tecniche di biologia molecolare la reazione polimerasica a catena principi teorici e aspetti pratici...
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TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENAPrincipi teorici e aspetti pratici
• Dott. MASSIMILIANO BERGALLO Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia Università degli Studi di TorinoDott. MASSIMILIANO BERGALLO Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia Università degli Studi di Torino
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POLYMERASE CHAIN REACTION(PCR)
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primers DNA polimerasi
DNA genomico
1955 A. Kronembreg e coll. (Stanford University) scoprono la DNA-polimerasi cellulare
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DNA polimerasi
primer
Nucleotide (dNTP)
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APERTURA DOPPIA ELICA DEL DNA
LEGAME DEI PRIMERS DI INNESCO
DUPLICAZIONE DEL DNA STAMPO
Nel 1983 K.B. Mullis utilizzò la DNA polimerasi in una reazione di polimerizzazione ciclica: la PCR
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PrimersDNA polimerasi
ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE
DNA STAMPO
DESOSSIRIBOSIO
Base Azotata(Adenina, Timina, Citosina, Guanina, Uracile)
Desossi Nucleotidi trifosfati (dNTP)
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fase 1: DENATURAZIONELa doppia elica di DNA stampo è aperta al calore
94°C
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fase 2: ANNEALINGI primers si appaiano alle sequenze complementari sul
DNA stampo
37-72°C
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72°C
fase 3: ESTENSIONELa DNA polimerasi allunga gli inneschi e produce
2 nuove catene di DNA
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IL PROCESSO SI RIPETE
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Ad ogni ciclo il numero di molecole di DNA “copiato” raddoppia
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Siti dei primers
DNA estratto dal campione
DNA target
Lunghezza DNA amplificato
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Numero di cicli123456789
101112131415161718192021222324252627282930
Numero di molecole di amplificati248
163264
128256512
1.0242.0484.0968.192
16.38432.76865.536
131.072262.144524.288
1.048.5762.097.1524.194.3048.388.608
16.777.21635.544.43267.777.216
134.217.728268.435.456536.870.912
1.073.741.724
Resa teorica di una reazione di PCR a partire da una singola copia di DNA
Y= N2n
Y= numero molecole di DNA amplificatoN= numero molecole di DNA di partenzan= numero dei cicli di PCR
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LA FORMULA DELLA PCR
Y =N (1+E) n
Y = resa di amplificazioneN = numero di molecole di DNA di partenzaE = efficienza di reazionen = numero di cicli di amplificazione
efficienza media resa finale (20 Cicli) % teorica max
100 1.048.576 100 95 631.964 60 90 375.900 36 85 220.513 21
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Log [DNA]
n° cicli
Fase Geometrica
Plateau
Fase Lineare
LA REAZIONE DI PCR
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Competizione tra il prodotto dei cicli precedenti e i primers per l'ibridazione
Inattivazione termica dell’enzima
Riduzione del rapporto molare tra le concentrazioni della DNA-polimerasi e del DNA
Riduzione progressiva dell’efficienza di denaturazione e/o di ibridazione
Distruzione degli amplificati per l’attività esonucleasica 5’>3’ della polimerasi
Accumulo di pirofosfati (inibitori della polimerasi)
Progressiva diminuzione della concentrazione di uno o più componenti necessari alla reazione (?)
CAUSE DELL’EFFETTO PLATEAU
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Scelta dei primersCondizioni di reazioneContaminazione
Specificità
Sensibilità
Scelta dei primersEterogeneità genomicaPresenza di inibitoriTipo di campioneEfficienza della reazione
Riproducibilità
Standardizzazione delle fasi del metodo:preparazione del campioneprotocollo di PCRsistema di rivelazione
PRINCIPALI FATTORI CHE INFLUENZANO LA RESA DELLA PCR
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PCR: PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE
Acido Nucleico TARGET Disegno dei Primers Temperatura di Annealing Concentrazione di Mg++ Concentrazione di dNTPs Qualità e quantità di Enzima Forza Ionica del tampone Presenza di Cosolventi Parametri dei Cicli Numero di Cicli
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I REAGENTI DELLA REAZIONE DI PCR
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DNA TARGET
NATURA:
Omogeneo (plasmide purificato): ogni molecola è identica e rappresenta la sequenza da amplificare
Eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA, come il DNA genomico, sospensione cellulari o materiale biologico)
Purezza: intesa come assenza di componenti che diminuiscono l’efficienza della PCR
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Troppo DNA Troppo RNA Presenza di emoglobina Eparina Ioni metallici SDS Composti Aromatici Etanolo Urea Detergenti
Ecc.
Inibitori della PCR
DNA TARGET
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DNA TARGET:
Il DNA umano è costituito da circa 3.3 x 109 bp, (1bp= 650 dalton) Il DNA contenuto in una cellula pesa circa 6.6 x10-6 ug
1 ug di DNA genomico corrisponde a circa 5 x 10-7 pmoli Circa 150.000 cellule umane contengono 1 ug di DNA
3 pg di DNA genomico contengono 1 copia di ogni gene umano
QUANTITA’ OTTIMALE
0.1 a 1-2 ug di DNA genomico Per reazione di PCR
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Estrema cura nella scelta della regione da amplificare Estrema purezza Lunghezza: 20-30 paia di basi (non meno di 16 bp) Equilibrato rapporto AT/GC Tm comprese tra 45-68° C Tm simili (+/- 2 C)
OLIGONUCLEOTIDI O PRIMERS
SPECIFICI DEGENERATI UNIVERSALI
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Evitare sequenze inusuali come serie di purine o pirimidine
Evitare sequenze palindromiche che provocano strutture secondarie (loop).
Le estremità 3’ non devono essere tra loro complementari: formazione dei “primers-dimeri”
--OH
OH--
--OH
Taq
DISEGNO DEI PRIMERS
PROVARE EMPIRICAMENTE IN FASE DI OTTIMIZZAZIONE
La concentrazione utilizzata è: 0.2-1 mM (20-100 pmoli/reazione)
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FORMAZIONE DEI “PRIMERS-DIMERI”
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FORMAZIONE DEI “PRIMERS-DIMERI”
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FORMAZIONE DEI “PRIMERS-DIMERI”
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FORMAZIONE DEI “PRIMERS-DIMERI”
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TAMPONE DI REAZIONE
controllo pH (attività Taq polimerasi)
controllo forza ionica ….(termostabilità Taq polimerasi)
Cosolventi: diminuiscono la temperatura di denaturazione e di annealing: DMSO, formamide, glicerolo
Standard PCR 1x Taq Buffer
10mM Tris-HCl: pH 8.3 a t.a. 50mM KCl 1.5mM MgCl2 (!!!!)
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Necessario per l’attività enzimatica Stabilizza l’ibridazione del DNA Sottratto alla reazione da diversi fattori: DNA, EDTA,
supporto in vetro (In Situ), dNTPs. Legato dai dNTP (gruppi fosfato) Concentrazione ottimale: dNTP+ primers+ DNA Effettuare sempre una “titolazione” di Mg++ quando
vengono cambiati i parametri di reazione
CONCENTRAZIONE DI MgCl2
PROVARE EMPIRICAMENTE IN FASE DI OTTIMIZZAZIONE
La concentrazione utilizzata è: 0.5-5 Mm (generalmente 1.5 mM)
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[Mg++] mM
CONCENTRAZIONE DI MgCl2
amplificatospecifico
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deossiNUCLEOTIDI TRIFOSFATI: dNTPs
Base Azotata(Adenina, Timina, Citosina, Guanina, Uracile)
DESOSSIRIBOSIO
La concentrazione utilizzata è: 0.2 mM ciascuno (200uM)
N.B. Usare dUTP ad una concentrazione 2-5 volte maggiore
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attività3’ esonucleasica
attivitàcatalitica
attività5’ esonucleasica
DNA POLIMERASI (Taq polimerasi)
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Enzima naturaleEnzima ricombinante AmpliTaqrTth
5’- 3’ EXO attivitàcatalitica
DNARNAdNTP modificati
DNA POLIMERASI (Taq polimerasi)
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attivitàcatalitica
5’ EXO
DNA POLIMERASI (Taq polimerasi)
Stoffel fragment
più termostabile: DNA ricco di CG
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Versione Modificata dell’ AmpliTaq DNA Polimerasi Stessa attività catalitica e termostabilità L’attività catalitica è attivata termicamente e progressiva Hot-start PCR
5’ EXOattivitàcatalitica
DNARNAdNTP modificati
DNA POLIMERASI (Taq polimerasi)
AmpliTaq GOLD
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LE CONDIZIONI DI REAZIONE
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DENATURAZIONE
SEPARAZIONE DELLE DUE ELICHE DEL DNA TARGET
94-95°C per 15-60 secondi
mezzo di reazione (presenza di cosolventi)
natura del DNA target
denaturazione preliminare di 3-5 minuti
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ANNEALING
FASE PIU’ DELICATA DELLA PCR
Calcolo della temperatura di annealing (Tm-5°C)
La durata dipende dal tipo di strumento utilizzato
Calcolo della temperatura di annealing: Uso di sofisticati algoritmi Uso della formula 2(A+T) + 4(C+G)
provare empiricamente
INCONTRO E IBRIDAZIONE DEI PRIMERS CON IL DNA TARGET
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ESTENSIONE
Lunghezza della sequenza amplificata
Tipo di strumento impiegato
Estensione finale di 5-10 minuti
72°C per 15-60 secondi
POLIMERIZZAZIONE DI NUOVE MOLECOLE COMPLEMENTARI AL DNA TARGET
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Varia a seconda del numero di copie iniziali di DNA target e della sensibilità richiesta:
1 ug DNA genomico (150.000 copie) 25 cicli 10.000 copie 30 cicli 1.000 copie 34 cicli 100 copie 38 cicli 10 copie 42 cicli
NUMERO DEI CICLI
N.B. Oltre un certo numero di cicli non si ottiene più un aumento del numero di amplificati, per ottenere una sensibilità maggiore ricorrere ad altri sistemi (nested-PCR)
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Parametri Condizioni di reazione
Buffer Taq polimerasi KCl 50Mm, tris-cloruro 10mM + MgCl2
DNA target 0,1-2 ug DNA o RNA (cDNA)
Primers 0,2-1 mM (20-100 pmoli per reazione)
MgCl2 0,05 e 5 mM
dNTP 0,2 mM ciascuno (200uM).
Taq polimerasi 0,1-4 U
Totale miscela di reazione 25 – 100 ul
Denaturazione 94-98°C
Annealing 37-72°C
Estensione 60-72°C
Numero dei cicli 25 – 40
I PARAMETRI DELLA REAZIONE DI PCR
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Primer Dimeri
pre-PCR mispriming
Pre PCR
OTTIMIZZAZIONE DELLA REAZIONE DI PCR:FORMAZIONE DI PRODOTTI ASPECIFICI
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DNA ds
DNA denaturato
primers
Taq polimerasi
FORMAZIONE DI PRODOTTI ASPECIFICI NEI PRIMI CICLI DI AMPLIFICAZIONE
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concentrazione Taq polimerasiHIGH LOW
FORMAZIONE DI PRODOTTI ASPECIFICI NEI PRIMI CICLI DI AMPLIFICAZIONE
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Disegno dei primer poco accurato
Errata temperatura di annealing
Concentrazione di MgCl2 non ottimale
OTTIMIZZAZIONE DELLA REAZIONE DI PCR:FORMAZIONE DI PRODOTTI ASPECIFICI
durante la PCR
Ottimizzazione dei parametri di amplificazione Hot-start PCR
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TIPI DI PCR
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NESTED - PCR
DNA TARGET
5’ 3’
Primo step:Primers Esterni
Secondo Step:Primers Interni
I AMPLIFICATO
II AMPLIFICATO
RIVELAZIONE ED ANALISI DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE
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PCR MULTIPLEX
permette l’analisi di più target contemporaneamente vengono usati miscele di primers o primers degenerati
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PCR in situ
Il DNA o l’RNA vengono amplificati direttamente nelle cellule e nei tessuti morfologicamente intatti
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LIGASE CHAIN REACTION (LCR)
ligasitermostabile
primers “legati”
primers senso
primers antisenso
il processo si ripete per 30 o più cicli
primers legati:prodotti di LCR
DNA stampo
no “amplificati” LCR
mismatch: mutazione puntiforme
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TRANSCRIPTION MEDIATED AMPLIFICATION (TMA)