técnicas de imunologia prof.doutor josé cabeda técnicas em imunologia parte i métodos...
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Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Técnicas em Imunologia
Parte IParte IMétodos Laboratoriais em ImunologiaMétodos Laboratoriais em Imunologia
Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Colheitas Utilizar o Utilizar o tubo correctotubo correcto
Sangue /plasmaSangue /plasmaAnticoagulante apropriadoAnticoagulante apropriado
• EDTAEDTA• CitratoCitrato• heparinaheparina
SoroSoroCom activador da coagulaçãoCom activador da coagulaçãoCom activador da coagulação e gel separador do Com activador da coagulação e gel separador do
coágulo e sorocoágulo e soro
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Soro
Coagulação deve ser completaCoagulação deve ser completa Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem
anticoagulanteanticoagulante Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da
coagulaçãocoagulação
Mais se o indivíduo estiver com hipocoagulação Mais se o indivíduo estiver com hipocoagulação natural ou induzidanatural ou induzida
Centrifugar os tubos 10 min a 1,000-1,200g-22ºCCentrifugar os tubos 10 min a 1,000-1,200g-22ºC Guardar a 4ºC excepto para CH50 e crioglobulinasGuardar a 4ºC excepto para CH50 e crioglobulinas
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Que tubo utilizar? Preparação de leucócitosPreparação de leucócitos
Habitualmente utilizar anticoagulante (qual Habitualmente utilizar anticoagulante (qual depende do teste)depende do teste)
Purificar as célulasPurificar as células Preservar as célulasPreservar as células
Fenotipagem Fenotipagem 4ºC 4ºCCultura/estudos funcionaisCultura/estudos funcionais
• Transportar o sangue a RT rapidamenteTransportar o sangue a RT rapidamente• Preparar as células rapidamentePreparar as células rapidamente• Cultivar/testar de imediatoCultivar/testar de imediato
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Outros tipos de Amostra (I) Urina (muito raro)Urina (muito raro)
CSFCSF SalivaSaliva Liquidos de:Liquidos de:
Sinovial, Sinovial, pleura, pleura, pericárdio, pericárdio, peritoneu, peritoneu, BALBAL
Utilizar Tubo c/ EDTA
ou
sem anticoagulante
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Outros tipos de Amostra (II)
Biópsias (aspirados por agulha fina)Biópsias (aspirados por agulha fina) Nódulos linfáticosNódulos linfáticos Medula ósseaMedula óssea TumoresTumores etcetc
Utilizar Tubo c/ EDTA
ou
Com heparina
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Amostras que necessitam de processamento especial
ComplementoComplemento Congelar a –20ºC até 2 horas após colheitaCongelar a –20ºC até 2 horas após colheita
CrioglobulinasCrioglobulinas Colhido em tubo morno, estéril e sem Colhido em tubo morno, estéril e sem
anticoagulanteanticoagulante Mantido a 37ºC até ser testadoMantido a 37ºC até ser testado
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O que deve acompanhar a amostra
Identificação completa do doente no tubo e na Identificação completa do doente no tubo e na requisição (ou código claro e unívoco)requisição (ou código claro e unívoco)
Sexo, data de nascimentoSexo, data de nascimento Exame requisitadoExame requisitado Patologia suspeitaPatologia suspeita Tipo de amostraTipo de amostra Data e hora da colheitaData e hora da colheita Nome,código e assinatura do Médico requisitanteNome,código e assinatura do Médico requisitante
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Razões de rejeição de amostras
Colheita inapropriadaColheita inapropriada Tubo erradoTubo errado Condições de manutenção/transporte incorrectasCondições de manutenção/transporte incorrectas Informação incorrecta/ilegível no tuboInformação incorrecta/ilegível no tubo Informação no tubo discordante da requisiçãoInformação no tubo discordante da requisição HemóliseHemólise Volume insuficienteVolume insuficiente Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante)Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante)
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Técnicas baseadas em Imunoglobulinas
Ligação dos anticorpos é específicaLigação dos anticorpos é específica Anticorpos podem ser conjugados com um Anticorpos podem ser conjugados com um
vasto leque de enzimas e marcadoresvasto leque de enzimas e marcadores
Constituem excelentes reagentes para a Constituem excelentes reagentes para a identificação sensível e específica de identificação sensível e específica de ligandosligandos
Permitem o estudo do historial imunológico Permitem o estudo do historial imunológico de um índivíduode um índivíduo
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Anticorpos como reagentes Preparação de Anticorpos policlonaisPreparação de Anticorpos policlonais
Inoculação/estimulação de animaisInoculação/estimulação de animaisAdjuvantesAdjuvantesQue animalQue animalQue via de inoculação/estimulaçãoQue via de inoculação/estimulação
Colheita, preparação e teste do soroColheita, preparação e teste do soro Estimulação repetida leva a uma Estimulação repetida leva a uma
maturação da especificidade do Abmaturação da especificidade do Ab
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Anticorpos como reagentes Preparação de anticorpos monoclonaisPreparação de anticorpos monoclonais
Estimular animais como anteriormenteEstimular animais como anteriormente Colher Linfoblastos BColher Linfoblastos B Fazer experiências de diluição limiteFazer experiências de diluição limite Preparar hibridomas com estas célulasPreparar hibridomas com estas células Fazer experiências de diluição limite dos Fazer experiências de diluição limite dos
hibridomashibridomas Testar cada clone para especificidadeTestar cada clone para especificidade
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Técnicas em Imunologia
Parte IParte IMétodos Laboratoriais em ImunologiaMétodos Laboratoriais em Imunologia
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Técnicas baseadas em imunoglobulinas
Ensaios LiquidosEnsaios Liquidos(ensaios homogéneos)(ensaios homogéneos)
Difração da luzDifração da luz NefelometriaNefelometria turbidimetriaturbidimetria
Outros ensaios liquidosOutros ensaios liquidos EMITEMIT CEDIACEDIA
ImunofluorescênciaImunofluorescência AglutinaçãoAglutinação QuimioluminescênciaQuimioluminescência
Ensaios SólidosEnsaios Sólidos(ensaios heterogéneos)(ensaios heterogéneos)
ELISAELISA CompetitivoCompetitivo Não-competitivo Não-competitivo
indirectoindirecto RIARIA
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Técnicas baseadas na difracção da luz
NefelometriaNefelometria
Baseada na reacção de Baseada na reacção de imunoprecipitaçãoimunoprecipitação
Mede a quantidade de luz Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de difractada devido à presença de complexos imunológicoscomplexos imunológicos
O ângulo de difracção e o O ângulo de difracção e o comprimento de onda são comprimento de onda são aspectos importantesaspectos importantes 31º permite melhor razão 31º permite melhor razão
sinal/ruídosinal/ruído
ImunoturbidimetriaImunoturbidimetria
Baseada na reacção de Baseada na reacção de imunoprecipitaçãoimunoprecipitação
Mede a diminuição de luz que Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma consegue atravessar uma solução na presença de solução na presença de complexos imunológicoscomplexos imunológicos
O detector está sempre alinhado O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada, mas da não difractadadifractada
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Curva de imunoprecipitação Assumindo:Assumindo:
Ig pelo menos bivalentes IgGIg pelo menos bivalentes IgG Antigénio com pelo menos 2 Antigénio com pelo menos 2
epitopesepitopes Se Ab em excesso, um aumento Se Ab em excesso, um aumento
de Ag implica um aumento da de Ag implica um aumento da reacçãoreacção
Se Antigénio em excesso, um Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a antigénios, o que diminui a precipitaçãoprecipitação
A quantificação só é possível se o A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excessoanticorpo estiver em excesso
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Cinética da Curva de imunoprecipitação
A reacção inicia-se A reacção inicia-se imediatamente, sendo visivel imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio20s após a adição do antigénio
A reacção prossegue de modo A reacção prossegue de modo aproximadamente linear até que aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos a precipitação dos complexos origina uma aparente origina uma aparente diminuição da reacçãodiminuição da reacção
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Rate Nephelometry [Ab] é constante[Ab] é constante Aumento progressivo da Aumento progressivo da
[antigénio][antigénio] Deve ser realizada na zona de Deve ser realizada na zona de
excesso de Abexcesso de Ab Em nefelómetros automáticos Em nefelómetros automáticos
deste tipo, 2 [antig] são deste tipo, 2 [antig] são inicialmente ensaiadas. inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado:Dependendo do resultado: São testadas novas []São testadas novas [] É testada o excesso de antigÉ testada o excesso de antig
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End-point nephelometers
Medida no ponto Medida no ponto máximo da reacçãomáximo da reacção
Medida de branco ou Medida de branco ou no inicio da reacçãono inicio da reacção
Valor intrapolado de Valor intrapolado de uma curva de uma curva de calibraçãocalibração
VariaçõesVariações Particle enhancedParticle enhanced
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Particle enhanced nephelometry
São utilizadas particulas de latex São utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antigénio conjugadas com anticorpo ou antigénio competidorcompetidor Aumento de sensibilidadeAumento de sensibilidade
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Ensaios RequisitosRequisitos
Qualquer fluido Qualquer fluido SoroSoro PlasmaPlasma UrinaUrina CSFCSF
Deve ser diluído (para não Deve ser diluído (para não interferir na leitura)interferir na leitura)
Amostras ricas em lipídios devem Amostras ricas em lipídios devem ser clarificadas por filtração ou ser clarificadas por filtração ou ultracentrifugaçãoultracentrifugação
Amostras ictéricas ou hemolisadasAmostras ictéricas ou hemolisadas Não afectam a nefelometriaNão afectam a nefelometria Afectam a turbidimetriaAfectam a turbidimetria
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Outro ensaios homogéneosCEDIA CEDIA
(Cloned enzyme donor assay)(Cloned enzyme donor assay) -galactosidade em 2 fragmentos -galactosidade em 2 fragmentos
inactivosinactivos enzyme donnorenzyme donnor Enzyme acceptorEnzyme acceptor
A reacção imune junta-os A reacção imune junta-os activando a enzima. activando a enzima.
Se não houver antigénio o Se não houver antigénio o anticorpo liga-se à enzima anticorpo liga-se à enzima inactivando-ainactivando-a
EMIT EMIT (Enzyme multiplied immunoassay (Enzyme multiplied immunoassay
technique)technique) Aumento ou diminuição da Aumento ou diminuição da
actividade enzimatica com a actividade enzimatica com a reacção Ag-Abreacção Ag-Ab
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Imunofluorescência Anticorpos conjugados com Anticorpos conjugados com
compostos fluorescentescompostos fluorescentes Conjugado utilizado como Conjugado utilizado como
revelador directorevelador directo Aumento de 10 a 1000 vezes na Aumento de 10 a 1000 vezes na
sensibilidadesensibilidade Grande aumento na rapidez de Grande aumento na rapidez de
detecçãodetecção Vantagens relativamente à RIA:Vantagens relativamente à RIA:
Tão sensivelTão sensivel Reagentes mais estáveisReagentes mais estáveis Mais fácil de implementarMais fácil de implementar
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Principais fluorocromos utilizados
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Técnicas de imunofluorescência (I)
DirectasDirectas Anticorpo directamente conjugadoAnticorpo directamente conjugado
IndirectasIndirectas Anticorpo secundário conjugadoAnticorpo secundário conjugado
AcopladasAcopladas Duas reacções acopladasDuas reacções acopladas
Fluorescence polarization immunoassayFluorescence polarization immunoassay Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida
quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o que se deve às restrições ao movimento rotacional do que se deve às restrições ao movimento rotacional do antigénio no complexoantigénio no complexo
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Técnicas de imunofluorescência (II)
Fluorescent Quenching assay Fluorescent Quenching assay Método competitivo directo que utiliza [ab] fixaMétodo competitivo directo que utiliza [ab] fixa
Competição para o ab entre o antigénio marcado e o Competição para o ab entre o antigénio marcado e o não marcado (a testar)não marcado (a testar)
A fluorescência é absorvida (quenched) quando o A fluorescência é absorvida (quenched) quando o antigénio marcado se liga ao anticorpoantigénio marcado se liga ao anticorpo
A intensidade de fluorescência é uma medida da A intensidade de fluorescência é uma medida da quantidade de antigénio não marcado que competiu quantidade de antigénio não marcado que competiu para o anticorpopara o anticorpo
Método indirectoMétodo indirecto
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Técnicas de imunofluorescência (III)
Substrate labelled Fluorescent immunoassay Substrate labelled Fluorescent immunoassay Método indirectoMétodo indirecto
Analito ligado a um modulador que influencia o sinal geradoAnalito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado Actividade do modulador influenciada pela ligação do AbActividade do modulador influenciada pela ligação do Ab
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Técnicas de imunofluorescência (IV)
Fluorescent energy transfer immunoassay Fluorescent energy transfer immunoassay Método competitivoMétodo competitivo
Analito conjugado com FITCAnalito conjugado com FITC Anticorpo ligado a RodaminaAnticorpo ligado a Rodamina Se o analito conjugado ligar ao Se o analito conjugado ligar ao
anticorpo, por ressonância a energia anticorpo, por ressonância a energia do FITC excita a rodaminado FITC excita a rodamina
Se por competição, o analito impedir Se por competição, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, o anticorpo de se ligar ao conjugado, não haverá excitação da rodaminanão haverá excitação da rodamina
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Problemas da imunofluorescência
AutofluorescenciaAutofluorescencia Proteinas do soro (320-Proteinas do soro (320-
350nm)350nm) Bilirubina (430-470nm)Bilirubina (430-470nm) Urina apresenta elevada linha Urina apresenta elevada linha
de basede base Para obviar a estes problemas Para obviar a estes problemas
pode-sepode-se Tratar a amostra com Tratar a amostra com
Enzimas proteoliticasEnzimas proteoliticas Agentes oxidantesAgentes oxidantes Agentes desnaturantesAgentes desnaturantes
QuenchingQuenching BilirrubinaBilirrubina HemoglobinaHemoglobina
FotodestruiçãoFotodestruição Diminuição da Diminuição da
fluorescência ao fluorescência ao longo da excitaçãolongo da excitação
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Aglutinação Baseada na reacção ag-abBaseada na reacção ag-ab Observada visualmenteObservada visualmente Tipos:Tipos:
Directa (ABO)Directa (ABO) IgM aglutina várias RBCIgM aglutina várias RBC IgG necessita de reagente de IgG necessita de reagente de
Coombs (anti-human-ab) para fazer Coombs (anti-human-ab) para fazer a pontea ponte
Indirecta ou passivaIndirecta ou passiva Antigénio ligado a subtancia inerteAntigénio ligado a subtancia inerte
ReversaReversa Anticorpo ligado a substancia inerteAnticorpo ligado a substancia inerte
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Aglutinação de partículas
Mais sensíveis que a aglutinaçãoMais sensíveis que a aglutinação Mensurável por nefelometria, turbidimetria, Mensurável por nefelometria, turbidimetria,
contagem de partículascontagem de partículas Anticorpo ou antigeneo conjugado com partículas Anticorpo ou antigeneo conjugado com partículas
de látexde látex Reacção ag-ab aglutina as partículas que saem de Reacção ag-ab aglutina as partículas que saem de
soluçãosolução A medida das partículas em solução é A medida das partículas em solução é
inversamente proporcional ao titulo a determinarinversamente proporcional ao titulo a determinar
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Ensaio quimioluminescente Produção de luz por uma reacção química, habitualmente uma reacção Produção de luz por uma reacção química, habitualmente uma reacção
de oxidação-reduçãode oxidação-redução O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10 -18-18 a a
zeptomole=10zeptomole=10-21-21)) Compostos utilizados:Compostos utilizados:
Esteres de acridina (detecção do NaOH e HEsteres de acridina (detecção do NaOH e H22OO22)) Limite de detecção de 0.5 atomolesLimite de detecção de 0.5 atomoles
Derivados do isoluminol (detecção com HDerivados do isoluminol (detecção com H22OO22 e um catalizador) e um catalizador) Limite de detecção de 50 atomolesLimite de detecção de 50 atomoles
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Enzimas utilizadas em ensaios quimioluminescentes
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Ensaios em fase sólida
ELISAELISA CompetitivoCompetitivo
Não competitivo-indirectoNão competitivo-indirecto
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Ensaios em fase sólida
ELISAELISA Sandwich ou de capturaSandwich ou de captura
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Resolver problemas do ELISA
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Electroforese de Imunoglobulinas
Electroforese em agarose de alta resoluçãoElectroforese em agarose de alta resolução ImunofixaçãoImunofixação ImunosubtracçãoImunosubtracção Electroforese capilarElectroforese capilar
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Electroforese de Ig em agarose
Electroforese + Corar com Ponceau S e secar
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Imunofixação ElectroforeseElectroforese Aplicação de tira de acetato de celulose com anticorpo Aplicação de tira de acetato de celulose com anticorpo
monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondenteprecipitado onde houver Ig correspondente
Proteinas não pp são lavadasProteinas não pp são lavadas Corar os pp com amido black nigrosinCorar os pp com amido black nigrosin
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Imunosubtracção
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Crioglobulinas (I) Tipo ITipo I
Monoclonal (IgG, IgM, Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves)IgA, raramente c.leves)
Tipo IITipo II Mistas (2 ou mais Ig, Mistas (2 ou mais Ig,
sendo uma monoclonal)sendo uma monoclonal) Tipo IIITipo III
PoliclonalPoliclonal
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Crioglobulinas (II)