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TEMA 5.7. Regulación de la expresión génica
1. CONCEPTO. 2. CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN PROCARIOTAS 2.1. Operones. El operón de la lactosa 2.2. La represión catabólica. La proteína CAP (CRP) 3. CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN EUCARIOTAS 3.1. Eucariotas versus Procariotas 3.2. Estructura de la cromatina 3.3. Eucromatina-Heterocromatina 3.4. Metilación del DNA 3.5. Acetilación de histonas 3.5 Los factores de transcripción 3.6. Dominios de unión al DNA de proteínas reguladoras 3.7. Regulada por señales inter e intracelulares 3.8. Represión traduccional 3.9. Silenciamiento postranscripcional de los genes por interferencia del RNA
La expresión génica es el proceso que abarca desde la transcripción de un gen a mRNA, el procesamiento de ese mRNA y su traducción a proteína
Las cels procariotas (reacc. al medio) y eucariotas pluricel (reacc. a hormonas, factores crecimiento,…) reaccionan a los estímulos* En org pluricel multitud de tipos celulares con el mismo DNA, pero notables diferencias morfo y fisiológicas Resultado de diferencias en la expresión génica
Inducción y represión
El primer y más importante control de la actividad de los genes tiene lugar a nivel del inicio de la transcripción Interacción entre proteínas y DNA (en secuencias, sitios de unión, específicos) Señales del entorno pueden modificar estas interacc y provocar cambios en la expresión génica
Expresión génica constitutiva: Los genes de los productos que se requieren en todo momento (genes constitutivos) son de expresión constante Los niveles celulares de otros genes aumentan y disminuyen en respuesta a señales moleculares: Expresión génica regulada (GENES INDUCIBLES)
RNApol se unen al DNA e inician transcripción en promotores. Promotores: su secuencia de nucleótidos varía e influye en afinidad unión RNApol (factor 1000)
En genes inducibles la tasa de inicio de la transcripción está regulada por la secuencia del promotor, pero además es modulada por proteínas reguladoras potencian o interfieren en la interacc entre RNApol y promotor Activadores, represores y factores de especificidad (subU σ RNApol) impiden el acceso Potencian interacción
Secuencia consenso de muchos promotores de E coli
El inicio de la transcripción está regulado por proteínas que se unen a los promotores o cerca de ellos
Sustitución de σ70 por σ32 cuando bacterias sometidas a estrés por calor RNApol se dirige entonces a promotores especializados con sec consenso ≠
Algunos incluyen fact transcripcionales como las prot de unión a TATA
En procariotas sitios de unión de represores al DNA: operadores Generalmente cercanos al promotor Unión RNApol o movimiento a lo largo del DNA bloqueado con represor presente Regulación negativa
La unión del represor al DNA se regula por un efector (molécula pequeña que une al represor y provoca cambio conformacional: ↑ o ↓ transcripción) En cels eucariota Regulación positiva: por activadores. Sitios de unión a menudo adyacentes a promotores a los que la RNApol no se une por si sola o débilmente También modulable por efector
En cels eucar. potenciadores también pueden estar distante del promotor Molécula señal o efector puede producir disociación del activador o ser necesario para su unión al DNA
EFECTOR
REPRESOR
ACTIVADOR
1. Control de la expresión génica en procariotas 2. Control de la expresión génica en eucariotas
TEMA 12. Regulación de la expresión génica
La mayoría de los genes procarióticos están agrupados y se regulan en operones
Mayoría de los mRNA procar son policistrónicos: promotor único Grupo de genes + promotor + secuencias adicionales (reguladoras) = operón Jacob y Monod (1960) introdujeron estos conceptos operón y operador en estudio del metabolismo de la lactosa (en ausencia glucosa puede ser única fuente de carbono) por E coli Gen regulador (i) codifica proteína represora que se une al centro operador (impidiendo transcripción genes estructurales)
Estructura general de un operón
Estructura del operón de la lactosa
Elementos del modelo: -gen regulador (i) -centro operador (secuencia reguladora del DNA) -genes estructurales
pi
El operón de la lactosa
E. coli depende de Glucosa como fuente de energía, pero en su ausencia puede procesar Lactosa
En condiciones normales sólo unas pocas moléculas (~10) de β-galactosidasa Tras activación miles
Transporte lactosa a través membrana
Detoxificación otros compuestos transportados por permeasa
Regulación del operón de la lactosa REGULACIÓN NEGATIVA
Secuencia nucleótidos operador lac repetición invertida casi perfecta (simetría rotacional binaria en DNA)
Lo que se corresponde con simetría en prot. represora
UNIDAD FUNCIONAL Dímero represor lac unido al DNA (puede formar tetrámeros)
En ausencia de lactosa el represor lac se une rápida e intensamente al operador impidiendo avance de la RNApol
2 lugares secuencia ~operador Unión cooperativa dímeros represor de interacción
con DNA
en formación dímeros y tetrámeros
Interacciones represor lac-DNA
El represor lac (DIMEROS N-terminal) unido al DNA mediante inserción de α-hélice (del motivo hélice-giro-hélice) en el surco mayor DNA y contactos con pares de bases y esqueleto fosfodiester (resíduo Arg forma puentes hidrógeno con resíduo G)
La unión de ligandos puede provocar cambios conformacionales en proteínas reguladoras
Cuando el represor lac se encuentra unido al inductor (alolactosa*) la afinidad del represor hacia el DNA del operador disminuye enormemente
El inductor (alolactosa o IPTG) se une al centro del dominio grande de cada monómero del represor
Otras muchas redes de regulación génica de E.coli y otras muchas bacterias funcionan de manera análoga a la del operón lac
* alolactosa:producto colateral de la reacción de la β-galactosidasa *IPTG: análogo sintético
Activación de la transcripción por la proteína CAP (o CRP) REGULACIÓN POSITIVA
En procariotas también hay proteínas que se unen al DNA y estimulan transcripción
CAP (catobolite activator protein) o CRP (prot de respuesta al cAMP) Estimula transcipción genes que catabolizan lactosa y arabinosa En operón lac CAP se une a repetición invertida (posic -61) SIMETRÍA BINARIA CAP actúa como un dímero Complejo CAP-cAMP estimula transcripción 50 veces Incorporación RNApol a promotores con CAP favorecida
El dímero de CAP unido al DNA
La superficie que se une al DNA está formada por un par de α-hélices separadas por un giro rígido motivo hélice-giro-hélice común a familia represor lac y otras muchas proteínas (no todas, ej. Represor metionina de E coli)
En condiciones normales uso glucosa: El efecto inhibidor de la glucosa, represión por catabolito, se debe a la capacidad de la glucosa para disminuir la concentración de cAMP en el interior de la cel
Operon lac con expresión génica máxima cuando no hay glucosa, 1) la alolactosa elimina la inhibición del represor lac 2) el complejo cAMP-CAP estimula la unión de la RNApol
1. Control de la expresión génica en procariotas 2. Control de la expresión génica en eucariotas
TEMA 12. Regulación de la expresión génica
Mayor complejidad de los genomas eucarióticos mecanismo de regulación génica más complejos
Eucariota vs Procariota
-Genoma más grande (varios cromosomas) -Diversidad de tipos celulares (diferencias drásticas en la expresión de genes) -Genes no agrupados en operones (genes que codifican prot para distintas etapas de una vía están desperdigados por el genoma) -Factores transcripcionales forman grandes complejos -Transcripción y traducción no acopladas -DNA asociado a histonas: cromatina
NUCLEOSOMAS: complejos de histonas unidos al DNA
Possible Points of Eukaryotic Gene Regulation
COMPARTIMENTALIZACIÓNseparación transcripción y traducción que hacen el proceso más complejo
Eucromatina-Heterocromatina
El acceso a los promotores eucar está restringido por la estruct de la cromatina Activación de la transcripción asociada con múltiples cambios estruct cromatina en la región transcrita El estado transcripcional basal es restrictivo por lo que predomina la regulación positiva: genes eucariotas requieren activación para ser transcritos Heterocromatina: transcripcionalmente inactiva (más condensada) Eucromatina: cromatina menos condensada, pero no toda en estado transcripcionalmente activo (sensibilidad DNAasa I)
Muchos sitios hipersensibles (a DNAasa I) corresponden a sitios de unión de proteínas reguladoras y la relativa ausencia de nucleosomas (o conformación alterada) en estas regiones puede permitir la unión de estas prot.
Metilación del DNA
Acetilación de histonas y desplazamiento nucleosomas
Para inhibición de genes inadecuados en determinados tipos cel Islas CPG: regiones de DNA que conforman ~ 40% promotores de los genes de mamíferos (regiones de gran concentración de pares de C y G enlazados por fosfatos) ~70% secuencias CPG están metiladas en posición C-5 de la citosina (metiltransferasas específicas). La distribución de estas citosinas metiladas varía según tipo cel En la mayoría de los casos, los sitios CPG están desmetilados si los genes están expresados
Dominios N-terminales de las histonas internas son ricos en Lys Allí donde la cromatina está siendo activada para la transcripción las histonas del nucleosoma se acetilan (por histonas acetiltransferasas nucleares).
MODIFICACIÓN DNA POR:
*Acetilación múltiples residuos de Lys de histonas H3 y H4 puede reducir afinidad nucleosoma por DNA *Acetilación también puede impedir o promover interacción con otras proteínas implicadas en la transcripción o en su regulación
También metilación, fosforilación y ubiquitinación
Formación del complejo de transcripción de la RNApol II
Regulación positiva por necesario empaquetamiento DNA (más eficiente) Aunque tb ej de regulación negativa Al aumentar el tamaño del genoma se debe mejorar la especificidad: necesidad complejos prot reguladoras
Mayoría promotores de la RNApol II incluyen la caja TATA y la sec Inr (iniciador), y sec. adicionales que varían en número y localización : potenciadores (Enhancers que pueden encontrarse a centenares o miles pb, incluso aguas abajo) *Enhancer en levaduras se llaman UAS generalmente aguas arriba y próximos
Se requiere participación de: factores de transcripción basales o generales, transactivadores (unión a los potenciadores) y coactivadores (no se unen al DNA, sino comunicación entre transactivadores y el complejo de la RNApol II y los factores de transcripción)
Primer componente complejo pre-inicio es la ‘prot de unión a TATA’ o TBP; compuesta por fact transcripción TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIA (tal vez) y RNApol II. NO es suficiente para inicio transcripción
*
Regulación negativa menos frecuente, en la que algunas prot reguladoras que se unen a promotores RNApol II pueden actuar como represores inhibiendo la formación de complejos de pre-inicio activos
Pueden funcionar a distancia (HMG) Algunos transactivadores facilitan transcripción centenares promotores, otros de sólo unos pocos Contienen dominio estructural para la unión al DNA y otro/s para la activación de la transcripción o interacc con prot reguladoras
Coctivadores: TFIID, formado por TBP y TAF (factores asociados a TBP): TAF son parecidas a histonas y pueden desplazar el nucleosoma durante la transcripción como Mediador (complejo de 20 o más polipéptidos) se unen a C-terminal subU grande RNApol II Funcionan en la proximidad caja TATA
Formación “lazo” facilitada por proteínas HMG (proteínas no histonas de alta movilidad)
Genes del metabolismo de la galactosa en levaduras
Genes para enzimas metabolismo galactosa (GAL) en varios cromosomas, transcriben por separado pero promotores (~) regulados de forma coordinada
Secuencia del proceso: los complejos se ensamblan secuencialmente, primero transactivador (Gal4p), de afinidad alta promueve unión de otros complejos, después lo hacen los complejos proteicos adicionales (como SWI/SNF, GCN5-ADA2-ADA3 y mediador) necesarios para remodelar la cromatina y permitir que comience la transcripción
Promotores con TATA, Ins y UASG reconocida por activador Gal4p
Dominios de unión al DNA de proteínas reguladoras Incluyen pequeños motivos estructurales reconocibles y característicos, permiten la discriminación entre pares de bases (las distinguen) estableciendo enlace por puente de hidrógeno con los grupos funcionales expuestos en el surco mayor. Principales: motivos hélice-giro-hélice (procariota) y dedo de zinc (muchas prot eucariotas)
Visto en el represor lac. También localizado en algunas proteínas reguladoras eucariotas ~20 aa en 2 segmentos α-hélice cortos, separados por un giro β. Uno de los segmentos α-helicoidales, el llamado de reconocimiento, interacciona con el DNA con especificidad de secuencia (se sitúa casi dentro del surco mayor)
~ 30 aa formando un lazo alargado sujeto por su base por único ión Zn2+, coordinado con 4 enlaces (4 Cys o 2 Cys y 2 His). Zinc no interacciona con DNA, sino que estabiliza el motivo estructural La interacción de un único dedo de zinc es débil y muchas proteínas que se unen al DNA contienen múltiples dedos de zinc (muy pocos casos en procariotas)
Estructura de dedos de zinc
Ej. Receptores hormonas esteroideas: prot con un sitio de unión para la hormona, un dominio de unión al DNA y una región que activa la transcripción del gen regulado
El dominio de unión al DNA (altamente conservado) con dos dedos de zinc
Interacción prot-prot entre proteínas reguladoras
La interacc entre 2 proteínas reguladoras tiene lugar a menudo a través de dominios que contienen cremalleras de leucina o motivos hélice-lazo-hélice
Región de la cremallera
Hélice α con residuos de aa hidrofóbicos concentrados en un lado, y con la superficie hidrofóbica como área de contacto entre los 2 polipéptidos de un dímero. Residuos de Leu en cada séptima posición formando una línea recta e interaccionando entre sí. Las 2 hélices se enrollan una en torno a la otra formando una hélice suavemente superenrollada
La cremallera de leucina no interaccionan directamente con el DNA
Comparten una región de unos 50 aa importantes tanto en la unión al DNA como en la dimerización de la proteína. Esta región forma 2 hélices α anfipáticas cortas unidas por un lazo de longitud variable: hélice-lazo-hélice que interaccionan para formar dímeros. Las hélices no están implicada en la unión al DNA
No confundir con motivo hélice-giro-hélice implicado en unión al DNA
DNA
DNA
La expresión génica eucar. puede ser regulada por señales inter e intracelulares: receptores hormonales nucleares
Hormonas esteroideas (muy hidrofóbicas; estrógenos, progesterona, cortisol) tras atravesar membrana (difusión) se une a su prot receptora específica en el núcleo y es el complejo hormona-receptor el que se une a secuencias muy específicas de DNA, elementos de respuesta hormonal (HRE), alterando la expresión génica (puede potenciar o inhibir la expresión de genes adyacentes) Unión (interacc) hormona-receptor →cambios conformacionales en prot receptoras que influyen es su capacidad de interacción con factores transcripcionales adicionales
Capacidad de una hormona alterar expresión gen específico (a traves complejo Recep-Ho) depende sec HRE, posición y número
Receptores hormonales tienen dominio de unión al DNA altamente conservado con dos dedos de zinc. La región de unión al ligando (extremo C-terminal) bastante específica para cada receptor (grandes diferencias en tamaño para cada caso)
Sec DNA HRE son ~ en longitud y estructura, pero # en secuencia. Cada receptor tiene una HRE consenso Dos sec consenso de 6 nucleótidos contiguos separados por 3 nucleótidos en tandem o palíndromo
La fosforilación de factores de transcripción puede contribuir a su regulación
Vía β-adrenérgica produce un aumento en los niveles de cAMP celulares. El cAMP se une a la subU reguladora de la PKA (protein quinasa A), activándola. subU de PKA liberada penetra en el núcleo y fosforila a la proteína nuclear de unión al elemento de respuesta al cAMP (CREB). Una vez fosforilada CREB se une a ciertas secuencias de DNA denominadas de respuesta al cAMP (CRE) y actúa como factor de transcripción, activando la expresión de los genes cercanos
CREB
Muchos mRNA eucarióticos está sometidos a represión traduccional
Transcritos generados en núcleo son modificados y transportados al citoplasma →retraso aparición prot
En algunas circunstancias (ej. genes eucar muy largos) para tener un incremento rápido en la producc de una prot, un mRNA reprimido traduccionalmente ya presente en citoplasma puede ser activado para su traducción sin retraso. También en cels anucleadas (reticulocitos) donde el control transcripcional es inasequible (control traduccional mRNA almacenados) Mecanismos:
1. Fosforilación de los factores de inicio (formas fosforiladas menos activas)
2. Represores traduccionales que se une directamente al mRNA (3’UTR) e interaccionan con otros factores de inicio de la traducc unidos al mRNA o con la subU 40S para impedir inicio traducc
3. Prot de unión que impiden la interacc entre eIF4E y eIF4G, en mamíferos 4E-BP (unión al eIF4E) Con crecimiento cel lento estas prot limitan la traducc, cuando se reanuda crecimiento o en respuesta a factores de crecimiento u otros estímulos se inactivan por fosforilación
Regulación postranscripcional por interferencia del RNA (microRNAs)
En eucariotas superiores (nemátodos, moscas, plantas y mamíferos) se ha descubierto una clase de pequeños RNA (19-25 nucleótidos) (micro-RNA o miRNA) que participan en el regulación génica
Regulan expresión de mRNA post-transcripcionalmente: Interacción con el mRNA, a menudo en animales en 3’UTR (en plantas en reg. codificadora), provocando inhibición traducción y llevan a la degradación del mRNA, silencian el gen
-Un solo microRNA puede regular potencialmente cientos de mRNAs -Un mismo mRNA puede ser regulado por múltiples micro-RNAs Muchos presentes sólo de manera transitoria durante el desarrollo (stRNA). Se han identificado cientos distintos -Controlar desarrollo temporal algunos organismos -mecanismo protecc frente virus (plantas) -controlar actividad transposones -papel en formación heterocromatina
Silenciamiento por micro-RNA
Transcriben como RNA prepulsor ~70 nucleótidos con secuencias complementarias internas en horquilla Los precursores se cortan con endonucleasas (la más conocida Dicer o troceador) para formar duplex de 20-25 nucleótidos. Una de la hebras se asocia con un mRNA diana o RNA virus o transposón…
Aprovechado en el lab como estrategia de RNA de interferencia (iRNA) para silenciar expresión genes
El desarrollo está controlado por cascadas de proteínas reguladoras Los mecanismos de regulación más complejos se encuentran en el desarrollo de un organismo multicelular. El destino de las células de las células en el embrión temprano está determinado por el establecimiento de gradientes antero-posterior y dorso-ventral de las proteínas que actúan como transactivadores de la transcripción o como represores de la traducción (morfógenos: producto de los genes reguladores del patrón), regulando los genes necesarios para el desarrollo de las estructuras apropiadas para una parte determinada del organismo. Los genes reguladores operan coordinadamente en el tiempo y el espacio.
Actúan genes maternos (se expresan en huevo no fecundado y mRNA permanecen latentes hasta fecundación), de segmentación (transcriben después fecundación y dirige la formación del número correcto de segmentos corporales; genes gap, genes de la regla par, genes de la polaridad de los segmentos) y homeóticos (se expresan más tarde, especificando que órganos y apéndices se desarrollan en los distintos segmentos corporales )