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Target and Differentiation Terapyin oncologia

Prof. Maurizio PianezzaDott. Stefano Cucumazzo

Cancro: malattia genetica acquisita dalle cellule somatiche

Conferma della definizione: aberrazioni cromosomiche

Biologia molecolareCitogenetica

Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

Cellule tumorali: deviazione del normale valore diploide dei cromosomiPloidia Combinazioni MorfologiaMonosomie delezioneTrisomie duplicazionePolisomie inversione

traslocazioneMSR: regioni cromosomiche amplificate all’interno del braccioDM: regioni cromosomiche amplificate all’esterno del braccio


BANDE CROMOSOMICHE

71 su 329Riarrangiamenti tumore-associati


La citogenetica consente di individuare due classi di geni implicati nello sviluppo e progressione tumorale

Proto – oncogenesTumor Suppressors Genes


Attivazione dei proto-oncogeni1° meccanismo:Aumento proteine del gene per iperespressione del gene stessoDelezione del dominio regolatorio

2° meccanismoTrasposizione per traslocazionecromosomica

3° meccanismoAmplificazione genica


attivazioneProto-oncogene Oncogene

Differenti compartimenticellulari

recettore fattore di sistemi di sistemi di direttocrescita trasduzione trascrizione su proteine

del segnale del ciclocellulare

bersaglio


Inattivazione dei Tumor Suppressor Genes1° evento

Si inattiva uno dei due alleliLinea germinale: tumori “ereditari”Mutazione somatica: tumori comuni

2° eventoMutazione somatica che inattiva la restante parte allelica (allele selvaggio)

La regione cromosomica che contiene l’allele selvaggio viene eliminata attraverso:

Non disgiunzione Mancata Ricombinazione mitoticaConversione genica


Eventi genetici nella genesi dei tumori solidi

Eventi genetici distinti:Attivazione oncogeniInattivazione tumor suppressors genes

Lesioni genetiche multiple: PERDITA ALLELI CHE SI VALUTA CON MARKER D.N.A. CONTROPARTE MOLECOLARE ALLELOTIPO


Cambiamenti genetico molecolari: ploidia del tumore

Tumori solidi aneuploidia instabilità genomica

Progressione dimalattia

Aumento numerico dei cromosomi

Ipometilazione

Gene di Divisione cellulare

Modello ComputerizzatoDi Shackney

Non-disgiunzionemitotica

Cloni iperdiploidii

Cloni ipodiploidi

Perdita di cromosomiTetraploidizzazioneCrescita cellulareDivisione cellulareGrowningPromotingAberrazione cromosomicaCopyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

Aneuploidia Attivazione oncogenica

Doppia e sequenziale sovraesposizionenon disgiunzione del cromosoma


Cromosoma eucarioteCROMATINA

Complesso DNAProteine CromosomicheRNA Nucleare

EUCROMATINA ETEROCROMATINA

geneticamente attiva geneticamente inattiva


Struttura del DNA


Proteine cromosomicheNucleosomaDNA avvolto sugli istoniH1 sigilla il DNA

Tra 2 nucleosomi: DNA detto “Linker”

Proteine IstonicheH1H2aH2bH3H4

Proteine non IstonicheEnzimiProteine di trascrizioneProteine di replicazione

Interazione proteine non istoniche che legano il DNA

SUL:Centromero: regolano DNA in mitosi e meiosievita non disgiunzione dei cromosomiCinetocromo: consentono attacco fibre del fusomitotico Telomero: evitano rimaneggiamenti cromosomi


Struttura Struttura deglidegliIstoniIstoni


Struttura del nucleosoma


RECETTORE

Molecola che lega in modo specifico, definito e con affinità precisa uno o più mediatori endogeni e che, in seguito al legame, subisce una modificazione conformazionale in grado di determinare un effetto biologico

In base alla localizzazione subcellulare:1)RECETTORI DI MEMBRANA2)RECETTORI INTRACELLULARI


Recettori di membrana6 SUPERFAMIGLIE:

•RECETTORI CANALE O IONOTROPI•RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G O METABOTROPI•RECETTORI CON ATTIVITA’ TIROSIN CHINASICA INTRINSECA•RECETTORI CON ATTIVITA’ GUANILATO CICLASI INTRINSECA•RECETTORI PER L’ADESIONE CELLULARE•RECETTORI PER LE CITOCHINE

RECETTORE CANALE trasduzione del segnale molto rapidaRECETTORE ACCOPPIATO ALLE PROTEINE G trasduzione del segnale più lunga e più lenta


STRUTTURA GENERALE DEI RECETTORI IONOTROPI

Caratteristiche strutturali che variano apprezzabilmente tra i vari recettori: composizione e lunghezza del terzo loop citoplasmatico e dell’estremità carbossiterminale.


RECETTORI METABOTROPIProteine recettoriali formate da una singola catena polipeptidica che attraversa la membrana plasmaticain corrispondenza di altrettante regioni idrofobiche(regioni transmembranaTM). La catena polipeptidica si organizza spazialmente nella membrana in modo da costituire una particella globulare.Sito di legame per il neurotrasmettitore: porzioni transmembranarie o extracellulari della sequenza amminoacidica.


RECETTORI METABOTROPITratto di sequenza tra

TM5 e TM6: rivolto verso il citoplasma;

importante per il riconoscimento delle proteine G specifiche

con cui ciascun recettore si accoppia QUINDI responsabile

della specificità dell’effetto

dell’attivazione recettoriale.Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

Struttura del recettore del fattore di crescitaepidermico EGF RECETTORI TIROSINO CHINASICI


Attivazione del recettore di EGF

Proteine G

Eterotrimeri costituiti da 3 subunità: α, ß, γ.α è in grado di legare il GTP e di idrolizzarlo grazie a una attività GTPasica intrinsecaLe proteine G trasferiscono informazioni dai recettori alle molecole effettrici attraverso un ciclo di attivazione-deattivazione governato dal legame e dall’idrolisi del GTP.


Recettori canaleo ionotropi

Recettori accoppiati alle proteine G o metabotropi


EFFETTORI DELLE PROTEINE G CON FUNZIONI DI CANALE IONICO

I più studiati sono i canali al calcio operati da proteina G e un numero sempre più crescente di canali al potassio


ATTIVAZIONE ED INATTIVAZIONE DELLE PROTEINE G

Le proteine G passano continuamente da una conformazione inattiva (GDP legato) ad una attiva (GTP legato). La transizione verso la forma attiva è indotta dal recettore; il ritorno alla forma inattiva è garantito

dalla proprietà della subunità αche idrolizza il GTPCopyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

SISTEMI EFFETTORIIl segnale generato dall’interazione recettore proteina G viene tradotto in un

messaggio cellulare attraverso l’attivazione di EFFETTORI specifici:


Meccanismo di azione tirosino chinasico


Recettori a tirosin-chinasi


ATTIVAZIONE DELLA CASCATA DELLE MAP CHINAS

Le MAP chinasi (proteinchinasi attivate da mitogeni) rivestono un ruolo centrale in processi cellulari importanti quali la proliferazione e il differenziamento. Possono essere attivate tramite vie diverse che coinvolgono o l’attivazione di recettori per i fattori di crescita ad attività tirosin chinasica o l’attivazione di recettori associati a

proteine G. Le MAP chinasi sono fosfoproteine fosforilate da una chinasi chiamata MEK.

L’attivazione delle MAP chinasi determinano traslocazione al nucleo, con conseguente fosforilazione di proteine nucleari, soprattutto fattori di trascrizione che

regolano l’espressione di geni essenziali per la stimolazione di crescita e differenziamento cellulari. Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE

La TRASDUZIONE DEL SEGNALE viene definita come la capacità della cellula di modificare il proprio funzionamento in risposta a una interazione recettore-ligando Il ligando rappresenta il PRIMO MESSAGGERO.


EFFETTORI DELLE PROTEINE G CON FUNZIONE ENZIMATICA

I secondi messaggeri sono l’anello di congiunzione tra l’attivazione recettoriale e la generazione della risposta cellulare. Il primo messaggero è invece il neurotrasmettitoreresponsabile dall’attivazione del recettore.Dato che il secondo messaggero è in grado di diffondere nel citoplasma, esso è anche in grado di regolare l’attività di processi cellulari che hanno luogo in sedi distanti.I più studiati sono l’ADENILATO CICLASI e la FOSFOLIPASI C che generano rispettivamente i SECONDI MESSAGGERI cAMP e IP3/DAG.


RECETTORI ACCOPPIATI ALL’ADENILATO CICLASI

L’adenilatociclasi è un enzima ubiquitario che converte ATP in cAMP; l’attività può essere inibita o stimolata da vari recettori

associati alle proteineG. Il cAMP svolge la sua azione di secondo messaggero regolando l’attività di diverse proteine cellulari, in

particolare le proteinchinasi A (PKA). Attraverso questo meccanismo il Camp controlla una serie di

processi cellulari: reazioni metaboliche, secrezione, rilasciamento delle cellule muscolari lisce, attività di canali ionici, trascrizione di

geni specifici. Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

RECETTORI ACCOPPIATI ALLA FOSFOLIPASI C

Il calcio si lega alla proteina calmodulina e il complesso CA++-calmodulina determina l’attivazione

di una serie di risposte cellulariCopyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

STIMOLAZIONE E INIBIZIONE DELL’ADENILATO CICLASI AD OPERA DI DIFFERENTI PROTEINE G

(a)Il legame della noradrenalina al recettore ß attiva Gsche attiva l’adenilatociclasi. Questo genera cAMP che attiva l’enzima a valle protein-chinasi A

(b)Il legame della noradrenalinaal recettore α2 attiva Gi che inibisce l’adenilatociclasi Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

RECETTORI ACCOPPIATI ALLA FOSFOLIPASI C

Le due vie di attivazione, calcio e proteinchinasi C (PKC), regolano svariati

processi cellulari (metabolismo,

secrezione, contrazione, attività neuronale,

proliferazione)Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE CAUSATA DALLE CASCATE DEL SECONDO MESSAGGERO

ASSOCIATO ALLE PROTEINE G


SCHEMA RIASSUNTIVO


I Recettori Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

Feed-back Terapeutico:differenziazione blocco proliferativo

Effettori extracellulari

Recettori diMembranaCitoplasmatica Trasduttori del

SegnaleEffettori Intracellularie secondi messaggeri

Sintesi Proteica

Recettori nucleariRNA M.T.R. Piccoli effettori

Modulazione Modulazione espressione Espressione genica genica diretta indiretta


FarmacodinamicaLa farmacodinamica studia gli effetti biochimici e il meccanismo d’azione dei farmaci proponendosi di:

identificare i siti di azione dei farmacidelineare le interazioni fisiche o chimiche tra farmaco e cellulacaratterizzare la sequenza completa farmaco-effettodefinire le basi per l’uso razionale dei farmaci e per il disegno di nuovi farmaci


FarmacomodulazionePresuppone la conoscenza di:

meccanismi biomolecolari normali e nel cancroconoscenza dei dosaggi terapeutici ottimali e i sinergismi tra di essi


Farmaci target molecolariTrastuzumab (herceptin)

Legame con ER2-NEUcodificato da gene C-ERB2Tirosino chinasicoFamiglia EGFR

MammellaStomaco


Farmaci target molecolariImatinib (Glivec)

Legame con CD117Tirosino Chinasico

Leucemia mieloide cronicaGIST


Farmaci target molecolariRituximab (Mabthera)

Legame CD20Citotossicità complemento-mediataCitotossicità cellulo-mediata

Linfoma Non-Hodgkin


Farmaci target molecolariGentuzumab Ozogamicin (Milotarg)

Legame CD33+Citotossicità come rituximab

Leucemia mieloide acuta


Farmaci target molecolariBortezomid (Velcade)

Blocco del proteosoma

Mieloma multiplo


Farmaci target molecolariGefitinib (Iressa)

Legame EGFRTirosino-Chinasico

PolmoneApparato digerente


Farmaci target molecolariCetuximab (Erbitux)

Legame EGFRTirosino ChinasicoMaggiore efficacia se su pezzo operatorio riscontro immunoistochimico di R1


Farmaci target molecolariBevacizumab (Avastin)

Legame VEGF

Tutti i tumori solidi con prevalenza di quelli ipervascolarizzati


Farmaci target molecolariSU11248 (sperimentale)

Legame VEGFLegame PDGF-R


Farmaci target molecolariBAY43-9009 (sperimentale)

Inibizione del RAFchinasiPromotore G proteins per effetto antiproliferativo ed antiangiogenetico

Tutti i tumori


Farmaci target molecolariBatimastat, Barimastat, Ag3340, BAY219566 (sperimentali)

Inibitori delle metalloproteinasi intercellulariInibizione angiogenetica

Tutti i tumori


Farmaci target molecolariFarnesil difosfato analoghi, CAAXtetrapeptide analogo

Inibitore della farnesil transferasi con interruzione dell’attività della proteina RAS-H, RAS-K, RAS-NBlocco del messaggio recettoriale da EGF, PDGF, GM-CSF, IL2, IL3


Farmaci Molecolari OrmonaliEstrogeni (Antagonisti ormonali)

Dietil-StilbestroloDietilen-estradioloFosfestrolo-tetrasodico

Progestinici Medrossi-progesterone acetato (Provera, Farlutal)Megestrolo-Acetato (Megace)Noretisterone (non registrato in Italia)


Farmaci Molecolari OrmonaliInibitori delle aromatasi (impediscono conversione androgeni--> estrogeni)

Aminoglutetimide NS (Orimeten)Anastrozolo NS (Arimidex)Letrozolo NS (Femara)Formestan S (Entaron)Esemestan S (Aromasin)Trilostato S (non registrato in Italia)


Farmaci Molecolari OrmonaliInibizione recettoriale, antagonista ormonale

Tamoxifene (Nolvadex)Toremifene (Fareston)Fulvestrant (Fasiodex)


Farmaci Molecolari OrmonaliAntiandrogeni, antagonisti ormonali

Ciproterone (Androcur)Flutamide (Eulexin)Bicalutamide (Casudex)


Farmaci Molecolari OrmonaliInibitori LHRH, analoghi ormone di rilascio

Buserelina (Suprefat)Goserelin (Zoladex)Leuprorelina (Enantone)Triptorelina (Decapeptil)


Somatostatina, Octreotide, Lanreotide, Vapreotide* Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

Azione antiproliferativa:

Diretta Indiretta

SST1-2-3-4-5 IGFR

Antiproliferativa Antiangiogenetica Antiproliferativa Antiangiogenetica Differenziante Differenziante

FosforilazionePTP Inibizione Inattivazione ERK Inibizione(fosfotirosin fosfatasi) bFGF IGFR

Inibizione:RAS (certa) Inibizione ENOS Inattivazione SRC (certo) Attivazione PI3K-AKTSRC (incerto) Ceramide UpRegolation P27 (incerto)

espressione Ki67 (incerto)

Defosforilazione ERK Inibizione di NO Inibizione eNOS-NOG-Protein inibizione SHP-2C-SRC

Blocco Proliferativo Blocco Angiogenetico Blocco Proliferativo Blocco Angiogenetico

Grazie per la cortese attenzione

Il cancro è una malattia in cui le cellule sfuggono al meccanismo di controllo della crescita indispensabile per mantenere normale lastruttura e le funzioni dei tessuti


Il concetto che il cancro sia una malattia genetica delle cellule somatiche ha trovato concretezza grazie agli studi di biologia molecolare e citogenetica molecolare. La prova della teoria della mutazione somatica è il frequente riscontro di aberrazioni cromosomiche nelle neoplasie solide, presentando peraltro uncariotipo molto più complesso rispetto alle neoplasie ematologichee quindi i cambiamenti cromosomici tumore specifici si rendono più difficoltosi.


La tumorogenesi è infatti considerata come il risultato finale di eventi genetici multipli che portano le cellule alla perdita delcontrollo della crescita ed alla metastatizzazione.


Nelle cellule tumorali si riscontrano spesso deviazioni dal normale valore diploide dei cromosomi. Questi cambiamenti citogeneticiinteressano l’aploidia o la morfologia dei cromosomi oppure combinazioni di entrambe le alterazioni. Le monosomie o letrisomie e polisomie appartengono al primo gruppo mentredelezioni, duplicazioni, inversioni e traslocazioni appartengono al secondo gruppo. In più certe regioni cromosomiche possono risultare amplificate e mostrarsi come regioni colorate omogeneamente all’interno del braccio cromosomico o all’esterno di esso.


La specificità dei cambiamenti cromosomici è dimostrata dal fatto che solo 71 delle 329 bande cromosomiche del genoma umano sono interessate da riarrangiamenti tumore associati. Inoltre molti oncogeni cellulari che sono stati localizzati su specifici cromosomi localizzano anche break-point neoplasia associati.


L’analisi dei cromosomi di cellule tumorali ha evidenziato che solo il 15% presenta alterazioni del cariotipo. Questo dato però, apparentemente discrepante, trova una spiegazione nella tecnica di studio: infatti è difficile ottenere preparati di buona qualità a causa di problemi come l’indice mitotico basso e crescita sproporzionata, oppure perché il cariotipo mostra alti numeri modali con molti markers cromosomici bizzarri che probabilmente riflettono l’evoluzione del cariotipo ma parallelamente mascherano gli eventi specifici principali.


Al momento attuale due classi di geni sono coinvolte nello sviluppo e progressione del cancro: proto-oncogeni e tumor suppressors genes


I proto-oncogeni sono normali geni cellulari implicati nel controllo della crescita cellulare. Le mutazioni possono convertirli in oncogeni attivati sovrintendendo in moto patologico alla crescita delle cellule tumorali. Ad oggi sono stati individuati 70 proto-oncogeni, ed il loro bersaglio è localizzato in differenti compartimenti e funzioni della cellula quale il recettore per lacrescita cellulare, i fattori di crescita cellulare, i sistemi ditrasduzione intracellulari, i fattori di trascrizione e direttamente sulla proteine che sovrintendono il ciclo cellulare.


La mutazione che attiva il proto-oncogene è dovuta ad un aumento delle proteine del gene per imprevedibile espressione del gene edelezione del dominio regolatorio del gene oltre, come secondo meccanismo di trasformazione, vi è la transposizione pertranslocazione cromosomica. Vi è poi l’amplificazione genica che porta ad una sovraespressione degli oncogeni.


I tumor suppressor genes formano una categoria di geni di recente scoperta. La loro inattivazione per mutazione libera i meccanismi di crescita negativi da loro esercitati. Il primo risultato che si ottiene è una linea germinale (tumore ereditario) o una mutazione somatica(tumore sporadico) che inattiva uno dei due alleli del gene. Il secondo evento è una mutazione somatica che inattiva la restanteparte allelica: il cosiddetto allele selvaggio.


Questo è dovuto al fatto che la presenza dell’allele selvaggio nella regione cromosomica sede di mutazione provoca la sua eliminazione. Ciò avviene per non disgiunzione, mancataricombinazione mititoca o conversione genica.


Gli studi di genetica molecolare dimostrano come la sequenza adenoma-carcinoma nelle neoplasie colo-rettali sia caratterizzata da un sovrapporsi di eventi genetici distinti tra cui l’attivazione di oncogeni e la inattivazione di Tumor Suppressors Genes. Occorrono quindi come avviene in altri tumori, il verificarsi di lesioni genetiche multiple.


Per valutare correttamente e quantizzare la perdita di alleli, bisogna testare tutti i cromosomi con almeno un marker DNA, ottenendo una controparte molecolare chiamata “allelotipo”.


Quale parametro quantitativo della perdita multipla di alleli, è stato introdotto il termine di perdita allelica frazionala (F.A.L.) che rappresenta la parte evidenziabile di cromosoma con perditaallelica per singolo tumore.


La aneuploidia rappresenta il segnale tipico dei tumori solidi e nello stesso tempo la sua associazione clinico patologica della malattia. Questo sembra si a generato od accompagnato da instabilità delgenoma.


L’evoluzione genetica dei tumori solidi sottostà a delle forze che sono state recentemente messe a fuoco da un lavoro di Shackneyche ha sviluppato un modello computerizzato di simulazione temporale delle mutazioni che accompagnano la spontanea mutazione neoplastica. Il modello include la crescita cellulare, la divisione cellulare, la tetraploidizzazione, la perdita di cromosomi, lo sviluppo di aberrazioni strutturali cromosomiche.


Mentre la tetraploidizzazione non è il solo meccanismo messo in moto, la non disgiunzione mitotica può portare ad aneuploidia, rappresentando la via preferita di sviluppo di cloni ipodiploidi oiperdiploidi.


L’instabilità genomica certamente gioca un ruolo centrale nell’evoluzione clonale. Oltre all’aumento numerico dei cromosomi, la ipometilazione e le mutazioni di uno specifico gene coinvolto nella divisione cellulare sono le teorie a sostegno.


I proto-oncogeni attivati sarebbero i candidati migliori per la crescita dose-dipendente con anormalità cromosomiche per l’evoluzione di linee aneuploidi come avviene nel modello diShackney.


L’aumento di dosaggio del gene mutante, associato adaneuploidia, è stato identificato in una doppia e sequenziale non disgiunzione del cromosoma dell’oncogene attivato.


La destabilizzazione di normali cellule diploidi da parte di fattori genetici può sfociare in cloni near-diploidi o tetraploidi.


Entrambe queste vie possono sfociare in attivazione di oncogeni oinattivazione di Tumor Suppressors Genes. Le cellule così configurate possono crescere e moltiplicarsi come linea dominante.


Analogamente si è dimostrata una forte correlazione traaneuploidia ed inattivazione di Tumor Suppressors Genes.

Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)Copyright Fondazione Raphael - Melide (CH)

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