•Metodología para la caracterización de las transiciones. •Procesos de congelación.

Teórica 2.

Determinación de las temperaturas de transición de fase y estado

Propiedades térmicas DTA

DSC

TGA

Propiedades espectroscópicas RMN

IR

Raman

RSE

Propiedades eléctricas DETA

DEA

Conductividad

Propiedades mecánicas MS

DMA

DMTA

Técnicas microscópicas y análisis de imágenes

DSC Differential Scanning Calorimetry

Horno

Sensores

Referencia

Muestra

Determinación de las temperaturas de transición

DSC Differential Scanning Calorimetry

Tm = Temperatura de la muestra TR = Temperatura de la referencia TC = Temperatura de la celda

Tm - TR = dT

Flujo de calor hacia la referencia Tm TR

TC

Flujo de calor hacia la muestra

Sensor-vista superior

Tanque de N2 (l)

Tanque de N2 (g)

DSC

caudalímetro

Calorimetría diferencial de barrido: Termograma típico de un azúcar liofilizado (adaptado de Roos, 1992).

TRANSICIÓN VíTREA

Región vítrea

Región sobreenfriada

Formación de cristales

Fusión de cristales

Temperatura/tiempo

Transiciones de fase de un sólido amorfo

Determinación de la temperatura de transición

vítrea por DSC

Temperatura

∆cp

Τg onset

Τg endsset

Τg midpoint

Fluj

o ex

otér

mic

o de

cal

or

Efecto del agua:

Variación de Tg en función del contenido de agua para glucosa y maltosa.

Transición vítrea de mezclas

Además del agua, otros compuestos miscibles modifican la Tg de un dado componente

Transición vítrea de mezclas

Ecuación de Gordon y Taylor: Relaciona Tg de mezclas binarias con la fracción en masa y la Tg de los componentes individuales.

21

2211

wkwTwkTw

g m e z c l aggT ⋅+

⋅⋅+⋅=Tg mezcla = Tg observado para una mezcla binaria w1 y w2 = fracción en masa de los componentes puros Tg1 y Tg2 = Tg de los componentes puros k = constante (representa la fuerza de interacción entre los componentes del sistema).

Transiciones entálpicas

Agua, azúcares, lípidos Fusión Cristalización

polioles,

Almidón gelatinización retrogradación

Proteínas desnaturalización agregación

DSC Differential Scanning Calorimetry

mW

-6

-4

-2

0

min

C 130 132 134 136 138 140 142 144

0 1 2 3 4 5 6 7

1

2 Exot.

Endot.

Deflección inicial

Area = calor involucrado

Flujo de calor (dh/dt) = TS - TR

dU/S

Ejemplos. 1. Desnaturalización de proteínas

Integral -28.76 mJ normalis. -4.23 Jg^-1

Integral -92.73 mJ normalis. -17.17 Jg^-1

Soybean

Lupines

Spelt

WheatmW2

°C50 60 70 80 90 100

exo Vegetable Proteins (1) 13.03.1998 10:14:32

DEMO Version SystemeRTAMETTLER TOLEDO S

2. Gelatinización de almidón

Integral -36.31 mJ normalized -7.52 Jg^-1Peak 69.61 °C

Wheat

Corn

Potato

Rice

mW2

°C40 50 60 70 80

exo Gelatinization of Starch (7) 13.03.1998 10:12:38

DEMO Version SystemeRTAMETTLER TOLEDO S

3. Fusión/crist. de lípidos

Diagrama de estado de semillas de nim (neem o lila india)

Sacandé y col., 2002

Técnicas complementarias: Microscopía

Microestructura de sistemas amorfos

Clausse, 2006

Platina térmica

Platina térmica Sistema de control de temperatura

Tanque de N2 L

-300

-200

-100

0

100

200

300

-60 -40 -20 0 20 40Temperature (°C)

Hea

t flo

w (m

W)

Exot

herm

icEn

doth

erm

ic

+20°C

Free

zing

Icemelting

-17°C-20°C

-1°C +4°C

Unfrozenwater

Ice

Clausse, 2006

masa = 28 mg; energía de congelación: 66.06 Cal/g ; energía de fusión: 78.45 Cal/g

Termogramas de agua (DSC)

Micrografías de soluciones de NaCl (180x)

Clausse, 2006

Rayos X

Para analizar cristalinidad o amorficidad

Técnicas complementarias:

Todos los solutos forman vidrios?

Dulcitol

(galacti-tol)

Sorbitol

Iditol

Maltitol

Manitol

solución cristal

Conformaciones moleculares de polioles

c

v

v

v

c

No deben modificar su conformación al cristalizar

Manitol y dulcitol, que tienen mayor tendencia a cristalizar, tienen mayores temperaturas de fusión y mayores ∆Hf

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

0 0.2 0.4 60 80 100

Solid mass fraction (%)

Tem

pera

ture

(°

C) Tm

Tg

Ts

cg'

solution

ice+glass

glass

Tg'

Maximum

100

120

V

G

Maximum ice crystallization rate ice + freeze-concentrated solution

C

B E

ce

A

D

F

Vitrificación por congelación rápida o secado

Cuando el agua se encuentra formando parte de una mezcla binaria con un soluto es importante determinar cuáles son las fases presentes en función de la composición, temperatura o de la presión. Además de las condiciones de equilibrio que proveen los diagramas de fase, los diagramas de estado suplementados incorporan la curva de temperatura de transición vítrea. Proveen información acerca de condiciones de no equilibrio y estados de equilibrio metaestable y, por lo tanto, incluyen la noción de tiempo completando así la información de los diagramas de fase.

Diagramas de estado suplementados

Estos diagramas son especialmente útiles para analizar la estabilidad en sistemas congelados, deshidratados o parcialmente deshidratados que no corresponden a estados de equilibrio termodinámico.

Concentración de soluto, %

• Temperatura de transisición vítrea (Tg) • Fusión de hielo (Tm) • Solubilidad (Tm

s)

Dichas curvas definen regiones de estabilidad variable.

(adaptado de Fennema, 1996).

Diagrama de estado suplementado para un sistema binario.

Líquido sobreenfriado

Solución

Hielo + solución

Hielo + líq. sobreenfriado Vidrio

Tem

pera

tura

, °C

Región comprendida entre Tm (equilibrio) y Tg: El sistema se encuentra, con raras excepciones, en un estado de no equlilibrio. La curva Tm define las condiciones donde el solvente (agua) puede cristalizar. Si la concentración de soluto supera la concentración definida por el punto eutéctico en el diagrama de fases, puede formarse un sólido eutéctico (soluto y solvente) o bien el solvente continúa cristalizando en una solución sobresaturada. La primera situación ocurre con las sales mientras que la segunda ocurre comúnmente con azúcares, polímeros y comp. polioxhidrílicos.

Zona metaestable donde puede ocurrir cristalización de solutos. En condiciones de temperatura y concentración cercanas a la curva de solubilidad, la velocidad de cristalización aumenta con la sobresaturación. Sin embargo, cuando el sistema se acerca a la curva de Tg, ya sea por concentración o congelación, la viscosidad aumenta drásticamente y la velocidad de cristalización disminuye debido a limitaciones difusionales. A Tg, las restricciones en la movilidad molecular del sistema son tales que impiden la cristalización en escalas de tiempo razonables. Cabe remarcar que éste es un estado dinámico (restringido cinéticamente) y no un estado de equilibrio.

Región comprendida entre las curvas Tms y Tg:

Región comprendida debajo de la curva de Tg: Si el material adquirió el estado vítreo, en general, las reacciones o procesos que dependen de la transferencia de masa o de la difusión están restringidos y son muy lentos. La cristalización, por ej., no ocurre en una escala de tiempo práctica. No es una condición de equilibrio sino un estado metaestable.

Congelación

Efecto de la velocidad de enfriamiento

Control de la cristalización. Variables extrínsecas 1. Velocidad de cristalización 2. Temperatura mínima alcanzada

Control de la cristalización:

Variables intrínsecas (Composición)

a) Presencia de agentes nucleantes:

Ejs. IAg; bacterias.

b) Modificación del crecimiento de los cristales de hielo:

Péptidos anticongelantes (en realidad inhiben el crecimiento de los cristales): peces antárticos.

Presencia de biopolímeros: gomas

Presencia de sales

La fuerza impulsora para los procesos de cristalización es la diferencia en potencial químico entre la fase solución y el sólido cristalino.

Puede expresarse como la diferencia de concentración respecto a la de saturación, o como la diferencia de temperatura entre el sistema que cristaliza y su punto de fusión.

Formación de hielo: La línea que se extiende desde el punto eutéctico (TE) a Tg’, representa condiciones de no equilibrio. Si el sistema se almacena a:

T > TE ⇒ fusión del hielo

T < Tg’ ⇒ sistema altamente viscoso, movilidad molecular muy reducida, limitaciones difusionales que impiden la cristalización de agua.

Máxima formación de hielo ⇒ congelación lenta a temperaturas entre TE y Tg’.

Congelación Formas de congelación y cantidad de

hielo formado

Formación de hielo en soluciones 60% de azúcares.

(A)Enfriamiento previo a -100°C a 30°C/min. Se observa formación de hielo al calentar (5°C/min) por encima de Tg.

(B) Enfriamiento a -100°C, mantenimiento 15 min a -48°C, re-enfriamiento a -100°C, para máxima formación de hielo.

Cambios inducidos en las biomoléculas por la congelación

Estrés Respuesta celular

Reducción de T Cambios de fase de lípidos de membrana

Aumento de la conc. de soluto Encogimiento osmótico

Aumento de fza iónica. Efectos directos en membranas, solubilización de proteínas de membrana

Deshidratación Desestabilización de bicapas lipídicas Precipitación de sales y formación de eutécticos variable

Formation de burbujas de gas Daño mecánico a membranas/citoesqueleto

Aumento de viscosidad Los procesos difusivos (ósmosis) se limitan Cambios de pH Desnaturalización de proteínas etc. Las células se comprimen Daños en membranas

Efecto de distintos crioprotectores en la estabilidad de LDH en congelado/descongelado

Comparación daño por cong./descong (tramado) con liofilizado (sólido). PFK con aditivos 0,5M

Velocidades de congelación:

Lenta: ≤ 1 °C/min

Rápida ≥ 100°C/min

La temperatura crítica que usualmente tiene efacto sobre la supervivencia de organismos vivientes es -40°C.

Los procedimientos desarrollados para la preservación de organismos por congelación o secado son aún altamente empíricos.

La presencia de cierto contenido de agua y el mantenimiento de un rango de temperaturas es un requerimiento para organismos vivientes.

Cuando a dos tipos de células distintas se aplica la misma velocidad de congelación, se obtienen diferentes niveles de congelación intracelular.

En células de levadura permanece una significativa cantidad de agua a velocidades > 10°C/min.

En glóbulos rojos, un aumento similar de agau remanente en las células se observa cuando la velocidad es > 1000°C/min.

Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.

Consecuencias de la congelación de sistemas biológicos.

La supervivencia de células de Saccharomyces cerevisiae luego de congelar y descongelar es máxima para una velocidad de congelación de 1 a 10°C/min.

La existencia de este óptimo se debe a dos fenómenos:

Efectos mecánicos

Efectos de los solutos

Efectos mecánicos

Congelación extracelular

•Cuando una suspensión de células se somete a enfriamiento lento, la cristalización de hielo comienza en el medio externo y su interior se mantiene en estado sobre-enfriado hasta ~ -10°C.

•En ese rango de T el agua sobre-enfriada tiene mayor presión de vapor que el hielo, y el agua intracelular se expele, causando deshidratación progresiva de las células.

Efectos mecánicos

•El agua que sale de las células congela en el exterior al encontrarse con cristales ya formados.

•Si el enfriamiento es lento, el sistema se equilibra con la expulsión de agua y las células se encogen por pérdida de agua intracelular, cuya concentración de solutos aumenta.

•

agua hielo

hielo hielo

Causa de daño por congelación intracelular

Cell

water Extracell.

ice

ice ice ice ice Supercooled cytoplasm

Sistemas congelados

Mecánicos

Dependientes de la velocidad

Químicos

Cambios de pH

Aumento de fuerza iónmica.

Daño por congelación intracelular

Efectos mecánicos

Congelación intracelular

•De un enfriamiento rápido, resulta cristalización intracelular, como resultado de la nucleación con hielo que proviene del exterior a través de ductos en las membranas.

•A su vez, si el enfriamiento es muy rápido, los cristales son pequeños y si es ultra-rápido ocurre vitrificación.

•Si se debe evitar el crecimiento de cristales, el descongelado debe ser muy rápido también.

Efectos mecánicos

•El enfriamiento muy rápido lleva a alta supervivencia, si está seguido de un descongelado rápido.

•Pero si el descongelado no puede ser lo suficientemente rápido, es mejor congelar más lentamente ya que la deshidratación de las células limita el desarrollo de cristales intracelulares.

•La velocidad de congelación que causa congelación intra y extracelular depende de la velocidad de movimiento del agua de adentro hacia afuera.

•Las condiciones de congelación que provocan cristalización intracelular causan disminución de viabilidad.

Tanto plantas como animales tienen mecanismos para evitar la cristalización de hielo. Los tres principales mecanismos son: •Formación de vidrios. •Cristalización extracelular. •Proteínas anticongelantes.

Sistemas congelados

Congelación rápida (ej. con nitrógeno líquido): Previene la cristalización de hielo y por lo tanto se obtiene un sistema amorfo con un valor de Tg (menor que Tg’) que será dependiente de la cantidad de agua asociada a la fase amorfa. Congelación lenta: Favorece la formación de hielo, que será máxima a Tg’ < T< TE,

Tiempo

Congelación lenta

Congelación rápida

Can

tidad

de

hiel

o fo

rmad

o, %

Cg’, Tg’: Punto en el diagrama de estado definido por la intersección de las curvas de fusión y de Tg. Corresponde a una concentración de soluto/temperatura a la cual la cristalización de agua está inhibida cinéticamente. Cg’ es la concentración correspondiente a la matriz máximamente concentrada por formación de hielo: a Cg’ se alcanza la mínima cantidad de agua asociada a la fase amorfa que se puede alcanzar por crioconcentración. Tg’ es la temperatura de transición vítrea correspondiente a esa matriz.

Crioconcentración

Caraterísticas de Tg’ : • El valor es independiente de la concentración inicial, sólo depende de la composición o tipo de soluto. Por lo tanto, cada sistema tendrá su diagrama de estado característico que diferirá cuantitativamente pero no cualitativamente del diagrama mostrado en la Figura anterior. • Se determina generalmente por DSC a partir de soluciones que fueron almacenadas en condiciones de máxima formación de hielo. • Conocer el valor de Tg’ es importante para evaluar la estabilidad de productos congelados (los cuales a Tg’ son estables a la cristalización de agua por largos períodos de tiempo).

Compuesto

T’g (°C)

Pentosas

Ribosa -48

Xilosa -47

Hexosas

Fructosa -42

Glucosa -43

Manitol -40

Disacáridos

Sacarosa -32

Trehalosa -30

Lactosa -28

Trisacáridos

Rafinosa -26

Tetrasacáridos

Estaquiosa -24

Maltohexaosa -15

Ciclodextrina -9

Temperaturas de transición vítrea de carbohidratos máximamente concentrados.

• Gráfico ∆H de fusión vs. Cont. de agua.

Extrapolando hasta ∆H =0 se obtiene el cont. de agua de la matriz concentrada.

• A partir de los termogramas, disminuyendo el contenido de agua hasta que no aparezca agua congelable.

• Luego de efectuar una serie de templados, determinando la Tg de la matriz concnetrada y calculando su contenido de agua por Gordon y Taylor.

Determinación de la matriz máximamente concentrada (Tg’/cg’)

Muchas sales forman soluciones sobresaturadas durante el enfriamiento y eventualmente vitrifican. Durante la descongelación muestran una transición vítrea y luego cristalización del eutéctico.

Las soluciones binarias agua-sal tienden a formar eutécticos pero las mezclas ternarias de dos sales (por ej., mezcla de fosfatos) y agua generalmente vitrifican.

La formación de eutécticos parciales puede estar entonces acompañada de importantes cambios de pH.

Formación de vidrio y separación de fases eutéctica en soluciones de sal

Sal Tg’ Te

NaCl.2H2O <-60 -21.7

NaHCO3 -52 -4

Tris base -55 -4

Glicina -70 -4

β-Ala -65 -14

CaCl2 -95 -52

NaCit -41 --

KCit -62 --

NaAc -64 --

KAc -76 --

Influencia de la velocidad de congelación sobre la morfología de los cristales en la muestra congelada

Lento

Rápido

hielo Sólidos en la matriz no congelada

Posibles estrategias para evitar daños por hielo.

1.Vitrificación (N líquido o solutos agregados) 2. Aumento de la velocidad de nucleación extracelular INAs 3. Inhibición del crecimiento de cristales AFP

Son lipoproteínas de cerca de 30 kD que reducen el grado de sobreenfriamiento. Proveen estructuras parecidas al hielo que sirven de molde.

Ice nucleating Agents (INAs)

Termogramas de agua pura y agua con agentes nucleantes (AgI o bacterias).

Colorado potato beetle

Ice nucleating bacteria from insects (Pseudomona syringae and Erwinia herbicola)

Muchos sistemas biológicos promueven nucleación heterogénea por medio de agentes nucleantes de hielo (INAs). Estos agentes nuclean hielo entre las células. Pueden reducir el sobreenfriamiento hasta 1°C. INAs adaptativos: son generalmente proteínas con PM hasta 30000. Los aminoácidos se encuentran ordenados de tal forma que forman un molde para el hielo. Se forma una capa de hielo en la superficie de los INAs. Sin embargo, esto no llevará al crecimiento de cristales si no alcanzan un tamaño mayor que r*

Agentes nucleantes de hielo

Proteinas anticongelantes AFP

En condiciones de baja temperatura muchas plantas producen crioprotectores coligativos, como prolina o sacarosa.

En otras, ocurren cambios en proteínas y lípidos de membranas.

Unas pocas plantas son capaces de producir AFP que las protegen de los efectos negativos de la congelación.

AFP

Se identificaron en peces antárticos pero luego se encontraron en microorganismos, insectos, plantas y nematodos.

(2,600 - 33,000 Daltons)

Actúan evitando el crecimiento de los cristales de hielo (bajo efecto sobre propiedades coligativas). Antarctic Notothenoid

Mecanismo

Las AFP inhiben el crecimiento de hielo por adsorción-inhibición. Se adsorben específicamente a los planos de crecimiento de hielo evitando la propagación. Se comportan como “agentes inhibidores de hielo estructurales”

Hexagonal ice grown in aqueous solution

(flat disc)

Ice crystal grown in AFP solution

(bipyramidal)

Type III antifreeze protein (AFP) linked through its N-terminus to the C-terminus of green fluorescence protein (GFP).

ice-binding site

Pertaya et al., 2007

AFP-GFP on the surface of ice crystals

Pertaya et al., 2007 J Phys: Cond Matter

INAs Sobre-enfriamiento Tn

Costos de energía

Tiempo de congelación

Tamaño de los cristales

Caracterización de los efectos

Caracterización de los efectos

AFPs Sobre-enfriamiento temperatura de congelación

Inhiben crecimiento de los cristales, modifican la morfología del hielo

Tamaño de los cristales,

Rat

e

Temperature

INAS Overall crystallization

Tg Tm

Rat

e

Temperature

AFP Overall crystallization

Tg Tm

Rat

e

Temperature

AFP INAS

Overall crystallization

Tg Tm

Tem

pera

ture

W 0.25 0.5 0.75 1

2

4

150

100

50

0

-50

-100

-150

0

Control cinético de la cristalización de solutos

y agua

Modificación de los diagramas de estado por cambios en la formulación