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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SINTÉTICOS BIOATIVOS
TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA A
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ,
Matricaria chamomilla LINNÉ, E Passiflora alata CURTIS.
JÚLIA BEATRIZ PEREIRA DE SOUZA
JOÃO PESSOA – PB
2007
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
JÚLIA BEATRIZ PEREIRA DE SOUZA
TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA A
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ, Matricaria
chamomilla LINNÉ, E Passiflora alata CURTIS.
Orientador: Prof. Dr. Rui Oliveira Macêdo
JOÃO PESSOA – PB
2007
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos do Centro de Ciências da
Saúde/Laboratório de Tecnologia Farmacêutica
da Universidade Federal da Paraíba, em
cumprimento às exigências para a obtenção do
título de Doutor em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos. Área de concentração:
Farmacoquímica.
JÚLIA BEATRIZ PEREIRA DE SOUZA
TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA A
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ, Matricaria
chamomilla LINNÉ, E Passiflora alata CURTIS.
Aprovado em 21 de Dezembro de 2007
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr. Rui Oliveira Macêdo
__________________________________________
Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly Moura
__________________________________________
Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão
___________________________________________
Profª. Drª. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz
__________________________________________
Prof. Dr. Celso Amorim Câmara
S731 Souza, Júlia Beatriz Pereira de
Tecnologia analítica baseada na pirólise acoplada a cromatografia
gasosa/espectrometria de massa para caracterização de extratos de
Erythrina mulungu Linné, Matricaria chamomilla Linné, E Passiflora
alata Curtis / Júlia Beatriz Pereira de Souza - João Pessoa, 2007.
126 p. il.
Orientador: Rui Oliveira Macêdo
Tese (Doutorado): UFPB/CCS/LTF
1. Produtos Naturais. 2. Pirólise-Cromatografia gasosa-
Espectrometia de massa. 3. Erythrina mulungu 4. Matricaria
chamomilla. 5. Passiflora alata
UFPB/BC CDU: 547.9 (043)
Este trabalho é dedicado aos meus pais
Magnólia Pereira de Souza e José Anchieta de
Souza, meus primeiros referenciais da verdadeira
sabedoria e inteligência, baseadas nos princípios
de honestidade, trabalho, perseverança,
humildade, educação, esperança, fé e amor.
AGRADECIMENTOS
À Deus, Trindade Santa, eterna sabedoria;
À Virgem Maria, exemplo de fortaleza, perseverança, fé e esperança;
Ao Prof. Dr. Rui Oliveira Macêdo pelo acolhimento, confiança e orientação;
À Universidade Federal da Paraíba, professores, funcionários, prestadores de
serviço, na pessoa de Franscysmary Nogueira e José Jailto, pela atenção e empenho em
proporcionar o bom andamento dos trabalhos experimentais;
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos, na pessoa da Profª Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz, pela
valiosa contribuição na minha formação acadêmica;
Aos então discentes do Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos, em especial, Luciano Augusto de Araújo Ribeiro, pela amizade e
companheirismo;
Aos Colegas da linha de pesquisa em Desenvolvimento e Ensaios de
Medicamentos, Ana Cláudia Dantas de Medeiros, Ana Flávia Oliveira dos Santos,
Antonilêni Duarte Medeiros, Elisana Moura e Hallisson Pires, Fábio Santos Souza,
Francisca Maria Souza, Francinalva Dantas de Medeiros, Fabíola e Pablo, Irinaldo
Diniz Bazílio Jr, João Paulo Guedes, Lidiane Pinto Correia, Rodrigo Molina, Rodrigo
Albuquerque, Louisianny Guerra da Rocha, Márcia Ferraz Pinto, Mônica Oliveira da
Silva Simões, Sayonara Maria Lia Fook Meira Braga, pela força, companheirismo e
amizade;
A Januária Costa dos Santos Lima, pela amizade, apoio, disponibilidade e
colaboração.
Às amigas, Ana Paula Barreto Gomes e Ertha Janine Medeiros Lacerda, pela
presença constante, paciência, apoio e incentivo;
Aos companheiros do Laboratório de Bromatologia, Profª Rita de Cássia
Queiroga, Elieidy, Carlos Eduardo, Renata Lima, pela atenção, apoio e
companheirismo.
A Mônica Tejo, Daniel, Kerly e Ranielly Silveira, irmãos que a vida me deu.
A Inise Machado de Lima e Igor Machado, pela partilha e pela força transmitida
diante dos mais diversos sentimentos durante a concretização desse trabalho.
À família Santa Maria, em especial Ana Goldfarb, Sheylla Lacerda e Adriana
Gomes Magalhães, e cada um dos colegas de trabalho, nas pessoas de Lourdes,
Filomena, Pollyana, Gigliola, Dimitri, Wellington, Joselito, João, Angelo, Simone,
Gilberto Cerqueira, Marly, Cláudia, Sandra, Guttemberg...pelo apoio, companheirismo,
carinho e atenção.
Aos amigos de todas as horas, Katiúscia Barbosa, Samuel, Janaína e Costa, Tia
Carmen, Paulo, Vilma, Davi, Fernanda, Drª. Dalva, José Edson e Maria Hilda, Pe. Rui
Braga, Pe. Eduardo, Pe. Ribamar, D. Epaminondas Araújo..., verdadeiros presentes de
Deus.
À minha família, meus pais Magnólia Pereira de Souza e José Anchieta de
Souza (Juca), meus irmãos, José Anchieta de Souza Jr e Emílio José Pereira de Souza,
meus sobrinhos, Navarro, Ana Beatriz e Lorena Beatriz, Tia Neném (Aparecida) e
Ramos, pelo apoio incentivo e compreensão nos tantos momentos de ausência;
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
“33Como é profunda a riqueza, a sabedoria
e a ciência de Deus! Como são insondáveis Suas
decisões, e como são impenetráveis Seus caminhos!
36Porque todas as coisas vêm dEle, por meio dEle e
vão para Ele. A Ele pertence a glória para sempre.
Amém.”.
Paulo de Tarso
Carta aos romanos, capítulo XI.
(Século – I, d.C)
i
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................... iii LISTA DE QUADROS ......................................................................................... v LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ............................................................. vi RESUMO ............................................................................................................... vii ABSTRACT ........................................................................................................... viii 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1
CAPÍTULO I
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Plantas com Atividade Ansiolítica .............................................................. 3
2.1.1. Erythrina mulungu Linné................................................................... 5
2.1.2. Matricaria chamomilla Linné ........................................................... 7
2.1.3. Passiflora alata Curtis ....................................................................... 8
2.2. Fitoterapia .................................................................................................... 10
2.3. Legislação para Fitoterápicos ...................................................................... 14
2.4. Desenvolvimento Tecnológico e Produção de Fitoterápicos ....................... 14
2.4.1. Soluções Extrativas e Extratos Secos por Nebulização .................... 16
2.4.2. Processo de secagem por Nebulização ............................................. 18
2.4.2.1. Fases do Sistema ................................................................... 19
2.4.2.2. Aplicação da técnica de Nebulização ................................... 22
2.5. A Qualidade dos Fitoterápicos .................................................................... 25
2.6. Métodos Analíticos ...................................................................................... 27
2.7. Técnicas Analíticas ...................................................................................... 30
2.7.1. Pirólise .......... .................................................................................... 30
2.7.2. Pirólise Acoplada à Cromatografia Gasosa Capilar e Espectrometria
de Massa (Pir-GC/MS) ............................................................................................. 35
2.7.3 Cromatografia ..................................................................................... 36
2.7.4. Cromatografia Gasosa (CG) .............................................................. 37
2.7.5. Espectrometria de Massas ................................................................ 40
OBJETIVOS ............................................................................................................ 43
3. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 44
ii
CAPÍTULO II
“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A
PARTIR DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ SECOS POR
NEBULIZAÇÃO.”.........................................................................................
55
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 75
CAPÍTULO III
“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A
PARTIR DE EXTRATOS DE Matricaria chamomilla LINNÉ SECOS POR
NEBULIZAÇÃO”..................................................................................................... 80
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 96
CAPÍTULO IV
“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A
PARTIR DE EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS SECOS POR
NEBULIZAÇÃO.”..........................................................................................
99
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 124
iii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 01 - Erythrina mulungu Linné....................................................................... 5 Figura 02 - Matricaria chamomilla Linné ............................................................... 7 Figura 03 - Passiflora alata Curtis .......................................................................... 9 Figura 04 - Sistema de Secagem por Spray-Drier de Soluções Extrativas Vegetais 18 Figura 05 - Pirolizador de microforno ..................................................................... 33 Figura 06 – Pirolizador de Ponto de Curie ............................................................... 34 Figura 07 - Pirolizador de Filamento ....................................................................... 35
Figura 08 - Diagrama esquemático de um cromatógrafo a gás ............................... 38
Figura 09 - Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas de
triploquadrupolo (Quatro LC, Waters/Micromass) .............................
42
CAPÍTULO II
Figura 01 - Alcalóides isolados de Erythrina mulungu Linné ................................. 57
Figura 02 - Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das folhas de
Erythrina mulungu Linné na faixa de temperatura de 350 a 750°C....
67
CAPÍTULO III
Figura 01 – Alguns constituintes químicos isolados de M. chamomilla Linné ....... 81
Figura 02 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das flores de
Matricaria chamomilla Linné na faixa de temperatura de 350 a
650°C ................................................................................................... 89
CAPÍTULO IV
Figura 01 - Flavonóides isolados de Passiflora alata Curtis ................................... 100
Figura 02 - Saponinas de Passiflora alata Curtis: quadrangulosídeo e ácido 3-
soforosil oleanóico ...............................................................................
101 Figura 03 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das folhas de
Passiflora alata Curtis na faixa de temperatura de 450 a 750°C. ..... 115
iv
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO I
Quadro 01 - Classificação Sistemática de Erythrina mulungu Linné .................. 06
Quadro 02 - Classificação Sistemática de Matricaria chamomilla Linné ............ 08
Quadro 03 - Classificação Sistemática de Passiflora alata Curtis ....................... 10
CAPÍTULO II
Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de
Erythrina mulungu Linné obtido por CG/EM acoplado ao
pirolisador em uma faixa de temperatura de 350 a 750°C, com o
auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey..................................... 61
CAPÍTULO III
Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de
Matricaria chamomilla Linné obtido por CG/EM acoplado ao
pirolisador em uma faixa de temperatura de 350 a 650°C, com o
auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey.....................................
85
CAPÍTULO IV
Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de
Passiflora alata Curtis obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador
em uma faixa de temperatura de 450 a 750°C, com o auxílio da
Biblioteca de Espectros da Willey...................................................... 104
v
LISTA DE ABREVIAÇÕES
µµµµL: microlitro ANVISA: Agencia Nacional de Vigilância Sanitária CG/EM: Cromatografia à gás acoplada à espectrometria de massas CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência E. mulungu: Erythrina mulungu
FID: Detector de Ionização por Chama M. chamomilla: Matricaria chamomilla
m/z: Razão massa/carga mL: mililitro mm: milímetro P. alata: Passiflora alata
Pir-CG/EM: Pirólise Acoplada à Cromatografia Gasosa Capilar e Espectrometria de Massa RDC: Resolução da Diretoria Colegiada SNC: Sistema Nervoso Central µm: micrômetro
vi
SOUZA, J.B.P. de - TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE
ACOPLADA A CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE
MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu
LINNÉ, Matricaria chamomilla LINNÉ, E Passiflora alata CURTIS.
Tese de Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos – CCS/LTF/UFPB. (2007) João Pessoa – PB.
RESUMO
A caracterização de extratos secos vegetais nebulizados empregados na produção de fitoterápicos é uma necessidade para a garantia da qualidade do produto final a ser obtido a partir desse produto intermediário. Essa caracterização deve ser rápida, eficiente, permitindo a identificação do maior número de constituintes possível, respeitando a característica de fitocomplexo do material vegetal. O presente trabalho explorou a caracterização de extratos secos neulizados de Erythrina mulungu Linné, Matricaria chamomilla Linné e Passiflora alata Curtis, três plantas farmacologicamente caracterizadas pela atividade sobre o Sistema Nervoso Central e encontradas no mercado em preparações farmacêuticas como calmantes, indutoras do sono entre outras indicações. O presente estudo baseou-se na tecnologia analítica da pirólise acoplada à cromatografia gasosa/espectrometria de massa (Pir-CG/EM) para a obtenção de um perfil pirolítico composto pelos produtos de decomposição obtidos por pirólise, separados por cromatografia gasosa e identificados por espectrometris de massa com auxílio da Biblioteca Espectral Willey. Os extratos secos foram obtidos a partir de soluções extrativas hidroalcoólicas variando de 10 a 90 % adicionados de 10 % de dióxido de silício coloidal em um nebulizador (Spray-Drier). Foram analisados em uma faixa de temperatura de 350 – 750 °C, possibilitando a caracterização constando de 166 compostos químicos obtidos dos extratos secos nebulizados de Erythrina mulungu
Linné, 80 de Matricaria chamomilla Linné e 235 de Passiflora alata.
vii
SOUZA, J.B.P. de – Analytical Tecnology Based on Pyrolisis coupled Gas
Chromatografy/Mass Spectrometry for Erythrina mulungu LINNÉ, Matricaria
chamomilla LINNÉ, E Passiflora alata CURTIS Extracts Characterization.
Tese de Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos – CCS/LTF/UFPB. (2007) João Pessoa – PB.
ABSTRACT
The spray-dried plants extracts characterization employed in the production of phytotherapeutic is a need for ensuring the quality of the final product to be derived from this product intermediary. This characterization has been fast, efficient, allowing the identification of the largest number of constituents possible, respecting the characteristic of phytocomplex of plant material. The present work explored the characterization of spray-dried extracts of Erythrina mulungu Linné, Matricaria chamomilla Linné and Passiflora alata Curtis, three plants characterized pharmacologically by the central nervous system activity and found on the market in pharmaceutical preparations as tranquillizers, inducing sleep among other indications. This present study was based on analysis of the pyrolysis technology coupled with gas chromatography-mass spectrometry (Pyr-GC/MS) for a pyrolytic profile composed of decomposition products obtained by pyrolysis, separated by gas chromatography and identified by mass spectrometry with the help of Spectral Library Willey. The dried extracts were obtained from extractive solutions hydroalchoolics ranging from 10 to 90% with the addition of 10% of colloidal silic dioxide in a nebulizer (Spray - Drier). They were examined in a temperature range of 350-750 °C of the spray-dried extracts, showing the characterization with 166 chemical compounds of Erythrina mulungu Linné, 80 of Matricaria chamomilla Linné and 235, Passiflora alata extracts.
1
1. Introdução
A crescente procura por medicamentos fitoterápicos tem despertado o interesse
da indústria farmacêutica e a preocupação dos órgãos reguladores da saúde, com
eficácia a segurança e a qualidade desses produtos. Na visão atual o produto fitoterápico
é um medicamento tecnicamente elaborado através de processos tecnologicamente
adequados.
Segundo a legislação vigente (RDC 48/2004/ANVISA), essa definição deixa
entrever que a transformação de uma planta em medicamento deve ter como objetivo a
preservação da integridade química e farmacológica de vegetal, garantindo a constância
de sua ação biológica e a segurança de utilização, além de proporcionar sua
administração que atenda as necessidades de dosagem adequadas à atuação terapêutica.
Para tanto, a produção de fitoterápicos pressupõe a realização de estudos de
desenvolvimento e o estabelecimento dos procedimentos e etapas adequadas de
processamento, objetivando a produção de produtos farmacêuticos adequados, de
acordo com os conceitos atuais de qualidade para o cumprimento de requisitos pré-
estabelecidos que conduzam à sua total adequabilidade ao fim a que se destinam.
Para que a qualidade desses produtos seja garantida, são necessários métodos
analíticos capazes de avaliar a integridade da composição desde as matérias-primas,
produtos intermediários até o produto acabado. Atualmente, a escolha de métodos
analíticos baseia-se, inicialmente, na escolha de marcadores, substâncias ou grupo de
substâncias, preferencialmente responsáveis pela ação farmacológica. Com o
entendimento do fitoterápico como fitocomplexo, a tendência no campo das
metodologias analíticas, é o desenvolvimento de métodos capazes de fornecer uma
avaliação mais abrangente da composição do produto, de forma a se aproximar ao
máximo da composição que melhor refletiria a ação terapêutica do produto. Essa é a
proposta da utilização da pirólise acoplada à cromatografia gasosa/espectrometria de
massas para a caracterização dos extratos secos de Erythrina mulungu, Matricaria
chamomilla e Passiflora alata, matérias-primas utilizadas na produção de diversas
formulações comerciais utilizadas no tratamento de transtornos do sistema nervoso
central.
Capítulo I
3
2. Revisão da Literatura
2.1. Plantas com atividade ansiolítica
Há uma tendência mundial do uso de plantas em preparações de origem vegetal
como recurso terapêutico influenciado por fatores culturais, econômicos e sociais.
Atualmente, existem vários fitoterápicos industrializados contendo material vegetal
individual ou em associações com indicações para insônia, stress e ansiedade. No nosso
trabalho, foi utilizado material de três espécies vegetais utilizadas em preparações
fitoterápicas industriais, cujos estudos anteriores apontam para comprovação de suas
atividades biológicas sobre o sistema nervoso central.
A despeito dos grandes avanços no campo da terapêutica médica, os estudos
realizados pelo Instituto Nacional de Saúde Mental dos Estados Unidos (National
Institute of Mental Health, Betesda, USA – NIMH), revelaram um alarmante aumento
das desordens do Sistema Nervoso Central (SNC) ralatadas, sendo a ansiedade e a
insônia, as duas principais. (MURRAY e LOPEZ, 2001; NIMH, 2001). Um dado do
NIMH relata a ansiedade irá acometer sete de cada dez indivíduos, por volta do ano
2.020, somente nos Estados Unidos. Também os países em desenvolvimento, 4/5 da
população mundial, irá passar por uma dramática mudança nas necessidades de
cuidados com a saúde da população, como as desordens relacionadas à ansiedade
ultrapassarão seus tradicionais inimigos, as doenças infecciosas (CHERR, 1999; ZAL,
2000).
Ansiedade é uma das desordens mentais mais comuns que afetam a espécie
humana. Sua prevalência têm aumentado nos últimos anos, devido ao tenso estilo de
vida imposto aos homens pela atmosfera competitiva e desumana impregnada no dia-a-
dia. (DHAWAN et al., 2001).
Durante as últimas duas décadas, a farmacoterapia com drogas psicoativas foi
reconhecida como sendo a mais eficaz para o controle da ansiedade, do estresse e dos
distúrbios do sono. Entretanto, o uso prolongado das drogas psicotrópicas conduz a uma
variedade de efeitos colaterais autonômicos, endócrinos, alérgicos, hematopoiéticos e
neurológicos. Além disso, tais agentes aliviam primeiramente os sintomas e oferecem
um efeito paliativo de uma natureza provisória. (HANDA, 1995).
Substâncias ansiolíticas, principalmente o grupo dos benzodiazepínicos ocupam
um notável posto entre as drogas mais utilizadas pelo homem (UHLEMHUNT et al.,
4
1999, HIGGINS et al, 2000). As principais razões apontadas para a prescrição foram:
insônia, depressão, ansiedade, queixas somáticas, sintomas de dor e sintomas de estresse
(LUDERER 1995, MANT 1996, ARGYROPOULOS e NUTT, 1999).
Contudo, as drogas ansiolíticas têm uma razão risco/benefício desfavorável, pois
produzem aminésia, dependência, síndrome de abstinência, reações paradoxais em
humanos e diminuição das funções psicomotoras (LADER and MORTON, 1991; KAN
et al.,1997; SCHWEIZER and RICKELS, 1998). Estes sintomas podem levar ao
aumento da possibilidade de acidentes automobilísticos e de fraturas (BARBONE, et
al.,1998; PIERFITTE et al., 2001).
Também, foi observado que fatores como idade acima de 45 anos, consumo por
período maior que um ano, a farmacologia da droga, fatores intrínsecos ao paciente,
distúrbios de personalidade, insônia crônica, doenças crônicas, histórico prévio de
dependência a substâncias estão associados à dependência a essas drogas e à síndrome
de retirada. (SONAVANE et al., 2002).
Como a presença dos fatores etiológicos responsáveis pela ansiedade e tensão
não têm expectativa de diminuição, há uma necessidade e um interesse grande na busca
para agentes novos e outras terapias com menor potencial para indução de reações
adversas (CARLINI, 2003).
As pessoas, em geral, em busca de segurança, economia e eficácia no tratamento
da ansiedade, tensão e estresse, estão começando a escolher produtos fitoterápicos e
outras alternativas de tratamento (NEWELL et al., 1996). Com essa visão, várias
plantas têm um grande campo na exploração clínica (DHAWAN, et al., 2004).
Desde tempos antigos algumas plantas têm sido utilizadas com tais propósitos.
Hoje o uso desses extratos está ganhando aceitação de médicos e pacientes. Embora
para a maioria das plantas, os dados químicos e farmacológicos sejam ainda
incompletos e seus princípios ativos ainda não identificados. (CARLINI, 2003).
As terapias com plantas medicinais podem ser consideradas como medicinas
alternativas ou complementares e a busca de plantas medicinais para doenças
psiquiátricas progrediu significativamente na década passada (ZHANG, 2004). Isto é
refletido no largo número de ervas medicinas cujo potencial psicoterapêutico foi
avaliado em uma variedade dos modelos animais.
Esses estudos fornecem suporte para o desenvolvimento de medicamentos
fitoterápicos, levando à necessidade de estudos e desenvolvimento de métodos de
controle da qualidade. Uma vez que o consumo de medicamentos com base em plantas
5
medicinais apresenta várias dificuldades, que vão desde a identificação correta do
material botânico utilizado, à inexistência de estudos de segurança, eficácia e qualidade
de grande parte das plantas utilizadas (ROCHA, 2004).
Entre tais plantas, Erythrina mulungu, Matricaria chamomilla e Passiflora
alata, já são encontradas no mercado em preparações farmacêuticas, merecendo
especial atenção.
2.1.1. Erythrina mulungu Linné
“Dizer que alguém merece chá de mulungu é publicidade bastante em
diagnóstico psicopático. Na sombra do mulungu não brincam crianças e sim meninos
já taludos. A penumbra da árvore enfraquece, debilita, esgota. Por isso tranqüiliza os
candidatos sôfregos da insanidade.”
Luís da Câmara Cascudo (l97l).
Figura 01: Erythrina mulungu Linné, destaque da árvore em período de floração e
detalhes das folhas.
Fonte. http://www.pl.barc.usda.gov/usda_plant/plant_detail_a.cfm?plant_id=211
http://www.dierbergertropicais.com.br/luisbacher/albuns/arvores/pages/Eugenia%20mul
ungu_jpg.htm
Erythrina mulungu Linné é árvore de porte médio, casca avermelhado fulva,
grossa e sulcada, ramos expandindo-se em copa ampla, com espinhos triangulares,
6
compressos, fulvas; folhas largamente pecioladas, trifolioladas; folíolos largos,
rombóides; racemos laterais, recurvos, com mais ou menos 30 cm de comprimento;
pedúnculo, arredondado, quando novo com pêlos tenuíssimos; pedicelos ternados,
glabros vermelhos, com 4 cm de comprimento; cálice largo, truncado; flores vermelhas,
estandarte amplo, recurvo, com 4-5 cm de comprimento, corena lanceolada, falciforme,
asas minúsculas, ovário piloso (CORRÊA, 1984).
Árvore eminentemente ornamental, presta-se para arborização de jardins e
parques. Na época de floração (junho-agosto) perde quase totalmente as folhas,
cobrindo-se de flores intesamente rubras. É planta calmante das tosses nervosas,
provocadora do sono e útil nas doenças do fígado. A madeira fornece quando seca,
68,16 % de fibras, sendo, pois, de alta importância para a indústria do papel (CORRÊA,
1984).
Quadro 01 - Classificação Sistemática de Erythrina mulungu Linné
Classificação Científica
Reino Plantae
Divisão Magnoliophyta
Classe Magnoliopsida
Ordem Fabales
Família Leguminosae-Papilionaceae
Subfamília Faboideae
Gênero Erythrina
Espécie Erythrina mulungu L.
Sinonímia Científica Erythrina verna
Corallodendrum mulungu Kuntze
Sinonímia Popular
Mulungu, suína, amansa-senhor, capa-homem, canivete,
bido-de-papagaio, murungu, sapatinho-de-judeu, sananduva,
corticeira, eritrina.
7
2.1.2. Matricaria chamomilla Linné
A camomila é uma planta herbácea anual que alcança, em média, de 10 a 30 cm
de altura, é ereta, tem estames alternados e caules delgados, rasteiros e muito
ramificados. Apresenta folhas bem recortadas e flores miúdas, semelhantes a margaridas
brancas com o miolo amarelo, exalando um perfume delicado (OLIVEIRA, et al.,1991).
Figura 02: Matricaria chamomilla L. Detalhe dos capítulos florais.
Fonte. http://laherbloguisteria.blogspot.com/2007/05/flor-de-manzanilla.html e
http://www.ag-network-chile.net/Medicinal%20Herbs.htm
Apresenta-se como capítulos longamente cônicos, com flores marginais
linguladas e femininas, em número de dez a vinte, em geral, com 6 a 9 mm oblonga,
tridenteada no vértice e percorrida por quatro nervuras. As flores internas ou do disco
são hermafroditas numerosas, em média com 2 mm de comprimento de corola amarela
tubulosa, pentadenteada e mostram cinco estames com as anteras unidas; do tubo
sobressai a ponta do estilete com dois estigmas recurvados. Todas as flores aparecem
sem papo. O receptáculo é nu, cônico, medindo até 6 mm de comprimento, desprovido
de palhetas e oco no seu interior. O invólucro é côncavo e formado de três fileiras de
brácteas, cujo número varia de vinte a trinta. As brácteas são lanceoladas, obtusas,
amareladas, largamente escariosas, inteiras no vértice e atigindo 2,5 mm de
comprimento (OLIVEIRA, et al.,1991).
8
Quadro 02 - Classificação Sistemática de Matricaria chamomila Linné
Classificação Científica
Reino Plantae
Divisão Magnoliophyta
Classe Magnoliopsida
Ordem Asterales
Família Asteraceae
Gênero Matricaria
Espécie Matricaria chamomilla L.
Sinonímia Científica
Chamomilla vulgaris Gray
Chrysantemum chamomilla (L.)Bernh.
Matricaria kochiana Sch. Bip.
Matricaria recutita var kochiana (Sch. Bip.) Greuter
Sinonímia Popular Chamomilla, camomila-comum, macela-nobre, camomila-
vulgar, camomila-da-alemanha, Chamomile
2.1.3. Passiflora alata Curtis
A espécie P. alata é aparentemente originária da região leste do Brasil, mas
encontra-se largamente distribuída em várias regiões, da Amazônia até São Paulo.
Conforme a região, recebe os mais diversos nomes populares, conforme descrito no
quando abaixo.
Trepadeira com caule quase quadrangular, estreitamente alado, glabro; folhas
oval-oblongadas, ou ovais, agudas, glabras, de 11-18 cm de comprimento e 8-10 cm de
largura, na face brilhantes e no verso pálidas; pecíolo de 2,5-3 cm de comprimento nas
folhas adultas, na parte superior profundamente sulcado, nas margens com 2-4
glândulas sésseis dispostas aos pares; estípulas pequenas, foliáceas, 2-3 vezes mais
curtas do que os pecíolos; flores pendentes, abertas com 11-17 cm de diâmetro; sépalas
sub-carnosas, oblongo-obtusas, no verso perto do ápice, coniculadas, semelhante, por
fora alvacentas e por dentro vermelhas, nas bases espessadas; corona da fauce
filamentosas e filamentos pluriseriados e distintos; exteriores carnosas, mais longas de
que as pétalas e transversalmente listradas de roxo e no ápice roxas, os interiores
9
pequenos, dentiformes; fruto ovóide, obovóide ou piriforme, glabro de 8-11 cm de
comprimento e 5 cm de espessura na parte mais larga, na base e ápice um tanto
escavados.
Figura 03: Passiflora alata. Detalhes das folhas, flor e fruto.
Fonte. http://www.passiflora.it/alata.htm
http://www.floratoskana.de/images/Passiflora_alata_g.jpg
10
Quadro 03 - Classificação Sistemática de Passiflora alata Curtis.
Classificação Científica
Reino Plantae
Divisão Magnoliophyta
Classe Magnoliopsida
Ordem Violales
Família Passifloriaceae
Gênero Passiflora
Espécie Passiflora alata Curtis
Sinonímia Científica Passiflora alata Dryander
Passiflora alata var. latifolia (DC.) Mast.,
Passiflora latifolia DC.
Passiflora phoenicia Lindl.
Sinonímia Popular
Flor-da-paixão, maracujá-açú, maracujá-amarelo,
maracujá-comprido, maracujá-comum-de-refresco,
maracujá-mamão, maracujá-melão, maracujá-silvestre,
maracujá-suspiro, passiflora, maracujá-grande; fragant
granadilla, winged-stem passiom flower, passiflore à tiges
ailées
2.2. Fitoterapia
O uso de plantas medicinais pelo homem data de épocas remotas, quando estes
as utilizavam como fonte de alimentação e para cura de seus males. O uso de vegetais
perde-se no tempo, na história do ser humano. O consumo de plantas medicinais teria
sido a primeira forma de uso de medicamento que se tem notícia. Paulatinamente o
conhecimento empírico vem se associando ao científico como forma de permitir o uso
seguro dos agentes fitoterápicos.
Mesmo após o sucesso da quimioterapia moderna, ainda persiste a utilização de
plantas medicinais pelo homem com fins terapêuticos. O século vinte foi um triunfo
para a indústria farmacêutica dominada pela síntese química, que substituiu os extratos
11
naturais por moléculas sintéticas que muitas vezes não guardam relação estrutural óbvia
com produtos naturais (RASKIN et al., 2002). Ainda assim, um grande número
(estimado em cerca de 50% em 1991) dos medicamentos de origem sintética é baseado
em um precursor que é um produto natural, ou contém um farmacóforo que é derivado
de um produto natural (BALANDRIN et al., 1993).
A Organização Mundial de Saúde estima que 80% da população depende da
medicina tradicional para suas necessidades básicas de saúde, e que quase 85% da
medicina tradicional envolve o uso de plantas medicinais, seus extratos vegetais e seus
ativos (CALIXTO, 2000).
No Brasil se estima a existência de cerca de 60 mil espécies de um total de mais
de 155 mil reconhecidas entre as angiospermas tropicais (GIULIETTI et al., 1990;
PRANCE, 1977). A necessidade de se explorar racionalmente esta biodiversidade fez
crescer o interesse por áreas do conhecimento como a Química de Produtos Naturais,
com linhas de pesquisa como Fitoquímica, Metodologia Analítica, Atividade Biológica,
Ecologia Química, Síntese, Biotransformação, Biotecnologia, Quimiossistemática,
Produtos Naturais Marinhos e Química de Microorganismos (PINTO et al., 2002).
Toda esta biodiversidade favorece o desenvolvimento de novos fármacos a partir
de produtos de origem natural, como foi relatado no Relatório Anual de Química
Medicinal (Annual Reports of Medicinal Chemistry) de 1984 a 1997, que indicou que
60% das drogas aprovadas e pré-aprovadas pelo FDA (Food and Drug Administration)
são de origem natural (PINTO et al., 2003).
Apesar do sucesso que a indústria farmacêutica acumulou ao longo do século
passado, dados recentes têm mostrado que atualmente as grandes indústrias
farmacêuticas enfrentam uma crise sem precedentes. Assim, de 1996 à 2001, o número
de novas substâncias químicas aprovadas (NCE, “new chemical entities”) diminuiu em
50%, apesar do gasto em pesquisa e desenvolvimento ter aumentado em quase 40%.
Estima-se que para atender às expectativas de investidores e manter uma taxa
anual de crescimento de 10%, a indústria farmacêutica deve aprovar, em média, 4 novas
moléculas/ano, e cada uma delas deve alcançar vendas de cerca de 350 milhões de
dólares/ano. Em 1996, menos de 1/4 de todas as moléculas aprovadas atingiram este
nível de lucratividade (BOLTEN et al., 2002). As razões de tal dificuldade são variadas.
Em primeiro lugar, as indústrias se encontram atualmente sob um ambiente regulatório
mais rigoroso e exigente, o que torna a aprovação de um novo fármaco um processo
muito mais arriscado. Baseado em grande medida nos desastres do passado, as agências
12
regulatórias passaram a ser mais exigentes com os testes clínicos, exigindo, por
exemplo, que se estude o efeito de uma molécula em determinadas subpopulações.
Outro fator, e talvez o mais importante é a complexidade das doenças para as
quais terapias satisfatórias ainda não são disponíveis e que têm amplo mercado em
potencial. Estas são geralmente doenças crônicas e multifatoriais, que quando
comparadas à doenças infecto-parasitárias por exemplo, apresentam uma fisiopatologia
muito mais complexa. Neste grupo encontram-se, por exemplo, o câncer, diabetes,
doença coronariana, hipertensão, depressão entre outras.
Esta dificuldade em se desenvolver terapias significativamente melhores que as
atualmente disponíveis para doenças crônico-degenerativas, contrasta com o grande
aumento no número de alvos moleculares conhecidos para estas doenças, que foi em
grande parte possibilitado pelos avanços em biologia molecular e pelo sequenciamento
do genoma humano. Para superar estas dificuldades, a indústria farmacêutica tem
investido massivamente em estratégias e tecnologias que possam aumentar as chances
de sucesso no desenvolvimento de novos medicamentos. Exemplos de tais tecnologias
são a química combinatorial, técnicas de screening biológico rápido (high throughput
screening) e técnicas computacionais que tentam prever o perfil de absorção,
distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade de novos protótipos de fármacos ainda
no processo de desenvolvimento, sempre no sentido de diminuir as chances de falha em
fases mais avançadas (ALVAREZ, 2004).
A crença relativamente disseminada na indústria farmacêutica de que a química
combinatorial deveria ser a solução para a busca de novos fármacos, levou ao
fechamento pela maioria das indústrias, de seus programas de prospecção de produtos
naturais como fontes de novas substâncias farmacologicamente ativas, uma vez que o
isolamento de novos produtos naturais que possam ser ou originar novos medicamentos
foi considerado um processo improvável, caro e lento frente à possibilidade da síntese
paralela de milhares de moléculas oferecida pela química combinatorial (ALVAREZ,
2004).
Mesmo com o crescimento da indústria farmacêutica e o impacto que esta teve
no tratamento de doenças e na sua prevenção - principalmente para a população de
países desenvolvidos - a fitoterapia é uma forma de medicina alternativa que se encontra
em expansão mesmo nos países desenvolvidos, enquanto que nos países em
desenvolvimento ela é em muitos casos a única opção disponível (CAPASSO et al.,
2000).
13
O uso de plantas com finalidades terapêuticas é uma prática comum no Brasil,
que tem sido transmitida através das gerações, com origem na cultura indígena
(SIMÕES et al., 2001), misturando-se posteriormente com as tradições européias e
africanas, e constituindo o atual conhecimento popular. Este conhecimento tem
despertado o interesse nacional e internacional pelo potencial terapêutico e econômico
que representa (BERG, 1993), já que o Brasil possui a maior floresta equatorial e
tropical úmida do planeta, com uma grande diversidade de solos e climas que favorecem
a riqueza e variedade de tipos de vegetação e espécies de flora distribuídas nos diversos
ecossistemas (DIAS, 1995).
Nos últimos anos, este aumento na busca por alternativas terapêuticas fez crescer
o mercado mundial de fitoterápicos, tanto entre os países desenvolvidos, quanto entre
aqueles em desenvolvimento, onde em muitos casos esta é a única opção terapêutica
disponível (CAPASSO et al., 2000). Este mercado movimenta atualmente cerca de 22
bilhões de dólares por ano. Nos Estados Unidos, estima-se que as vendas de produtos
fitoterápicos em 1999 tenham alcançado 5 bilhões de dólares, enquanto as vendas na
União Européia neste mesmo ano alcançaram 7 bilhões de dólares (CALIXTO, 2000),
sendo a Alemanha o maior mercado mundial de fitoterápicos (PINTO et al., 2002).
Entretanto os gastos com investimento em pesquisa e desenvolvimento não ultrapassam
15% desses valores (DICKSON et al., 2004).
As razões que levaram a esta expansão, mesmo com o aparente sucesso que a
indústria farmacêutica teve no século passado, estão relacionadas a uma mudança de
paradigma, devido à falta de avanço das terapias convencionais em tratar doenças
crônicas ou de fisiopatologia multifatorial. Porém isso pode levar à uma falsa percepção
de que a fitoterapia seja sempre uma opção terapêutica natural e segura, o que leva
muitas vezes à auto-medicação (RASKIN et al., 2002).
Embora disseminada, a crença na inocuidade dos produtos fitoterápicos devido a
serem produtos “naturais” é perigosa, pois muitas espécies de plantas produzem
metabólitos tóxicos, ou que podem interagir com medicamentos alopáticos. Além disso,
condições inadequadas de produção e armazenamento da matéria-prima vegetal, assim
como a adulteração pode levar a fitoterápicos com contaminantes que oferecem
considerável risco à saúde, como metais pesados e aflatoxinas.
A medicina tradicional chinesa, por exemplo, utiliza-se de muitas espécies
vegetais potencialmente tóxicas na preparação de seus medicamentos. Deng (DENG,
14
2002) lista várias preparações da medicina chinesa que têm provocado intoxicações
agudas.
2.3. Legislação para Fitoterápicos
No Brasil, o registro de fitoterápicos é realizado pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) e regido pela Resolução da Diretoria Colegiada número
48 (RDC 48), de 16 de Março de 2004 (BRASIL, 2004), que visa atualizar a
normatização do registro de medicamentos fitoterápicos. Esta resolução define
medicamento fitoterápico como: “Todo medicamento obtido empregando-se
exclusivamente matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado pelo conhecimento da
eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua
qualidade. Sua eficácia e segurança são validadas através de levantamentos
etnofarmacológicos de utilização, documentações tecnocientíficas em publicações ou
ensaios clínicos fase 3. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que, na sua
composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem as associações
destas com extratos vegetais”.
A RDC 48 da ANVISA estabelece a necessidade de um controle de qualidade
adequado para os medicamentos fitoterápicos, que assegure tanto a sua eficácia quanto a
ausência de toxicidade. A resolução estabelece ainda a necessidade de controle da
matéria-prima vegetal, que obviamente constitui uma das mais importantes etapas do
controle de qualidade, com influência direta na qualidade do produto final. Portanto,
faz-se necessário a identificação botânica do material vegetal, cultivo e coleta em
condições adequadas, pré-tratamento e armazenamento correto, a fim de garantir que o
material vegetal seja cultivado e colhido em condições e na época em que os
constituintes químicos estejam mais abundantes.
2.4. Desenvolvimento Tecnológico e Produção de Fitoterápicos
Os fitoterápicos são medicamentos obtidos a partir de matérias-primas
exclusivamente vegetais, com finalidades profiláticas, paliativas, curativas ou de
diagnóstico. Geralmente um fitoterápico contém uma mistura complexa, consistindo em
diferentes produtos do metabolismo primário como os triglicérideos (gorduras vegetais)
e carboidratos, sais minerais, vitaminas, corantes e clorofilas, e substâncias do
15
metabolismo secundário, que são biologicamente ativas como os flavonóides,
alcalóides, terpenos, etc.
As drogas, sejam de origem natural ou sintética, raramente são administradas na
sua forma bruta, ou na forma de substâncias químicas puras (YORK, 2005). Este fato
pode se justificado pela baixa dosagem das drogas usadas atualmente, o que exclui a
possibilidade de obtenção de doses adequadas e seguras sem que a droga seja
processada. Isso envolve matérias-primas que podem ter graus de processamento
variáveis, como a planta na forma de pó, extratos da planta obtidos por maceração
exaustiva ou extração à quente (Soxhlet por exemplo), ou formas mais elaboradas como
liofilizados ou extratos secos nebulizados (Spray Drying).
Portando a administração de agentes terapêuticos necessita de sua incorporação
em uma forma farmacêutica caracterizada normalmente pelo seu estado físico de
apresentação, constituída de componentes farmacologicamente ativos e de adjuvantes
farmacêuticos. Podendo variar desde soluções relativamente simples até sistemas de
liberação complexos, dependendo do uso apropriado de adjuvantes e excipientes
(YORK, 2005).
Desta forma entende-se por medicamento ou forma farmacêutica, um meio de
administrar um agente terapêutico de maneira segura, eficiente, reprodutível e prática ao
organismo (YORK, 2005).
Portanto, a visão atual de medicamento fitoterápico é de um produto elaborado a
partir de matérias-primas exclusivamente vegetais, através de processos
tecnologicamente adequados. Segundo a RDC 48/2004/ANVISA (BRASIL, 2004), essa
definição deixa antever que a transformação de uma planta em medicamento deve ter
como objetivo a preservação da integridade química e farmacológica do vegetal,
garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de utilização.
A produção de fitoterápicos pressupõe que estudos de desenvolvimento tenham
sido realizados anteriormente, estando procedimentos e etapas de processamento
devidamente estabelecidas, objetivando a produção de produtos farmacêuticos
adequados, de acordo com os conceitos atuais de qualidade, que são o nível de
satisfação de produtor e usuário do medicamento e o cumprimento de requisitos pré-
estabelecidos que conduzam à sua total adequabilidade ao fim a que se destinam.
(TOLEDO, et al.,2003).
O desenvolvimento tecnológico de um produto fitoterápico exige estudos em
diversas áreas de conhecimento, isto pressupõe, obrigatoriamente, o trabalho
16
multidisciplinar uma vez que envolve conhecimentos botânicos, agronômicos,
etnofarmacológicos, etnobotânicos, farmacológicos, fitoquímicos, farmacognósticos,
médicos e de tecnologia farmacêutica, entre outros. Lembrando que a cadeia de
desenvolvimento de fitoterápicos tem, normalmente, como ponto de partida o
conhecimento popular (TOLEDO, et al,.2003)
O nosso trabalho explora a qualidade de extratos vegetais secos por aspersão
(nebulizados). Tal material vêm sendo utilizado tanto como produtos finais, quanto
intermediários na obtenção de diferentes formas farmacêuticas (VASCONCELOS,
2004).
2.4.1. Soluções extrativas e extratos secos por nebulização
Uma etapa importante na preparação de um medicamento de origem vegetal é a
operação de extração. Freqüentemente são empregadas misturas de solventes, tais como
etanol, metanol ou acetona com água, com o objetivo de aumentar o rendimento na
extração das substâncias de interesse, baseando-se, principalmente, na sua solubilidade
e estabilidade (VOIGT, 1993).
Define-se secagem como a operação usada para a remoção ou eliminação de um
líquido volátil que contém um substrato não volátil de um material por aplicação de
calor, o que se consegue por transferência de um líquido a partir de uma superfície para
uma fase gasosa insaturada (LACHMAN et al, 2001;CASEDEBAIG et al., 1989a).
Ainda, a secagem consiste em diminuir a atividade da água através da
eliminação da mesma, e é um método de preservação de produtos biológicos, uma vez
que não envolve tratamento por aquecimento severo, e permite estocagem a uma
temperatura ambiente (SCHUCK, et al., 2005)
Grandes quantidades de produtos líquidos (leites desnatados e comuns, frações
resultantes de filtração por membrana e separação cromatográfica) são secas de forma a
produzir rações, alimentos e ingredientes. A maioria desses pós é seco pela técnica de
nebulização (SCHUCK et al., 2005).
A tecnologia de secagem por nebulização pode ser realizada utilizando – se o
aparelho Spray Drier, que permite a passagem de uma solução pré – formulada num
sistema previamente aquecido a uma temperatura estabelecida anteriormente.
Por meio da atomização de líquidos em pequenas gotículas, o secador do
nebulizador, permite uma elevada área superficial para a transferência de massa e calor.
17
Os líquidos são aspergidos no meio de uma corrente de ar aquecido, de modo que cada
gotícula seca firma uma partícula sólida individual (AULTON, 2005).
Spray Drying – secagem do pó por nebulização ou aspersão – é o processo
industrial mais extensamente utilizado que envolve formação e secagem de partículas. É
altamente adequado para a produção contínua de sólidos secos, seja na forma de pós,
granulados ou aglomerados, a partir de soluções, emulsões ou suspensões.
Conseqüentemente, A nebulização é um processo ideal no qual o produto final obedece
a padrões de qualidade relacionados à distribuição do tamanho de partícula, do índice de
umidade residual, densidade do pó, e forma das partículas (MEDEIROS, 2006).
É uma forma eficiente de secagem devido à grande área superficial disponível
para aquecimento e transferência de massa como resultado da atomização do líquido em
pequenas gotículas da ordem de algumas centenas de mícrons (FARID, 2003).
Ainda, a técnica é largamente utilizada na manufatura de muitos produtos
industriais, como: alimentos instantâneos, detergentes para roupas, cerâmicas, e
produtos agroquímicos; o crescimento no setor farmacêutico deve-se às inúmeras
vantagens em relação às tecnologias que utilizam várias etapas de processo e competem
com as tecnologias de redução de partícula (MEDEIROS, 2006).
Os produtos secos por nebulização (nebulizados) são facilmente reconhecíveis,
sendo de aparência uniforme. As partículas apresentam uma forma característica de
esferas ocas, algumas vezes com um pequeno orifício, que resulta do processo de
secagem. À medida que a gotícula entra na corrente de ar aquecido, é seca pelo lado
externo, formando uma crosta externa, remanescendo ainda líquido no interior. Esse
líquido evapora e o vapor formado internamente escapa, forçando a passagem e
formando o orifício na esfera (AULTON, 2005).
Na indústria farmacêutica, a utilização de adjuvantes farmacotécnicos
apropriados, juntamente com a tecnologia de spray drying, representa um passo
importante na garantia da estabilidade e qualidade de extratos de plantas. Isto se deve ao
fato de que os adjuvantes podem conseqüentemente, influenciar na biodisponibilidade
dos produtos (MACÊDO, et al., 2001).
18
2.4.2. Processo de secagem por nebulização (Spray Drying)
A nebulização baseia-se na secagem de líquidos e suspensões, por divisão destes
em finas gotículas, dentro de uma torre de secagem munida de ar quente circulante
(MASTERS, 1978; BASSANI et al.,1990).
Figura 04: Sistema de Secagem por Spray-Drier de Soluções Extrativas
Vegetais. (1) Agitação e aquecimento, (2) Amostra, (3) Bomba, (4) Tubo de amostra,
(5) Atomizador, (6) Desbloqueador, (7) Câmara de aquecimento, (8) Agulha injetora,
(9) Câmara de secagem, (10) Ciclone, (11) Tubo de exaustão, (12) Tubo coletor da
amostra.
O processo de secagem por nebulização tem como mecanismo a aspersão de
uma forma líquida de uma determinada substância através de um jato que passa por um
sistema fechado no qual a temperatura previamente programada para aquecer promove a
retirada da água e / ou solvente rapidamente, depositando assim, a forma de pó em finas
partículas do produto seco (MEDEIROS, 2006a).
Para aquecer o sistema, promove-se a ativação de um fluxo de gás (geralmente o
ar) que ao circular pelo aparato eleva a temperatura do mesmo, com isso, ocorre a
19
evaporação do líquido presente na amostra, bem como um fluxo livre da amostra seca, e
ainda, pode-se controlar o tamanho das partículas secas (MEDEIROS, 2006a).
Dentre as variáveis do processo de secagem, pode-se dizer que são de suma
importância: a razão de evaporação e a distribuição do tamanho da partícula do produto
seco.
A razão de evaporação e a diferença de temperatura do processo (temperaturas
de entrada e de saída do sistema) determinam a quantidade de ar necessário para secar a
amostra, que por sua vez, determina o tamanho da partícula seca. Quanto maior for a
temperatura de secagem da amostra, menor será o fluxo de ar necessário para o processo
(MEDEIROS, 2006a).
Segundo Medeiros (2006a), o processo de secagem dá-se por uma única etapa. E
os componentes do sistema podem ser visualizados a seguir:
2.4.2.1. Fases do sistema
a) Atomizador
A atomização ou redução do tamanho de partículas consiste em produzir
gotículas de tamanho e área superficial específicos, assim, esta é uma etapa crítica da
secagem por nebulização. É justamente a razão de atomização, juntamente com as
condições estabelecidas no processo, que controla o grau de secagem das partículas, e
com isso, controla também o tempo de residência das partículas na câmara de secagem.
Dentre as técnicas de atomização, podemos citar:
1) Atomização por jato pressurizado – o jato de aspersão do líquido forma-se
através da força que o fluido exerce para passar através do pequeno orifício de
atomização; a energia requerida para tal processo é suprida por uma bomba
alimentadora. Por este processo, é possível obter uma distribuição de tamanho de
partículas de diâmetros diminutos, assim, é bastante indicado quando a minimização do
diâmetro da partícula é requerida. Ainda, o tamanho de partícula obtido é uma função
do fluxo do líquido aspergido através do jato e também do diâmetro do orifício do jato
de atomização.
2) Atomização por jato de fluido duplo – o jato de aspersão forma-se quando a
amostra líquida juntamente com o gás comprimido passa através do orifício do jato
20
aspersor. A energia requerida para a atomização é provida pelo gás comprimido, que
geralmente é o ar.
Neste processo, são geradas partículas de diâmetros maiores e a média dos
tamanhos das partículas produzidas é em função do fluxo do jato de aspersão, e também
da razão e pressão exercidas pelo ar.
3) Atomização centrífuga – o jato de aspersão é formado pela passagem da
amostra líquida através de um disco rotatório, a energia requerida para isto é fornecida
pelo motor do atomizador. São obtidas partículas de diâmetros maiores, o que é
determinado em função do diâmetro do disco rotatório e das rotações por minuto do
mesmo.
b) Fluxo de ar / gás
O fluxo de ar ou gás utilizado no processo serve para promover o aquecimento
do sistema, pois à medida que a temperatura aumenta, faz com que o ar aqueça e circule
por todo sistema, aquecendo o mesmo.
A amostra aspergida e o ar quente misturam-se durante a atomização, o que é
bastante importante, pois isto influencia na evaporação, no controle do tamanho de
partícula, na densidade da amostra e na degradação pelo calor. A velocidade, a
orientação e a forma como o fluxo de ar quente ocorre vão influenciar no processo.
Os tipos de fluxo existentes no processo de secagem são:
1) Fluxo co-corrente – neste tipo de fluxo, tanto o jato de aspersão,
quanto o fluxo de ar movimentam-se para baixo na câmara de secagem, e a
amostra é aspergida no fluxo de ar quente, o que aumenta a razão de secagem
instantânea.
2) Fluxo contra-corrente – a amostra aspergida e o fluxo de ar têm
movimentos de sentidos opostos, ou seja, a amostra movimenta-se para baixo na
câmara de secagem, e o fluxo de ar movimenta-se para cima; isto faz com que as
partículas produzidas tenham um maior tamanho, pois o movimento contrário do
fluxo em relação à amostra aumenta o tempo de queda da partícula, permitindo
com isso, um tempo extra de secagem.
21
3) Fluxo misto ou fluxo de fonte – o ar quente movimenta-se para
baixo na câmara de secagem e a amostra é aspergida para cima da mesma, ao
encontrar o ar quente, a amostra é seca e desce juntamente com o ar quente na
câmara de secagem.
Como foi visto anteriormente, a mistura do fluxo de ar ou gás com a amostra
pode ocorrer de várias formas. Os tipos de fluxo podem ser realizados de forma lenta,
ou turbulenta. A escolha de um ou outro tipo de fluxo varia de acordo com o objetivo
desejado, assim, se a secagem é o único objetivo, por exemplo, é melhor aplicar um
fluxo mais rápido; se o importante é o tamanho da partícula seca, então é desejável
utilizar um fluxo mais lento.
O fluxo de mistura lento é utilizado quando é importante a minimização do
tamanho da partícula, pois como a velocidade de mistura da solução aspergida com o
gás é menor no momento da atomização, ocorre uma maior secagem da partícula,
permitindo obter uma distribuição de tamanho menor da mesma.
Já um fluxo de mistura rápido permite uma secagem instantânea da gotícula
aspergida, produzindo com isso, uma distribuição de tamanho de partículas maiores, isto
porque a turbulência gerada faz com que as gotículas aspergidas circulem mais rápido
na câmara de secagem.
c) Separação das partículas do pó seco
As partículas do pó seco são continuamente depositadas na parte inferior do
sistema de secagem por nebulização. O movimento do fluxo de ar quente empurra as
partículas secas na direção de um ciclone, ou ainda em alguns tipos de aparato, existem
filtros de separação das partículas secas.
A separação primária da amostra seca ocorre na câmara de secagem, a separação
do pó do ar circulante ocorre no ciclone. Após a passagem pelo ciclone, as partículas de
pó são depositadas num recipiente coletor da amostra, e o ar circulante do sistema sai
através de um exaustor.
d) Bomba de alimentação
A bomba de alimentação é um dispositivo que leva a amostra até o atomizador
do sistema, funcionando a uma velocidade pré-programada, de forma a funcionar rápida
ou lentamente.
22
2.4.2.2. Aplicação da técnica de Nebulização (Spray Drying)
A secagem por nebulização é bastante útil na indústria farmacêutica devido à
rapidez da secagem e à forma única do produto final. Existem três aplicações principais
para os processos de secagem por nebulização: (1) secagem de materiais termo-
sensíveis, (2) alteração da forma física dos materiais para uso na produção de
comprimidos e de cápsulas e, (3) encapsulação de partículas sólidas e líquidas
(LACHMAN, 2001).
Diferentes métodos de secagem produzem materiais amorfos com propriedades
físicas diferentes, como por exemplo, em termos de tamanho de partícula, estrutura e
área de superfície, e seu comportamento térmico pode diferir. A lactose seca por SpDr é
o excipiente mais comum nas indústrias farmacêuticas, principalmente como diluente na
produção de comprimidos (KAMRUL E ROOS, 2005).
Foi demonstrado que a concentração da amostra tem efeito importante nas
propriedades do material seco por nebulização. Um estudo com o excipiente lactose
mostrou que um aumento no teor de lactose na amostra da solução ou suspensão a ser
seca por nebulização em preparações mais concentradas resultou numa diminuição da
percentagem de lactose amorfa nos produtos secos via nebulização (CHIDAVAENZI et
al.,1997).
Spray drying tem sido uma técnica usada com sucesso na indústria farmacêutica
para processar pós, uma vez que oferece um meio de obtenção de pós com tamanho de
partículas e forma pré-determinados. Adicionalmente, a lactose seca por processo de
nebulização é um dos excipientes mais utilizados na indústria farmacêutica, e tem sido
comercializada por muitos anos, sendo sua maior vantagem ser utilizada para a
compressão direta (REGE et al.,2003).
A cinética de secagem de gotículas de vários tamanhos tem sido um dos
experimentos de secagem mais importantes e largamente realizados em relação ao
entendimento do fenômeno associado à secagem de alimentos relacionados às operações
de secagem por nebulização incluindo a morfologia das partículas (ALAMILLA-
BELTRÁN, et al.,2005).
O tempo de secagem varia na ordem de 5-100 segundos; o tamanho das
partículas secas pode variar entre 2-500 µm, o que depende da configuração do aparelho
bem como das condições empregadas para secagem. (CORRIGAN, 1993).
23
As principais vantagens da técnica de secagem por nebulização são a
minimização dos efeitos térmicos sobre o material tratado, devido ao tempo
extremamente curto de contato do líquido disperso com o calor, a versatilidade na
obtenção de pós, grânulos ou aglomerados e o elevado rendimento por tempo de
produção. Consiste numa técnica de baixo custo, quando comparada à liofilização, e
pouco destrutiva quando comparada a outras técnicas que empregam calor (MASTERS,
1978; LIST et al.,1989).
A escolha de um método de secagem para uma solução extrativa vegetal
específica envolve uma série de fatores, tais como natureza do produto a ser submetido
ao processo, a massa de solvente ou de água a ser removida, a massa de produto a ser
processada por unidade de tempo, a estabilidade das substâncias ativas contidas no
produto, a higroscopicidade e outras características físicas do produto final, bem como
os custos de produção envolvidos (LIST et al.,1989).
As indústrias farmacêuticas têm um interesse especial pelos extratos vegetais
secos, pois apresentam as vantagens características inerentes às formas farmacêuticas
sólidas, precisão de dosagem e facilidade de manuseio, transporte e armazenagem, além
de favorecerem a manutenção da estabilidade química, microbiológica e farmacológica.
Os extratos secos são preparados a partir de uma solução extrativa vegetal, podendo ser
submetidos às técnicas de liofilização ou de nebulização, entre outras (MASTER, 1978;
LIST et al.,1989).
A secagem por nebulização, aspersão ou spray-drying é mais utilizada na
preparação de extratos secos. Como o tempo de exposição ao calor é reduzido, a técnica
adquire especial importância na secagem de extratos que possuem compostos ativos
termolábeis (CASEDEBAIG et al., 1989).
Do ponto de vista das exigências modernas, a preparação de extratos vegetais
hidroalcoólicos e aquosos constitui uma etapa preliminar que leva à obtenção de um
produto intermediário, geralmente, um extrato seco. A solução extrativa é o resultado da
extração da fração de interesse terapêutico e da dissolução parcial dos constituintes
presentes em um vegetal. O extrato seco é considerado tecnologicamente viável para
fins de produção em larga escala, caracterizado pela estabilidade física, química,
farmacológica e microbiológica (CASEDEBAIG et al., 1989; JACOB et al., 1984;
PAULA, 1996; SOUZA, 1997).
No desenvolvimento galênico de fitoterápicos vêm sendo utilizadas várias
técnicas de secagem de extratos aquosos e hidroalcoólicos, de forma a manter a
24
estabilidade e obter formas intermediárias de produção. Dentre as técnicas de secagem
mais empregadas, encontra-se a nebulização ou spray-drying, devido à facilidade de
redispersão, acondicionamento, preparação de formas farmacêuticas sólidas e
padronizadas e pela qualidade do produto acabado (ARAGÃO, 2002).
No campo da indústria farmacêutica de fitoterápicos, a matéria-prima vegetal
seca por nebulização padronizada encontra aplicação na preparação de comprimidos,
cápsulas, granulados, pomadas e outras formas famacêuticas como um produto
intermediário. Entre outras vantagens, apresenta maior estabilidade, menor
higroscopicidade, distribuição homogênea dos constituintes da preparação, assim como
uma manipulação mais simples, o que permite pesagem e doseamento mais fáceis e
exatos (MASTERS, 1978; GAUDY et al.,1991).
A questão da estabilidade das substâncias ativas frente ao processo de
nebulização merece especial atenção, uma vez que uma possível perda ou diminuição da
atividade farmacológica não pode ser descartada (ARAGÃO, 2002).
Estudos sobre a obtenção de extratos secos nebulizados (CARVALHO, 1997)
têm demonstrado a viabilidade deste método, principalmente a adição de adjuvantes de
nebulização, como dióxido de silício coloidal (Aerosil®), a fim de melhorar as
características físicas do extrato nebulizado.
O dióxido de silício coloidal vem se destacando devido as suas propriedades, tais
como: elevada pureza, inércia química e farmacológica. O produto seco obtido com a
adição de dióxido de silício coloidal apresenta fluidez, decorrente do baixo diâmetro das
partículas (16 µm), com elevada superfície específica (200 m2/g), bem como, possui
melhor estabilidade frente à umidade devido aos grupos silanóis e siloxanos nas
extremidades da molécula, o que lhe confere a característica de absorver até 40% de seu
peso em água sem prejuízo das propriedades tecnológicas. Este último fator é
importante para a manutenção da qualidade dos produtos, principalmente tratando-se de
produtos obtidos a partir de extratos vegetais altamente higroscópicos (WADE et
al.,1994).
A caracterização de extratos secos vegetais nebulizados empregados na
produção de fitoterápicos é uma necessidade para a garantia da qualidade do produto
final a ser obtido a partir desse produto intermediário. Essa caracterização deve ser
rápida, eficiente, permitindo a identificação do maior número de constituintes possível,
respeitando a característica de fitocomplexo do material vegetal.
25
2.5. A Qualidade dos Fitoterápicos
A indicação de medicamentos fitoterápicos na terapêutica humana não deve
sugerir a substituição de medicamentos convencionais registrados, mas aumentar as
opções terapêuticas oferecendo produtos de boa qualidade e respeitando os preceitos
éticos que regem a utilização de substâncias com finalidade terapêutica (SOUZA,
2003).
O uso popular e mesmo tradicional não são suficientes para validar as plantas
medicinais como medicamentos eficazes e seguros (SIMÕES et al., 2001). Neste
sentido, as plantas medicinais não se diferenciam de qualquer outro produto sintético.
Se a intenção é utilizar uma planta medicinal como medicamento, ela deve ter sua ação
comprovada e sua toxicidade potencial avaliada cientificamente como qualquer outro
medicamento.
O desafio que acompanha este crescimento na procura e uso de medicamentos
fitoterápicos, é a necessidade de garantir sua qualidade. Como qualquer medicamento,
os fitoterápicos devem ter a sua eficácia e ausência de toxicidade comprovadas, bem
como a reprodutibilidade lote a lote de sua ação (BATEMAN et al., 1998; ERNST,
2003; STEDMAN, 2002).
A garantia da qualidade dos produtos fitoterápicos certamente não tem
acompanhado o crescimento na popularidade destes produtos. A falta de testes clínicos
que demonstrem de forma inequívoca a sua eficácia, e a ausência de reprodutibilidade
dos produtos fitoterápicos são as maiores críticas que esta forma de terapia tem sofrido
ao longo dos anos. Existem poucos estudos na literatura realizados com o objetivo
específico de se comparar a qualidade dos fitoterápicos comercializados, mas os poucos
estudos realizados reforçam a idéia bastante generalizada de que a qualidade dos
fitoterápicos é extremamente variável (ALVAREZ, 2004).
Um fator limitante na análise de fitoterápicos é a ausência, na maioria dos casos,
de substâncias de pureza conhecida que possam ser usadas para fins de comparação e
padronização dos extratos vegetais, ou seja, padrões de referência. Entretanto, mesmo
quando possível, o uso de marcadores químicos nem sempre irá garantir a
reprodutibilidade da ação terapêutica, principalmente devido à complexidade química
inerente ao fitoterápico.
26
Sabe-se hoje que muitas vezes a eficácia de um produto fitoterápico não pode ser
atribuída a uma determinada substância, ou muitas vezes nem mesmo a uma classe
específica de produtos naturais. Nestes casos, o controle de qualidade baseado no uso de
marcadores químicos, nem sempre irá garantir a reprodutibilidade da ação terapêutica
destes produtos (CAPASSO et al., 2000). Os efeitos sinérgicos e os aditivos dos
diferentes componentes de uma mesma espécie, ou de várias plantas, são responsáveis
pela atividade biológica (ALVES, 2005).
A complexidade química dos produtos fitoterápicos impõe um grande desafio
analítico para o seu controle de qualidade físico-químico. Neste sentido, qualquer
método de controle físico-químico que seja sensível a variações nas concentrações
relativas de vários constituintes do fitoterápico, e não apenas a um único marcador ou a
alguns marcadores relacionados, constitui-se em uma ferramenta importante na análise
de produtos naturais, para garantir a reprodutibilidade da ação terapêutica do
fitoterápico.
Além disso, a falta de reprodutibilidade de atividade de mais de 40% dos
extratos de plantas é um dos maiores obstáculos no uso de plantas para a descoberta de
novos medicamentos uma vez que as atividades detectadas nos screenings
freqüentemente não se repetem numa segunda extração e teste da mesma planta
(RASKIN et al.,2002).
Somando-se a isso, os perfis bioquímicos de plantas cultivadas em diferentes
estações, períodos do ciclo de vida e locais variam muito. Os autores propõem que, uma
vez que os fatores ambientais e genéticos afetam muito a composição bioquímica dos
extratos de plantas, a produção de fitoterápicos necessitará de monoculturas
uniformizadas geneticamente, de plantas, crescidas em condições totalmente
padronizadas para assegurar a consistência bioquímica e para otimizar a segurança e a
eficácia em cada safra. Desta maneira, o processo para padronização de misturas
fitoquímicas complexas deve envolver da semente ao comprimido, lote a lote.
Portanto, o controle da qualidade do material vegetal tem como pré-requisito
principal, obter fitoterápicos com reprodutibilidade de ação. Este requisito vale para
qualquer medicamento fitoterápico, mesmo aqueles elegíveis para registro simplificado.
Sendo uma das maiores dificuldades, o desenvolvimento de fitoterápicos que
apresentem reprodutibilidade lote a lote da ação terapêutica, devido a variabilidade na
concentração de marcadores, decorrente dos efeitos de sazonalidade no cultivo das
27
plantas. Para isso torna-se muito importante o estudo da variação sazonal dos
constituintes químicos da planta.
Para garantir a uniformidade da composição de um fitoterápico, é necessário que
os diferentes produtos intermediários sejam caracterizados através de seus constituintes
químicos ou de sua atividade farmacológica. Nenhuma das duas alternativas é rápida ou
de fácil execução. A opção mais segura seria identificar e quantificar as substâncias
ativas, o que nem sempre é possível devido ao grande número de componentes
presentes no extrato. A utilização de substâncias marcadoras, relacionando a
concentração das substâncias mais abundantes, ou de grupos químicos com a atividade
biológica, é uma alternativa a ser avaliada. (SIMÕES, et al., 2001).
A partir do estabelecimento dos parâmetros de qualidade para a matéria-prima, e
considerando-se um planejamento adequado e um controle do processo de produção do
produto final, a qualidade do medicamento estará, em grande parte, assegurada
(IHRING e BLUME, 1992). Portanto, a qualidade da matéria-prima vegetal é a
determinante inicial da qualidade do fitoterápico, mas não garante a eficácia, a
segurança e a qualidade do produto final.
A segurança e a eficácia dependem de diversos fatores, tais como, metodologia
de obtenção, formulação e forma farmacêutica, entre outros e, portanto, devem ser
definidas para cada produto, estabelecendo-se os parâmetros de controle da qualidade
do produto final.
A qualidade adequada das matérias-primas deve ser realizada de acordo com
bases científicas e técnicas. Nos procedimentos rotineiros de análise da qualidade,
geralmente é preconizado o emprego de metodologias físico-químicas e biológicas,
sendo necessária à correlação entre os parâmetros analisados e a finalidade a que se
destina o medicamento. Para tanto, deve-se garantir o resultado da análise qualitativa e
quantitativa dos princípios ativos, a fim de comprovar que não houve degradação, de
modo que o produto final não perdeu suas características terapêuticas (ABREO, et al.,
2007).
2.6. Métodos Analíticos
Quimicamente, os fitoterápicos são misturas complexas de vários compostos
biologicamente ativos, que muitas vezes não são possíveis de ser isolados e cujas
28
atividades farmacológicas muitas vezes não são possíveis de serem identificadas
(CORDELL, 2000).
A separação destes compostos é muito difícil ou não custo-efetiva, e, muitas
vezes, elimina o efeito terapêutico combinado de muitos compostos ou, ainda, gera uma
substância que sozinha é tóxica (ALVES, 2005)
A análise química de uma planta tem importância significativa no fornecimento
de informações valiosas que podem sugerir finalidades para o seu uso, bem como na
avaliação do padrão de qualidade de matérias-primas vegetais. Portanto, os métodos
analíticos permitem a avaliação da qualidade do produto fitoterápico, garantindo, assim,
a constância de ação terapêutica e a segurança de utilização.
Até o momento a determinação de métodos analíticos depende, inicialmente, da
escolha dos marcadores, substâncias ou grupo de substâncias, preferencialmente
responsáveis pela ação farmacológica em estudo, que estejam presentes tanto na
matéria-prima, como nos produtos intermediários do processamento e no produto final.
(BASSANI, 2005).
Devido ao fato de raramente os princípios ativos responsáveis pela atividade
farmacológica serem conhecidos, o controle da qualidade, a padronização e a
estabilidade destes medicamentos se tornam tarefas bastante complexas, embora
possíveis principalmente por causa dos avanços nos métodos analíticos de alta resolução
(SIANI, et al., 2003)
Segundo Sonaglio e colaboradores (SONAGLIO et al.,2003), vistos de forma
pragmática, os métodos analíticos cumprem duas funções diferenciadas:
a) A avaliação do teor de substâncias ativas ou grupo de substâncias
ativas e do perfil qualitativo dos constituintes químicos de interesse,
presentes na matéria-prima vegetal, produtos intermediários e produto final.
A avaliação quantitativa, semi-quantitativa ou qualitativa envolve a utilização de
métodos espectrofotométricos, cromatográficos, físicos, físico-químicos ou químicos.
Nos casos em que os constituintes responsáveis pela atividade farmacológica são
desconhecidos utiliza-se marcadores químicos selecionados segundo a sua abundância,
facilidade de detecção e doseamento, preferencialmente aqueles com maior labilidade
frente a uma determinada etapa tecnológica.
Quando o objetivo analítico é o controle da qualidade do produto final, registro
do produto ou monitoramento do processo tecnológico, as exigências analíticas
29
incidentes devem considerar diversos fatores, como especificidade, exatidão, precisão e
tempo de rotina analítica, ou seja, o método analítico deve ser validado para o marcador.
Recomenda-se, também, que o mesmo possa ser utilizado em estudos de estabilidade,
permitindo, inclusive, a detecção de produtos oriundos da degradação das substâncias
ativas ou dos marcadores químicos.
Em relação aos processos tecnológicos, a sua inserção ocorre em nível de
controle da qualidade das matérias-primas, de produtos intermediários e finais,
considerando as características específicas da matriz analisada. Nos casos de controle de
processamento, os métodos selecionados para avaliação das substâncias de interesse
devem considerar o tempo da etapa de transformação, caracterizando-se, portanto, como
método simples, rápido e robusto. Segundo as circunstâncias, o método pode assumir
características qualitativas ou quantitativas. (SONAGLIO et al., 2003)
b) Avaliação das características físicas e físico-químicas dos
produtos tecnologicamente transformados.
Importante pelo fato de que essas características podem interferir sobre o perfil
biofarmacêutico do produto fitoterápico. Constitui exemplo a velocidade de dissolução
de formas farmacêuticas sólidas, diretamente relacionadas à liberação dos princípios
ativos, à qual se condiciona o tempo necessário para ocorrer o início da absorção das
substâncias ativas, e, conseqüentemente, para o início da ação do medicamento, tempo
de duração da ação e intervalo entre as doses (SONAGLIO et al., 2003).
Além disso, a utilização de métodos analíticos visando à quantificação de
substâncias ativas ou de referência bem como de aspectos relativos à forma
farmacêutica são essenciais para a obtenção da homogeneidade dos lotes de produção.
Faltam tecnologias rápidas e eficientes para isolar e caracterizar novas entidades
químicas, principalmente as que aparecem em pequenas quantidades (ALVES, 2005).
Uma forma de garantir a eficácia das plantas medicinais seria através de
padronização. Já é bem conhecido que a eficácia terapêutica das plantas medicinais não
é influenciada por um único composto ou até mesmo por uma simples classe de
compostos. Portanto, a análise química não pode se limitar a um simples composto – tal
como um único marcador químico - mas deve estender-se a vários grupos de
constituintes, de maneira a se obter uma caracterização química tão completa quanto
possível. Conseqüentemente, a atividade não pode ser prevista com precisão somente
30
com a identificação de um constituinte ou grupo de constituintes, o que dificulta a
padronização do material por análise química.
2.7. Técnicas Analíticas
Atualmente o uso de técnicas hifenadas, como cromatografia a gás acoplada à
espectrometria de massas (CG/EM) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
com diferentes detectores, como ultravioleta, infravermelho, arranjo de diodos,
espectrometria de massas, entre outros, tem auxiliado nesses estudos. A pirólise
analítica é uma técnica, na qual, substâncias, geralmente de alto peso molecular como
polímeros, são aquecidas de forma rápida, mas controlada, em uma atmosfera inerte, a
uma temperatura suficientemente alta para induzir a degradação térmica das substâncias
(WAMPLER et la., 1999). Acoplada à cromatografia gasosa interfaciada à
espectrometria de massas (Pir-CG/EM), a pirólise estende a utilidade da cromatografia
gasosa a substâncias de alto peso molecular que não seriam passíveis de análise direta.
A pirólise de matérias-primas vegetais produz um padrão de pirólise complexo
(pirograma) que pode ser utilizado para fins de classificação, como uma espécie de
impressão digital da amostra (fingerprint analysis) (FANG et al., 1990). A análise deste
padrão de pirólise por métodos comparativos com bancos de dados de bibliotecas
analíticas de espectros de massas permite que se quantifique a similaridade de diferentes
amostras, com a vantagem de que o método é sensível (em maior ou menor grau) a
variações dos diversos componentes, e não apenas de um único marcador.
2.7.1. Pirólise
A pirólise é uma técnica de degradação de moléculas de alto peso molecular em
fragmentos menores, utilizando exclusivamente energia térmica (WAMPLER et al.,
1999). A pirólise analítica é uma técnica que é geralmente acoplada à cromatografia
gasosa, onde o pirolisador serve como um método de introdução da amostra. A
cromatografia gasosa se beneficia da pirólise, pois através desta torna-se capaz de
analisar substâncias de alto peso molecular, e conseqüentemente com baixa pressão de
vapor, como polímeros sintéticos e naturais, tais como resinas, madeira, carvão,
borracha, e até mesmo bactérias e vírus (BLAZSO, 1997; BONFANTI et al., 1997). Ao
mesmo tempo, a cromatografia gasosa capilar ajuda a separar a mistura complexa de
31
componentes resultantes da degradação térmica de polímeros e outras substâncias de
alto peso molecular (WAMPLER, 1999).
Na pirólise, o modo de fragmentação de uma molécula é dependente da força
relativa de suas várias ligações químicas, e, portanto moléculas diferentes quimicamente
terão padrões de pirólise característicos. Segundo Wampler (WAMPLER, 1999), para
se beneficiar do alto poder de resolução fornecido através do uso de colunas
cromatográficas capilares, a pirólise deve satisfazer um requisito básico: A amostra
deve ser transferida à entrada da coluna como um “plug” o mais compacto possível,
para evitar o alargamento da banda cromatográfica extra-coluna. Para que isso aconteça,
alguns critérios devem ser observados:
a) A amostra deve ser aquecida rapidamente: se a amostra sofre
um aquecimento gradual, sua transferência da porta de injeção (pirolisador) para
a coluna, ocorrerá durante um intervalo de tempo suficiente para causar
alargamento da banda cromatográfica.
b) A amostra deve ser muito pequena: amostras grandes, além de
ultrapassar a capacidade de massa de colunas capilares, podem levar a um
aquecimento não uniforme da amostra. Em uma situação de aquecimento não
uniforme, a região da amostra que sofre aquecimento mais lento irá também ser
transferida de forma mais lenta para a coluna, o que resultará em perda de
resolução através do alargamento da banda cromatográfica.
c) O pirolisador deve ter um volume interno pequeno: Isto garante
que os produtos de pirólise sejam transferidos para a coluna de forma eficiente e
rápida pelo gás de arraste, minimizando o alargamento de pico extracoluna e
reações de degradação secundárias.
d) O fluxo de gás carreador deve ser suficiente: O fluxo de gás
carreador (gás de arraste) deve ser suficiente para a transferência rápida dos
produtos de pirólise para a coluna. Uma vez que o uso de um pirolisador
adiciona um volume morto (pois não há separação cromatográfica no
pirolisador) ao sistema, este volume, por menor que seja, deve ser
eficientemente provido com um fluxo de gás de arraste.
32
Apesar da sua ampla aplicabilidade, a pirólise analítica foi pouco explorada
quantitativamente, sendo mais utilizada para fins qualitativos. Uma das principais
razões para este fato é a baixa reprodutibilidade frequentemente atribuída a esta técnica.
Entre as razões que contribuem para a falta de reprodutibilidade, pode-se citar o
tamanho da amostra (maior do que a capacidade da coluna) e a falta de uniformidade da
mesma, falta de reprodutibilidade na velocidade de aquecimento e temperatura final do
pirolisador, e a transferência lenta do pirolisado para a coluna (WAMPLER et al.,
1987). Em resumo, a reprodutibilidade dos pirogramas (ou falta desta) pode ser
atribuída principalmente a características físico-químicas da amostra, a parâmetros do
pirolisador, à maneira como a amostra é introduzida no pirolisador, à velocidade de
aquecimento e temperatura do mesmo, e à manutenção de um fluxo de gás de carreador
constante (WHITE et al., 1991). Deste modo, todas as razões que contribuem para uma
pobre performance cromatográfica, discutidos acima, acabam contribuindo também para
uma baixa reprodutibilidade.
Segundo Tsuge e Takeuchi (TSUGE et al., 1977), são 3 os principais tipos de
pirolisadores: O pirolisador de filamento (aquecimento resistivo), o de ponto de Curie
(aquecimento indutivo) e o pirolisador de microforno. Os dois primeiros tipos são
classificados como pirolisadores de modo pulsado, enquanto que o pirolisador de
microforno é considerado como sendo de modo contínuo. A Figura 5 mostra uma
representação esquemática de um pirolisador de microforno vertical. Este pirolisador
consiste de uma zona aquecida a uma temperatura constante e pré-determinada, na qual
a amostra é inserida através de um mini-cadinho metálico para que possa sofrer pirólise.
Os detalhes deste tipo de pirolisador variam de acordo com cada fabricante, mas os
principais constituintes incluem: (A): um botão para liberar a amostra, que cai por força
da gravidade no tubo de quartzo aquecido; (B): O-ring (anel); (C): um mecanismo para
prender e liberar o cadinho (geralmente de platina) que contêm a amostra; (D): uma
entrada para o gás carreador; (E): o cadinho que contêm a amostra; (F): um tubo de
quartzo por onde a amostra é introduzida; (G): um filamento para aquecimento; (K e N):
O-rings para interfaciamento com o cromatógrafo a gás; (P): coluna cromatográfica
(cromatógrafo à gás). No pirolisador de microforno, a temperatura de pirólise é pré
configurada e a amostra, uma vez inserida na zona de pirólise, será submetida a um
aquecimento isotérmico.
33
Figura 05: Pirolisador de microforno. Reproduzido a partir de (TSUGE et al.,
1977).
O pirolisador de ponto de Curie (STANKIEWICZ et al., 1998) tem como
mecanismo de aquecimento, o ponto de Curie de metais ferromagnéticos. Quando estes
metais são submetidos a um campo de radiofrequência apropriado, eles sofrem
aquecimento até atingirem uma temperatura característica de cada material. Este tipo de
pirolisador (Figura 6) se caracteriza por possuir uma alta velocidade de aquecimento (o
Ponto de Curie do metal é alcançado em menos de 0,2 segundos), e alta
reprodutibilidade na temperatura final de pirólise. A amostra é normalmente colocada
em contato com uma fina folha do metal ferromagnético (Pyrofoil®
) ou em um
filamento do mesmo (Pyrowire®
).
34
Figura 06: Pirolisador de Ponto de Curie. Adaptado de (STANKIEWICZ et al.,
1998).
A temperatura final de pirólise depende da composição da liga metálica
utilizada. Várias ligas metálicas são disponíveis comercialmente com Pontos de Curie
que cobrem uma ampla faixa de temperatura. Os principais componentes de um
pirolisador por ponto de Curie incluem uma bobina de radiofrequência para induzir o
aquecimento, uma entrada para o gás carreador, um termopar, e um capilar para
introdução da amostra e da liga metálica, na forma de Pyrofoil®
.
O pirolisador de filamento (Figura 7) se baseia no aquecimento de amostras
colocadas em um tubo de quartzo através de uma resistência elétrica. Neste tipo de
pirolisador a amostra sofre um aquecimento durante um tempo que pode ser pré-
programado (0-100 segundos), e pode alcançar temperaturas de pirólise de até 1200 ºC.
Uma das vantagens deste tipo de pirolisador é a possibilidade de se realizar análises
seqüenciais, variando em cada intervalo a temperatura e o tempo de pirólise. Cada
modelo de pirolisador tem vantagens e desvantagens próprias, como por exemplo, a
35
capacidade limitada da massa de amostra que pode ser analisada por pirolisadores de
Ponto de Curie quando comparados com pirolisadores de filamento. Entretanto, devido
à sua reprodutibilidade na temperatura final de pirólise e à sua elevada velocidade de
aquecimento, o pirolisador de Ponto de Curie é um dos mais utilizados em aplicações
que demandam um alto grau de reprodutibilidade, em especial em aplicações
quantitativas.
Figura 07: Pirolisador de Filamento. Adaptado de (STANKIEWICZ et al.,
1998).
2.7.2. Pirólise Acoplada à Cromatografia Gasosa Capilar e
Espectrometria de Massa (Pir-CG/EM):
A técnica de pirólise acoplada à cromatografia gasosa e espectrometria de
massas (Pir-CG/EM) é uma das mais eficientes técnicas para estudo de composição
volumose de complexos de moléculas orgânicas. Constitui uma combinação poderosa
na caracterização de diversos tipos de materiais, de origem natural ou sintética,
incluindo a identificação e classificação de bactérias e vírus (KIM et al., 2003;
SOBERA et al., 2003; TALON et al., 2002).
A espectrometria de massas como sistema de detecção alia informação estrutural
importante aos componentes separados pelo cromatógrafo a gás. Em geral, a
espectrometria de massas é utilizada tendo como método de ionização impacto
eletrônico. Este método de ionização induz fragmentação abundante e reprodutível, que
pode ser utilizada para fins de identificação dos constituintes do pirolisado, geralmente
36
através de comparação com um banco de dados de espectros (biblioteca) do sistema de
aquisição. Além disso, o detector de massas pode ser considerado como “universal”,
respondendo à maioria dos compostos orgânicos com sensibilidade e especificidade.
Devido a alta sensibilidade da técnica de espectrometria de massas (WILLARD et al.,
1992), a quantidade de amostra necessária por análise é mínima, o que é essencial para
que a resolução elevada resultante do uso das colunas capilares em cromatografia
gasosa seja preservada.
As aplicações da técnica de Pir-CG/EM são muito variadas. Geralmente, para a
análise dos dados resultantes do padrão complexo de pirólise de compostos de alto peso
molecular, incluindo os dados de espectrometria de massas, técnicas de análise
estatística multivariada (tais como análise de componentes principais e análise
hierárquica de clusters) se fazem necessárias (ALVAREZ, 2004).
2.7.3. Cromatografia
A análise de produtos fitoterápicos é complexa devido à natureza da amostra,
que quase invariavelmente apresenta interferentes com características físico-químicas
muito próximas das do analito. Por isso, a seletividade do método analítico de escolha é
crítica para a validade dos resultados obtidos. As técnicas cromatográficas são bastante
utilizadas, pois envolvem a separação destes interferentes e permitem a quantificação do
analito de forma precisa, exata e sensível (MEDEIROS, 2006b).
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de
uma amostra, os quais são particionados entre duas fases, uma estacionária e outra,
móvel. A fase móvel carreia o analito pela fase estacionária, e durante essa passagem os
componentes da mistura são distribuídos de forma que cada composto é seletivamente
retido nesta fase (CIOLA, 1998).
As diferentes técnicas cromatográficas são classificadas de acordo com critérios
relacionados à técnica empregada, ao mecanismo de separação envolvido e aos
diferentes tipos de fases utilizados. Essa classificação pode ser baseada, na forma do
leito cromatográfico: cromatografia em coluna ou planar; no estado físico da fase
móvel: cromatografia gasosa, líquida e de fluido supercrítico; no mecanismo de
separação: cromatografia de adsorção, de partição, de troca iônica, de exclusão e por
afinidade. A cromatografia se destaca dentre os modernos métodos de análise química,
37
efetuando a separação, identificação e quantificação das espécies químicas (CIOLA,
1998; COLLINS et al., 1997).
Uma das aplicações principais das técnicas cromatográficas é a análise
quantitativa de componentes de uma mistura, baseado principalmente na capacidade que
a maioria das técnicas de separação tem de introduzir uma quantidade reprodutível de
amostra na coluna, e na relação linear entre a quantidade de soluto introduzido e a
resposta do sistema detector.
Onde a concentração ou distribuição da massa do soluto no espaço é descrita
pela análise do pico cromatográfico (MEDEIROS, 2006b).
2.7.4. Cromatografia Gasosa (CG)
A cromatografia gasosa é uma técnica analítica, qualitativa e quantitativa, que
permite a separação de compostos de uma mistura (amostra) através da partição dos
componentes da amostra entre uma fase líquida (estacionária) e uma fase gasosa
(móvel). A interação que ocorre entre os componentes da amostra e as duas fases é do
tipo partição gás-líquido, onde a fase estacionária é um líquido não-volátil ligado à
parede interna de um tubo capilar de sílica fundida, e a fase móvel é um gás inerte,
chamado gás carreador, H2, N2 ou He (MEDEIROS, 2006b).
A amostra é introduzida no equipamento através de um injetor sob aquecimento,
favorecendo a vaporização dos compostos, um fluxo de gás contínuo carreia a amostra
através da coluna, que se encontra em um forno, onde a temperatura pode se manter
constante, ou aumentar através de uma rampa de aquecimento. Essa programação de
temperatura favorece uma melhor separação dos compostos e diminui o tempo de
análise. O analito segue até um detector que gera um sinal para um sistema de aquisição
(ROUESSAC et al., 2000). A figura 05 apresenta um esquema de equipamento de
cromatografia gasosa.
38
Figura 08: Diagrama esquemático de um cromatógrafo a gás.
A cromatografia à gás é um dos métodos mais utilizado para a análise
quantitativa e qualitativa de componentes voláteis, ou passíveis de derivatização. Esta
técnica possui alto poder de resolução, o que torna possível a análise de dezenas de
compostos de uma mesma amostra. A identificação pode ser feita comparando-se o
tempo de retenção de um padrão com o da amostra, ou relacionar o logaritmo de um
dado de retenção com uma outra propriedade da amostra, como temperatura de
ebulição, números de átomos de carbono ou massa molecular, este método é chamado
de índice de retenção de Kovats (HARRIS, 1998). O índice de retenção tem a vantagem
de variar muito pouco, ou de maneira linear, com a temperatura.
Vários detectores podem ser utilizados, como Detector de Ionização por Chama
(FID), considerado universal já que é capaz de detectar qualquer substância orgânica;
Detector de Condutividade Térmica, que se baseia na modulação da condutividade
térmica dos gases de arraste pelos analitos; Detector de Nitrogênio/Fósforo; de
Infravermelho por Transformata de Fourier; e Espectrometria de Massas, que é seletivo,
sensível e universal (COLLINS et al., 1997).
Dependendo do tipo de substância analisada e do detector empregado, consegue-
se detectar até cerca de 10-12
g. Essa sensibilidade faz com que haja necessidade de
introduzir apenas pequenas quantidades de amostra (respeitando sempre a capacidade de
massa das colunas capilares), o que em certos casos é uma grande vantagem em relação
a outras técnicas que necessitam quantidades maiores de amostra (VOGEL, 1992) É
importante salientar que a cromatografia gasosa é excelente como técnica quantitativa,
39
sendo possível a obtenção de resultados quantitativos em concentrações que variam de
picogramas a miligramas.
A cromatografia gasosa é uma técnica com excelente poder de resolução,
tornando possível, muitas vezes, a análise de dezenas de substâncias de uma mesma
amostra. Um dos principais motivos que a torna de uso bastante acentuado é a sua
sensibilidade.
A cromatografia gasosa se aplica à análise de substâncias voláteis e
termicamente estáveis. Esta é a principal limitação de seu uso. Entretanto, mesmo com
substâncias não voláteis, muitas vezes é possível formar um derivado com estas
características através da reação do analito com um reagente de derivatização
(WILLARD et al., 1992). Esta consiste em transformar a substância de interesse em um
derivado com características adequadas para serem analisadas por cromatografia gasosa.
A derivação também pode ser usada para a introdução de grupos específicos. A análise
cromatográfica isoladamente é rápida, podendo ser efetuada em minutos. No entanto, na
maioria das vezes há necessidade de etapas de preparação da amostra, antes que ela
possa ser analisada, para que não haja interferências durante a análise e contaminação
da coluna cromatográfica. Às vezes, esta etapa de preparação é longa e complexa,
aumentando em muito o tempo e o custo da análise. Além disso, a cromatografia gasosa
não é uma técnica qualitativa eficiente, necessitando, muitas vezes, de técnicas
auxiliares para a identificação segura das substâncias presentes na amostra (WILLARD
et al., 1992).
A cromatografia gasosa é, atualmente, uma das técnicas de análise de maior uso
que fornece dados quantitativos quando são usados padrões de concentração conhecida
com a concentração desconhecida de diversos produtos e podendo também ser usada
como técnica de identificação, em casos especiais, principalmente quando acoplada a
um espectrômetro de massas ou outro tipo de detector. Os recentes avanços nessa área
fazem da cromatografia gasosa uma técnica altamente atrativa empregada nas mais
diversas áreas, como a análise ambiental, nas indústrias químicas, farmacêuticas, de
alimentos, de produtos petroquímicos e outras (ALVAREZ, 2004).
40
2.7.5. Espectrometria de Massas
A espectrometria de massa atômica é uma ferramenta versátil e largamente
usada na identificação dos elementos presentes em amostras e na determinação de suas
concentrações (SCOOG, 2002).
É uma técnica analítica baseada na determinação da massa atômica ou molecular
de uma espécie individual numa amostra. O grande desenvolvimento da técnica,
resultando no aumento de sua aplicabilidade, ocorreu a partir da década de 70, devido
ao acoplamento às técnicas cromatográficas, ao surgimento de novas formas de
ionização, e ao desenvolvimento de computadores e aplicativos. A importância do seu
acoplamento com técnicas cromatográficas se deve ao tipo de informação que se obtém,
como identificação de compostos, quantificação de compostos conhecidos e elucidação
da estrutura e de propriedades químicas de moléculas (ANDREY, 2003).
Na espectrometria de massas, moléculas gasosas são ionizadas, aceleradas por
um campo elétrico para um analisador, numa região de alto vácuo, e então separadas de
acordo com sua relação massa/carga. A grande quantidade de energia que normalmente
é fornecida à molécula para que ocorra a ionização, faz com que esta fragmente,
resultando em espectros de massas característicos de cada substância. O espectro de
massas corresponde a abundância relativa dos íons em função da razão massa/carga
(razão m/z) (ANDREY, 2003).
A ionização pode ser do tipo impacto eletrônico, ionização química, ionização
por bombardeamento de átomos rápidos (FAB), ionização a laser auxiliada por matriz
(MALDI), ionização por eletrospray (ESI) ou ionização química a pressão atmosférica
(APCI) entre outras. Na ionização por impacto eletrônico ocorre o bombardeamento da
amostra por um feixe de elétrons energéticos (variando de 20 – 120 eV), gerando íons
radicais geralmente com energia em excesso. Os espectros produzidos são bastante
reprodutíveis. A ionização química é uma técnica mais amena, produzindo menos
fragmentação que a ionização por impacto eletrônico. Os íons produzidos são do tipo
quasimoleculares [MH]+, pelo ganho ou perda de prótons, e o nível de fragmentação
dependerá da afinidade da molécula por prótons (HARRIS, 1998).
O analisador pode ser do tipo quadrupolo, tempo de vôo (TOF), setor magnético
e íon trap. No quadrupolo a separação dos íons ocorre com base na razão massa/carga,
onde os íons são transmitidos ao detector a depender da combinação e variação das
voltagens aplicadas (sempre uma superposição de voltagens DC e de radiofrequência)
41
nas barras metálicas do quadrupolo. A análise pode também ser sequencial (Tandem,
MS/MS ou MSn), usando dois ou mais estágios de análise de massas, onde um ou mais
íons são selecionados e monitorados, em seguida induzidos a sofrer fragmentação por
colisão com um gás inerte, como argônio ou hélio, e os fragmentos dos íons
selecionados são então monitorados. Duas formas de operação básica de um
instrumento de quadrupolo são possíveis: quando se deseja detectar substâncias em uma
mistura com massas diferentes (razões m/z diferentes), pode-se operar o quadrupolo no
modo de operação chamado de SCAN (com uma voltagem DC contínua e
radiofreqüência sobrepostas aplicadas ao quadrupolo), varrendo uma faixa de massa
ampla. Já quando a substância a ser analisada é conhecida, pode-se selecionar uma
razão m/z específica, de modo que o quadrupolo só transmitirá ao detector íons com
uma razão m/z pré-determinada (radiofrequência e voltagem DC fixas em um
determinado valor). Este segundo modo de detecção é chamado de SIM
(Monitoramento do íon selecionado) (HARRIS, 1998).
Quando mais de um quadrupolo (filtro de massas) é utilizado, diversas
combinações de operação do instrumento são possíveis (figura 06). No caso mais
comum, tem-se um quadrupolo, seguido de uma célula de colisão e um segundo
quadrupolo em tandem. Neste tipo de instrumento, chamado de triplo quadrupolo, cada
estágio de filtro de massas (dois ao todo) pode ser operado no modo SCAN ou SIM,
dando origem a vários modos de aquisição. No modo de aquisição chamado de
“Daughter Scan”, o primeiro quadrupolo é operado no modo SIM, selecionando o íon
molecular do composto em estudo, em seguida este íon é fragmentado na célula de
colisão e no terceiro quadrupolo, uma faixa de massa correspondente aos possíveis
fragmentos gerados é varrida pelo segundo estágio que é operado no modo SCAN. No
modo de aquisição mais seletivo e sensível, utilizado principalmente para a análise de
traços em matrizes complexas, o primeiro quadrupolo é operado no modo SIM,
selecionando um íon precursor, este íon é então induzido a se fragmentar na célula de
colisão, e o fragmento (íon filho) é transmitido pelo segundo quadrupolo, operado no
modo SIM. Deste modo, uma (ou mais) transições entre um íon pai e um íon filho são
monitoradas. Este modo de aquisição é chamado de MRM (Monitoramento de Reações
Múltiplas) (WATSON et al., 2003).
42
Figura 09: Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas de
triploquadrupolo (Quatro LC, Waters/Micromass).
43
OBJETIVOS
Geral
Desenvolver a tecnologia analítica para caracterizar os produtos obtidos
através de processos pirolíticos.
Específicos
• Estudar os processos pirolíticos nos extratos secos nebulizados das folhas e
cascas de Erythrina mulungu Linné.
• Estudar os processos pirolíticos nos extratos secos nebulizados das folhas e
cascas de Matricária chamomilla Linné.
• Estudar os processos pirolíticos nos extratos secos nebulizados das folhas e
cascas de Passiflora alata Curtis.
44
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ZAL, H.M. (2000). Herbal Medicine and the Treatment of Anxiety. Psychiatric Times 17. ZHANG, Z.J. (2004) therapeutic effects of herbal extracts and constituents in animal models of psychiatric disorders. Life Sci. 75:1659 – 99.
Capítulo II
55
“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR
DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ SECOS POR NEBULIZAÇÃO.”
5
Campo da Invenção
A presente invenção diz respeito a uma tecnologia analítica para caracterização
de extratos secos por nebulização de Erythrina mulungu Linné, na qual a amostra sofre
processo de pirólise cujos produtos obtidos são separados por cromatografia gasosa e 10
identificados por espectrometria de massa através da biblioteca espectral de Wiley para
Class-5000.
Antecedentes da Invenção
A Erythrina mulungu Mart. Ex Benth (Leguminosae-Papilionaceae), possui 15
como sinonímia científica Erythrina verna e Corallodendrum mulungu Kuntze e
popularmente é conhecida como: suína, amansa-senhor, capa-homem, canivete, bico-de-
papagaio, murungu, sapatinho-de-judeu, sananduva, corticeira, eritrina e mulungu. É
apreciada por suas belas flores avermelhadas. É uma planta da família Fabaceae, árvore
de médio porte, bem ramificada e nativa do sul do Brasil em regiões tropicais e 20
subtropicais (NEILL, 1988 e LOURENZI, 1992). Produz uma inflorescência
avermelhada, visto que essas flores têm a mesma cor de corais, por vezes, esta espécie é
também chamada de árvore de corais (LOURENZI, 1992).
Existe cerca de 115 espécies conhecidas de Erythrina Mart. (Leguminoseae,
Papilionaceae) nas regiões tropicais e subtropicais, bem como em algumas regiões 25
temperadas do mundo (NEILL, 1988) e aproximadamente metade delas foram
estudadas (GARCÍA-MATEOS, et. al., 2001). Algumas de suas espécies são utilizadas
pela população devido ao seu efeito calmante (VASCONCELOS et al., 2003).
Como em outras espécies do gênero, os alcalóides são os principais constituintes
químicos presentes em E. mulungu. Muita pesquisa foi realizada para a investigação da 30
presença de alcalóides de Erythrina na última década, uma vez que representam um
grupo de produtos químicos muito ativos e com várias propriedades e estão sempre
56
presentes nas espécies do gênero. Os alcalóides foram encontrados em 72 das 107
espécies do gênero Erythrina estudadas. Na E. mulungu é relatado cerca de 20
alcalóides isoquinolínicos. Muitos deles apresentaram atividades anti-inflamatória,
cardioativa, narcótica e sedativa.
Análises fitoquímicas demonstraram que essas plantas acumulam alcalóides 5
eritrínicos, flavonóides, terpenóides, e glicosídeos (SARRAGIOTO et. al., 1981;
SOTO-HERNANDEZ; JACKSON, 1994; NKENGFACK et. al., 1997).
Os alcalóides de E. mulungu encontrados principalmente nas cascas, flores e
sementes agem no sistema nervoso central, levando à um bloqueio neuromuscular e ao
relaxamento da musculatura lisa e ação anticonvulsivante sendo lentamente absorvidos 10
no trato intestinal e rapidamente eliminadas pela urina (GÁRIN-AGUILAR et al.,
2000).
Na sua composição fitoquímica foi demonstrada a presença dos seguintes
alcalóides: hipaforina, erisopina, eritamina, eritrina, eritrocoraloidina, erisotrina,
eritrartina, cristamina, erisodina N-óxido, erithrartina N-óxido (SARRAGIOTTO et. al., 15
1981).
Os compostos químicos alcaloídicos foram também identificados em flores de
Erythryna mulungu por BOLZANI et al., (2007), cujos resultados foram objetos da
patente PI0504517-7A.
Vegetais do gênero Erythrina são amplamente utilizados em medicamentos 20
folclóricos para tratar diversos problemas de saúde, tais como agitação, insônia, e
processos inflamatórios (GARCÍA-MATEOS, et. al., 2001).
Em algumas comunidades do Brasil, uma tintura preparada a partir de folhas ou
do decocto da casca de Erythrina mulungu é usada para acalmar agitação e outras
desordens do sistema nervoso central como insônia e depressão (ONUSIC et al., 2002; 25
RODRIGUES; CARVALHO, 2001; LEITE et al., 2000; RODRIGUES e CARVALHO,
2001). Preparações comerciais do extrato bruto de E. mulungu estão disponíveis no
Brasil e Estados Unidos em drogarias como um medicamento fitoterápico. No entanto,
há uma falta de estudos demonstrando a sua segurança, eficácia e mecanismo de ação.
Apesar do amplo uso de E. mulungu, suas propriedades só começaram a ser avaliadas 30
recentemente por estudos pré-clínicos (ONUSIC et al., 2002). Além disso, muitos
57
estudos têm investigado o potencial ansiolítico apenas do extrato bruto, não enfatizando,
por exemplo, quais componentes de E. mulungu alteraram este estado emocional.
5
Figura 01: Alcalóides isolados de E. mulungu (BOLZANI, V.S., et al,.2007).
Foi demonstrado que tratamentos agudos e crônicos com extrato hidroalcoólico
de E. mulungu produz efeitos ansiolíticos semelhantes aos provocados pelo conhecido 10
composto ansiolítico: diazepam (ONUSIC et. al., 2002, 2003). Efeitos centrais tais
como anticonvulsivante, ansiolítico, analgésico e antiinflamatório já foram
demonstrados em várias espécies pertencentes ao gênero Erythrina, incluindo E.
mulungu (DE OLIVEIRA et al., 2000; GARÍN – AGUILAR et. al. , 2000; ONUSIC et
al. , 2002, 2003; VASCONCELOS et al. , 2002, 2004; VASCONCELOS et. al., 2003). 15
Sumário da Invenção
A pirólise de matérias-primas vegetais produz um padrão de compostos químicos
complexo, denominado de pirograma, o qual pode ser utilizado para fins de 20
classificação da amostra na forma de impressão digital do material analisado. A análise
58
do pirograma usando bancos de dados de bibliotecas de espectros de massas permite
que se identifique os diferentes componentes químicos produzidos no processo
pirolítico com a vantagem de ser uma tecnologia limpa sem uso de solventes orgânicos
poluentes e outros reagentes.
Descrição detalhada do invento 5
A invenção está baseada no fato de que o processo pirolítico acoplado à
cromatografia gasosa / espectrometria de massa permite a obtenção de cromatogramas
ricos em picos cromatográficos correspondentes aos diferentes compostos químicos
produzidos nas condições estabelecidas para o processo pirolítico em extrato seco por 10
nebulização da Erythryna mulungu.
Foi estudado o extrato seco nebulizado de Erythrina mulungu para a
caracterização dos produtos obtidos através de tecnologia de pirólise na faixa de
temperatura de 350 a 750°C.
Os extratos hidroalcoólicos do pó das folhas e cascas de Erythrina mulungu 15
obtido da região Sul do país foram obtidos pelo método de extração por maceração em
proporções de água:etanol variando de 10 a 90 %. Os extratos foram secos por
nebulização num aparelho Mini-Spray Dryer, da marca LabPlant contendo 10 % de
dióxido de silício coloidal. Os sistemas de alimentação e atomização são constituídos
por uma bomba peristáltica, um atomizador com agulha injetora (0,5 mm d.i.) sob 20
pressão. Os extratos secos foram separados por sedimentação na base de um ciclone e a
circulação do fluído aquecido na temperatura de entrada a 140 °C assegurada por um
sistema de aspiração, co-corrente. A temperatura de saída variou de 90 – 95 °C sob um
fluxo de alimentação de 3,0 mL.min-1.
Para a preparação das amostras analíticas foram pesados exatamente 2 g da 25
amostra e transferidos para erlenmeyer de 25 mL adicionando-se 4 mL de solução
água:metanol (1:1). Esta solução foi sonicada durante 20 minutos. Em seguida filtrada
através de papel de filtro faixa preta de 125 mm (84 g/m2 de gramatura, velocidade de
filtração de 10 mL/9 s, porosidade de 12,5 – 15,0 µm). Foi transferida uma alíquota de
500 µL do filtrado para tubo ependorf e adicionados 500 µL da solução de água:metanol 30
(1:1) e homogeneizado.
59
O processo pirolítico do extrato seco de Erythrina mulungu, foi conduzido
usando um pirolizador (Shimadzu, Pyr-4A) diretamente acoplado a um sistema de
cromatografia gasosa/espectrometria de massas (Shimadzu, GCMS-QP5050A).
Utilizou-se uma coluna de 5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano com 30 m de
comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de tamanho de partícula. A 5
temperatura da interface foi de 300 ºC. O forno foi operado com a seguinte
programação de temperatura 50ºC (inicial) e 9ºC/ min até 280ºC. Utilizou-se como gás
de arraste o Hélio a um fluxo de 1,4 mL/min e uma razão de split de 1:16. O
espectrômetro de massas foi configurado para varrer uma faixa de massa entre 50 e 450
u.m.a. Os espectros de massas foram obtidos por impacto eletrônico a uma energia 70 10
eV.
Foram injetados diretamente no pirolizador, com auxílio de uma seringa, um
volume fixo de 1µL da amostra. Os processos pirolíticos foram estudados na faixa de
temperatura de 350 a 750°C.
Os compostos químicos produzidos nos processos pirolíticos foram identificados 15
através da análise comparativa dos seus espectros de massas com os espectros de
massas da biblioteca Wiley, 6th
Edition for Class-5000 de 1999, com 229.119
espectros).
Estado da técnica da invenção desejada 20
A literatura apresenta diversas técnicas de separação e identificação de
constituintes de matrizes complexas, como as matérias-primas vegetais, tais como,
cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia em camada delgada,
cromatografia gasosa e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, 25
eletroforese capilar, espectroscopia de ressonância magnética nuclear, cromatografia
gasosa combinada com análises de componente principal vêm sendo utilizadas na
investigação de compostos isolados de diferentes grupos químicos (FLAUSINO, JR.O,
et al.,2007; CHRISTY, A.A., et al.,1998; DE FERRANTE, et al.,2007;
PADASHETTY, S.A. et al.,2007; DHALWAL, K. et al., 2007; WAN, J.; et al.,2007; 30
YI, T., et al., 2007; LI, Y. et al.,2006; MA, L., et al.,2007; I, Y., et al., 2006;) dos quais,
certo número de compostos ativos são identificados e quantificados por essas técnicas,
60
mas nem sempre dão acesso à qualidade intrínseca total da planta e, portanto ainda não
têm sido utilizadas como ferramenta para a caracterização de material vegetal no
controle da qualidade dessas amostras vegetais, no contexto de fitocomplexos.
A patente PI0504517-7 A, teve como objetivo a padronização química de
extratos brutos secos por rotavapor e por liofilização de flores da Erythrina mulungu, 5
especificamente em relação aos compostos alcaloídicos derivados da eritrina que
incluem a 11-OH-eritravina, seus isósteros, sais, derivados e/ou solvatos, eritrartina e/ou
eritravina isolados de extrato bruto ou da fração purificada da Erythryna mulungu ou
sintetizados quimicamente.
O controle da qualidade de fitoterápicos tem empregado técnicas 10
cromatográficas líquida e gasosa com o uso de diferentes detectores na identificação e
quantificação de um ou vários marcadores do material vegetal ou seus extratos e
produtos.
Métodos analíticos para identificação de compostos químicos da Erythrina
mulungu droga vegetal, seus extratos e produtos são pouco citados na literatura 15
especializada. Dados atuais mostram que foram publicados 17 trabalhos com estudos
desta planta e seus extratos, sendo 13 deles voltados para estudos farmacológicos sobre
a atividade no sistema nervoso central de animais de laboratórios, 01 com atividade
antibacteriana, 01 com isolamento e identificação de alcalóides, 01 com estudos
farmacognósticos e 01 com composições farmacêuticas. Métodos analíticos qualitativos 20
e quantitativos para componentes químicos da Erythrina mulungu na forma de extratos
secos e produtos não constam da literatura.
A tecnologia analítica baseada em processos pirolíticos é bastante utilizada para
caracterização de polímeros com alto peso molecular que são transformados em
moléculas menores e, portanto capazes de serem identificadas. 25
A presente invenção buscou associar a tecnologia pirolítica, que catalisa a
transformação de compostos químicos originais de um material em novos compostos,
com a cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM), que permite identificar
os compostos químicos formados a partir da tecnologia pirolítica. Como resultado da
associação dos processos pirolíticos dos extratos secos por nebulização da Erytrhina 30
mulungu com a cromatografia gasosa/espectrometria de massas foi possível identificar
todos os compostos químicos produzidos a partir desta matéria-prima. O cromatograma
61
resultante com a riqueza de picos cromatográficos permitiu a caracterização dos extratos
secos por nebulização das cascas e folhas de Erythrina mulungu na forma de impressão
digital.
Não foram encontradas referências de aplicação da técnica utilizada na presente
invenção (Pir-CG/EM), nos bancos de dados pesquisados – Periódicos CAPES, 5
Scifinder e MedLine, para caracterização de extratos secos de Erythrina mulungu.
No quadro abaixo, está representada a lista padrão de substâncias fornecidas pela
comparação dos pirogramas obtidos com a biblioteca espectral.
Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Erythrina 10
mulungu Linné obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de
temperatura de 350 a 750°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey.
Substância Química Obtida por Pirólise Dados químicos
Nome Fórmula P.M.
(+)-3-methylcyclopentanone C6H10O 98 (4.2.2)propella-7,9-diene Tricyclo[4.2.2.0(1,6)]deca-7,9-diene (CAS)
C10H12 132
.beta.-angelica lactone C5H6O2 98 1-(2,3-epoxypropoxy)-2-propene C8H14O 126 1,2,3,4-cyclopentanetetrol, (1.alpha.,2.beta.,3.beta.,4.alpha.)- (CAS)
C5H10O4 134
1,2,4 – cyclopentanetrione –(CAS) C5H4O3 112 1,2,4 – cyclopentanetrione, 3-ethyl–(CAS) C7H8O3 140 1,2-benzenedicarbonitrile (CAS) Phthalonitrile
C8H4N2 128
1,2-benzenedicarboxilic acid, bis(2-methylpropyl) ester (CAS) Isobutyl Phthalate
C16H22O4 278
1,2-benzenedicarboxilic acid, butyl 2-methylpropyl ester (CAS) N-Butyl Isobutyl Phthalate
C16H22O4 278
1,2-benzenedicarboxilic acid, butyl cyclohexyl ester Phthalic acid, butyl cyclohexyl ester
C18H24O4 304
1,2-benzenedicarboxilic acid, dibutyl ester (CAS) Di-N-Butyl Phthalate
C16H22O4 178
1,2-benzenedicarboxilic acid, dibutyl ester (CAS) Butyl Phthalate
C16H22O4 278
1,2-benzenedicarboxilic acid, dilpropyl ester (CAS) Propyl Phthalate
C14H18O4 250
62
1,2-benzenedicarboxilic acid, dipentyl ester (CAS) Amyl Phthalate
C18H26O4 306
1,2-cyclohexanedione-(CAS) C6H8O2 112 1,2-dimethylbenzene 0-xylene
C8H10 106
1,3 – cyclohexanedione, 4-propyl–(CAS) C9H14O2 154 1,3,5,7- cyclooctatetraene (CAS) C8H8 104 1,3-benzenedicarbonitrile (CAS) Isophthalonitrile
C8H4N2 128
1,3-cyclopentadiene, 5-(1-methylethylidene)- (CAS) 6,6-dimethylfulvene
C8H10 106
1,3-cyclopentadienone, 2-methyl- (CAS) C6H8O2 112 1,3-cyclopentadienone, 4-propyl- (CAS) C9H14O2 154 1,3-cyclopentanedione – (CAS) C5H6O2 98 1,3-cyclopentanedione, 2-methyl – (CAS) C6H8O2 112 1,3-diphenyl-2-(phenylimido)propan-1,3-dione 1,3-propanedione, 1,3-diphenyl-2-(phenylimino)- (CAS)
C21H15NO2 313
1,3-propanediol C3H8O2 76 1,4- cyclohexanedione (CAS) Tetrahydroquinone
C6H8O2 112
1,4-benzenedicarbonitrile (CAS) Terephthalonitrile
C8H4N2 128
1,4-cyclohexadienone (CAS) Tetrahydroquinone
C6H8O2 112
1-acetoxy-2-propanol C5H10O3 118 1-hexen-3-ol Propylvinylcarbinol
C6H12O 100
1H-Imidazole, 2,4-dimethyl- (CAS) C5H8N2 96 1H-Imidazole, 2-ethyl- (CAS) C5H8N2 96 1H-indene (CAS) indonaphtene
C9H8 116
1H-indene, 1-chloro-2,3-dihydro- (CAS) C9H9Cl 152 1H-Indene-1-methylene- (CAS) C10H8 128 1H-Pyrazole, 3,5-dimethyl- (CAS) 3,5-dimethylpyrazole
C5H8N 96
1-nitro-2-phenylethane C8H9NO2 151 1-octen-3-ol C8H16O 128 1-Penten-3-ol (CAS) Ethyl vinyl carbinol
C5H10O 86
1-propanol, 3-chloro- (CAS) C3H7ClO 94 1-propen-1-thiol C3H6S 74 2(3H)-Furanone, 5-methyl- (CAS) .alpha.-angelica lactone
C5H6O2 98
2(3H)-pyridazinone, 4,5-dihydro-6-methyl-(CAS) C5H8N2O 112 2,2-pyrrolidinedione, 1-methyl-3-phenyl- (CAS) Phensuximide
C11H11NO2 189
63
2,3,4,5-cyclopentanetetrol, (1.alpha.,2.beta.,3. alpha.,5. beta.)- (CAS)
C6H12O4 148
2,3,7-trimethyloctanal C11H11O 170 2-amine-2-methylpropanediol-(1,3) C4H11N2O 105 2-cyclopenten-1-one,2-hydroxy-3-methyl-(CAS) Corylone
C6H8O2 112
2-Decanone C10H20O 156 2-furanmethanol (CAS) Furfuryl alcohol Furylcarbinol
C6H5O2 98
2-heptanone, 6-methyl- (CAS) C8H16O 128 2-hexanone-5-methyl- (CAS) Isamyl methyl ketone
C7H14O 114
2H-Inden-2-one, 1,3-dihydro- (CAS) 2-Indanone
C9H8O 132
2-hydroxy-2-cyclopenten-1-one C5H6O2 98 2-methyl-3-phenylthiirene 1,1-dioxide Thiirene, methylphenyl-, 1,1-dioxide (CAS)
C9H8O2S 180
2-methylhexanoic acid C7H14O2 130 2-methyl-propan-1-ol C4H10O 74 2-methylvaleric acid C6H12O2 116 2-nonanone C9H18O 142 2-pentanone-4methyl-(CAS) Methyl isobutil ketone
C6H12O 100
2-penten-1-ol,(E)-(CAS) Trans-PENT-2-ENOL
C5H10O 86
2-pentenal, 2-methyl- (CAS) C6H10O 98 2-pentene, 3-ethyl-(CAS) C7H14O 98 2-pyridinecarbonitrile (CAS) 2-cyanopyridine Picolinonitrile
C6H4N2 104
2-Undecanone Methyl nonyl ketone
C11H22O 170
3(2H)-pyridazinone, 4,5-dihydro-6-methyl- (CAS) 2,3,4,5-tetrahydro-6-methyl-3-oxopyridazide
C5H8N2O 112
3,4-diphenyl-3,4-dimethyl-hexa-1,5-diyne Cyclopropane, 1,1’-(1,2-diethynyl-1,2-dimethyl-1,2-ethanediyl)bis- (CAS)
C14H18 186
3,6-dicyclopropyl-3-methyl-hepta-4,5-diene-1-yne Cyclopropane, 1,1’-(4-ethynyl-1,4-dimethyl-1,2-butadiene-1,4diyl)bis- (CAS)
C14H18 186
3-Butene-1,2-diol (CAS) Erythrol
C4H8O2 88
3-methyl pentanoic acid 3-methyl valeric acid
C6H12O2 116
3-pentanol C5H12O 88
64
3-pentanone, 2,2-dimethyl- (CAS) tert-butyl ethyl ketone
C15H20O2 114
3-pentenone (CAS) Diethyl ketone
C10H22 142
4-phenylamino-6-ethoxycarbonyl-1-phenyl-1H-pyrazolo(4,3-c)pyridine
C21H18N4O2 358
5-hepten-3-one, 5-methyl-, cis/trans C5H10O 86 7-octen-4-ol (CAS) 1-octen-5-ol
C8H16O 128
9-octadecenoic acid (Z)- (CAS) Oleic acid
C18H34O2 282
Acetic acid, methyl ester (CAS) Methyl acetate
C3H6O2 74
Allyl ethyl ether C5H10O 86 Anthracene (CAS) C14H10 178 Azetidine, 2-phenyl- (CAS) C9H11N 133 Aziridine,2-methyl-3-(1-methylethyl)-1-(2-propenyl)-, trans- (CAS)
C9H17N 86
Aziridinone,1,3-bis(1,1-dimethylethyl)-(CAS) C10H19NO 169 Azulene (CAS) Cyclopentacycleheptene
C10H8 128
Benz(a)azulene C14H10 178 Benzene, 1,3-dimethyl- (CAS) m-xylene
C8H10 106
Benzene, 1,4-dimethyl- (CAS) p-xylene
C8H10 106
Benzene, 1-propynyl- (CAS) C9H8 116 Benzene, ethyl- (CAS) Phenylethane
C8H10 106
Benzene,1,1’-(1,2-ethynedyl)bis – (CAS) C14H10 178 Benzenemethanimine Benzaldimine
C7H7N 105
Benzenemethanol C7H8O 108 Bicyclo(4.4.1)undeca-1,3,5,7,9-pentaen-11-one (CAS) C11H8O 156 Bicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene (CAS) Benzenecyclobutane Cardene
C8H8 104
Borinic acid, diethyl (CAS) DIETHYL- BORIC ACID
C4H11BO 86
Butane, 1-(2-propeniloxy)-(CAS) Allyl n-butyl ether
C7H14O 114
Butanedial (CAS) Succinilaldehyde
C4H6O2 86
Butyl-2-ethylhexyl phthalate C20H26O4 330 Cyclohexaneethanamine, N-.alpha.-dimethyl- (CAS) C10H21N 155 cyclohexanone C6H10O 98
65
Cyclohexanone, 2-prothyl-(CAS) C3H6O 140 Cyclohexanone, 5-methyl-2-(1-methylethyl)-, cis- (CAS) Isomenthone
C10H18O 154
Cyclohexene, 1(1,1-dimethylethoxy)-2-methyl- (CAS) C11H20O 168 Cyclohexene,1-(1,1-dimethylethoxy)-2-methyl- (CAS) 1-methyl-2-T-butoxycyclohexene
C11H20O 168
Cyclopentanol (CAS) C5H10O 86 Cyclopentene, 1-ethenyl-3-methylene- (CAS) C8H10 106 Decanoic acid (CAS) Capric acid
C10H20O2 172
Diazene, Bis(1,1-Dimethylethyl)-(CAS) 1-1-1’,1’-TETRAMETHYLAZOETANE
C8H18N2 142
Di-Isopentyl Phthalate C18H26O4 306 Di-N-butyl phthalate C16H22O4 278 Docosanoic acid Behenic acid
C22H44O2 340
Eicosanoic acid (CAS) Arachidic acid
C20H40O2 312
Ethyl.alpha.-azido-.beta.-[(1-pheny)-5-pyrazolyl]acrylate C14H13N5O2 283 Furan, 2,5-dihydro-3,5-dimethyl- (CAS) C6H10O 98 Furan, 2,5-dimethyl- (CAS) C6H8O 96 Heptadecanoic acid (CAS) Margaric acid
C17H34O2 270
Heptane-2,3,5-trimethyl-(CAS) 2,3,5-trimethyleptane
C10H22 142
Heptane-2,3,6-trimethyl-(CAS) C26H30O16 142 Heptanoic acid C7H14O2 130 Hexadecanal, 2-methyl- (CAS) Formylhexadecane
C17H34O 254
Hexadecanoic acid (CAS) Palmitic acid
C16H32O2 256
Hexadecanoic acid, 2,3-dihydroxypropyl ester (CAS) 1-monopalmitin
C19H38O4 330
Hexadecanoic acid, 2-hydroxy-1,3propanediyl ester (CAS) 1,3-dipalmitin
C35H68O5 569
Hexanal, 2-methyl-(CAS) C7H14O 114 Hexanoic acid (CAS) Caproic acid
C6H12O2 116
Lactic acid, monoanhydride with 1-butaneboronic acid, cyclic ester (CAS)
C7H13BO3 156
L-histidine, 1-methyl- L- (CAS) C7H11N3O2 169 L-treonine, ethyl ester (CAS) C6H13NO3 147 Methanamine, N-methyl-N-nitroso- (CAS) Dimethylnitrosamine
C2H6N2O 74
Methyl ethanoate C3H6O2 74 N-(3-butenyl)-dimethylamine C3H13N 99
66
Naphtalene C10H8 128 Nitroso dimethylamine C2H6N2O 74 Nitrous acid, butyl ester (CAS) n-butyl nitrite
C4H9NO2 103
Nonadecanoic acid C19H38O2 298 Nonanoic acid Pelargic acid
C9H18O2 158
N-phenyl-4a,8a.-(oxoiminooxo)naphtalene C18H13NO2 275 octadecanoic acid (CAS) Stearic acid
C18H36O2 284
Octanoic acid Caprylic acid
C8H16O2 144
Oxetane (CAS) Trimethylene oxide
C3H6O 58
Oxirane, 2,3-diethyl- (CAS) 3,4-hepoxyhexane
C6H12O 100
Pentadecanilic acid (CAS) Pentadecylic acid
C15H30O2 242
PENTANAL C5H10O 86 Pentanal, 2,4-dimethyl – (CAS) Valeraldehyde, 2,4-dimethyl
C7H14O 114
Pentanal, 3-hydroxy-2-methyl Valeraldehyde, 3-hydroxy-2-methyl
C6H12O2 116
Pentanoic acid Valeric acid
C5H11O2 102
Phenanthrene (CAS) C14H10 178 Phenol, 2-methyl- (CAS) o-toluol
C7H8O 108
Phenol, 3-methyl- (CAS) m-toluol
C7H8O 108
Phenol, 4-methyl- (CAS) p-toluol
C7H8O 108
Phthalic acid, butyl ester, with butyl glycolate (CAS) C18H24O6 336 Piperidine,2,6-dimethyl – (CAS) C7H15N 113 Propanal (CAS) C3H6O 58 Propanenitrile, 3-(dimethylamino)- (CAS) C5H10N2 98 Propanoic acid Propionic acid
C3H6O2 74
Propanoic acid, 2 propenyl ester(CAS) Allyl propionate
C6H10O2 114
Propanoic acid, 2-diazo-3methylphenylamino0-3-oxo-,ethyl ester
C12H13N3O3 247
Propanoic acid-2,2-dimethyl-(CAS) Pivalic acid
C5H10O2 102
S-N,N’-dimethyl-1,2-propanediamine C5H14N2 102 Styrene C8H8 104
67
Benzene, Ethenyl- (CAS) Tetradecanoic acid (CAS) Myristic acid
C14H28O2 228
Trimethyl-aluminum C3H9Al 72 Undecanal, 2-methyl- (CAS) C12H24O 184 Urea, methyl- (CAS) C2H6N2O 74
5
Figura 02 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das folhas e cascas de
Erythrina mulungu Linné na faixa de temperatura de 350 a 750°C.
68
REINVINDICAÇÕES
5
1. Uso da tecnologia pirolítica para obtenção dos compostos químicos, constantes no
quadro I desta patente, produzidos no processo pirolítico dos extratos secos por
nebulização dos pós das folhas e cascas da Erythrina mulungu, caracterizada por
compreender:
- processo pirolítico na faixa de 350 – 750ºC 10
- 167 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I
2. Uso da tecnologia pirolítica acoplada a cromatografia gasosa/espectrometria de
massas para caracterização dos extratos secos por nebulização dos pós das folhas e
cascas da Erythrina mulungu, caracterizada por compreender:
- processo pirolítico na faixa de 350 – 750ºC 15
- 167 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I
69
Resumo
TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR 5
DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ SECOS POR NEBULIZAÇÃO.
A presente invenção proporciona a utlilização da tecnologia analítica baseada na
pirólise para a obtenção de produtos de decomposição dos constituintes dos extratos
secos nebulizados de Erythrina mulungu Linné separação desses compostos por 10
cromatografia gasosa e identificação por espectrometria de massa, fornecendo uma
caracterização dos extratos na faixa de temperatura de 350 a 750° C, constando de um
total de 167 compostos químicos obtidos.
Anexo I
71
Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados defolhas de Erythrina mulungu, Linné a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 450°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
1 4.785 2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) .alpha.Angelica lactone
98 C5H6O2 90
2 6.406 2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) Corylone
112 C6H8O2 95
3 7.609 1-Penten-3-ol 86 C5H10O 90 -
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
72
Cont.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
1 4.785 2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) .alpha.Angelica lactone
98 C5H6O2 90
2 6.406 2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) Corylone
112 C6H8O2 95
3 7.609 1-Penten-3-ol 86 C5H10O 90 -
4 13.995 1,2,3,4-Cyclopentanetetrol, (.alpha..,2.beta.,3beta.,4.alpha.)- (CAS)
134 C5H10O4 83
5 19.869 9-octadecenoic acid (Z)- (CAS) Oleic acid
282 C18H34O2 87 Me(CH2)7CH:CH(CH2)7CO2H
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
73
Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados das folhas de Erythrina mulungu, Linné a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 750°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
1 3.475 Furan, 2,5- Dimethyl- (CAS)
96 C5H8O 80
2 4.140 Benzene, ethenyl- (CAS) Styrene
104 C8H8 92
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
74
Cont.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
3 5.076 2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) .alpha.Angelica lactone
98 C5H6O2 90
4 6.634 1H-Indene (CAS) 116 C9H8 80
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
75
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Capítulo III
80
TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR
DE EXTRATOS DE Matricaria chamomilla LINNÉ SECOS POR
NEBULIZAÇÃO. 5
A presente invenção diz respeito a uma tecnologia analítica para caracterização
de extratos secos por nebulização de flores de Matricaria chamomila Linné, na qual a
amostra sofre processo de pirólise cujos produtos obtidos são separados por
cromatografia gasosa e identificados por espectrometria de massa através da biblioteca 10
espectral de Wiley para Class-5000.
Descrição do Estado da Técnica
O gênero Matricaria (Asteraceae) é uma fonte de fitomedicamentos de crescente
importância freqüentemente utilizada (DRAGLAND et al., 2003), empregada como
componente de misturas para chás e como um valioso ingrediente de muitas preparações 15
galênicas tais como tinturas e extratos (ZAITER, et al.,2007)
Flores secas de Matricaria chamomilla Linné são largamente utilizadas para
provocar efeitos sedativos, espasmolíticos e anti-inflamatórios. Estudos demonstraram
que os componentes responsáveis por esses efeitos ainda não foram completamente
caracterizados (AVALLONE, et al., 2000). 20
Foi demonstrada atividade depressiva da infusão liofilizada de flores de M.
chamomilla, no sistema nervoso central em camundongos (DELLA LOGGIA et al.,
1982). Muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de esclarecer quais
componentes são responsáveis pelo efeito sedativo. Foi demonstrado, também, que M.
chamomilla contém vários ligantes dos receptores benzodiazepínicos, dos quais o mais 25
interessante, do ponto de vista farmacológico, é o flavonóide apigenina. Os autores
relatam que a apigenina exibe atividade ansiolítica em camundongos sem nenhum efeito
sedativo ou miorelaxante (VIOLA, et al., 1995).
Entre as 16 das mais de 80 espécies do gênero estudadas quimicamente, os
constituintes de maior importância encontrados foram sesquiterpenos e flavonoides. Os 30
resultados obtidos com M. chamomilla indicam a presença de sesquiterpenos lactonas
dos tipos eudesmanolídeo, germacranolídeo e guaianolídeo e um glicosil monoterpeno
81
(ZAITER, et al.,2007), e alguns derivados cumarínicos, como a 7-metoxicumarina e 7-
hidroxicumarina, componentes aos quais se atribuem suas propriedades espasmolíticas
(COSTA, 2002).
Análises do extrato metanólico de M. chamomila, por HPLC revelaram a
presença de vários compostos capazes de se ligar a receptores benzodiazepínicos 5
centrais, os quais ainda estão em processo de identificação. Um desses compostos foi
identificado por HPLC-ESI-MS/MS, como apigenina.
10
Figura 01 – Alguns constituintes químicos isolados de M. chamomilla
Os estudos levam a crer que os efeitos sedativos dos extratos de M. chamomilla
são obtidos por outros compostos com atividade nos receptores benzodiazepínicos 15
(AVALLONE, et al., 2000).
82
Sumário da Invenção
A pirólise de matérias-primas vegetais produz um padrão de pirólise complexo,
denominado pirograma, que pode ser utilizado para fins de classificação da amostra na
forma de impressão digital do material analisado. A análise do pirograma usando 5
bancos de dados de bibliotecas de espectros de massas permite que se identifique os
diferentes compostos químicos produzidos no processo pirolítico com a vantagem de ser
uma tecnologia limpa sem uso de solventes orgânicos poluentes e outros reagentes.
Descrição Detalhada do Invento 10
A invenção está baseada no fato de que o processo pirolítico acoplado a
cromatografia gasosa / espectrometria de massa permite a obtenção de cromatogramas
ricos em picos cromatográficos correspondentes aos diferentes compostos químicos
produzidos nas condições estabelecidas para o processo pirolítico em extrato seco por 15
nebulização da Matricaria chamomilla.
Foi estudado o extrato seco nebulizado de flores de Matricaria chamomilla, para
a caracterização dos produtos obtidos através de tecnologia de pirólise na faixa de
temperatura de 350 a 650°C.
Os extratos hidroalcoólicos do pó das flores de Matricaria chamomilla 20
cultivadas no município do Conde-PB, foram obtidos pelo método de extração por
maceração (à frio) em proporções de água:etanol variando de 10 a 90 %. Os extratos
foram secos por nebulização num aparelho Mini-Spray Dryer, da marca LabPlant
contendo 10 % de dióxido de silício coloidal. O sistema de alimentação e atomização é
constituído por uma bomba peristáltica, um atomizador com agulha injetora (0,5 mm 25
d.i.) sob pressão. Os extratos secos foram separados por sedimentação na base de um
ciclone e a circulação do fluído aquecido na temperatura de entrada a 140 °C assegurada
por um sistema de aspiração, co-corrente. A temperatura de saída variou de 90 – 95 °C
sob um fluxo de alimentação de 3,0 mL.min-1.
Na preparação das amostras foram pesados exatamente 2 g da amostra e 30
tranferidos para erlenmeyer de 25 mL adicionando-se 4 mL de solução água:metanol
(1:1). Esta solução foi sonicada durante 20 minutos. Em seguida filtrada através de
83
papel de filtro faixa preta de 125 mm (84 g/m2 de gramatura, velocidade de filtração de
10 mL/9 s, porosidade de 12,5 – 15,0 µm). Foi transferida uma alíquota de 500 µL do
filtrado para tubo eppendorff e adicionados 500 µL da solução de água:metanol (1:1) e
homogeneizado.
O processo pirolítico do extrato seco de Matricaria chamomilla, foi realizada em 5
um pirolizador (Shimadzu, Pyr-4A) diretamente acoplado a um cromatógrafo a gás
interfaciado com espectrômetro de massas (Shimadzu, GCMS-QP5050A). Utilizou-se
uma coluna de 5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano com 30 m de comprimento, 0,25 mm
de diâmetro interno e 0,25 µm de tamanho de partícula. A temperatura da interface foi
de 300 ºC. O forno foi operado com a seguinte programação de temperatura 50ºC 10
(inicial) e 9ºC/ min até 280ºC. Utilizou-se como gás de arraste o Hélio a um fluxo de 1,4
mL/min e uma razão de split de 1:16.
O espectrômetro de massas foi configurado para varrer uma faixa de massa entre
50 e 450 u.m.a. Os espectros de massas foram obtidos por impacto eletrônico a uma
energia 70 eV. 15
Foram injetados diretamente no pirólise, com auxílio de uma seringa, um
volume fixo de 1µL de padrão e amostra, separadamente. Foram utilizadas as seguintes
temperaturas de pirólise: 350°C, 450ºC, 550ºC e 650ºC.
Os compostos químicos produzidos nos processos pirolíticos foram identificados
através da análise comparativa dos seus espectros de massas com os espectros de 20
massas com o espectro de massas da biblioteca Wiley, 6th
Edition for Class-5000 de
1999.
Estado da técnica da invenção desejada
A literatura apresenta diversas técnicas de separação e identificação de 25
constituintes de matrizes complexas, como as matérias-primas vegetais. Técnicas como
cromatografia em camada delgada, cromatografia gasosa e cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas, eletroforese capilar, espectroscopia de ressonância
magnética nuclear, cromatografia gasosa combinada com análises de componente
principal, vêm sendo utilizadas na investigação de compostos isolados de diferentes 30
grupos de químicos de M. chamomilla, entre eles, lactonas, flavonóides, óleos
84
essenciais, compostos fenólicos (AVALLONE. R. et al.,2000; ZAITER, L. et al.,2007;
NARDER. N., et al.,2006; BLAZEKOVIC, B. STANIC, G. et al.,2004; HETHELYI, B.
et al.,2002; FONSECA, F. et al., 2002; REPCAK, M. et al., 2001; RUBIOLO, P. et
al.,2006; SCHILCHER, H. et al., 2005) .
O controle da qualidade de fitoterápicos têm empregado técnicas 5
cromatográficas líquida e gasosa com uso de diferentes detectores na identificação e
quantificação de um ou vários marcadores do material vegetal ou seus extratos e
produtos.
Métodos analíticos para a identificação de compostos químicos da M.
chamomilla droga vegetal, seus extratos e produtos são pouco citados na literatura 10
especializada. Dados recentes mostram que foram publicados 13 trabalhos com estudos
com essa espécie e seus extratos envolvendo estudos fitoquímicos e farmacológicos.
A presente invenção buscou associar a tecnologia pirolítica, que catalisa a
transformação de compostos químicos originais de um material em novos compostos,
com a cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM), que permite identificar 15
todos os compostos químicos formados a partir da tecnologia pirolítica. Como resultado
da associação dos processos pirolíticos dos extratos secos por nebulização da
Matricaria chamomilla com a cromatografia gasosa/ espectrometria de massas foi
possível identificar todos os compostos químicos produzidos a partir desta matéria-
prima. O cromatograma resultante com a riqueza de picos cromatográficos permitiu a 20
caracterização dos extratos secos por nebulização das folhas de Matricaria chamomilla
na forma de impressão digital.
Não foram encontradas referências de aplicação da técnica utilizada na presente
invenção (Pir-CG/EM), nos bancos de dados pesquisados – Periódicos CAPES,
Scifinder e MedLine, para caracterização de extratos secos de Matricaria chamomila. 25
No quadro abaixo, está representada a lista padrão de substâncias fornecidas pela
comparação dos pirogramas obtidos com a biblioteca espectral.
30
85
Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Matricaria
chamomila Linné obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de
temperatura de 350 a 650°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey.
Dados Químicos e
Probabilidade Substância Química Obtida por Pirólise
Fórmula P.M.
(+)-3-methylcyclopentanone C6H10O 98
1,2,3,4-cyclopentanetretol,
(1.alpha.,2.beta.,3.beta.,4.alpha.)- (CAS)
1,2,3,4-tetrahydroxy-cyclopentane
C5H10O4 134
1,2,4-Cyclopentenetrione (CAS) C5H4O3 112
1,2,4-Cyclopentenetrione, 3-ethyl- (CAS) C7H8O3 140
1,2-cyclohexanedione (CAS) C6H8O2 112
1,2-Cyclopentanediol trans- (CAS) C5H10O2 102
1,3,5,7-cyclooctatetraene (CAS) C8H8 104
1,3-Cyclohexanedione, 4-propyl- (CAS) C9H14O2 154
1,3-cyclopentadione C5H6O2 98
1,3-cyclopentenedione, 2-methyl- (CAS) C6H8O2 112
1-Formylcyclopentene C6H8O 96
1-Hexen-3-ol (CAS)
Propyl vinyl carbinol C6H12O 100
1H-Imidazole, 4,5-dihydro-2,4-dimethyl- (CAS) C5H10N2 98
1H-Pyrazole, 3,5-dimethyl- (CAS) C5H8N2 96
1-nonen-3-ol (CAS)
Hexylvinylcarbinol C9H18O 142
1-octen-3-ol
Amyl vinyl carbinol C8H16O 128
1-penten-3-ol (CAS)
Ethyl vinyl carbinol C5H10O 86
1-penten-3-ol (E)- (CAS) C5H10O 86
1-penten-3-ol, 4-methyl- (CAS) C6H12O 100
86
1-penten-3-one (CAS) C5H8O 84
2(3H)-furanone, 5-methyl- (CAS)
.alpha.-Angelica lactone C5H6O2 98
2(5H)-furanone, 5-methyl- (CAS)
.beta.-Angelica lactone C5H6O2 98
2,4-dimethylfuran C6H8O 96
2-Butenal, 2-ethenyl- (CAS) C6H8O 96
2-cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS)
Corylone C6H8O2 112
2-cyclopenten-1-one, 2-methyl- (CAS)
2- methyl-2-cyclopenten-1-one C6H8O 96
2-cyclopenten-1-one, 3-methyl- (CAS)
3- methyl-2-cyclopenten-1-one C6H8O 96
2H-1-Benzopyran-2-one, 7-methoxy- (CAS)
7-methoxycoumarin C10H8O3 176
2-Hexen-1-ol, (E)- (CAS) C6H12O 100
2-penten-1-ol (Z)- (CAS)
Z-2-pentenol C5H10O 86
2-pentenal, 2-methyl- (CAS)
.alpha.-methyl-.beta.-ethylacrolein C6H10O 98
2-pentene, 3-ethyl- (CAS) C7H14 98
3 methyl pentanoic acid
3 methyl valeric acid C6H12O2 116
3(2H)-Pyridazinone, 4,5-dihydro-6-methyl- (CAS) C5H8N2O 112
3-butene-1,2-diol (CAS)
Erythrol C8H16O 128
4-pentenal, 2-ethyl (CAS) C7H12O 80
5-methyl hexanoic acid C7H14O2 130
7-octen-4-ol (CAS)
1-octen-5-ol C8H16O 128
9-octadecenoic acid (Z)- (CAS) C18H34O2 282
87
Oleic acid
Aziridine, 2-methyl-3(1-methylethyl)-1-(2-propenyl)-,
trans- (CAS) C9H17N 139
Aziridone, 1,3-bis(1,1-dimethylethyl)- (CAS) C10H19NO 169
Benzene, propyl- (CAS)
Isocumene C9H12 120
Benzeneacethaldehyde (CAS) C8H8O 120
Benzofuran, 4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl- (CAS)
Menthofuran C10H14O 150
Bicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene (CAS)
Cardene C8H8 104
Borinic acid, diethyl- (CAS) C4H11BO 86
Cis-2-pentenol C5H10O 86
Cyclohexanone C5H10O 98
Cyclohexanone, 2-ethyl- (CAS) C8H14O 126
Cyclohexanone, 2-propyl- (CAS) C9H16O 140
Cyclopentane, ethylidene- (CAS) C7H12 96
Cyclopentanol C5H10O 86
Cyclopentanone (CAS) C5H8O 84
Cyclopentanone, 3-methyl C6H10O 98
Cyclopentene, 1-ethyl- (CAS) C7H12 96
Cyclopentene, 3-ethyl- (CAS) C7H12 96
Docosanoic acid (CAS)
Behenic acid C22H44O2 340
Eicosanoic acid (CAS)
Arachidic acid C20H40O2 312
Ether, di-3-buten-2-yl C8H14O 80
Heneicosanoic acid (CAS) C21H42O2 326
Heptadecenoic acid (Z)- (CAS)
Margaric acid C17H34O2 270
Heptane, 2-3-5-trimethyl- (CAS) C10H22 142
88
Heptane, 4(-1-methylethyl)- (CAS) C10H22 142
Heptanoic acid (CAS)
Enanthic acid C7H14O2 130
Hexadecanoic acid, 2,3-dihydroxypropyl ester (CAS)
Glyceril palmitate C19H38O4 330
Hexadecanoic acid, 2-hydroxy-1,3-propadienyl ester
(CAS)
Glycerol, 1,3-dipalmitate
C35H68O5 569
Hexadecenoic acid (CAS)
Palmitic acid C16H32O2 256
Hexanoic acid (CAS)
n-hexanoic acid
Caproic acid
C6H12O2 116
Lactic aced, monoanhydride with 1-butaneboronic acid,
cyclic ester (CAS) C7H13BO3 156
Methoxy-6-vinylphenol C9H10O2 150
Nitrous acid, butyl ester (CAS)
N-butyil nitrite C4H9NO2 103
Nonadecanoic acid (CAS) C19H32O2 298
Nonanoic acid (CAS)
Pelargic acid C9H18O2 158
octadecanoic acid (Z)- (CAS)
Estearic acid C18H36O2 284
Octanoic acid (CAS)
Caprylic acid C8H16O2 144
Pentadecanoic acid (CAS)
Pentadecylic acid C15H30O2 242
Pentanoic acid (CAS)
Valeric acid C5H10O2 102
Piperidine, 2,6-dimethyl- (CAS) C7H15N 113
Styrene C8H8 104
89
Benzene, ethenyl- (CAS)
Tetradecanoic acid (CAS)
Myristic acid C14H28O2 228
Figura 02 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco de flores de M.
chamomilla Linné na faixa de temperatura de 350 a 650°C. 5
90
REINVINDICAÇÕES
3. Uso da tecnologia pirolítica para obtenção dos compostos químicos, constantes no
quadro I desta patente, produzidos no processo pirolítico dos extratos do pó das
flores da Matricaria chamomilla Linné, secos por nebulização, caracterizada por 5
compreender:
- processo pirolítico na faixa de 350 – 650ºC
- 80 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I
4. Uso da tecnologia pirolítica acoplada a cromatografia gasosa / espectrometria de
massas para caracterização dos extratos do pó das flores da Matricaria chamomilla 10
Linné, secos por spray dryer, caracterizada por compreender:
- processo pirolítico na faixa de 350 – 650ºC
- 80 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I
91
Resumo
“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA 5
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR
DE EXTRATOS DE Matricaria chamomilla LINNÉ SECOS POR
NEBULIZAÇÃO”.
A presente invenção proporciona a utlilização da tecnologia analítica baseada na 10
pirólise para a obtenção de produtos de decomposição dos constituintes dos extratos
secos nebulizados de flores de Matricaria chamomilla Linné separação desses
compostos por cromatografia gasosa e identificação por espectrometria de massa,
fornecendo uma caracterização dos extratos na faixa de temperatura de 350 a 650° C,
constando de um total de 80 compostos químicos obtidos. 15
Anexo II
93
Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados capítulos florais de Matricaria chamomilla, Linné a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 450°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
1 4.996 2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) .alpha.Angelica lactone
98 C5H6O2 88
2 7.609 1-Penten-3-ol 86 C5H10O 91 - 3 12.500 2-Methoxy-6-vinylphenol 150 C9H10O2 82 -
4 14.051 Hexanoic acid (CAS) Caproic acid
116 C6H12O2 84 HO2C(CH2)4Me
5 17.313
2H-Benzopyran-2-one, 7-methoxy- (CAS) Coumarin, 7-methoxy 176 C10H8O3 95
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
94
Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados capítulos florais de Matricaria chamomilla, Linné a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 550°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
1 4.914 2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) .alpha.Angelica lactone
98 C5H6O2 89
2 6.495
2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) Corylone
112 C6H8O2 95
3 7.609 1-Penten-3-ol 86 C5H10O 91 -
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
95
Cont. Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
4 12.539 2-Methoxy-6-vinylphenol 150 C9H10O2 83 -
5 17.349 Hexanoic acid (CAS) Caproic acid
116 C6H12O2 84 HO2C(CH2)4Me
6
2H-Benzopyran-2-one, 7-methoxy- (CAS) Coumarin, 7-methoxy 176 C10H8O3 95
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecula
96
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lactones and other constituents from Matricaria chamomilla L. Biochemical
Systematics and Ecology 35 533e 538.
Capítulo IV
99
TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR
DE EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS SECOS POR NEBULIZAÇÃO.
5
A presente invenção diz respeito a uma tecnologia analítica para caracterização
de extratos secos por nebulização de folhas de Passiflora alata Curtis, na qual a amostra
sofre processo de pirólise cujos produtos obtidos são separados por cromatografia
gasosa e identificados por espectrometria de massa através da biblioteca espectral de
Wiley 6ª edição para Class-5000. 10
A família Passifloraceae apresenta distribuição tropical e subtropical,
congregando espécies arbóreas, arbustivas, lianas e herbáceas, sendo o seu maior
gênero, Passiflora, que compreende em torno de 500 espécies e ocorre nas áreas mais
quentes da América, com algumas espécies na Ásia e Austrália e uma espécie em
Madagascar (DHAWAN et al., 2001). 15
A maioria das referências ao uso de Passiflora na medicina popular está
direcionada às suas propriedades psicotrópicas (FREISE, 1933; PIO CORREA, 1984;
ROYG e MESA, 1945; MOREIRA, 1862), e a maioria dos estudos farmacológicos têm
demonstrado efeitos no sistema nervoso central, tais como ação ansiolítica e sedativa e
propriedades anticonvulsivantes (DHAWAN et al., 2001; SOLEIMANI et al. 1997; 20
PETRY et al. 2001; DE-PARIS et al. 2002). No Brasil, a referida espécie, conhecida
como "maracujá", foi posta à utilização também como diurético e analgésico (OGA et.
al., 1984).
As espécies mais utilizadas na medicina popular brasileira são P. alata e P.
edulis. P. alata é a única espécie presente na Farmacopéia Brasileira, mas existem 25
poucas investigações sobre suas propriedades farmacológicas (PETRY et al. 2001; DE-
PARIS et al. 2002). Uma solução líquida oral da planta na dose de 5 mL três vezes ao
dia é recomendada na insônia, ansiedade, tosse seca, irritação da mucosa respiratória,
distúrbios nervosos da menopausa e algumas condições de dor (Monteiro da Silva Ltda,
2000). 30
Muitos compostos isolados de Passiflora spp. têm sido sugeridos como
princípios ativos responsáveis pelo efeito ansiolítico/sedativo alegado, tais como
100
flavonóides (como apigenina, vitexina, kampferol, homorientina, chrystina), alcalóides
harmane (harman, harmaline, harmalol) e derivados da pirona (maltol), mas, até agora
os princípios ativos ainda não foram identificados (SPERONI et al.,1996a.
SOLEIMANI et al.,1997 e DHAWAN et al., 2001). Os dados mostram, contudo, que
os flavonóides são os candidatos mais próximos (SPERONI et al. 1996a.; DHAWAN et 5
al., 2001). A esse respeito, extratos de Passiflora alata foram comparados com seu
conteúdo de flavonóides e atividade ansiolítica (PETRY et al. 2001).
Flavónoide R8 R7 R6 R3 R
Vitexina C-glicosil H H H H
Iso-vitexina H H C-glicosil H H
Orientina C-glicosil H H H OH
10
Figura 01: Flavonóides isolados de Passiflora alata. (Adaptadado de
DHAWAN, et al., 2004).
Extratos de folhas de P. alata apresentaram C - glycosyl flavonóides isovitexin e
vitexin juntamente com outros grandes flavonóides não identificados. Recentemente
saponinas foram descritas como compostos adicionais que podem contribuir para os 15
seus efeitos farmacológicos (REGINATTO et. al., 2001).
101
Figura 02: Saponinas de P. alata: quadrangulosídeo e ácido 3-soforosil oleanóico
(DOYAMA, J.T., et al., 2005).
Sumário da Invenção 5
A pirólise de matérias-primas vegetais produz um padrão de pirólise complexo,
denominado pirograma, que pode ser utilizado para fins de classificação da amostra na
forma de impressão digital do material analisado. A análise do pirograma usando
bancos de dados de bibliotecas de espectros de massas permite que se identifique os
diferentes compostos químicos produzidos no processo pirolítico com a vantagem de ser 10
uma tecnologia limpa sem uso de solventes orgânicos poluentes e outros reagentes.
Descrição detalhada do invento
A invenção está baseada no fato de que o processo pirolítico acoplado a
cromatografia gasosa / espectrometria de massa permite a obtenção de cromatogramas 15
ricos em picos cromatográficos correspondentes aos diferentes compostos químicos
102
produzidos nas condições estabelecidas para o processo pirolítico em extrato seco por
nebulização da Passiflora alata.
Foi estudado o extrato seco nebulizado de folhas de Passiflora alata, para a
caracterização dos produtos obtidos através de tecnologia de pirólise na faixa de
temperatura de 350 a 650°C. 5
Os extratos hidroalcoólicos do pó das folhas de Passiflora alata foram obtidos
pelo método de extração por maceração (à frio) em proporções de água:etanol variando
de 10 a 90 %. Os extratos foram secos por nebulização num aparelho Mini-Spray Dryer,
da marca LabPlant contendo 10 % de dióxido de silício coloidal. O sistema de
alimentação e atomização é constituído por uma bomba peristáltica, um atomizador com 10
agulha injetora (0,5 mm d.i.) sob pressão. Os extratos secos foram separados por
sedimentação na base de um ciclone e a circulação do fluído aquecido na temperatura de
entrada a 140 °C assegurada por um sistema de aspiração, co-corrente. A temperatura de
saída variou de 90 – 95 °C sob um fluxo de alimentação de 3,0 mL.min-1.
Na preparação das amostras foram pesados exatamente 2 g da amostra e 15
tranferidos para erlenmeyer de 25 mL adicionando-se 4 mL de solução água:metanol
(1:1). Esta solução foi sonicada durante 20 minutos. Em seguida filtrada através de
papel de filtro faixa preta de 125 mm (84 g/m2 de gramatura, velocidade de filtração de
10 mL/9 s, porosidade de 12,5 – 15,0 µm). Foi transferida uma alíquota de 500 µL do
filtrado para tubo eppendorff e adicionados 500 µL da solução de água:metanol (1:1) e 20
homogeneizado.
O processo pirolítico do extrato seco de Passiflora alata, foi realizada em um
pirolizador (Shimadzu, Pyr-4A) diretamente acoplado a um cromatógrafo a gás
interfaciado com espectrômetro de massas (Shimadzu, GCMS-QP5050A). Utilizou-se
uma coluna de 5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano com 30 m de comprimento, 0,25 mm 25
de diâmetro interno e 0,25 µm de tamanho de partícula. A temperatura da interface foi
de 300 ºC. O forno foi operado com a seguinte programação de temperatura 50ºC
(inicial) e 9ºC/ min até 280ºC. Utilizou-se como gás de arraste o Hélio a um fluxo de 1,4
mL/min e uma razão de split de 1:16.
103
O espectrômetro de massas foi configurado para varrer uma faixa de massa entre
50 e 450 u.m.a. Os espectros de massas foram obtidos por impacto eletrônico a uma
energia 70 eV.
Foram injetados diretamente no pirólise, com auxílio de uma seringa, um
volume fixo de 1µL de padrão e amostra, separadamente. Foram utilizadas as seguintes 5
temperaturas de pirólise: 450ºC, 550ºC, 650ºC e 750°C.
Os compostos químicos produzidos nos processos pirolíticos foram identificados
atrvés da análise comparativa dos seus espectros de massas com os espectros de massas
com o espectro de massas da biblioteca Wiley, 6th Edition for Class-5000 de 1999.
10
Estado da técnica da invenção desejada
A literatura apresenta diversas técnicas de separação e identificação de
constituintes de matrizes complexas, como as matérias-primas vegetais. Souza,
Schapoval e Bassani (2002) realizaram um trabalho utilizando cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), para quantificar flavonóides isolados ou compostos em matrizes 15
biológicas complexas. Moraes (1995) estudou a diferenciação entre P. edulis, P. alata e
P. incarnata, com base nos flavonóides, tendo constatado que o perfil cromatográfico
destas três espécies permite diferencia-las através de CLAE. Mueller e colaboradores
(2007) utilizaram a técnica de cromatografia líquida (LC) acoplada a um detector de
ultra-violeta (UV) para a determinação de flavonóides em extratos e folhas de P. alata. 20
O controle da qualidade de fitoterápicos tem empregado técnicas
cromatográficas, líquida e gasosa com uso de diferentes detectores na identificação e
quantificação de um ou vários marcadores do material vegetal ou seus extratos e
produtos.
Métodos analíticos para a identificação de compostos químicos da P. alata droga 25
vegetal, seus extratos e produtos são pouco citados na literatura especializada. Dados
recentes mostram que foram publicados 6 trabalhos com estudos com essa espécie, seus
extratos e chá, sendo 2 deles voltados para estudos farmacológico, 1 de investigação dos
efeitos do chá sobre parâmetros bioquímicos e 3 com estudos fitoquímicos com
isolamento e identificação de flavonóides (PETRY, et al., 2001; OGA et al., 1984; 30
DOYAMA et al., 2004; VARGAS et al., 2007; MÜLLER et al., 2005; PEREIRA et al.,
2000).
104
A presente invenção buscou associar a tecnologia pirolítica, que catalisa a
transformação de compostos químicos originais de um material em novos compostos,
com a cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM), que permite identificar
todos os compostos químicos formados a partir da tecnologia pirolítica. Como resultado
da associação dos processos pirolíticos dos extratos secos por nebulização da P. alata 5
com a cromatografia gasosa/ espectrometria de massas foi possível identificar todos os
compostos químicos produzidos a partir desta matéria-prima. O coramatograma
resultante com a riqueza de picos cromatográficos permitiu a caracterização dos extratos
secos por nebulização das folhas de P. alata na forma de impressão digital.
Não foram encontradas referências de aplicação da técnica utilizada na presente 10
invenção (Pir-CG/EM), nos bancos de dados pesquisados – Periódicos CAPES,
Scifinder e MedLine, para caracterização de extratos secos de Passiflora alata.
No quadro abaixo, está representada a lista padrão de substâncias fornecidas pela
comparação dos pirogramas obtidos com a biblioteca espectral.
15
Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Passiflora
alata Curtis obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de temperatura de
450 a 750°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey.
Substância Química Obtida por Pirólise Dados Químicos
Nome Fórmula P.M.
(+)-3-methylcyclopentanone C6H10O 98
(trans)-2-nonadecene C19H38 266
(Z,Z0-3,9-cis-6,7-epoxy-nonadecadiene C19H34O 278
.alpha.-Cyano.alpha.-13C-tuloebe C8 13C H7N 117
.beta.angelica lactone C5H6O2 98
[4.2.2]propella-7,9-diene
Tricyclo [4.2.2.0(1,60]deca-7,9-diene (CAS) C10H12 132
[Cyano-13C]-1,3,5-cycloheptatrien-7-carbonitrile C7 13CH7N 117
1,2,3,4-Cyclopentanetetrol, (1.alpha.,2.beta.,3.beta.,4.alpha.)-
(CAS) C5H10O4 134
1,2,3,5-Cyclopentanetetrol, (1.alpha.,2.beta.,3. alpha.,5. C6H12O4 148
105
beta.)- (CAS)
1,2,4-Cyclopentatrione (CAS) C5H4O3 112
1,2,4-Cyclopentatrione, 3-ethyl (CAS) C7H8O3 140
1,2,4-Trioxolane, 3,5-diphenyl- (CAS)
Stylbene ozonide C14H12O3 228
1,2,4-Trioxolane, 3-methyl-5-phenyl- (CAS) C9H10O3 166
1,2,4-Trioxolane, 3-phenyl- (CAS)
Styrene ozonide C8H8O3 152
1,2-Benzenedicarbonitrile (CAS)
o-dicyanobenzene C8H10N2 128
1,2-Benzenedicarboxaldehyde (CAS) C8H6O2 134
1,2-Cyclohexadienone (CAS) C6H8O2 112
1,2-Oxiathiane, 6-dodecyl-, 2,2-dioxide (CAS) C16H32O3S 304
1,3,5,7-Cyclooctatetraene (CAS)
[8]Annulene C8H8 104
1,3-Benzenedicarbonitrile (CAS)
m-dicyanobenzene C8H10N2 128
1,3-cyclopentadiene, 5-(1-methylethylidene)- (CAS)
6,6-dimethylfulvene C8H10 106
1,3-Cyclopentadienone, 2-methyl- (CAS) C6H8O2 112
1,3-Cyclopentanedienone (CAS) C5H6O2 98
1,4-Benzenedicarbonitrile (CAS)
p-dicyanobenzene C8H10N2 128
1,5-Dihydroxy-4-methyl-1-phenyl-3-pentanone C12H16O3 208
11,14-Eicosadienoic acid, methyl ester (CAS) C21H38O2 322
12,15- Octadecadienoic acid, methyl ester (CAS) C19H34O2 294
13-Oxabicyclo[10.1.0]tridecane (CAS) C12H22O 182
1-acetoxy-2-propanol C5H10O3 118
1-Docosanol (CAS) C22H46O 326
1-Eicosene (CAS) C20H40 280
1-Heptadecene (CAS) C17H34 238
106
1-Hexadecanol C16H34O 242
1-Hexadecene (CAS) C16H32 224
1-hexen-3-ol (CAS) C6H12O 100
1H-Imidazole-4-ethanamine, .beta.-methyl- (CAS) C6H11N3 125
1H-Indene, 1-methyl- (CAS) C10H10 130
1H-Indole (CAS) C8H7N 117
1H-Indole, 2-Methyl (CAS) C9H9N 131
1H-Indole, 3-ethanamine- (CAS) C10H12N2 160
1H-Indole, 3-Methyl (CAS) C9H9N 131
1H-Indole, 5-Methyl (CAS) C9H9N 131
1H-Indole, 6-methyl- (CAS) C9H9N 131
1H-Indole, 7-Methyl (CAS) C9H9N 131
1H-Pyrazole, 3,5-dimethyl- (CAS) C5H8N2 96
1H-tetrazole, 1-methyl- (CAS) C2H4N4 84
1-nitro-2-phenylethane C8H9NO2 151
1-Nonadecene (CAS) C19H38 266
1-Octadecene (CAS) C18H36 252
1-octen-3-ol C8H16O 128
1-Oxaspiro[4.5]decane-2,4-dione (CAS) C9H12O2 168
1-penten-1-one (CAS)
n-propylketene C5H8O 84
1-penten-3-ol C5H10O 86
1-penten-3-one (CAS) C5H8O 84
1-propene-1-thiol C3H6S 74
1-propylmethyl ether C4H10O 74
1-Tricosanol (CAS) C23H48O 340
2(1H)-Benzocyclooctenone, decahydro-10a-methyl-, trans-
(CAS) C13H22O 194
2(3H)-Furanone, 5-methyl- (CAS)
.alpha.angelica lactone C5H6O2 98
2(5H)-Furanone C4H4O2 84
107
4-Hydroxybut-2-enoic acid lactone
2,4,6-Cycloheptatriene-1-carbonitrile (CAS) C8H7N 117
2,4-dimethylfuran C6H8O 96
2,5-Pyrrolinediione, 1-methyl-3-phenyl- (CAS) C11H11NO2 189
2,6-Xylenol C8H10O 122
2-butenal, 2-ethenyl- (CAS)
Crotonaldehyde, 2-vinyl C6H8O 96
2-Butenal, 2-methyl- (CAS) C5H8O 84
2-Butenoic acid lactone C4H4O2 84
2-chloroethyl linoleate C20H35ClO2 342
2-cyclopenten-1-one, 2-methyl- (CAS) C6H8O 96
2-cyclopenten-1-one, 3-methyl- (CAS) C6H8O 96
2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS)
Corylone C6H8O2 112
2-Furancarboxaldehyde (CAS)
Furfural C5H4O2 96
2H-Inden-2-one, 1,3-dihydro- (CAS)
2-Indanone C9H8O 132
2H-Pyran, 3,4-dihydro- (CAS) C5H8O 84
2H-Pyran, tetrahydro- (CAS) C5H10O 86
2H-Pyran-2-one, 3,4-dihydro-5-methyl- (CAS) C6H8O2 112
2-hydroxy-2-cyclopenten-1-one C5H6O2 98
2-Hydroxy-2-phenylacetonitrile C8H7NO 133
2-Pentenal, 2-methyl- (CAS) C6H10O 98
2-Pentene, 3-ethyl- (CAS) C7H14 98
2-Phenylnitroethane C8H9NO2 151
2-Pyridinecarbonitrile (CAS) C6H4N2 104
3 Methyl pentanoic acid
3 methyl valeric acid C6H12O2 116
3(2H)-Pyridazinone, 4,5-dihydro-6-methyl- (CAS) C5H8N2O 112
3-buten-2-ol C4H8O 72
108
3-butene-1,2-diol (CAS)
Erythrol C4H8O2 88
3-Eicosene, (E) (CAS) C20H40 280
3-Furaldehyde C5H4O2 96
3-furanmethanol (CAS) C5H6O2 98
3-Octadecene, (E)- (CAS) C18H36 252
3-Pentanone, 2,2-dimethyl- (CAS)
Tert-butyl ethyl ketone C7H14O 114
3-Pentenal, 4-methyl- (CAS) C6H10O 98
4-vinyl-2-methoxy-phenol C9H10O2 150
5-hepten-3-one, 5-methyl-, cis/trans C8H14O 126
5-hexenoic acid, methyl ester (CAS) C7H12O2 128
5-Methylhexanoic acid (CAS) C7H14O2 130
6,11-Hexadecadien-1-ol C16H30O 238
6-methyl-tetracos-5-em-7-yn-1-al C25H44O 360
7,10-Hexadecanoic acid, methyl ester (CAS) C17H30O2 266
7-octen-4-ol (CAS) C8H16O 128
7-Thiapentacyclo[4.4.0.0(2,5).0(3,9).0(4,80]decan-10-one,
7,7-dioxide (CAS) C9H8O3S 196
9- Octadecynoic acid, methyl ester (CAS) C19H34O2 294
9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)- (CAS)
Linoleic acid C18H32O2 280
9,17-Octadienal, (Z)- (CAS) C18H32O 264
9-Eicosene, (E) (CAS) C20H40 280
9-Eicosyne (CAS) C20H38 278
9-Octadecen-1-ol, (Z)- (CAS) C18H36O 268
9-octadecenal, (Z)- (CAS) C18H34O 266
9-Octadecene (CAS) C18H36 252
9-Octadecenoic acid (Z)- (CAS)
Oleic acid C18H34O2 282
9-Octadecyne C18H34 250
109
Acethaldehyde, 2-propenylhydrazone (CAS) C5H10N2 98
Acetic acid, methyl ester (CAS) C3H6O2 74
Antrhacene (CAS) C14H10 178
Azetidine, 2-phenyl- (CAS) C9H11N 133
Aziridine, 2-(1,1-dimethylethyl)-3-methyl-, trans- (CAS) C7H15N 113
Aziridine, 2-methyl-3-(1-methylethyl)-1-(2-propenyl)-, trans-
(CAS) C9H17N 139
Aziridine, 2-tert-butyl-1,3-dimethyl-, trans- (CAS) C8H17N 127
Azulene (CAS)
Cyclopentacycloheptene C10H8 128
Benzaldehyde (CAS) C7H6O 106
Benzene, (1-methyl-2-cyclopropen-1-yl)- (CAS)
Cyclopropene, 3-methyl-3-phenyl C10H10 130
Benzene, (1-methylene-2-propenyl)- (CAS)
2-phenyl-1,3-butadiene C10H10 130
Benzene, (1-methylethenyl)- (CAS)
.alpha.-methylstyrene C9H10 118
Benzene, (cyclopropylindenemethyl)- (CAS) C10H10 130
Benzene, (isocianomethyl)- (CAS) C8H7N 117
Benzene, 1,1’-[oxybis(methylene)]bis- (CAS)
Benzyl ether C14H14O 198
Benzene, 1,2,3-trimethyl- (CAS) C9H12 120
Benzene, 1,2,4-trimethyl- (CAS)
Pseudocumol C9H12 120
Benzene, 1,2-dimethyl- (CAS)
o-xylene C8H10 106
Benzene, 1,3-butadienyl- (CAS) C10H10 130
Benzene, 1,3-dimethyl- (CAS)
m-xylene C8H10 106
Benzene, 1,4-dimethyl- (CAS)
p-xylene C8H10 106
110
Benzene, 1-ethenyl-2-methyl- (CAS)
o-methylstyrene C9H10 118
Benzene, 1-ethoxy-4-methyl- (CAS) C9H12O 136
Benzene, 1-isociano-2-methyl- (CAS) C8H7N 117
Benzene, 1-isociano-4-methyl- (CAS) C8H7N 117
Benzene, 1-propenyl- (CAS) C9H10 118
Benzene, ethyl- (CAS) C8H10 106
Benzeneacetonitrile (CAS) C8H7N 117
Benzeneacetonitrile, 2-methyl- (CAS) C8H7N 117
Benzeneacetonitrile, 3-methyl- (CAS) C8H7N 117
Benzeneacetonitrile, 4-methyl- (CAS) C8H7N 117
Benzenemethanimine (CAS)
Benzaldimine C7H7N 105
Benzenemethanol, .alpha.-methyl- (CAS) C8H10O 122
Benzoic acid, methyl ester (CAS) C8H8O2 136
Benzonitrile, 4-methyl- (CAS) C8H7N 117
Bicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene (CAS)
Cardene C8H8 104
Borane, diethylmethyl- (CAS) C5H13B 84
Cyclohexanone C6H10O 98
Cyclohexanone, 2-propyl- (CAS) C9H16O 140
Cyclooctane, cycloctylidene C16H28 220
Cyclopentane ethylidene- (CAS) C7H12 96
Cyclopentanol (CAS) C5H10O 87
Cyclopentanone (CAS) C5H8O 84
Cyclopentanone, 3-methyl- (CAS) C6H10O 98
Cyclopentene, 1-ethyl- (CAS) C7H12 96
Cycloprop[a]indene, 1,1a.,6,6a.-tetrahydro- (CAS)
2,3-methylene-inden C10H10 130
Cyclopropaneoctanoic acid, 2-[[2-[(2-
ethylcyclopropyl)cyclopropyl]methyl]-, methyl ester (CAS) C22H48O2 334
111
Decanoic acid (CAS) C10H20O2 172
Diazene, bis(1,1-dimethyl)- (CAS) C8H18N2 142
Dicumyl peroxide C18H22O2 270
Docosanoic acid (CAS) C22H44O2 340
Eicosanoic Acid (CAS) C20H40O2 312
Eicosanoic Acid, Methyl Ester (CAS)
Methyl Arachatate C21H42O2 326
Ethanol, 2-(9-octadecenyloxy)-, (Z)- (CAS) C20H40O2 312
Ethanone, 1-phenyl- (CAS)
Acethophenone C8H8O 120
Ethyl linoleate C20H36O2 308
Ethylbenzene
Benzene, ethyl- (CAS) C8H10 106
Furan -3-carboxaldehyde
Furfural C5H4O2 96
Furan, 2,5-dihydro-3,4-dimethyl- (CAS) C6H10O 98
Furan, 2,5-dimethyl- (CAS)
2,5-Dimethylfuran C6H8O 96
Heneicosanoic acid (CAS) C21H42O2 326
Heptadecanoic acid (CAS)
Margaric acid C17H34O2 270
Heptadecanoic Acid, Methyl Ester (CAS)
Methyl Margarate 284 C18H36O2
Heptane, 2,3,5-trimethyl- (CAS) C10H22 142
Heptane, 2,5-dimethyl- (CAS) C9H20 128
Heptane, 3,5-dimethyl- (CAS) C9H20 128
Heptanoic acid (CAS) C7H14O2 130
Hexadecanoic acid (CAS)
Palmitic acid C16H32O2 256
Hexadecanoic Acid, 2,3-dihydroxypropyl ester (CAS) C19H38O4 330
Hexadecanoic Acid, 2-hydroxy-1,3-propanediyl ester (CAS) C35H68O5 569
112
Hexadecanoic acid, methyl ester (CAS)
Methyl Palmitate C17H30O2 266
Hexadecanoic acid, methyl ester (CAS)
Methyl Palmitate C17H30O2 266
Hexanoic acid (CAS)
Caproic acid C6H12O2 116
Indolizine, 3-methyl- (CAS) C9H9N 131
Lactic acid, monoanhydride with 1-butaneboronic acid, cyclic
ester (CAS) C7H13BO3 156
L-histidine, 1-methyl- (CAS) C7H11N3O2 169
Methanamine, N-methyl-N-nitroso- (CAS) C2H6N2O 74
Methyl (2R,3R)-2,3-Dihydroxy-3-phenylpropanoate C10H12O4 196
Methyl- (3R)-(-)- 5-oxo 3-propylpentanoate C9H16O3 172
Methyl ethanoate C3H6O2 74
Methyl Octadecanoate C19H38O2 298
Methyl-(3R)-(-)-3-ethyl-5-oxopentanoate C8H14O3 158
Methyllaurate C8H10 106
Naphthalene (CAS) C10H8 128
N-benzylidene-dimethylammonium chloride C9H12ClN 169
Nitrous acid, butyl ester (CAS) C4H9NO2 103
Nonadecanoic acid (CAS) C19H38O2 289
Nonadecanoic Acid, Methyl Ester (CAS) C20H40O2 312
Nonanoic acid
Pelargic acid C9H18O2 158
N-Phenyl-4a,8a-(oxoiminooxo)naphthalene C18H13NO2 275
Octadecanoic acid (CAS)
Stearic acid C18H36O2 284
Octanoic acid (CAS)
Caprylic acid C8H16O2 144
Oxacycloheptadec-8-em-2-one (CAS)
Ambrettolide C16H28O2 252
113
Oxirane, 2-ethyl-2-methyl- (CAS) C5H10O 86
Pentadecanoic acid (CAS) C15H30O2 242
Pentadecanoic acid, 1,4-methyl-, methyl ester (CAS) 270 C17H34O2
Pentanoic acid (CAS) C5H10O2 102
Phenanthrene (CAS) C14H10 178
Phenol, 2,4-dimethyl- (CAS)
2,4-Xylenol C8H10O 122
Phenol, 2,5-dimethyl- (CAS)
2,5-Xylenol C8H10O 122
Phenol, 2-ethyl- (CAS)
o-Ethylphenol C8H10O 122
Phenol, 2-methyl- (CAS)
o-cresol C7H8O 108
Phenol, 3,4-dimethyl- (CAS)
3,4-Xylenol C8H10O 122
Phenol, 3-ethyl- (CAS)
m-Ethylphenol C8H10O 122
Phenol, 3-methyl- (CAS)
m-cresol C7H8O 108
Phenol, 4-ethyl- (CAS)
p-Ethylphenol C8H10O 122
Phenol, 4-methyl- (CAS)
p-cresol C7H8O 108
Piperidine, 2,6-dimethyl- (CAS) C7H15N 113
Propanoic acid, 2,2-dimethyl- (CAS)
Pivalic acid C5H10O2 102
Pyrazolo[5,1c]-as-triazin-4-ol, benzoate (ester) (CAS) C12H8N4O2 240
Styrene
Benzene, ethenyl- (CAS) C8H8 104
Tetradecadien-4,9 ol-1 C14H26O 210
Tetradecanoic acid (CAS) C14H28O2 228
114
Myristic acid
Tetradecanoic Acid, Methyl Ester (CAS)
Methyl Mirystate C15H30O2 242
Tridecanoic acid (CAS) C13H26O2 214
Tridecanoic Acid, Methyl Ester (CAS) C14H28O2 228
Trimethyl-aluminum C3H9Al 72
Trioxolane, 3-phenyl- (CAS)
Styrene ozonide C8H8O3 152
Tryptaminiumchloride C10H13ClN2 196
9,12-Octadien-1-ol (CAS) C18H34O 266
9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)- (CAS) C18H32O2 280
9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester, (E,E)- (CAS) C19H34O2 294
9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z)-, methyl ester (CAS) C19H34O2 294
Bicyclo[4.4.1]undeca-1,3,5,7,9-pentaen-11-one (CAS)
1,6-methano(10)annulen-11-one C11H8O 156
115
Figura 03 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das folhas de Passiflora
alata Curtis na faixa de temperatura de 450 a 750°C.
5
10
15
116
REINVINDICAÇÕES
1. Uso da tecnologia pirolítica para obtenção dos compostos químicos, constantes no
quadro I desta patente, produzidos no processo pirolítico dos extratos do pó das
folhas da Passiflora alata Curtis, secos por nebulização, caracterizada por 5
compreender:
- processo pirolítico na faixa de 450 – 750ºC
- 235 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no
quadro I
2. Uso da tecnologia pirolítica acoplada a cromatografia gasosa/espectrometria de 10
massas para caracterização dos extratos do pó das folhas da Passiflora alata Curtis,
secos por nebulização, caracterizada por compreender:
- processo pirolítico na faixa de 450 – 750ºC
- 235 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I
15
117
Resumo
“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À
CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA 5
CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR
DE EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS SECOS POR NEBULIZAÇÃO.”
A presente invenção proporciona a utlilização da tecnologia analítica baseada na
pirólise para a obtenção de produtos de decomposição dos constituintes dos extratos 10
secos nebulizados de folhas de Passiflora alata Curtis separação desses compostos por
cromatografia gasosa e identificação por espectrometria de massa, fornecendo uma
caracterização dos extratos na faixa de temperatura de 350 a 650° C, constando de um
total de 235 compostos químicos obtidos.
15
Anexo III
119
Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados das folhas de Passiflora alata Curtis a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 450°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
1 4.978 2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) .alpha.Angelica lactone
98 C5H6O2 89
2 6.527 2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) Corylone
112 C6H8O2 92
3 7.601 3-butene, 1,2-diol (CAS) Erythrol
88 C4H8O2 89 H2C:CHCH(OH)CH2OH
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
120
Cont. Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
4 14.057 Hexanoic acid (CAS) Caproic acid
116 C6H12O2 84 HO2C(CH2)4Me
5 19.887 9-octadecenoic acid (Z)- (CAS) Oleic acid
282 C18H34O2 93 Me(CH2)7CH:CH(CH2)7CO2H
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
121
Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados das folhas de Passiflora alata Curtis a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 750°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura 1 3.226 Furaldehyde 96 C5H4O2 81
2 3.474 Furan, 2,5- dimethyl- (CAS)
96 C6H8O 80
3 3.818 Benzene, 1,4-dimethyl 106 C8H1O 87
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
122
Cont.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
4 4.125 Benzene, ethenyl- (CAS) Styrene
104 C8H8 89
5 5.267 Benzaldehyde (CAS) 106 C7H6O 94
6 5.533 Benzene , (1-methylethenyl)- CAS) 118 C9H10 87
7 6.791 Phenol, 2-methyl o-cresol
108 C7H8O 91
8 7.035 Ethanone, 1-phenyl- (CAS) 120 C8H8O 86
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
123
Cont.
Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura
9 7.176 Phenol, 4-methyl- (CAS) p-cresol
108 C7H8O 95
10 9.076 Naphtalene 128 C10H8 91
11 12.374 1-Indole, 3-methyl- (CAS) 131 C9H9N 91
T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular
124
REFERÊNCIAS
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