a planta encontra excelentes condições para o
cultivo em quase todo o território brasileiro.9
O abacaxi integra um dos 14 Polos de Fruticultura presentes no Espírito Santo.10
Tradicionalmente, a cultura do abacaxi é praticada no Sul do estado. Entretanto, em
2009, o Governo Estadual, por meio da Secretaria de Estado da Agricultura,
Abastecimento, Aquicultura e Pesca (SEAG) e do INCAPER, implantou outros polos
de Abacaxi em duas regiões distintas. Um polo está no Sul, nos municípios de cultivo
tradicional, e outro na região Norte.3
O lançamento da cultivar Vitória suscitou o interesse de novos agricultores pelo
plantio de abacaxi na região norte do estado, permitindo a expansão da cultura e
fazendo com que a produção ganhasse destaque no cenário da fruticultura capixaba.
Em 2015, o Espírito Santo foi responsável por cerca de 8% de toda a produção da
região sudeste.8
Tabela 1. Produção de abacaxi em 2015
Variável = Produção (Mil frutos)
Ano da safra = Safra 2015
Produto = Abacaxi
Brasil, Grande Região e Unidade da Federação
Brasil 1.767.267
Sudeste 495.334
Espírito Santo 41.261
17
Figura 2.Produção de abacaxi do Espírito Santo em relação a região sudeste em 2015.8
1.3 Estádios de Maturação
A maturação consiste na fase final do desenvolvimento dos frutos na qual as
células atingem o tamanho máximo e os frutos adquirem características que os
tormam mais adequados ao consumo tais como: valores ótimos de açúcares, ácidos
voláteis e fixos, e ésteres, responsáveis pelo sabor e aroma característicos de fruto
maduro. Na maturação também observa-se alterações nos pigmentos
predominantemente (clorofila e carotenóides) relacionados com a coloração da casca
e da polpa.11
A maturação do abacaxi pode ser dividida em seis estádios de acordo com a
cor da casca da fruta, como se segue: estádio 0 (zero) = a cor começa a mudar de
verde para amarelo; estádio 1 = ¼ da fruta é amarela; estádio 2 = ½ da fruta é amarela;
estádio 3 = ¾ do fruto é amarelo; estádio 4 = o fruto é completamente amarelo; e
estádio 5 = o fruto está completamente maduro, com todos os frutilhos amarelos.12
1.4 Características Físico-químicas do Abacaxi
As condições climáticas, estádios de maturação, tamanho do fruto, diferenças
entre variedades e nutrição mineral exercem influência acentuada na composição
18
química do abacaxi. Como o fruto é constituído por cerca de 100 a 200 frutilhos, sua
composição química também difere nas partes de um mesmo fruto.13
A qualidade interna dos frutos podem ser conferidas por um conjunto de
constituintes físico-químicos da polpa, dentre os quais se destacam: cor, acidez total
titulável, sólidos solúveis e a relação entre sólidos solúveis e acidez total titulável.14
A acidez total titulável (AT) representa a soma dos ácidos orgânicos livres e
complexados nos frutos. No abacaxi, é expressa, usualmente, em percentagem de
ácido cítrico, por ser o ácido orgânico que prevalece no mesmo.13,14 O teor de ácidos
orgânicos nesse fruto tende a diminuir com a maturação em decorrência do seu uso
como substrato no processo respiratório ou de sua conversão em açúcares.15
O teor de sólidos solúveis totais (SST) expressos em ºBrix, apresenta alta
correlação positiva com o teor de açúcares uma vez que aumenta de valor à medida
que esses açúcares vão se acumulando na fruta. A sua medida não representa o teor
exato dos açúcares, pois outras substâncias também se encontram dissolvidas na
seiva vacuolar (vitaminas, fenólicos, pectinas, ácidos orgânicos, etc.) no entanto, entre
essas, os açúcares são as mais representativas, chegando a constituir até 85-90%
dos SS, portanto, geralmente é aceito como uma importante variável na determinação
da qualidade dos frutos.16
A relação SST/AT indica o grau de equilíbrio entre o teor de açúcares e os
ácidos orgânicos do fruto, estando diretamente relacionada à qualidade quanto ao
atributo sabor e, por consequência, aceitação pelos consumidores de frutos.17
1.5 Compostos Fenólicos
A composição química do fruto abacaxi foi intensamente investigada durante
as últimas décadas mas há uma falta de informação sobre os compostos fenólicos
presentes no mesmo.18
Compostos fenólicos são moléculas que possuem em sua estrutura um ou
mais anéis aromáticos com um ou mais grupos hidroxila. Eles estão amplamente
distribuídos no reino vegetal e são os metabolitos secundários mais abundantes nas
19
plantas, com mais de 8000 estruturas fenólicas atualmente conhecidas,19 que variam
entre moléculas simples, como os ácidos fenólicos, a substâncias altamente
polimerizados, como taninos. Polifenóis de plantas estão geralmente envolvidos na
defesa contra a radiação ultravioleta ou agressão por patógenos, parasitas e
predadores, bem como com a coloração dos vegetais. 20 Sua elevada capacidade
antioxidante é atribuída à sua habilidade em complexar íons metálicos, inativar
reações radicalares em sistemas deslipidados, e prevenir conversão de hidroperóxido
em oxirradicais reativos.21
Polifenóis de plantas têm atraído atenção crescente devido às suas
propriedades antioxidantes potentes e seus notáveis efeitos na prevenção de várias
doenças associadas a estresse oxidativo, tais como o câncer. Nos últimos anos, a
identificação e desenvolvimento de compostos fenólicos ou extratos de plantas
diferentes tornou-se uma importante área de pesquisa relacionada a saúde. 20
Compostos fenólicos incluem os ácidos fenólicos, flavonoides, taninos,
estilbenos e lignanos. Os flavonóides são os polifenóis mais abundantes em nossas
dietas. A estrutura básica dos flavonóides contém 15 átomos de carbono dispostos
em três anéis (C6-C3-C6), os quais são rotuladas como A, B e C. flavonóides são
subdivididos em seis subgrupos: flavonas, flavonóis, flavonol, flavanonas, as
isoflavonas, e antocianinas, de acordo com o estado de oxidação do anel central C.20
Steingass detectou mais de 60 compostos fenólicos nas várias partes do fruto
abacaxi do genótipo MD2 "Sweet Extra" sendo que desses 39 foram encontrados na
polpa.18 O presente trabalho visa identificar os compostos fenólicos presentes na
poupa da cv. Vitória.
1.6 Espectrometria de Massas
A Espectrometria de Massas (do inglês: Mass Spectrometry - MS) é uma
técnica analítica utilizada para obter informações da massa molar e de características
estruturais de amostras. A MS de alta resolução permite a separação e detecção de
uma gama muito grande de íons produzidos para determinar as distribuições de
massa ou para identificar os compostos específicos.22 Os átomos ou moléculas de
uma amostra são ionizados por um sistema de ionização ou por uma fonte de íons e
20
separados de acordo com suas relações massa-carga (m/z).23 Essa técnica fornece
com exatidão informações importantes como a composição elementar, a estrutura
molecular, a quantificação e o perfil isotópico, que é único para cada composição
química. Possui alta sensibilidade, exatidão e versatilidade.24
Os espectrômetros de massas constituem-se basicamente de: um sistema de
introdução de amostra; uma fonte de ionização; um analisador de massas; e um
detector, que realiza a “contagem” dos íons e transforma o sinal em corrente elétrica,
que posteriormente, de acordo com a magnitude do mesmo, será convertido em
função da razão m/z, proporcionando um espectro de massas correspondente.25
Geralmente, o pico com maior valor de m/z é referente ao pico do íon molecular
e representa a massa molecular do analito analisado.26 No geral, nos espectros de
massas, encontram-se ainda outros picos de menor razão m/z que o pico do íon
molecular, que correspondem a novas espécies ionizadas produzidas a partir de
processos de fragmentações que ocorrem a partir da molécula.27
Os componentes mais importantes do espectrômetro de massas são a fonte de
ionização e o analisador. Cada método de ionização produz maior abundância de tipos
específicos de compostos e discrimina outros.28As diferentes formas de ionização
juntamente com analisadores de massas são o que determinam a aplicabilidade da
MS.
Um diagrama esquemático do funcionamento de um espectrômetro de massas é
mostrado na Figura 3.
21
Figura 3. Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas.29
Atualmente, existe uma grande variedade de fontes de ionização, tornando
possível a determinação de espécies químicas polares, apolares, em fase líquida, em
fase gasosa ou sólida.30 Já o tipo de analisador de massa a ser utilizado dependerá
da exatidão e precisão requerida.
No geral, detectores de alta precisão e exatidão são requeridos para análises
qualitativas de misturas complexas onde é necessária a determinação exata de
formula molecular. Já para a quantificação, são utilizados detectores menos exatos e
precisos. 27
1.6.1 Analisador de Massas com Ressonância Ciclotrônica de Íons
O analisador de massas tem como finalidade separar o conjunto de íons de
acordo com sua razão m/z. Eles podem ser divididos em diferentes categorias, como
magnéticos ou elétricos puros, baseados em pulso, de aprisionamento ou não
aprisionamento.26 Os analisadores de massas mais comuns utilizados em MS e
algumas de suas características mais relevantes estão apresentados na Tabela 2.
Espectrômetro de Massas
Introdução
da amostra
GC HPLC
Injeção direta
Detector Fonte de
Ionização
ESI - APCI -
APPI - MALDI
Analisador
Quadrupolo TOF Orbitrap
ICR
Processamento
de dados
Alto vácuo 10-5 – 10-8 mbar
22
Tabela 2. Alguns analisadores de massa usados em MS.26
Analisadores / Informações
Quadrupolo (TOF) (FT-ICR) Orbitrap
Princípios de separação
Estabilidade da trajetória
Tempo de voo Freqüência de ressonância
Freqüência de ressonância
Resolução Baixa – Média Baixa-alta A maior Muito alta
Exatidão de massas
Baixa Alta Muito alta Muito alta
Intervalo de m/z
Baixo Muito alta Médio Baixo
Sensibilidade Alta Alta Médio Médio
Quantificação Boa-muito boa Média-boa Médio Médio
Fonte de íons Contínua Pulsada/Contínua Pulsada/Contínua Pulsada/contínua
Velocidade Médio-rápido Rápida Devagar-médio Devagar-médio
O princípio de separação do analisador de massa com Ressonância
Ciclotrônica de Íons (ICR) se baseia na medida de diferentes freqüências de cíclotron
desenvolvida por cada íon quando este é submetido a um campo magnético.24
A espectrometria de massas, em especial da Ressonância Ciclotrônica de Íons
por Transformada de Fourier (do inglês: Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance
Mass Spectrometry - FT-ICR MS), possui uma ultra-alta resolução que permite a
atribuição da composição elementar dos milhares de compostos encontrados em
amostras complexas, até mesmo para espécies isobáricas que podem apresentar
diferenças de massas uma da outra de até 3,4 mDa.30
A Figura 4 ilustra o arranjo interno de um típico analisador de altíssima
resolução de massas, o FT-ICR MS Solarix (Bruker, Bremen, Alemanha).
23
Figura 4. Ilustração do FT-ICR MS.31
1.6.2 Ionização por Electrospray (ESI)
As fontes de ionização têm como finalidade criar íons em fase gasosa ou
transferir espécies iônicas em solução para a fase gasosa. Cada tipo de fonte possui
um método especifico de ionização, o que torna a técnica seletiva a um grupo de
compostos. A fonte a ser utilizada é definida em virtude do analito que se deseja
analisar.24
A geração de íons por ionização a pressão atmosférica, como a fonte de
eletrospray (ESI), permite a caracterização detalhada de compostos não voláteis,
antes não detectáveis. O sucesso dessa técnica se deve, principalmente, à sua
habilidade em ionizar moléculas de massa molecular quase ilimitada, alta polaridade
e complexidade estrutural, diretamente para a fase gasosa de maneira branda e
24
eficiente.32 Nesta técnica, os compostos polares podem ser analisados nos dois
modos de ionização.
No processo de ionização, a fonte de ESI é capaz de transferir as espécies do
analito ionizadas para a fase gasosa na forma de moléculas protonadas ou cátions no
modo positivo de aquisição de íons (ESI(+)), ou ainda na forma de moléculas
desprotonadas ou ânions no modo negativo (ESI(-)).30
Na ionização por ESI, dissolve-se o analito em um solvente volátil, em meio
ácido ou básico, para que ocorra a protonação ou desprotonação das moléculas. Para
formação de íons gasosos, o analito em solução é inserido num capilar metálico, o
qual está sujeito a um forte campo elétrico responsável por gerar uma dupla camada
elétrica na interface capilar/solução. Quando a repulsão de cargas é suficientemente
alta para vencer a tensão superficial do líquido, ocorre a formação do cone de Taylor,
e as primeiras gotas carregadas se formam. As gotas carregadas passam
posteriormente por regiões de aquecimento onde ocorrerá a evaporação do solvente.
À medida que o solvente se evapora, as gotas tornam-se menores e,
consequentemente, a repulsão eletrostática aumenta. Com isso, novas fissões
ocorrem, originando assim gotículas cada vez menores até que restem apenas íons
em fase gasosa. Esse fenômeno é chamado de explosão coulômbica. A partir daí, as
microgotas que liberam os íons[M+H]+ ou [M-H]-são conduzidos para a região de alto
vácuo do analisador de massas e a redução da pressão feita gradativamente com
auxílio de pequenos orifícios em forma de cone. 24,28,29.
Há três razões para ESI se destacar frente às outras fontes de ionização.
Primeiramente, a sua capacidade de produzir íons multiplamente carregados, com
elevado número de carga, reduzindo assim a razão m/z. Segunda razão é que as
amostras a serem introduzidas necessitam estar em solução, o que permite o
acoplamento com muitas técnicas de separação. E, por último, o fato de ser uma
técnica de ionização branda, o que torna possível a análise de misturas complexas
em uma única etapa, visto que a fragmentação das espécies transferida para a fase
gasosa é minimizada.33
Outras vantagens da fonte de ESI são a facilidade de operação, o custo
relativamente baixo do equipamento, e a elevada seletividade para as espécies
polares em matrizes complexas.34
25
Graças à alta resolução da técnica, a combinação de ESI com FT-ICR MS
possibilita a caracterização direta de matrizes complexas, sem a necessidade de pré-
separação da amostra, e permite a identificação de até 20000 compostos em uma
única análise.35
1.7 Ensaio de indução enzima NADPH: quinona redutase (QR)
As células estão constantemente expostas a potenciais agentes cancerígenos
que estão presentes no ambiente, tais como: radiação e substâncias químicas
carcinogênicas. A indução da fase II de destoxificação enzimática por componentes
da dieta é uma potencial estratégia para a quimioprevenção do câncer.36 Essas
enzimas são responsáveis pela captação de radicais e eletrófilos protegendo as
células do dano oxidativo ao DNA. Diversos estudos in vitro e in vivo indicam que a
redução de quinonas eletrofilícas pela quinona redutase (QR), uma das enzimas da
fase II, é uma importante via de destoxificação, na qual quinonas são convertidas em
hidroquinonas, demonstrando ser a enzima QR um potencial biomarcador para a
pesquisa de agentes quimiopreventivos contra a fase inicial do câncer.37 Na figura 5
é mostrado um esquema com as grandes etapas da carcinogênese e em quais fases
os agentes bloqueadores, supressores e quimiopreventivos atuam.
Figura 5. Esquema do processo da carcinogênese.38
26
Estudos prévios mostram alimentos fitoquímicos que estimulam a expressão
da fase II enzimática em células e tecidos. Vários flavonoides e compostos fenólicos
estão entre os mais comumente identificados como indutores da fase II enzimática.36
O ensaio de indução da QR é amplamente utilizado, sendo desenvolvido em
uma placa de microtitulação contendo 96 poços, possibilitando a análise de um
elevado número de amostras.37
Neste análise, a enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase, atua sobre a glicose-
6-fosfato, transferindo dois elétrons e um próton para o NADP, produzindo NADPH
que transfere o hidreto para o complexo FAD-QR, com subsequente redução à FADH2
pela enzima QR. A quinona menadiona (Vitamina K3), substrato para a QR, é reduzida
a menadiol pela transferência de dois elétrons da FADH2-QR. Por processo
espontâneo, o menadiol se oxida a menadiona, reduzindo o brometo de 3-(4,5
dimetiltazo-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT) para azul de formazana, o qual é
quantificado por espectrofotometria no comprimento de onda de 595 nm. A atividade
indutora é expressa como o dobro da concentração (DC) requerida para a atividade
específica da QR, em relação aos níveis basais, e a toxicidade é relatada como a
concentração necessária para inibir o crescimento da cultura em 50% (CI50). O índice
de quimioprevenção (QI) é obtido pela razão entre CI50 e DC (QI = CI50/DC), tendo
o mesmo significado, portanto, do índice terapêutico.37
2.OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Determinar o estádio de maturação ótimo para consumo com relação a
qualidades nutracêuticas e atributos sensoriais.
2.2 Objetivos Específicos
Realizar análises físico-químicas da polpa do abacaxi cv. Vitória nos estádios
de maturação 0, 1, 2, 3, 4 e 5.
27
Identificar, por meio da técnica de ESI(-)-FT-ICR MS, metabólitos primários,
como açúcares e ácidos orgânicos e metabólitos secundários como compostos
fenólicos nos seis estádios de maturação.
Quantificar o conteúdo fenólico encontrado em cada estádio pelo método de
Folin-Ciocalteu e por FT-ICR MS (não-convencional).
Avaliar o potencial quimiopreventivo de câncer do extrato fenólico obtido da
polpa dos frutos empregando-se ensaio de indução enzima NAD(P)H: quinona
redutase (QR) em cultura celular.
28
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Amostras e Reagentes
Abacaxis da variedade Vitória nos estádios de maturação 0, 1, 2, 3, 4 e 5 foram
colhidos na Fazenda Experimental Bananal do Norte/ Incaper - Pacotuba, localizada
no município de Cachoeiro de Itapemirin – ES, Brasil. As amostras foram
armazenadas em um freezer a -20ᴏ C até a realização das análises. Os materiais
usados foram: água deionizada, metanol (Dinâmica - grau HPLC), hidróxido de
amônio (Vetec Química Fina Ltda, Brazil), ácido clorídrico (Dinâmica), acetato de etila
(Vetec), padrão Glicose Deuterada (D-Glucose-1,2,3,4,5,6,6-d7) adquiridos da Sigma-
Aldrich e Chromabond® C18ec cartucho de SPE (1000 mg de sorvente, 6 ml de
volume, largura do poro 60 Â, tamanho de partícula 45 µm; Macherey- Nagel )
3.1.1 Preparo do Suco das Amostras
Foram utilizados 20 g da parte da polpa das amostras do fruto. Para isso, os
mesmos foram lavados em água clorada e posteriormente em água destilada e
descascados. A polpa foi triturada em um gral com o auxílio de um pistilo até a
obtenção de um suco que foi então filtrado em papel de filtro Unifil® faixa preta 125
mm.
Para injeção no ESI FT-ICR MS, uma alíquota de 10 μL do suco obtido , 5μL
de solução dopante de glicose deuterada D-Glicose-1,2,3,4,5,6,6-d7 (SIGMA) (5x10-3
mol/l) e 4 μL de solução de NH4OH PA (Vetec Química Fina Ltda, Brazil) foram
adicionados a 981μL de solução de metanol/água (50% v/v).
3.1.2 Preparo do Extrato Fenólico das Amostras
O isolamento de compostos fenólicos presentes na polpa das amostras de
abacaxi ‘Vitória’ foi realizada utilizando as metodológicas descritas por Alothman e
colaboradores39 e por Steingass e colaboradores18 ambas com modificações. Porções
29
de 25 gramas da parte da polpa das amostras, previamente lavadas com água clorada
e posteriormente em água destilada e descascadas, foram retiradas das mesmas em
um corte longitudinal, passaram por trituração em liquidificador doméstico por 3
minutos com 75 mL de uma solução de metanol a 70% contendo 0,1% (v/v) de HCl.
A solução obtida foi acondicionada em um frasco de vidro âmbar e submetida a banho
ultrassônico com frequência de 40 KHz por 20 minutos. Em seguida foi centrifugada a
3500 xg por 10 minutos para a precipitação da pectina. O sobrenadante gerado pela
centrifugação foi evaporado em rota evaporador a 45º C. O resíduo gerado foi
ressuspendido em 5 mL de água deionizada e carregado em um cartucho de SPE
Chromabond® C18ec (500 mg sorvente, 6 ml de volume, largura de poro 60 Â,
tamanho de partícula 45 µm; Macherey-Nagel), previamente ativado pela injeção de
3 mL de metanol seguidos por 10 mL de água deionizada. O extrato bruto foi então
lavado com 20 mL de uma solução de HCl a 0,01% (v/v) para a remoção de ácidos
orgânicos e açúcares.20 A solução ácida foi utilizada para prevenir a ionização dos
compostos fenólicos, o que poderia reduzir a adsorção desses compostos durante a
eluição da fração mais polar.40 Os analitos foram eluídos utilizando 6 mL de metanol
a 100% e subsequentemente 1 mL de acetato de etila. O lavado contendo os
compostos fenólicos foi concentrado no rotaevaporador a 25ºC e o extrato resultante
foi redissolvido em 1,5 mL de uma solução de metanol a 50% (v/v).
Para injeção no ESI FT-ICR MS 15 μL do extrato obtido, 3 μL de solução
dopante de glicose deuterada D-Glicose-1,2,3,4,5,6,6-d7 (SIGMA) (5x10-2 mol/L) e 2
μL de solução de NH4OH PA (Vetec Química Fina Ltda, Brazil) foram adicionados a
483 μL de solução de metanol a 50% (v/v).
3.2 Análises Físico–Químicas
Foram determinadas a acidez total titulável (AT, expressos em gramas de ácido
cítrico por 100 g de polpa), sólidos solúveis totais (SST, expresso em ºBrix) e cálculo
da razão SST/AT. A análise de sólidos solúveis totais (SST) foi realizada através de
um refratômetro de bancada (ABBE com escala de refração de 1,300-1,72 nD de 0 -
30
95°Brix modelo 2 WAJ). A acidez titulável (AT) foi determinada por titulação utilizando
solução de NaOH 0,1 mol.L-1 padronizada (expressos em g de ácido cítrico por 100 g
da polpa). A razão SST/AT foi calculada dividindo-se o valor da leitura de SST pelos
valores de AT. Todos os procedimentos foram executados de acordo com a
metodologia descrita pelo Instituto Adolfo Lutz.41
3.3 Análise ESI FT-ICR MS e ESI (-) FT - ICR MS/MS
Foi utilizado espectrômetro FT-ICR MS (modelo 9.4 T Solarix, BrukerDaltonics,
Bremen, Alemanha). As análises foram realizadas no modo negativo em uma faixa de
massa m/z 150-1250. As condições da fonte de ESI foram: pressão de gás nebulizador
de 1,4 Bar, voltagem capilar de 3,8 kV, e a temperatura de transferência capilar de
200° C. O tempo de acumulação dos íons foi de 0,010 s. Cada espectro foi adquirido
pela acumulação de 32 varreduras (scans), com alta resolução (16 M) e erros de
massas próximos a 1 ppm, fornecendo fórmulas moleculares inequívocas para os íons
moleculares de carga única.
Os espectros de massa foram adquiridos e processados utilizando o software
de Compass Data Analysis (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha).
Para os experimentos de MS/MS, a janela do quadrupolo foi fechada em um
intervalo de 1 Da; ou seja, a corrente contínua e o potencial de rádio frequência
aplicado às hastes do quadrupolo foram ajustados para possibilitar a passagem de
íons com m/z selecionado ± 1, isolando o íon de interesse. Em seguida, o íon é
conduzido para o interior de uma cela de colisão (hexapolo) com energia de colisão
variando entre 3-20 V, sendo Argônio o gás de colisão utilizado. A fim de aumentar a
quantidade de íons na cela ICR (analisador do FT MS), o tempo de acumulação de
íons no hexapolo (ion accumulation time) foi aumentado de 0.02 para 1 s. Cada
espectro foi adquirido a partir da acumulação de 32 scans com um domínio de tempo
de 4M (mega-point).
3.3.1 Semiquantificação de Açúcares
31
Com o intuito de semiquantificar os açúcares presentes nas amostras a partir
de espectros de ESI(-)-FT-ICR MS adquiridos das amostras uma relação entre a soma
da intensidade dos sinais dos açúcares identificados e a soma da intensidade dos
sinais gerados pela presença do padrão de glicose deuterada adicionada as mesmas.
Os resultados passaram por tratamento estatístico e foram plotados em um gráfico.
3.3.2 Semiquantificação de Compostos Fenólicos
Para a realização da semiquantificação de compostos fenólicos com base nos
espectros de ESI(-)-FT-ICR MS adquiridos dos extratos obtidos de cada amostra foi
realizada uma relação entre a soma da intensidade de todos os sinais que foram
atribuídos a compostos fenólicos e a soma da intensidade de todos os sinais que
foram provenientes da detecção do padrão de glicose deuterada D-Glicose-
1,2,3,4,5,6,6-d7. A relação gerada foi submetida a tratamento estatístico e os
resultados obtidos foram plotados em um gráfico.
3.4 Quantificação de Polifenóis Totais por Folin-Ciocalteau
O teor de compostos fenólicos nos sucos e nos extratos das amostras foi
determinado pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau com adaptações 42
em espectrofotômetro de UV/Vis 482 (Femto). A curva de calibração foi preparada
com soluções de diferentes concentrações de ácido gálico (10 a 120 µg/mL) que foi
usado como padrão de referência e a quantificação dos polifenóis totais foi feita
através da equação da reta da curva de calibração y = 0,00081x + 0,07e r2 = 0,9925.
Os resultados foram expressos como µg de fenóis por 100g de polpa do fruto. Todas
as análises foram realizadas em triplicata.
32
Figura 6. Curva de calibração obtida utilizando soluções do padrão de ácido gálico.
3.5 Ensaios de Atividade da Quinona-Redutase
3.5.1 Soluções empregadas nos ensaios de quimioprevenção de câncer
3.5.1.1 Tampão fosfato salina (PBS) pH 7,4
Transferiram-se, para balão volumétrico de 1 L, 200 mg de cloreto de potássio
(concentração final 2,7 mM), 8,0 g de cloreto de sódio (concentração final 347,8 mM),
240 mg de fosfafo monobásico de potássio (concentração final 1,7 mM) e 1,4 g de
fosfato dibásico de sódio (concentração final 5,6 mM), adicionando-se, na seqüência,
900 mL de água Mili-Q. Agitou-se até completa dissolução. O pH da solução foi
ajustado para 7,4 com adição de solução de NaOH a 10% p/v. Completou-se o volume
com água Milli-Q. Essa solução foi armazenada à temperatura ambiente.
3.5.1.2 Solução de duodecil-sulfato de sódio (SDS) a 0,5% p/v
Solubilizaram-se 2,5 g de SDS em 500 mL de EtOH a 50%. Essa solução foi
armazenada à temperatura ambiente
.
33
3.5.1.3 Preparo do meio de cultura
Conforme recomendado pelo fabricante, foram transferidos para um béquer de
1000 mL, o conteúdo presente em um pacote de α-MEM 12000-022 liofilizado,
adicionando-se em seguida 900 mL de água Mili-Q. Agitou-se até completa
solubilização. Adicionou-se 2,2 g de bicarbonato de sódio, PSF- solução de penicilina
G-estreptomicina-fungizona 1:1:1 a 10mL/L e soro bovino fetal inativado pelo calor a
10%. Ajustou-se o pH com adição de ácido clorídrico a 50% p/v, seguindo-se de ajuste
de volume em balão volumétrico de 1 L. A solução foi esterilizada por meio de filtração
em filtro de 0,2 µm. O meio de cultura foi armazenado em frascos estéreis, a 4 °C. No
momento de uso, o meio de cultura foi aquecido a 37 °C, em banho-maria.
3.5.1.4 Solução de digitonina a 0,8% p/v
Transferiu-se, para béquer de 150 mL, 1,0 g de digitonina, e adicionaram-se
100 mL de solução de EDTA 2 mM. Aqueceu-se à temperatura de 50 °C, sob agitação,
até completa solubilização. Transferiu-se para um balão volumétrico de 125 mL,
completando-se o volume com EDTA 2 mM. Essa solução foi armazenada à
temperatura ambiente.
3.5.2 Re-Estabelecimento das Linhagens Celulares Mantidas em N2 Líquido
O frasco criogênico contendo as células (Hepa 1c1c7) foi descongelado em
banho-maria a 37°C. A superfície externa do frasco foi esterilizada com EtOH a 70%
v/v e o seu conteúdo foi transferido para um frasco estéril de 75 mL contendo 15 mL
de meio de cultura. Incubou-se em estufa de CO2 por 24 horas e o meio de cultura foi
renovado de 3 em 3 dias. Manteve-se o frasco em estufa de CO2 até que a cultura
primária se apresentasse como uma monocamada 90% confluente.
3.5.3 Preparo das Células para Ensaio
34
Quando a cultura primária apresentou-se 90% confluente, o meio de cultura foi
removido e a monocamada celular foi lavada com 10 mL de PBS pH 7,4. Foram
adicionados 1 mL de solução de tripsina-EDTA (Gibco), e incubou-se, em estufa de
CO2, por 10 minutos para que as células aderidas ao frasco fossem removidas.
Acrescentou-se, então, 10 mL de meio de cultura e procedeu-se com a contagem
celular. Após a contagem, transferiu-se, para um novo frasco estéril, utilizando razão
de passagem de 1:10, quantidade suficiente da suspensão celular para obter a
concentração de 5 x 103 células/mL, seguido da adição de 15 mL de meio de cultura.
O frasco com a cultura de célula foi então incubado em estufa de CO2 até que
a cultura se apresentasse como uma monocamada 90% confluente. O meio de cultura
foi renovado de 3 em 3 dias. Essa etapa foi repetida por três vezes, ou até que se
obtivesse o número de células necessário para o ensaio.
Após o número necessário de células ter sido atingido, realizou-se a contagem
celular como descrito anteriormente. Na sequência, a suspensão foi diluída com meio
de cultura até a concentração de 1 x 104 células/mL. As células foram semeadas na
placa de micro titulação, empregando-se 200 µL/poço, seguindo-se incubação em
estufa de CO2 por 24h.
3.5.3.1 Preparo das Amostras
Para os ensaios de quimioprevenção de câncer, as amostras foram
solubilizadas em DMSO, na concentração de 4,0 mg/mL, sendo esta a solução
estoque que foi mantida a -20 °C, até o momento de uso, quando 10 µL dessa solução
foi diluída em 90 µL de solução estéril de PBS gerando uma solução de concentração
final de 0,4 mg/mL.
3.5.4 Determinação da Indução da Quinona – Redutase
O ensaio de indução da quinona redutase será realizado segundo método
descrito por Prochaska e Santamaria (1988)43 e modificado por Gerhauser et al.
(1997).44
35
Para a avaliação de amostras como indutores da enzima quinona redutase,
será empregada cultura de hepatoma de rato, Hepa1c1c7. As células serão semeadas
em duas placas estéreis, transparentes, de 96 poços, marcadas como “Proteína” e
“QR ensaio”, respectivamente. Após pré-incubação de 24 h, será removido o meio de
cultura inicial e será adicionada nova alíquota (190 µL) de meio de cultura. Será
adicionado a cada placa 10 µL da solução da amostra, 10 µL das soluções da curva
de diluição de 4’-bromoflavona (concentrações finais de 50,0 µM a 0,4 µM)(controle
positivo), e 10 µL de solução de DMSO a 10% em PBS (controle negativo). As placas
serão incubadas, por 48 h, em estufa de CO2.
Após a incubação, o meio de cultura será removido da placa “Proteína”. Em
seguida, serão adicionados 200 µL de cristal violeta a 2% em etanol. Será incubado à
temperatura ambiente, por 10 min, em seguida a placa será lavada em água corrente,
com fluxo baixo, por 2 min, secará em capela e após isso serão adicionados a cada
poço da placa “Proteína”, 200 µL de SDS a 0,5% em 50% de etanol. A incubação será
à temperatura ambiente, sob agitação, 10 ciclos/min, por 5 a 10 min. Em seguida, a
absorbância será determinada em leitor de microplacas no comprimento de onda de
595 nm. O valor de absorbância do controle negativo será de 1,0.
De maneira semelhante, após a 48 h de incubação, o meio de cultura será
removido da microplaca “QR ensaio”. Serão adicionados 50 µL de solução de
digitonina a 0,8%. A placa será incubada em estufa comum, a 37 ºC, por 10 min,
seguida de incubação à temperatura ambiente, sob agitação, 10 ciclos/min, por 10
min. Em seguida, serão adicionados 200 µL da mistura reacional composta por 28 ml
de H2O; 1,5 mL de Tris-HCl, 0,5 M, pH 7,4; 200 µL Tween 20 a 1,5% V/V; 20 µL FAD
7,5 mM; 200 µL G-6-P 150 mM; 18 µL NADP 50 mM; 20 mg BSA; 9 mg MTT; 60 U G-
6-PH; e 30 µL Menadions 50 mM. A incubação será à temperatura ambiente, a placa
“QR ensaio” será agitada com 10 ciclos/min, no período de 5 min. A absorbância será
determinada em leitor de microplacas no comprimento de onda de 595 nm. O valor de
absorbância controle será de 0,4, obtido para o controle negativo.
A atividade indutora da QR será expressa como DC (dobro da concentração
requerida para a atividade específica da QR), CI50 e IC (índice quimiopreventivo,
correspondente à razão CI50/DC). Para o cálculo de DC será aplicado, a cada valor de
absorbância lido na placa “QR ensaio”, a seguinte equação:
36
DC = [(A1 x /5) / AT] x 3.247 Eq. 1
Onde:
A1 = absorbância da solução na presença do indutor, lido na placa “QR ensaio”
(AAmostra - ABranco)
AT = absorbância da solução na presença do indutor, lido na placa “Proteína” (AAmostra -
ABranco)
O denominador 5 refere-se ao tempo de incubação à temperatura ambiente. E
o denominador 3.247 é a razão entre a constante de proporcionalidade do cristal
violeta pelo coeficiente de extinção do MTT no comprimento de onda 595 nm.
Para o cálculo da CI50 será empregado o software livre, usando os valores
resultantes da equação abaixo, aplicado a cada valor de absorbância lido na placa
“Proteína”.
% células sobreviventes = (AA x 100/Ac) Eq. 2
Onde:
AA = absorbância da solução na presença da amostra
Ac = absorbância da solução na presença do controle negativo.
Os resultados são apresentados como média de, no mínimo, triplicatas,
seguidas do erro padrão da média. Serão consideradas ativas as amostras que
apresentaram valor DC superior a 2.
37
3.6 Análise Estatística
A análise de variância (ANOVA) foi utilizada para a comparação das médias
das unidades experimentais em relação a cada tratamento (estádios de maturação).
Onde diferenças entre as médias foram detectadas, aplicou-se o teste de Tukey para
comparação entre as mesmas e mostrar quais grupos são semelhantes ou diferentes.
Valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Para a realização dessas
análises foi utilizado o programa Assistat versão 7.7 beta.45,46
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análises físico – químicas
As análises foram realizadas nos seis estádios de maturação do abacaxi cv.
Vitória determinados pela coloração da casca dos frutos (Figura 6). Ao todo foram
analisados 30 frutos sendo 5 de cada estádio.
38
Figura 7. Abacaxi cv. Vitória nos seis estádios de maturação
Os resultados das análises físico-químicas são apresentados na tabela 3, na
qual podemos observar que os valores dos sólidos solúveis aumentam com o grau de
amadurecimento do fruto, indo de 14.61 °Brix no estádio 0 a 17.45 °Brix no estádio 5,
isso porque, com a evolução da maturação, há aumento da concentração de açúcares
simples provenientes da hidrólise do amido (acumulado na fase de crescimento do
fruto), até o completo amadurecimento, com declínio posterior em função de sua
utilização como fonte de energia.15
Estatisticamente, os estádios 2, 3 e 4 apresentam médias que não se diferem
em relação ao teor de sólidos solúveis totais, revelando que a partir do estádio 2 o
fruto já apresenta quantidades ótimas de açúcares para o consumo, dados
semelhantes também foram reportados por Costa12 ao avaliar a mesma variedade.
A acidez total titulável expressa em porcentagem de ácido cítrico foi de 0,81 no
estádio 0 e diminuiu com o amadurecimento do fruto até alcançar o valor de 0,45 no
estádio 5. Essa queda tende a ocorrer porque, durante a maturação, há um
decréscimo acentuado no teor de ácidos orgânicos, pois são largamente utilizados
39
como substratos, juntamente com os açúcares, no processo respiratório para
fornecimento de carbono e para a produção de energia nas diferentes fases do ciclo
vital dos produtos vegetais. Essa diminuição também pode ser atribuída à
transformação dos mesmos em açúcares.15
A relação SST/AT foi crescente do estádio 0 ao estádio 5. Tal relação é uma
das formas mais utilizadas para a avaliação do sabor, sendo mais representativa que
a medição isolada de açucares ou da acidez pois dá uma boa ideia de equilíbrio entre
esses dois componentes.15
Tabela 3. Ensaios Físico–químicos utilizando metodologias convencionais: SST, AT e Razão SST/AT.
SST AT SST/AT
Estádio 0 14.60600 c 0.81500 a 17.92641 b
Estádio 1 15.04600 bc 0.64942 b 23.48146 b
Estádio 2 17.11000 ab 0.57478 bc 30.69752 ab
Estádio 3 15.68600 abc 0.59236 bc 26.49182 ab
Estádio 4 16.87600 abc 0.45500 c 39.43838 a
Estádio 5 17.44600 a 0.45400 c 39.67309 a
40
Figura 8. Ensaios físico–químicos utilizando metodologias convencionais: (a) SST, (b) AT, (c) Razão SST/AT.
4.2 ESI-FT-ICR MS E ESI (-) FT - ICR MS/MS
4.2.1 Análise dos Açúcares
Para a análise de amostras de abacaxi cv. Vitória nos estádios de maturação
0, 1, 2, 3, 4 e 5 foi utilizada a técnica de ESI(-)-FT-ICR MS por ser mais adequada em
relação a ESI(+) para verificar o perfil químico, pois nesse modo existe menor
supressão de sinais, relacionados a altas concentrações de sais minerais (Na+, K+,
Ca+, dentre outros) presentes em amostras de produtos naturais.42 No modo ESI(-)
ocorre a desprotonação do analito (íon [M – H]-), e espécies químicas como ácidos e
açucares são facilmente ionizadas.21
A figura 8 mostra os espectros de ESI(-)-FT-ICR MS para as amostras de
abacaxi em função do estádio de maturação 0, 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente. O alto
teor de açúcares presente nas amostras encontrado nos testes físico-químicos
também foi revelado pelos sinais intensos gerados pela presença de dissacarídeos
desprotonados como o íon [C12H22O11-H]- de m/z 341 além da formação de complexos
41
não covalentes dessa molécula gerando dímeros como o íon [2M-H]- de m/z 683
assim como [3M-H]- de m/z 1025 onde M = C12H22O11. De acordo com o que foi
reportado por Wan et al.(2013)47 ao estudar isômeros de dissacarídeos verificou-se
que o aumento da concentração dessas espécies na amostra aumenta gradualmente
a propensão de formação de dímeros.
O dissacarídeo também foi detectado fixado a água ([C12H24O12-H]– de m/z
359), a cloreto ([C12H22O11+Cl] – de m/z 377), a ácido lático ([C15H28O14-H] – de m/z
431), a glicose ou isômeros da mesma ([C18H34O17-H] – de m/z 521), a padrão de
glicose deuterada D7 ([C18H26D7O17-H] – de m/z 528) e a ácido cítrico ([C18H30O18-H] –
de m/z 533).47
Sinais menos intensos também foram observados para moléculas de glicose
ou seus isômeros na forma desprotonada gerando o íon [C6H12O6-H] - de m/z 179 e
fixada ao ânion cloreto [C6H12O6+Cl]– de m/z 215 e a ácido málico [C10H18O11-H] – de
m/z 313.
A figura 8 também revela sinais gerados pela presença do ácido cítrico nas
amostras sendo eles o sinal do ácido cítrico desprotonado [C6H8O7-H] – de m/z 191 e
fixado a sacarose ou seus isomêros [C18H30O18-H] – de m/z 533 como já mencionado.
É possível observar que esses sinais decrescem do estádio 0 para o estádio 5,
corroborando com os testes físico-químicos que revelaram a diminuição da acidez
com a progressão do amadurecimento do frutos.
O dopante foi detectado em sua forma isolada desprotonada [C6H5D7O6-H]- de
m/z 186, fixada a Cl- [C6H5D7O6+Cl]- de m/z 222, na forma de dímero [C12H9D14O12-H]-
de m/z 373, fixada a uma molécula de glicose ou seus isômeros [C12H17D7O12-H]- de
m/z 366 e fixado a uma molécula de sacarose ou seus isômeros [C18H26D7O17-H]- de
m/z 528.
42
Figura 9. ESI(-)-FT-ICR MS: (a) estádio 0, (b) estádio 1, (c) estádio 2 e (d) estádio 3, (e) estádio 4 e (f) estádio 5.
Na tabela 4 serão mostrados os dados obtidos a partir dos espectros de ESI(-
)-FT-ICR MS de alguns compostos químicos identificados tais como: as fórmulas
mínimas, erros de massa, o índice de deficiência de hidrogênio (DBE), valores de m/z
medidos e teóricos.
43
Tabela 4. Compostos Químicos Propostos dos Espectros de Massas ESI(-)-FT-ICR MS dos estádios de maturação.
Fórmula
[M - H]-
m/z Medido
m/z Teórico
Erro (ppm)
DBE Identificação
1 [C6H12O6-H] - 179.05599 179.05611 0.68 1
Glicose ou Isômeros
2 [C6H5D7O6-H] - 186.09998 186.10005 0.35 1
Padrão de Glicose D7
3
[C6H8O7-H] - 191.01963 191.01973 0.05 3
Ácido Cítrico
4 [C6H12O6+Cl] - 215.03272 215.03279 0.31 0
Glicose ou Isômeros / Cl-
5 [C6H5D7O6+Cl]- 222.07677 222.07673 -0.05 0
Padrão de Glicose D7 / Cl-
6 [C10H18O11-H] - 313.07773 313.07763 -0.31 2
Glicose ou Isômeros / Ácido Málico
7 [C12H22O11-H] - 341.10904 341.10894 -0.30 3
Sacarose ou Isômeros
8
[C12H24O12-H] -
359.11957 359.11950 -0.21 1
Sacarose ou Isômeros / H2O
44
9 [C12H17D7O12-H] -
366.16352
366.16344
-0.24
1
Glicose ou Isômeros/GlicoseD7
10
[C12H9D14O12-H] -
373.20755 373.20755 -0.46 1
Dímero Glicose D7
11
[C12H22O11+Cl] -
377.08567 377.08561 -0.24 1
Sacarose ou Isômeros /Cl-
12
[C15H28O14-H] -
431.14076
431.14063
-0.31
2
Sacarose ou Isômeros / Ácido
Lático
13 [C16H28O16-H] - 475.13057 475.13046 -0.24 3 Não Identificado
14 [C18H34O17-H] - 521.17268 521.17268 -0.69 2
Sacarose ou Isômeros / Glicose ou Isômeros
15
[C18H26D7O17-H] -
528.21622 528.21626 0.07 2
Sacarose ou Isômeros / Glicose D7
16
[C18H30O18-H] -
533.13636 533.1354 -0.79 4
Sacarose ou Isômeros / Ácido
Cítrico
45
A estrutura química proposta para os principais açúcares encontrados são
confirmados por experimentos de CID dos sinais de m/z 341, 431, 521, 533, 683 e
1025, onde os espectros de ESI(-)-MS/MS são mostrados na figura 9. Perdas neutras
de monossacarídeos como os isômeros glicose/frutose C6H12O6, H2O, C3H6O3 e de
dissacarídeos (m/z 341) foram identificados. Tais fragmentos também foram
observados por Wan et al.(2013)47 ao fragmentar os mesmos sinais gerados por
amostras de padrões de isômeros de dissacarídeos revelando que na presença
desses há formação de complexos não covalentes entre os dissacarídeos e entre
esses e os outros fragmentos isto porque suas estruturas adaptáveis permitem que
tenham uma gama de potenciais ligações de hidrogênio fazendo com que os mesmos
se atraiam.
17
[C24H44O22-H] -
683.22545 683.22515 -0.44 3
Dímero de Sacarose ou
Isômeros
18 [C36H66O33-H] - 1025.34267 1025.34136 -1.28 4
Trímero de Sacarose ou Isômeros
46
Figura 10. ESI (-) MS/MS dos íons m/z (a) 341, (b) 431, (c) 521, (d) 533, (e) 683 e (f) 1025.
Uma análise comparativa entre a abundância dos sinais produzidos pela
presença de carboidratos em cada estádio de maturação do abacaxi cv. Vitória com o
SST foi realizada. A figura 10 mostra os valores obtidos para a razão dos sinais
relativos a açúcares encontrados no abacaxi (íons de m/z 179, 215, 341, 359, 366,
377, 521, 528, 533, 683 e 1025) pelos sinais do padrão interno de glicose deuterada
(m/z 186, 222, 366, 373 e 528). Estatisticamente, não houve diferença entre os
estádios de maturação e, por isso, os resultados foram seguidos pela mesma letra.
Tal resultado, expressa o que é observado visualmente na análise dos espectros
devido à alta concentração e diversidade de açúcares presentes nas amostras e
47
também pela formação de adutos entre esses e o padrão adicionado as mesmas não
é possível diferir entre os espectros de amostras de estádios diferentes.
Figura 11. Variação da razão entre a soma dos sinais gerados pela presença de açúcares pela soma dos sinais produzidos pela presença do padrão de glicose deuterada em função dos estádios de maturação.
4.2.3 Análise de Compostos Fenólicos
O extrato obtido a partir das amostras de abacaxi cv. Vitória foram dopadas
com solução de glicose deuterada e analisados por ESI(-)-FT-ICR MS. Os espectros
ESI(-)-MS das amostras nos estádios de maturação 0 (a), 1 (b), 2 (c), 3 (d), 4 (e) e 5
(f) são mostrados na figura 11 que traz 12 possíveis estruturas de compostos fenólicos
detectados na forma desprotonada, sendo eles: o 4-alil-2,6-dimetoxifenol,48
[C14H20O9-H] – de m/z 331,49 [C15H14O9-H]- de m/z 337,50 [C16H20O9-H]- de m/z
355,51 [C17H24O8-H]- também de m/z 355,52 [C15H20O10-H]- de m/z 359,49
[C16H18O10-H]- de m/z 369,53 Hirtellanine B de m/z 379,54 [C17H22O10-H]- de m/z
385,51,55 Hymenoside S de m/z 397,56 [C18H25O12-H]- de m/z 433,57 [C27H22O6-H]- de
m/z 441,51 e Seguinoside J,58.
3,4a 3,4a4,15a
3,77a 3,72a4,46a
0
1
2
3
4
5
ESTÁ D IO 0
ESTÁ D IO 1
ESTÁ D IO 2
ESTÁ D IO 3
ESTÁ D IO 4
ESTÁ D IO 5
INTE
NSI
DA
DE
AB
SOLU
TASI
NA
IS A
ÇÚ
CA
RES
/SI
NA
IS G
LIC
OSE
D
EUTE
RA
DA
48
Figura 12. ESI(-)-FT-ICR MS do extrato: (a) estádio 0, (b) estádio 1, (c) estádio 2, (d) estádio 3, (e) estádio 4 e (f) estádio 5.
Os valores de m/z medido, m/z teórico, DBE, erro de massa, estrutura proposta
e artigos que relatam sobre esses compostos são mostrados na tabela 5.
Os compostos 2, 7 e 16 apresentam relatos na literatura sobre sua presença
em frutos abacaxi. O composto 2, que apresenta baixa massa molecular, foi
encontrado por Wu et al. (1991)48 ao analisar compostos responsáveis pelo aroma do
abacaxi. Já os compostos 7 e 16 fazem parte da composição fenólica já descrita do
mesmo51 e também foram detectados em banana55.
Os compostos 4 e 8 são encontrados em frutos umbu e estudos anteriores
mostraram que esses apresentaram alta atividade antioxidante e inibição da
acetilcolinesterase demonstrando que a presença desses compostos no umbu o torna
um possível ingrediente ativo para produtos alimentares funcionais 49 e assim também
pode ser considerado o abacaxi por apresentar tais moléculas. O composto 5 foi
encontrado no espinafre e sua síntese e acumulação no mesmo já foi elucidada.50
49
Tabela 5. Compostos Químicos Propostos dos Espectros de Massas ESI (-) FT-ICR do extrato.
Fórmula
[M - H]-
m/z
Medido
m/z Teórico
Erro (ppm)
DBE Identificação Ref.
1 [C6H5D7O6-H] - 186.09998 186.10005 0.35 1
Padrão de Glicose D7
2 [C11H14O3-H]- 193.08703 193.08702 -0.08 5
4-alil-2,6 dimetoxifenol
WU et al. (1991)48
3 [C6H5D7O6+Cl]- 222.07677 222.07673 -0.05 0
Padrão de Glicose D7 / Cl-
4 [C14H20O9-H] - 331.10360 331.10346 -0,42 5
Zeraik
et al. (2016)48
5 [C15H14O9-H]- 337.05666 337.05651 -0.46 9 2-Acetil-3-(p-coumaroyl)-meso-ácido tartárico
Strack
et al.
(1987)49
6 [C16H20O9-H]- 355.10384 355.10346 -1.08 7
Wen
et al.
(2002)50
7 [C17H24O8-H]- 355.13995 355.13984 -0.31
6
Yang
et al.
(2011)51
50
8 [C15H20O10-H]- 359.09857 359.09837 -0.55 6
Zeraik
et al. (2016)48
9
[C12H17D7O12-H] –
366.16352 366.16344
-0.24
1
Glicose ou Isômeros/GlicoseD7
10 [C16H18O10-H]- 369.08304 369.08272 -0.86 8
Li et al. (2009)52
11
[C12H9D14O12-H] -
373.20755 373.20755 -0.46 1
Dímero Glicose D7
12 [C21H16O7-H]- 379.08308 379.08233 -2.00 14
Hirtellanine
Shou
et al.
(2009)53
13 [C17H22O10-H]- 385.11419 385.11402 -0.44 7
Wen
et al.
(2002)50
Tsamo
et al.
(2015)54
14 [C19H26O9-H]- 397.15058 397.15041 -0.43 7
Hymenoside S
Toyota
et al.
(2002)55
15 [C18H26O12-H]- 433.13538 433.13515 -0.54 6
Kumar
et al.
(2010)56
51
16 [C27H22O6-H]- 441.13391 441.13436 1.03 17
Wen
et al.
(2002)50
17 [C23H32O12-H] - 499.18226 499.18210 -0.32 8
Seguinoside J
Zhonga
et al.
(1997)57
18
[C18H26D7O17-H] -
528.21622 528.21626 0.07 2
Sacarose ou
Isômeros / Glicose D7
Os dados de ESI(-)-FT-ICR MS foram avaliados estatisticamente pela análise
de variância e teste de Tukey. Quando comparamos a intensidade desses compostos
em relação a soma dos sinais gerados pela presença do padrão interno (íons de m/z
186, 222, 366, 373 e 528), uma maior abundancia dos compostos fenólicos é
observado a partir do estádio de maturação 2 indicando uma maior concentração
dessas espécies fenólicas então nos estádios 2, 3, 4 e 5.
Figura 13. Variação do conteúdo de compostos fenólicos em função dos estádios de maturação.
52
* Refere-se aos: m/z 355.10384 e m/z 355.13995
Uma relação entre cada composto fenólico detectado e os estádios de
maturação foi realizada fazendo a razão entre a intensidade absoluta encontrada para
cada composto fenólico e a soma das intensidades absolutas dos sinais gerados pelo
padrão (figura 14).
Essa análise permitiu avaliar a intensidade absoluta dos sinais de quais
compostos contribuíram para a relação realizada anteriormente, que fez uma relação
com todos os compostos fenólicos, ou seja, quais compostos estão em maior
concentração em cada estádio. Assim, verificou-se que as espécies representadas
nas figuras 14–c, 14-e e 14-f não apresentaram diferenças, de acordo com os testes
estatísticos realizados, entre os estádios indicando que a concentração desses
compostos ao longo do processo de amadurecimento dos frutos permanece
constante. Os compostos mostrados nas figuras 14-a, 14-b, 14-d, 14-j e 14-m
apresentaram concentrações maiores em estádios intermediários, entre o 1 e o 4. Já
os compostos em 14-g, 14-h, 14-e 14-k e 14-l tiveram sua concentração nitidamente
aumentada em um determinado estádio, assim o composto fenólico da figura 14-g
apresentou maior concentração no estádio 3, o da 14-h no estádio 5, o 14-i no estádio
4, os 14-k e 14-l no estádio 5.
53
Figura 14. Razão entre a intensidade absoluta dos compostos fenólicos pela soma da intensidade absoluta dos sinais gerados pelo padrão em função dos estádios de maturação.
54
4.3 Quantificação de Polifenóis Totais por Folin-Ciocauteau
4.3.1 No extrato
Os conteúdos totais de compostos fenólicos no extrato foram determinados
como índice de polifenóis totais, representados na figura 15. Os resultados foram
tratados estatisticamente pela análise de variância e teste de Tukey e, confirmaram
que o estádio 3 é o mais rico em compostos fenólicos e os estádio 1, 2, 4 e 5 não
diferiram estatisticamente. Isso mostra que houve um aumento dessas espécies com
o processo de maturação até o estádio 3 e depois um decréscimo até a estabilização
sugerindo que o processo fisiológico de maturação no abacaxi afeta diretamente a
presença de compostos fenólicos e sua atividade antioxidante. Uma hipótese seria
que a atividade celular passaria por um ligeiro aumento no qual a maior parte das
biomoléculas estão para ser metabolizadas,59 nesse período, os frutos precisam de
uma quantidade maior de energia para suportar todas as vias fisiológicas na célula.60A
geração dessa energia por parte do sistema respiratório produziria radicais livres e,
por isso, os frutos podem precisar ativar os mecanismos de defesa produzindo
antioxidantes para evitar os danos que seriam causados pelo stress oxidativo.61
Figura 15. Determinação da concentração de compostos fenólicos no extrato.
55
4.3.2 No suco
Os conteúdos totais de compostos fenólicos no suco também foram
determinados e os resultados foram tratados estatisticamente pela análise de
variância e teste de Tukey e estão representados na figura 16.
As quantidades de compostos fenólicos encontradas é muito superior a
encontrada nos extratos e isso pode ser explicado pela presença de maior quantidade
de ácido ascórbico no suco, que reage com o reagente de Folin-Ciocalteu. Isso porque
o suco não passou pelo processo de extração que acaba por degradar essa
substância que é muito instável. 61
Nessa análise, os teores não puderam ser diferenciados em função dos
estádios de maturação uma vez que, estatisticamente, as médias dos resultados
foram iguais.
Figura 16. Determinação da concentração de compostos fenólicos no suco.
56
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