TECNICAS PARA MEDICION DE BIOMASA MICROBIANA (LEVADURAS).

YESID MARTINEZ FUENTESLUIS PACHECO RUIZ

ALEXANDER RODRIGUEZ PEREZASTRID SANTOS CACERES

JUAN SIERRA MARQUEZ

RAFAEL OLIVERO VERBELING. ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD DE INGENIERÍA

PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIALSINCELEJO – SUCRE

2009

RESUMENLas levaduras son microorganismos muy importantes en la industria y en la biotecnología actual. Por sus características leudantes y metabólicas puede fermentar muchos carbohidratos obteniendo así los llamados vinos de gran acogida entre la sociedad.Para la medición de biomasa microbiana se empleó (Saccharomyces cerevisiae), una levadura con la cual se preparó 200mL solución madre 2500ppm, de la cual se prepararon 7 muestras de diferentes concentraciones de las cuales se analizo la cantidad de biomasa por dos métodos: - Por conteo directo (cámara de

Neubauer), donde fue necesario preparar una dilución de menor concentración, debido a que las concentraciones eran muy altas para visualizarse.

- Por densidad óptica (espectrofotómetro), un método mas eficaz para medir la concentración de microorganismos analizando la cantidad de absorbancia de cada muestra.

Todos estos datos analizados se muestran a continuación.

ABSTRACT Yeasts are very important microorganisms in the industry and in the current Biotecnologí. Due to characteristics leudants and metabolic it can ferment many carbohydrates obtaining this way the so called wines of great reception among the society.For the measurement of microbial biomass there was used (Saccharomyces cerevisiae), a yeast with which to prepare 200mL solution mother 2500ppm, of which there were prepared 7 samples of

different concentrations of which analyze the quantity of biomass for two methods:

- For direct count (Neubauer's camera), where it was necessary to prepare a dilution of minor concentration, due to the fact that the concentrations were very high to be visualized. - For optical density (spectrophotometer), a method most effective to measure the concentration of microorganisms analyzing the quantity of absorbancia of every sample. All this analyzed information appears later.

INTRODUCCIONLa biomasa microbiana es un componente esencial del ciclo de los nutrientes en agroecosistemas. El crecimiento microbiano puede ser considerado como un aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo, lo cual, para todos los organismos unicelulares conduce a un aumento de individuos en la población.

Uno de los métodos mas practico para la determinación de la biomasa microbiana se basa en pruebas detectando la presencia de compuestos bioquímicas específicos que indican la presencia de microorganismos. La medida de ATP puede usarse para calcular la biomasa microbiana, sin embargo existen dificultades para el cálculo exacto pues en algunos casos la concentración de ATP cambia

según sus condiciones alteradas como las nutricionales y fisiológicas.

Debido a las dificultades que presenta el anterior método y a las exactitudes que se necesitan para realizar de una buena práctica de laboratorio, es recomendado utilizar un método que posea mayor eficacia y efectividad. De acuerdo a esto el método mas usado para la medición de biomasa es secar volúmenes determinados de cultivos celulares lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trate de métodos de células que sedimenten rápidamente, como las levaduras, esto usualmente implica centrifugación de muestras del cultivo en tubos de centrifuga prepesados. En el caso de células bacterianas difíciles de concentrar pro centrifugación, las muestras de cultivo se filtran a través de membranas hidrofilicas con tamaño de poros de 0.2 um.

Otro método muy utilizado es el de determinación por densidad óptica, en el cual se aprovecha la proporcionalidad de la densidad óptica a la masa celular, cuando no se tienen en el medio de fermentación u otros sólidos en suspensión. También podemos encontrar otros métodos que son utilizados en la medición de biomasa, pero los más destacados son los anteriormente mencionados y destacados en la practica de laboratorio realizada.

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS

1. CULTIVO MADRE.Con 5 gr (500mg) de levadura seca comercial (Saccharomyces cerevisiae) y 200 ml (0.2 L) de agua destilada.

Ppm= (mg/L) Ppm= (500 mg/ 0.2 L) = 2500 ppm.

Solución Madre De levaduras. >

2. SOLUCIONES PROBLEMA.

TUBOS 1 2 3 4 5 6 7mL H2O * 9 8.5 8 7.5 7 6.5 6mL cultivo M 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4Ppm (mg/L) 250 375 500 625 750 875 1000(*) Agua destilada.

3. MEDICION DE BIOMASA MICROBIANA POR CONTEO DIRECTO EN CAMARA DE NEUBAUER.

CAMARA DE NEUBAUER

V. de cultivo = 0.4 mLPpm =100 mg/L

# de células en cámara de Neubauer. = 52

# de células/ml: 34,66666667

4. MEDICION DE BIOMASA MICROBIANA POR DENSIDAD OPTICA.

TABLA 2. Mediciones con celda y con tubo de ensayo con respecto a la concentración.

Con/ción.ppm

Muestra (ml)

Absorbancia con el tubo Absorbancia con la celda

Ensayo 1

Ensayo 2

Prom. Ensayo 1

Ensayo 2

Prom.

0 Blanco 0 0 0 0 0 0250 1 0,269 0,255 0,262 0,318 0,317 0,3175375 1,5 0,398 0,398 0,398 0,219 0,219 0,219500 2 0,375 0,361 0,368 0,303 0,302 0,3025625 2,5 0,57 0,52 0,545 0,283 0,286 0,2845750 3 0,684 0,666 0,675 0,496 0,496 0,496875 3,5 0,777 0,751 0,764 0,486 0,486 0,486

1000 4 0,829 0,802 0,8155 0,487 0,487 0,487

Grafica # 1

Grafica # 2

ESPECTROFOTÓMETRO DIGITALUNISUCRE

MINI VORTERVER UNISUCRE

Muestra problemaAbsorbancia

Ensayo 1 Ensayo 2 Promedio0.851 0.832 0.8415

Concentración (ppm) ¿?

Con la

ecuación obtenida en la grafica de absorbancia con el tubo de ensayo podríamos hallar la concentración de la muestra problema, pero pese a que el valor de la absorbancia de la muestra problema esta por fuera del rango de datos del experimento, no se puede aplicar dicha formula, por lo que no se puede encontrar la concentración.

ANALISIS DE RESULTADOSDe la anterior experiencia de laboratorio se analizaron los siguientes puntos: De la primera grafica donde se

analizo la solución madre se puede observar que el resultado obtenido de la grafica, el R2 es

muy aproximado a 1 lo que quiere decir que cada medición fue lo mas exacta posible y que los datos tienden a estar en una proporción directa.

En comparación con la segunda grafica, el R2 es muy alejado del anterior con una diferencia de

Tabla 3. Datos de absorbancia con respecto a la concentración (resumida).

Muestra (ml)

Absorbancia con el tubo (promedio).

Absorbancia con la celda (promedio).

Blanco 0 01 0,262 0,3175

1,5 0,398 0,2192 0,368 0,3025

2,5 0,545 0,28453 0,675 0,496

3,5 0,764 0,4864 0,8155 0,487

0.159 (0.975-0.816), lo que indica que el espectrofotómetro es mas eficiente con los tubos de ensayo que con las propias celdas del equipo. El error es de 16.3%.

De la grafica 1 se observa que el valor que acompaña a la X es aproximadamente cero, según cálculos aparte, este valor es 1.9304*10-7 aproximadamente, este valor significa que por cada valor de concentración en ppm, se aumenta la absorbancia en dicho valor.

Al igual sucede en la segunda grafica cuyo valor que acompaña a la X es de 5.92*10-4.

Para el conteo de las células por medio de la cámara de Neubauer, se utilizo una concentración muy pequeña debido a que entre mayor sea la concentración (ppm) de las muestras, mayor es el numero de células. Es decir que hay una relación en la concentración de la muestra con el número de células (directamente proporcionales).

La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la muestra analizada, debido a que si la concentración aumenta, la absorbancia también aumenta.

Para poder hallar la concentración de una muestra problema con una ecuación obtenida de un análisis realizado, necesitamos que el valor de dado (la absorbancia)

este dentro del rango del experimento realizado.

CONCLUSIONESDespués de analizar los resultados obtenidos dentro de la práctica de investigación pudimos observar lo siguiente:

Para la medición de biomasa microbiana se pudieron encontrar distintos métodos, los cuales se utilizan de acuerdo al tipo de sustancia microbiana a utilizar y de acuerdo a la concentración de la muestra a analizar.

Se debe tener en cuenta que para utilización de la cámara de Neubauer las concentraciones de estudio son muy limitadas debido a que a mayor concentración, menor visibilidad.

CUESTIONARIO

¿Que otros métodos se utilizan para la medición de biomasa?Lo mas practico para la determinación de la biomasa microbiana se basa en pruebas detectando la presencia de compuestos bioquímicas específicos que indican la presencia de microorganismos.

ATP

La medida de ATP puede usarse para calcular la biomasa microbiana, sin embargo existen dificultades para el cálculo exacto pues en algunos casos la concentración de ATP cambia según sus condiciones alteradas como las nutricionales y fisiológicas.

COMPONENTES DE LA PARED CELULARLa mayoría de las bacterias poseen acido murámico en su pared celular, y esta es la herramienta útil para la determinación de la biomasa microbiana. Esta se basa en la liberación de lactato por parte del acido muramico y posteriormente el análisis químico para determinar la concentración de dicho lactato. La conversión de la medida de acido muramico (MA) en biomasa indica que las bacterias Gram positivas presentan una proporción de 44µg MA/mg C y las Gram negativas 1244µg MA/mg C.

CLOROFILALa biomasa de los microorganismos fotosintéticos se puede determinar a partir de la determinación de la clorofila. Esta se puede extraer con disolvente como la acetona o el metanol, y cuantificarse midiendo su absorbancia en

un espectrofotómetro a una longitud de onda de 665nm.

PROTEINALas proteínas son fácilmente cuantificables, y estas con grupos hemo pueden ser detectadas específicamente mediante quimioluminiscencia.Esta determinación proteica es apropiada solamente cuando se encuentra solamente una población.

DNALa determinación del ADN puede emplearse como la determinación de la masa microbiana. Suelen emplearse reacciones con colorantes fluorescentes como el bromuro de etidio y la espectrofluorometria.

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