técnicas citoquímicas aplicadas à embriologia vegetal disciplina: elementos de microscopia e...
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Técnicas Citoquímicas Aplicadas à Embriologia Vegetal
Disciplina: Elementos de Microscopia e MicroanáliseDocente: Profa. Dra. Maria Tercília V. de Azeredo Oliveira
Eduardo João Pereira Junior
● FLOR: Ramo modificado que porta os esporófilos (carpelos e estames)● ANDROCEU (estames): filete(1) + conectivo(3) +antera bilobada(2) → 4 androsporângios ou sacos polínicos(4)
● GINECEU: estigma(1) + estilete(2) + ovário(3) com óvulos (4), (5- saco embrionário)
● ANDROSPOROGÊNESE E ANDROGAMETOGÊNESE● Androsporogênese → formação dos andrósporos dentro dos androsporângios
● androgametogênese → desenvolvimento do andrósporo em um grão de pólen
Lilium
Lilium
● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
● Ginogametogênese → formação do ginósporo no interior do nucelo (ginosporângio)
Tabebuia pulcherrima
● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
Lilium
● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
● Ginosporogênese → desenvolvimento do ginósporo em um ginófito (saco embrionário)
● FERTILIZAÇÃO
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Arabidopsis
Técnicas Citoquímicas
● Calose – Solução de azul de anilina
● Cora tecidos frescos ou fixados (10-15 min.)● Elevando-se o pH para 9 ou 10 aumenta a intensidade da coloração mas diminui sua aplicabilidade como corante vital● Resultado: A calose emite fluorescência verde/amarela ao ser observada em microscopia de epi-fluorescência com comprimento de onda da luz UV em 365 nm.
Azul de anilina 0,005%K2HPO4 0,15MpH 8,2
● Polissacarídeos insolúveis – PAS● Ótimo protocolo de coloração para identificar polissacarídeos insolúveis ● Utilizado para secções frescas, secções desparafinizadas, secções incluídas em glicol metacrilato ou epóxi. ● Grupos aldeídicos do tecido (principalmente se houve fixação com um aldeído) devem ser tratado com um agente bloqueador, p.ex. solução saturada de 2,4-dinitrofenil hidrazina em ácido acético 15% durante 30 min ● Lavar por 30 min. em água corrente● Oxidar por 10 min. em ácido periódico 1%● Lavar rapidamente● Corar com reativo de Shiff● Resultado: polissacarídeos se coram de púrpura,os núcleos podem se corar fracamente
● Lignina – Floroglucinol● Usado freqüentemente com cortes á mão livre● Gotejar uma a solução de floroglucinol sobre o tecido e incubar por 30 – 60 min
● Resultado: células lignificadas se coram de vermelho. A coloração não é permanente, o corante se degrada num curto período.
Etanol 100 mLHCl 16 mLFloroglucinol 0,1 g
● Amido – IKI (Iodo-Iodeto de Potássio)● Usado em cortes manuais ou incluídos● Gotejar uma gota de IKI sobre o tecido e deixar reagindo por 5 min.
● Resultado: O corante se intercala na estrutura do amido resultando numa coloração escura.
Água destilada 100ml
Iodeto de Potássio 1 g
Iodo 1 g
● Ácidos graxos, suberina e cutina – Sudan● Cora cortes frescos e secções incluídas em historresina
● Coloca-se o corte em etanol 50% por poucos segundos, então adiciona-se o corante● Incuba-se por 5 – 10 min. com o corante, que dever ser recém preparado● Mergulha-se novamente em etanol 50%● Montar em glicerina
Etanol 70% 100 mLSudan IV, Sudan Black 0,07 g
● Resultado: Os lipídios bem como a suberina e a cutina solubilizam o corante e torna-se distinguíveis. Sudan Black B pode ser usado para corar ceras fracamente
● Pectina – Vermelho de Rutênio● Usado para tecidos fixados ou frescos● As secções são mergulhadas numa solução preparada imediatamente antes do uso com de vermelho de rutênio a 0,005%● Os tecidos são montados em uma solução de glicerina dissolvida● Resultado: as substâncias pectínicas (lamela média) se coram de vermelho ou rosa.
● Clarificação de tecidos (Fluido de Herr) – Microscopia de Normanski● Método indicado para visualizar células e tecidos delicados como óvulos e embriões intactos dentro dos óvulos/sementes em estádios iniciais● Fixar o material em fluido de Navashin modificado por Randolph ●Dissecar (p. ex.) os ovário e mergulhá-los no fluido de Herr por pelo menos 24 horas
● Montagem: coloque o material sobre uma lâmina escavada com um pouco da solução de clarificação● Cobrir com lamínula e observar em microscopia de contraste interferencial de Normanski
Ácido Lático 20gCloral Hidratado 20gFenol 20gÓleo de Cravo 20gXilol 20g
● DNA – 4’-6- Diamino-2-fenilindol (DAPI)
● Dissecção e fixação do tecido por 24 horas em solução de álcool etílico e ácido acético (3:1). ● Em seguida as peças são infiltradas em historesina e seccionadas em série em micrótomo ● As secções aderidas em lâminas de vidro são imersas em solução de 0,25 mg/ml-1 de 4’, 6-diamidino-2- fenilindol (DAPI), em tampão TRIS 0,05 M, e mantidas na temperatura ambiente e no escuro ● Em seguida, as secções são examinadas em microscópio de epi-fluorescência ● Resultado: Núcleos emitem fluorescência azul
A CB
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ns
nps
sp
nceo
no
Obrigado !