tecniche elettroforetiche - dipartimento di chimica ... · • 1983 hjerten – elettroforesi...
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TECNICHE ELETTROFORETICHE
Le tecniche elettroforetiche permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità. Sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, perché sono basate su di una diversa velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria, tranne che nel caso dell’l’elettrocromatografia. Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate soprattutto in campo biologico (separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri), e in generale di ioni, sostanze ionizzabili e anfoliti, (es. aminoacidi e peptidi). Trova applicazione anche in altri campi, dati alcuni vantaggi che mostra rispetto alla cromatografia.
PROTOSTORIA DELL’ELETTROFORESI
• 1886 Lodge – Migrazione di H+ in un tubo di fenolftaleina “gelificato”
• 1892 Smirnow – Frazionamento di una soluzione di tossine di Ditteri per azione di un campo elettrico
• 1899 Hardy – Migrazione di globuline in un tubo ad “U” al passaggio di corrente elettrica.
• 1905 Hardy – Studi dettagliati sul movimento di globuline con varie tipologie di tubi ad “U”.
• 1907 Field e Teangue - Separazione tossina/antitossina via
ponti di agar tra campione ed acqua
• 1923 Kendall e Crittenden – Separazione preparativa di isotopi in tubi ad “U” di agar
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The Nobel Prize in Chemistry 1948 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius ( 1902 1971)
Uppsala University Sweden
"for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his
discoveries concerning the complex nature of the serum proteins"
•1930 Tiselius – Studi dello strato mobile di proteine
in soluzione
•1937 Tiselius - Apparato migliorato per lo studio
dello strato mobile
•1939 Coolidge – Separazione elettroforetica di
proteine del siero in tubi riempiti di lana di vetro
•1946 Consden – Ionoforesi di amminoacidi e peptidi
su strato di silice; primi esperimenti di “blotting”*
•1950 Haglund e Tiselius – Elettroforesi su colonna di polvere di vetro
•1956 Porath – Elettroforesi su colonna di cellulosa
•1964 Ornstein – Apparato per “disc” elettroforesi
•1965 Tiselius – “free zone elettroforesi di particelle virali in capillari
rotanti di 3 mm I.D.
•*Trasferimento, dopo migrazione, della banda adsorbita su altro materiale
L’era di Hjerten
• 1965 Hjerten – “Particle seiving” elettroforesi di ribosomi in
tubi di gel di poliacrilammide
• 1967 Hjerten – Elettroforesi in soluzione in tubi da mm I.D.
• 1974 Virtenen – Dimostra i vantaggi di tubi di piccolo diametro
• 1979 Mikkers – Elettroforesi in capillari polimerici
• 1981 Jorgenson e Lukacs – Approccio teorico e sperimentale
all’elettroforesi ad alta risoluzione in capillari di vetro (CE)
• 1983 Hjerten – Elettroforesi capillare SDS-PAGE
• 1984 Terabe – Cromatogrfia micellare elettrocinetica per la
separazione di molecole neutre
• 1987 Cohen e Karger – Dimostrano l’elevata efficienza
dell’elettroforesi capillare su gel
• 1989 Prima strumentazione commerciale per CE
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VELOCITA’ DI MIGRAZIONE
ELETTROFORETICA
V = µep x E = µep x V/L
µep = flusso elettroforetico E = campo elettrico
In presenza di flusso elettroosmotico µeo si ha:
V = (µep + µeo) x V/L
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In assenza di flusso elettroosmotico
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µeo
µep +
µep - effetto netto
+O
-
L’origine del flusso elettroosmotico non è
di facile comprensione
The observed mobility of water was due to the fact that the solid
substrates such as glass, silicon, polymeric materials, minerals of
various kinds, etc.) acquire a surface charge when in contact with
an electrolyte. The immobile surface charge in turn attracts a cloud
of free ions of the opposite sign creating a thin (1–10 nm under
typical conditions, e.g., univalent electrolyte at a concentration of
1–100 mol per m3) Debye layer of mobile charges next to it. The
thickness of this electric double layer (EDL) is determined by a
balance between the intensity of thermal (Brownian) fluctuations
and the strength of the electrostatic attraction to the substrate. In
the presence of an external electric field, the fluid in this charged
Debye layer acquires a momentum which is then transmitted to
adjacent layers of fluid through the effect of viscosity. If the fluid
phase is mobile (such as in a packed bed of particles or in a narrow
capillary), it would cause the fluid to flow (electroosmosis)
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Electroosmotic flow occurs because the walls of the capillary tubing are electrically charged.
The surface of a silica capillary contains large numbers of silanol groups (–SiOH). At pH levels
greater than approximately 2 or 3, the silanol groups ionize to form negatively charged silanate
ions (–SiO–). Cations from the buffer are attracted to the silanate ions. As shown here, some of
these cations bind tightly to the silanate ions, forming a fixed layer. Because the cations in the
fixed layer only partially neutralize the negative charge on the capillary walls, the solution
adjacent to the fixed layer—what we call the diffuse layer—contains more cations than anions.
Together these two layers are known as the double layer. Cations in the diffuse layer migrate
toward the cathode. Because these cations are solvated, the solution is also pulled along,
producing the electroosmotic flow.
http://www.kirbyresearch.com/index.cfm/wra
p/textbook/microfluidicsnanofluidicsch6.html
Micro- and Nanoscale Fluid Mechanics:
Transport in Microfluidic Devices
Brian J. Kirby
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ELETTROOSMOSI
Il valore del potenziale elettroosmotico è dato
dall’equazione di Helmholtz
ζ = 4πη µeo /ε
η = viscosità; ε = costante dielettrica
La velocità elettroosmotica è quindi:
VVVVeoeoeoeo = E µeo = E ε ζ / 4πη
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LA RISOLUZIONE IN ELETTROFORESI
• L’allargamento della banda di migrazione è dovuto
alla sola diffusione longitudinale:
σ2 = 2Dm t; t = L/V V V V = L2 / (µeo + µep) V
σ2 = 2Dm L2 / (µeo + µep) V
N = L2/σ2 = (µeo + µep) V/2Dm
RRRR = (µeo+µep1)-(µeo +µep2)=(µep1- µep2) ¼N1/2
= ¼ x ½½ (µep1- µep2) [V/Dm (µeo + µep)] 1/2
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Classificazione delle tecniche
•• elettroforesi priva di elettroforesi priva di carriercarrier, in cui , in cui
gli ioni migrano in una soluzione gli ioni migrano in una soluzione
tampone. Non viene più usata. tampone. Non viene più usata.
•• elettroforesi mediante elettroforesi mediante carriercarrier, più , più
comunemente utilizzata, in cui gli comunemente utilizzata, in cui gli
ioni migrano su un supporto di ioni migrano su un supporto di
carta, un gel o un polimero. Un carta, un gel o un polimero. Un
esempio comune èesempio comune è
•• L’elettroforesi classicaL’elettroforesi classica (es. su carta (es. su carta
per la separazione delle proteine per la separazione delle proteine
del siero)del siero)
•• elettroforesi capillareelettroforesi capillare
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Le tecniche elettroforetiche si classificano in:
Elettroforesi su carta
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1) A long strip of filter paper is moistened with a suitable buffer
solution of the desired p H and the sample is applied transversely
across the central part of the strip.
2) Ends are fixed to dip in buffer solutions in two troughs fitted
with electrodes.
3)Electric field of about 20 volts/cm is established.
4)The charged particles of sample migrate along the strip towards
respective electrodes of opposite polarity, according to net
charges, sizes and interactions with the solid matrix.
5)Homogeneous group of particles migrate as a separate band
6)The electrophoresis is carried out for 16-18 hours.
7) Separated Proteins are fixed to a solid support using a fixative
such as Acetone or Methanol
8)Proteins are stained (bromophenol blue) to make them visible
9) The separated proteins appear as distinct bands
Scan of normal
serum proteins
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ELETTROFORESI SU GEL• L’ elettroforesi su gel è senza dubbio una delle tecniche maggiormente
utilizzate nei laboratori di biologia molecolare, che permette
• la separazione la visualizzazione e la purificazione di molecole di interesse biologico quali acidi nucleici e proteine.
• Tale separazione dipende dal peso molecolare e dalla carica elettrica di cui sono dotate tali macromolecole.
• Tali molecole poste in un campo elettrico generatosi dalla d.d.p. applicata tra due elettrodi, si muoveranno in direzione dell'elettrodo di carica opposta.
• Gli acidi nucleici migrano naturalmente verso il polo positivo per la presenza nella loro molecola delle cariche negative dei gruppi fosfato (PO4
- - ) Il numero di gruppi fosfato è uguale al numero di nucleotidi per cui, se le catene sono completamente svolte, la separazione dipende dal PM.
• Le proteine si muovono tutte verso il polo positivo e vengono separate in base al PM solo dopo essere state complessate con sodio dodecil solfato (SDS)
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GEL DI POLIACRILAMMIDE
• Variando la concentrazione di acrilamide e di bisacrilamide si creano nel gel maglie di diversa grandezza.
• La concentrazione di bis-acrilamide può variare dal 3% al 20% rispetto al volume totale del gel.
• Comunemente si usano i cosiddetti gel piatti ottenuti per polimerizzazione del gel tra due lastre di vetro, che consentono il caricamento di più campioni-
• Prima del caricamento le proteine in genere sono denaturate, ridotte ed alchilate
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STOCK SOLUTIONS FOR POLYACRYLAMIDE GEL PREPARATION
Monomer solution
30% T, 2.5% C Mix 29.25 g of acrylamide and 0.75 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.
30% T, 3% C Mix 29.10 g of acrylamide and 0.90 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.
30% T, 4% C Mix 28.80 g of acrylamide and 1.20 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.
Initiator solution
40% (w/v) ammonium persulphate This reagent is stable at 4°C for no more than 1 week
Catalyst
TEMED This reagent is used undiluted. It is stable at 4°C for several months.
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Strumento per elettroforesi su gel
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Caricamento del
campione per una
corsa di
elettroforesi su gel
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IL MERCAPTOETANOLO RIDUCE I
PONTI DISOLFURO
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SDS-PAGE di
miscele di
proteine
ridotte ed
alchilate in
urea 6
mol/L
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Additive Purpose Concentration Limitations
Sucrose,
Glycerol
To improve the mechanical
properties of low %T gels and to
reduce water transport and drift.
5-20% The increased viscosity slightly slows
the focussing process.
Glycine,
Taurine
To change the dielectric constant
of the medium. This increases the
solubility of some proteins (e.g.
globulins) and reduces ionic
interactions
0.1-0.5 M Glycine is zwitterionic between pH 4
and 8, Taurine between pH 3 and 7.
Their presence somewhat slows the
focussing process and shifts the
resulting gradient.
Urea Disaggregation of supramolecular
complexes.
2-4 M Unstable in solution especially at
alkaline pH.
Urea Solubilisation of water-insoluble
proteins, denaturation of
hydrophilic proteins.
6-8 M Urea is soluble at >10°C; it
accelerates
polyacrylamidepolymerisation, so
reduce the amount of TEMED added.
Non-ionic
and
zwitterionic
detergents
Solubilisation of amphiphilic
proteins.
0.1-1% To be added to the polymerising
solutions just before thè catalysts to
avoid foaming; they interfere with
polyacrylamide binding substrata;
they are precipitated by to reactive
TCA and require a specific staining
protocol.
COMMON ADDITIVES FOR IEF
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il gradiente di pH necessario alla focalizzazione può essere formato dal passaggio della
corrente in una miscela di sostanze anfotere, gli anfoliti trasportatori (CA): CA-IEF,
oppure preformato attraverso la copolimerizzazione in una matrice di PAA di
acrilamidoacidi e acrilamidobasi, formando gradienti di pH immobilizzati: IPG39
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…STRESS SALINO
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GEL D’AGAROSIO
• L'agarosio è un polimero lineare naturale di galattosio e 3,6 anidro galattosio.
• L' agarosio è sciolto in opportuno tampone: Tris BoratoEDTA (TBE) oTris Acetato (TAE) e fatto gelificare su un supporto di vetro o di plastica.
• Si crea così una matrice gelificata le cui maglie permettono la separazione di macromolecole a diverso PM.
• Anche per l'agarosio è possibile intervenire sulla concentrazione per favorire la migrazione di materiale più o meno grande.
• In linea di massima il range di concentrazione varia tra lo 0,3% - 2%.
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45doppie eliche fasci di doppie eliche
unità strutturale L-galattosil-3,6-anidro-L-galattosio
UTILIZZAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO
PER LA SEPARAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
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ELETTROFORESI CAPILLARE
Due grossi svantaggi dell’elettroforesi classica sono:
••convezione di caloreconvezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al dovuta alla resistenza del tampone al
flusso di corrente elettrica: crea un gradiente radiale di flusso di corrente elettrica: crea un gradiente radiale di
temperatura che porta all’allargamento dei picchitemperatura che porta all’allargamento dei picchi--
••difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi.difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi.
Questi svantaggi sono superati grazie all’avvento della
tecnica capillare, derivata da elementi della GC capillare. In
questa tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un
sistema miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale il
calore di Joule è più facilmente disperso con vantaggi
evidenti sulla risoluzione.52
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PROFILO PIATTO DEL FLUSSO
ELETTROOSMOTICOIl profilo piatto del flusso è vantaggioso dal
momento che non contribuisce direttamente alla
dispersione del soluto (cosa che avverrebbe nel
caso di flusso laminare dove le componenti che
si trovano al centro del tubo migrano ad una
velocità maggiore di quelle che si trovano ai
bordi.
Effetto del gradiente di temperatura
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schema del gradiente di temperatura in un capillare, dal centro all'ambiente
esterno.
La dissipazione termica del calore attraverso le pareti del capillare può dar luogo a
temperature più alte nel centro del capillare piuttosto che alle pareti
Tali gradienti di temperatura causano differenze locali di viscosità nel buffer e
quindi una migrazione non uniforme.
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Le 4 modalità in cui può essere
condotta l’elettroforesi capillare
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ELETTROFORESI CAPILLARE SU GEL
• Separazione per elettroforesi
capillare su gel in presenza di
sodio dodecilsolfato (SDS-CGE)
di una serie di proteine:OG:
colorante Orange-G(rif.)
• 1)β-lattalbumina(PM 14200 Da
2)Anidrasicarbonica (PM 29000
Da) 3)Ovalbumina(PM 45000)
4)Albumina di siero bovino (PM
66000) 5)FosforilasiB (PM
97400) 6)β-galattosidasi(PM
116000) 7) miosina(PM 205000)
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La CEC è una tecnica ibrida derivante dalla combinazione fra CE e HPLC.
Rispetto alla tipica CZE il capillare è impaccato con una fase stazionaria
tipica per l’HPLC in fase inversa (C18, C8): La presenza di gruppi silanolici
sulla superficie delle particelle di impaccamentosi traduce in un forte
incremento del flusso elettroosmotico, rispetto all’elettroforesi capillare
convenzionale.
Poiché il flusso
elettroosmotico ha un
profilo piatto, non
parabolico,
l’allargamento di banda è
decisamente inferiore
rispetto all’HPLC e quindi
l’efficienza molto
superiore, anche se
inferiore rispetto alla
CZE.
RIVELAZIONE OTTICA
La configurazione tipica prevede la
presenza di un’apertura nel
rivestimento di poliimmide (non
trasparente alla radiazione UV) posto
intorno al capillare di silice,
attraverso la quale passa il fascio
della radiazione incidente che
attraverso perpendicolarmente il
flusso di analita e raggiunge poi il
rivelatore.
Il fascio della radiazione deve essere
estremamente focalizzato, data
l’esiguità dell’ampiezza di banda.
Il rivelatore può essere un singolo
fototubo fotomoltiplicatore o
un DAD (DiodeArrayDetector).
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While in general small fragments can find their way through the gel matrix more easily than
large DNA fragments, a threshold length exists above 30–50 kb where all large fragments will
run at the same rate, and appear in a gel as a single large diffuse band.
However, with periodic changing of field direction, the various lengths of DNA react to the
change at differing rates. That is, larger pieces of DNA will be slower to realign their charge
when field direction is changed, while smaller pieces will be quicker. Over the course of time
with the consistent changing of directions, each band will begin to separate more and more
even at very large lengths. Thus separation of very large DNA pieces using PFGE is made possible
PULSED FLOW
ELETTROPHORESIS