ĐẶt v Ấn ĐỀ...ph ươ ng th ị hà lu ận v ăn th ạc s ĩ khoa h ọc 1 ĐẶt v Ấn...

Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm gan do virut C là có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe của con

người trên toàn thế giới , bởi vì sau khi bị nhiễm virus viêm gan C cấp tính thì có

khoảng 70-90% bệnh nhân chuyển từ giai đoạn cấp tính sang giai đoạn mạn tính và

có tới 20-25% trong số bệnh nhân này sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan và ung thư

gan [17,33,36]. Theo tổ chức y tế thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm virut

viêm gan C (HCV), tương ứng với khoảng 2-3% tổng dân số toàn thế giới

[14,26].Theo ghi nhận về tình hình nhiễm virut viêm gan C ở Việt Nam thì tỉ lệ

người bình thường bị nhiễm căn bệnh này là khoảng 6% [42], xem như là thuộc

nhóm các quốc gia có tỉ lệ nhiễm viêm gan C cao trên thế giới [13,42].

HCV là một virut có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virut phải sử

dụng men ARN polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình

tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân

virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] và con đường lây nhiễm chủ yếu của

HCV là qua đường máu. Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV,

Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có

vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng

số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan

C (HCV Genotypes) [1,37]. Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa lý,

mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen nổi trội riêng [41,43]. Hiện nay trên

thế giới đã biết được 6 loại genotypes và khoảng hơn 50 subtype (dưới type)[3,7], ở

Việt Nam phổ biến genotypes 1,2, và 6, kiểu genotype 3 hiếm gặp [1,50].

Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ

sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều

kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer,

Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes

HCV với độ chính xác cao. Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên

chưa được áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes


2

HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ

thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu

gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc

subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều

kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên

cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ

thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù

hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định

được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6. Với mục đích khuyến cáo

bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài:

“Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C

bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau :

1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử

dụng Taqman probe.

2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing)

trên đoạn gen NS5B.


3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV)

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phân loại

Vào năm 1970, Harvey J.Alter Trưởng khoa nhiễm trùng của bộ phận truyền

máu Viện Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ chứng minh là nhiễm virut sau truyền máu

phần lớn là do virut viêm gan không phải là A và cũng không phải là B và được đặt

tên là virut không A-không B.Mười bảy năm sau (năm 1987) Michael Houghton,

Qui-lim Choo và tập đoàn, Gorge K dung sinh học phân tử định clon để định tính

virus không A không B , năm 1989 đã xác định virut không A không B có tên chính

thức là virut viêm gan C và được công bố bằng 2 bài trên báo Science[7].

Virus viêm gan C ( Hepatitis C virus - HCV) thuộc nhóm IV (+ssARN) virus

ARN. Họ Flaviridae, cùng họ với virus Dengue, Flavivirus West Nile, virus tiêu

chảy ở bò ( Bovine viral diarrhea - BVDV). Thuộc loài Hepacivirus[4,8,9].

Virut Viêm gan C hiện nay được xem là nguyên nhân phổ biến nhất gây bệnh

viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát [6,12].

1.1.2. Hình thái cấu trúc virut viêm gan C

Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát

hiện HCV có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1).

Hình 1.1 Hình thái của HCV dưới kính hiển vi điện tử


4

Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein

và màng vỏ (Hình 1.2).

Kích thước khoảng 60nm

Hình 1.2. Cấu trúc của virut viêm gan C

1.1.3. Genome HCV

Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính

phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa

diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một

chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb. Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut

khác, tổ chức genome của virut viêm gan C cũng mang vai trò như một ARN thông

tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47].

Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng

Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm:

- Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để

tạo nuclecapsit.

- Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33.

- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70.

Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm:

Màng vỏ ARN virus

Màng vỏ glycoprotein

Core


5

- Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23).

- Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72).

- Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa

cho protein p27.

- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho

ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép.

Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading

frame), mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino

axit (Hình 1.3). Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt

bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core,

E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B,

NS5A, NS5B)[31]. Một protein khác (kí hiệu F-Temed) hoặc ARF (khung đọc thay

thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao

chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46].

Cấu trúc Không cấu trúc

Tổng hợp chuỗi polyprotein

Protein

Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica và ARN-polymerase

Hình 1.3: Tổ chức genome HCV


6

Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là

E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã

hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B

(Hình 1.3). Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó

các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong

quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50].

ORF (Open reading frame) được cố định ở các vùng không bị mã hóa là vùng 5’

và vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm các chuỗi nucleotit có liên quan

đến sự điều chỉnh quá trình sao chép của virut. Tất cả các NCR đều có chứa các

vùng miền bảo tồn cao so với các vùng protein mã hóa của genome HCV.

Mức độ chuyển hóa cao của các NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu:

+ Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử.

+ Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut.

+ Nghiên cứu kháng sinh chống HCV.

Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit và nó có một cấu trúc phức thứ hai với

bốn vùng khác nhau (I-IV) [30], 125 nucleotit đầu tiên của 5’ NCR được phân ba

đều ra các vùng I và II là phần cơ bản của quá trình sao chép ARN trong virut

[ 21,52]. Các vùng (II-IV) thiết lập một tâm đầu vào của ribosome bên trong (IRES)

bao gồm ribosome liên kết và độc lập khởi động cho quá trình sao chép tương

ứng[7,52].

Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức năng khác nhau: một vùng có thể thay

đổi, một chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi và đuôi X đã chuyển đổi ở mức độ cao

tại đuôi 3’ của hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit và không

quan trọng đối với quá trình sao chép ARN. Tuy nhiên nếu bỏ đi chuỗi này có thể

dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu quả của quá trình sao chép[21]. Chiều dài của

chuỗi vùng U/UC thay đổi theo các chuỗi HCV khác nhau và nằm trong khoảng từ


7

30- 80 nucleotit [35]. Chiều dài nhỏ nhất trong vùng này đối với quá trình sao chép

ARN được cho là có chứa 26 nucleotit homouridine trong môi trường tế bào

[22,49]. Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba

stem-loops (SL1-SL3) [23] và quá trình tiêu hủy hoặc thay thế nucleotit trong các

vùng này thường không gây tử vong [23]. Một cách gọi tên khác của quá trình

tương tác giữa đuôi 3’ X và SL2 là “ kissing-loop” và một phần phức hợp của vùng

mã hóa NS5B đã được mô tả [23,35]. Sự tương tác này bao gồm một cấu trúc ARN

tertiary của genome HCV, đây chính là phần quan trọng của quá trình sao chép

HCV trong hệ thống môi trường tế bào [23,49]. Cuối cùng cả NCRs đều xuất hiện

để làm việc cùng với sự tương tác ARN-ARN theo chiều dài có thể sẽ hình thành

một vòng tuần hoàn gen tạm thời [46].

1.1.4. Gen và Protein

Như đã mô tả ở phần trên, quá trình chuyển hóa của chuỗi protein HCV là được

khởi động thông qua sự tương tác của một số phần trong NCRs của hệ genome

HCV ARN. Chuỗi protein là sản phẩm có chứa 10 protein sẽ đồng thời chuyển hóa

hoặc chuyển hóa bước đầu được kích hoạt từ chuỗi protein. Các protein đuôi N như

C, E1, E2 và p7 đều được kích hoạt bởi một tín hiệu peptit trong tế bào (SP)[15,20].

Lõi tiền protein được tạo ra vẫn có chứa tần số tín hiệu E1 tại đuôi C của nó. Tiếp

theo sẽ kích hoạt tần số tín hiệu này bằng một tín hiệu peptit là peptidase (SPP) dẫn

đến việc hình thành lõi protein hoàn chỉnh [15,20].

Các protein phi cấu trúc NS2 đến NS5B của chuỗi protein HCV là đều kích hoạt

bởi hai protease có virut mã hóa ( NS2-NS3 và NS3) với protease NS2-NS3

cysteine được kích hoạt tại chỗ ghép nối NS2-NS3 và protease NS3 serine được

kích hoạt bởi các protein duy trì chức năng [17,51].

Các vị trí tiếp theo của nucleotit virut và gốc amino axit theo HCV chuỗi H77

kiểu gen 1a, được tiếp nhận theo số NC_004102. Một số thông số đặc trưng cho

các protein HCV được tập hợp trong bảng dưới đây.


8

Bảng 1.1: Tổng quan về kích thước của protein HCV

Protein Số aa Vị trí aa trong chuỗi Trọng lượng protein

Core: protein core HCV có độ pH kiềm cao là một protein gắn ARN tạo ra

nucleocapsid của HCV. Protein core đã được báo cáo tương tác với nhiều loại

protein của tế bào tác động đến chức năng của nhiều protein của tế bào và chức

năng của tế bào túc chủ như gen dịch mã, chuyển hóa lipid, chết theo chương trình

và khá nhiều tín hiệu dẫn đường. Ngoài ra protein core mồi dẫn gan hóa mỡ và ung

thư gan ( UTG)[51,52].

E1 và E2: là protein type I xuyên màng và có đoạn cuối C ái nước làm neo.

Được chuyển vị đến ruột của ergoplasme và được glycosyl hóa tại đấy. Do kết nối

rất mạnh với N liên kết glycosyl hóa. E1,E2 tạo thành non-covalent heterodimer đã

cho là tạo thành vỏ của HCV. Quá trình đóng gói các phần tử của HCV và trồi ra

chưa được hiểu thấu đáo nên cần nghiên cứu có hệ thống vấn đề này[15,20,48].

F-Protein, ARFP: Tổng hợp protein này là do một khung đọc mở thay thế

trong nội tại gen core. Được đặt tên là khung protein đọc mở thay thế ( ARFP ) hay

là khung F ( F frame shift ) có 160 amino acid. ARFP hay F là cần thiết cho

ARN-HCV tăng sinh. Được thể hiện trong diễn biến tự nhiên như thế nào khi nhiễm

HCV cần làm sáng tỏ [7,46].

Protein P7: P7 là một polypeptide có 60 amino acid, nằm tại vị trí giao nhau

của gen cấu trúc và gen không cấu trúc. Chưa biết chắc chắn là P7 có được đóng gói


9

không với các phần tử khác của HCV, P7 gồm 2 vùng để tạo thành hexamer là kênh

cho các ion hoạt động, có thể cho rằng P7 có vai trò quan trọng trong đóng gói vì

một protein như vậy của virus gây tiêu chảy ở Bò ( BVDV- bonine diarrhea virus)

đã chứng minh là rất cần thiết để sản sinh virus-progeny nhưng không thể để cho

tăng sinh ARN virus [28].

Protein tự tiêu NS2-3 ( autoprotease): kết nối NS2/3 bị tách bởi autoprotease

để có NS2 và đoạn cuối N thứ ba của NS3. Mặc dù hoạt tính protease của NS2-3

cho genome HCV tăng sinh trong chu kỳ sinh trưởng nội bào cũng như trong in

vitro cho subgenomic replicon nhưng cũng cần để biết NS2 còn có chức năng nào

khác sau khi tách rời NS3[7,48,51].

Protein NS3-4A-NS3: là protein đa chức năng có chứa một serin protease tại

phần ba đoạn N-cuối chịu trách nhiệm dòng xuôi tách biệt ở vùng không cấu trúc là

một NTPase/ARN vùng helicase hai phần ba của C tận cùng.

NS4A :là 154 polyamino acid tác động đến NS3 tại tế bào nội màng và cần như

một đồng yếu tố cho NS3 serin protease. Cấu trúc tinh thể của phức hợp đã cho thấy

NS3-4A là thành phần tích hợp của enzyme nhân. Đáng ngạc nhiên NS3 seri

protease có ảnh hưởng tới sự đề kháng miễn dịch tế bào tự nhiên của túc chủ bởi đã

ức chế tín hiệu RIG-1 và TLR. Nhận xét này sẽ rất hấp dẫn NS3 có thể là hướng

cho thuốc chống HCV. Chất ức chế serin protease đã nổi lên là thành phần cực kỳ

có hiệu quả và trở thành nguyên lý hàng đầu để nghiên cứu điều trị bệnh nhân HCV

mạn tính. Tác dụng men hoạt tính của NS3NTP-ase /helicase là rất cần thiết cho

ARN-HCV tăng sinh. Đích của chức năng trong quá trình sinh trưởng có thể là

không xoắn 2 vòng tăng sinh, ARN trung gian làm loại trừ ARN cấu trúc thứ phát

hay là tách rời genome với protein gắn kết. Những tiến bộ về hiểu biết cơ chế phân

tử của enzyme này có thể là một chiến lược mơi về thuốc ức chế HCV.

NS4B : Do tính chất rất ái nước nên NS4B là thành phần HCV rất khó nghiên

cứu và hiểu biết chưa nhiều, cho đến nay được biết NS4B với 27-kDa là thành phần


10

tích hợp với protein màng khu trú tại ergoplasme xuất xứ từ thành phần riêng lẻ của

màng. Đáng chú ý biểu hiện của NS4B sẽ mồi dẫn tổn thương màng đặc hiệu được

đặt tên là web-màng tác dụng như một giàn giáo để tạo thành cấu tạo phức hợp tăng

sinh HCV.

NS5A :là kẽm phosphoryl hóa protein kim loại chức năng chưa biết, mặc dù đã

có nhiều tài liệu nói về chức năng có thể có của NS5A cũng như một danh mục

khổng lồ về tương tác với các yếu tố khác của NS5A nên chức phận của NS5A lại

không rõ ràng. Khởi đầu thì rất hấp dẫn vì NS5A có tiềm năng điều hòa đáp ứng

interferon, tuy kết quả nghiên cứu còn trái ngược nhau. Một nhận xét nổi bật là trên

replicon thích ứng của nuôi cấy tế bào thấy độ tập trung đột biến cao trong phần

trung tâm của NS5A, hiện tượng trên chỉ ra rằng NS5A có tác động hiệu quả trên

điều hòa tăng sinh của HCV. Yếu tố liên kết màng của NS5A được làm trung gian

bởi một amphipathic alpha helix khu trú tại N-đoạn cuối, tuy ít thực nghiệm về

tiêu hủy protein mới đây nhưng cũng cho phép định nghĩa ba vùng protein tại

domain cytosolic. Gần đây nhất cấu trúc ba chiều của đoạn N- cuối domain 1 cũng

được giải quyết bằng chụp hình. Sau khi dimer hóa cấu trúc này tạo ra basic groove

đối diện với cytosol tại bề mặt màng tế bào. Cấu trúc kiểu claw like được cho rằng

đã cung cấp chỗ cho ARN gắn kết và vì vậy đã tham dự vào việc điều hòa đích của

genome ngay trong phức hợp sinh trưởng HCV [7,48,51].

NS5B: Chìa khóa của replicase khởi hoạt tổng hợp genome ARN mới là NS5B

ARN- phụ thuộc ARN polymerase (RdRp). NS5B là kích thước đo theo mấu của

protein neo màng (tail-anchored protein) có đặc trưng bởi domain xuyên màng tại

C- đoạn cuối của protein chịu trách nhiệm tác động hậu dịch mã màng. Cấu trúc của

NS5B là điển hình cấu tạo polymerase dáng hình bàn tay phải với dưới vùng ngón

tay, mu bàn tay, ngón tay cái bao bọc thành vòng tròn nơi có hoạt tính cao. Quá

trình tăng sinh thông qua tổng hợp một vòng ARN bổ sung mang dấu (-) sử dụng

genome như là một khuôn mẫu và hậu quả của tổng hợp được ARN (+) từ ARN(-)


11

trung gian. Tác động như là thành phần trung tâm của tăng sinh NS5B nổi lên như

là một đích chính để làm thuốc mới có hiệu quả.

1.1.5. Vòng đời của virut viêm gan C

Chưa biết đầy đủ vòng đời của HCV vì chưa có môi trường nuôi cấy HCV in

vitro để thể hiện vòng đời và sinh trưởng của HCV. Nhưng vì hình thành hệ thống

replicon đã như một cuộc cách mạng giúp tìm hiểu sinh trưởng vòng đời của HCV.

Hình 1.4 : Mô hình hiện tại vòng đời và sinh trưởng HCV [51]

(1:Sự hấp phụ bề mặt tế bào gan nhờ đồng tiếp nhận. 2: Xâm nhập nội tế

bào. 3: Sự dung hợp với àng lipit tế bào gan. 4: Phá bỏ lớp vỏ ngoài giải

phóng ARN (+). 5: Dịch mã và sao chép ARN nhờ Web màng. 6: Tập hợp

và đóng gói. 7: Tạo virut hoàn chỉnh. 8: Sự phóng thích ra khỏi tế bào gan).


12

Mô hình thay thế nghiên cứu bước xâm nhập đầu tiên bao gồm kiểu nhiễm virus

sao chép ngược kiểu giả type ( infectious retroviral pseudotype) đã làm rõ vai trò

chức năng của glycoprotein HCV:

Bước 1: xâm nhập kiểu nội nhập tế bào trong môi trường phụ thuộc pH thấp và

cũng chưa biết yếu tố nào là khuôn cho virion thâm nhập, tuy cũng xác định được

các yếu tố tham gia, pH thấp, và hòa màng nội nhập tế bào gan và đầu tiếp nhận trên

tế bào gan là bước khởi đầu[11,32].

HCV E2 có ái lực mạnh với vòng ngoài rộng của CD81, một tetrspaspamin có

trên mặt nhiều loại các tế bào kể cả các tế bào gan và có thêm các đồng tiếp nhận

lớp B type 1 SR-B1 ( tế bào dọn rác – scavenger cell) và CLDN1 ( the tight junction

claudin -1 ) (Hình 1.5) [7,16].

Ngoài ra lipoprotein tỷ trọng thấp ( low density lipoprotein) cũng được xem là

một dạng đầu tiếp nhận quan trọng và được xác định giá trị do nghiên cứu với sự

hiện diện của thành phần huyết thanh người. Đặc biệt là lipoprotein tỷ trọng cao kết

hợp làm cho SR-B1 tăng độ hướng dẫn và thâm nhập HCV vào tế bào gan và còn

bảo vệ chống kháng thể trung hòa của cơ thể [7,34].

Bước 2: giải phóng sợi ARN (+) tác dụng như một m-ARN và có 2 vùng NCR3’

và 5’ vùng không mã hóa là vùng bảo tồn cao trong các chủng HCV được phân lập

và có chứa IRSE ( internal ribosome entry site). IRES gắn trực tiếp với riboxom

40S và được coi là yếu tố tiền khởi động cần thiết cho cap-dependent dịch mã. Cấu

trúc ba chiều HCV IRES gắn với 40S ribosomal subunit minh họa cơ sở phân tử để

dịch mã tạo ra polyprotein bằng bộ máy dịch mã của tế bào [7,46].

Bước 3: xâm nhập ergoplasme và polyprotein tự cắt đoạn để sinh 3 protein cấu

trúc C,E1,E2 và 7 protein không cấu trúc NS; đặc biệt tạo ra ARN (-) làm khuôn

mẫu để HCV sinh trưởng tạo lại ARN sợi (+), tại 1 thời điểm nào đó genome HCV

thay chức phận trở thành phức hợp sinh trưởng liên quan đến màng (membrane

associated replication complex)[7].


13

Bước 4: đóng gói và xuất ra ngoài.

Mọi việc của quá trình đều trong nguyên sinh chất không liên quan đến nhân tế

bào gan như HBV.

Như tất cả virus ARN (+) đã nghiên cứu từ trước đến nay HCV tạo ra một phức

hợp màng liên kết bao gồm protein virut,yếu tố tổn thương màng, và những thành tố

của tế bào túc chủ. Yếu tố tổn thương màng đặc hiệu được coi như là một web

màng, đã được xác định là nơi ARN tăng sinh trên tế bào Huh-7 chứa subgenomic

HCV replicon.

Hình 1.5 : Các đầu đồng tiếp nhận HCV[29]

Một khi đã vào trong tế bào gan và chỉ trong nguyên sinh chất tế bào gan chu kỳ

sinh trưởng của HCV mới khởi động dựa chủ yếu vào bộ máy của nội tế bào để

hoàn thành chu kỳ sinh trưởng. đặc hiệu nhất genome HCV dịch mã để tạo ra một

protein đơn độc có khoảng 3011 amino acid gọi là chất đa protein. Chất đa protein

tiếp theo quá trình tự phân hủy bởi protease của virus và tế bào gan để tạo ra 3

protein cấu trúc có liên quan đến virion và 7 protein không cấu trúc.

Một khung nhóm có thể xuất hiện tại vùng nhân (core) để sản xuất ra khung đọc

mở thay thế protein ( ARFP). HCV mã hóa hai protease NS2 cystein tự tiêu protein


14

và NS3-4A serin protease. NS protein tuyển chọn genome HCV vào trong một phức

hợp ARN sinh trưởng gắn với săp xếp lại màng nguyên sinh chất. theo Olaf Isken

tuyển chọn là do cái gọi là NF/NFAR protein đặt tên là NF90/NFAR-1 can thiệp

vào quá trình tăng trưởng của ARN-HCV.

1.2. Genotype HCV

HCV là một virus có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử

dụng men RNA polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình

tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân

virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50].

Tiến hành so sánh đối chiếu chuỗi nucleotit của các chủng virut thu nhận được

từ các bệnh nhân nhiễm bệnh với các nhóm bệnh khác nhau của quá trình lây nhiễm

tại các vùng miền địa lý khác nhau người ta đã phát hiện thấy sự tồn tại của ít nhất

là 06 nhóm gen chính bao gồm type 1, type 2,type 3 type 4,type 5 và type 6[12,39].

Khi tính toán mức trung bình trên toàn bộ genome hoàn chỉnh, khi đó sự khác biệt

về các tâm nucleotit là 30- 35% với sự biến đổi nhỏ trong các vùng xác định như là

glycoprotein E1 và E2 mà tại đó chuỗi của gen nhân và một số gen không có cấu

trúc như NS3 thì có sự bảo toàn cao hơn. Khả năng khác nhau của các chuỗi ở mức

thấp nhất giữa các genotype được phát hiện thấy trong 5’ NCR, tại đó chuỗi riêng lẻ

và cấu trúc ARN thứ cấp là cần thiết cho quá trình sao chép và chức năng chuyển

hóa[44,47].

Mặc dù có sự đa dạng về các chuỗi HCV, tất cả trình tự bổ sung và kích thước

trên đoạn gen là có sự đồng nhất. Tuy nhiên trái ngược với quan sát chung là sự

biến đổi của chuỗi trình tự mã hóa ở cả hai vị trí khung đọc và kích thước của

protein là không có sự bảo tồn cao với kiểu gen. Điều này trái ngược với tính chất

bảo tồn tiến hóa của rất nhiều bản sao HCV, đồng ý với ý kiến này cho rằng có khả

năng gen này là sản phẩm sinh ra từ sự nhân đôi của ARN có sự biến đổi codon thứ

ba của gen lõi[42,44].

Phương Thị Hà

Hình 1.6 : S

Mỗi nhóm gen trong b

một chuỗi các subtype có li

mỗi subtype vào khoả

>30%. Một số genotype nh

thể là kết quả của quá tr

sử dụng ma túy trong v

nước phương tây (Hình 1.6 ).(

các thử nghiệm lâm sàng và thông tin m

với interferon (INF) và các ph

toàn thế giới, 1b phân b

và Trung Đông, type 3 ch

Nam Phi, type 6 ở Hồng

Type 6a tìm thấy ởkhu công nghiệp ởgần đây tìm thấy ở

Kiểu gen 3a được phân bố ở các khu vực công nghiệp hóa ở Châu

Kiểu gen 2 [2a,2b,2c] tìm thchủ yếu ở các nước vùng

Trung Hải và viễn Đ

Luận văn Th

15

Hình 1.6 : Sự phân bố của các kiểu gen [4

i nhóm gen trong bộ 06 nhóm gen quan trọng nhất của HCV

i các subtype có liên quan chặt chẽ với nhau. Trong đ

ảng 20- 25% về chuỗi nucleotit, với genotype con s

genotype như 1a,1b, và 3a có sự phân bố rộng h

a quá trình truyền máu và dùng chung kim tiêm gi

ng ma túy trong vòng 30-70 năm qua và bây giờ phần lớ

ình 1.6 ).(Đây là những kiểu gen được gặp ph

àng và thông tin mới nhất đã được thu thậ

eron (INF) và các phương pháp điều trị virus khác). Trong

i, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, type 2 phân b

ông, type 3 chủ yếu ở Châu Âu, type 4 phân bố ở trung

ồng Kông và Việt Nam [42,44].

Kiểu gen 1a được phân bbắc Âu và Mỹ, các nướ

nghiệp hóa.

Kiểu gen 1b thb

Type 4a phân b

Type 5a thường tìm thấy duy nhất ở Nam Phi

ấy ở Việt Nam, các ệp ở Hồng Kông và ấy ở Autralia

ở các khu Âu

ìm thấy ùng Địa

ễn Đông

n văn Thạc sĩ khoa học

44].

t của HCV đều có chứa

Trong đó, sự khác biệt của

i genotype con số này là

ộng hơn cả, điều này có

à dùng chung kim tiêm giữa những người

ần lớn là phân bố ở các

ặp phổ biến nhất trong

c thu thập trên các phản ứng

. Trong đó 1a phân bố

, type 2 phân bố địa trung hải

ố ở trung đông, type 5 ở

c phân bố rộng rãi ở ớc có nền công

p hóa.

u gen 1b thường thường phân bố toàn thế giới

Type 4a phân bố rộng rãi ở Trung Đông


16

Một mô hình khác về tính đa dạng của chuỗi được quan sát thấy trong khu vực

châu Phi và Đông Nam Á, Ở đây có những kiểu gen gần gũi và khu vực địa lý cụ

thể. Ví dụ, sự lây nhiễm HCV ở miền tây Châu Phi là do genotype 2, trong khi

những người ở Trung Phi, chẳng hạn như Cộng hòa Dân chủ Congo và Gabon, lại

có sự lưu hành của kiểu gen 1 và 4,còn kiểu gen 6 sự lưu hành ở khu vực Đông Á là

phổ biến. Phân tích ở mức độ phân tử cho thấy rằng sự có mặt của các kiểu gen này

có thời gian lưu hành tại các khu vực địa lý tương ứng ít nhất vài thế kỷ [42,44].

Kiểu gen 6 là một ví dụ nổi bật của sự đa dạng HCV trong vùng lưu hành. Thật

vậy, kiểu gen HCV được phân lập đầu tiên từ Đông Á rất khác nhau mà ban đầu các

nhà nghiên cứu phân loại là kiểu gen 7,8,9 và 11[42]. Những chủng này khi được

phân loại như là phân nhóm của kiểu gen 6. Lây nhiễm kiểu gen 6 là một con số

đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO xác định có 62 triệu người bị nhiễm

trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây nhiễm các kiểu gen trên toàn

thế giới [42]. Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của Thái Lan, Ấn Độ,

Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và Indonesia

[42,44]. Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông

Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái

Lan [42] và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2-

3% xấp xỉ khoảng 30 triệu người [42]. Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á

là do kiểu gen 6 và sự phân bố kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong

khu vực Đông Á.

Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả

năng đáp ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype

khác: 18,1% so với 54,9%)[2]

Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV:

+Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ

nhiễm HCV mạn cao (>80%)


17

+ Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái

nhiễm

+ Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin

(do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng

virut mới)

1.3. Bệnh học viêm gan virut C

1.3.1. Dịch tễ học

HCV lây truyền bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu. Đường truyền bệnh bao

gồm việc dùng chung các vật dụng ma túy như kim chích, dây cầm máu, ống hút,

ống píp,vv… Kim dùng xăm mình, xỏ da và châm cứu cũng có thể truyền HCV,

dùng chung các vật dụng cá nhân như dao cạo, bàn chải đánh răng hay dũa móng

tay tuy ít nguy cơ nhưng vẫn có thể làm lây nhiễm bệnh.

Trước năm 1992, nhiều người đã bị nhiễm HCV qua máu hoặc do nhận máu

của người khác. Đến năm 1992, cách thử máu đáng tin cậy để xác định kháng thể

HCV được sử dụng và từ đó các nguồn cung cấp máu được thử nghiệm. Ngày

nay, tỉ lệ lây nhiễm HCV do truyền máu bị nhiễm rất thấp dưới 0.01 % một số ít

(khoảng 1%- 3% người có quan hệ tình dục khác phái, một vợ một chồng) có thể

bị lây nhiễm HCV do có quan hệ tình dục không an toàn. Những người thuộc

nhóm có “nguy cơ mắc bệnh cao” (như đàn ông đồng tính, mãi dâm, người có

nhiều bạn tình, người mang bệnh lây qua đường tình dục) thường dễ bị nhiễm

HCV qua đường tình dục hơn.

Các nhân viên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn việc làm như

bị kim đâm hoặc trong những trường hợp không thêt tránh được có thể tiếp xúc trực

tiếp với máu của người mang bệnh.

Khoảng 5% những bà mẹ bị HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúc trước

hoặc trong khi sinh nở. Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV có trong máu

của người mẹ. Có đến 10% người có HCV không xác định được tại sao họ bị mắc


18

bệnh. HCV không lây truyền qua những tiếp xúc thông thường hang ngày như ăn

chung bàn, uống chung ly nước, ôm, hắt hơi hoặc ho.

1.3.2. Diễn biến của bệnh nhân nhiễm virut viêm gan C

Viêm gan C cấp tính

Khỏi (10-30%) Mang các dấu ấn của HCV mạn tính (70-90%)

Mang dấu ấn âm tính không triệu chứng 50% VGMT tối thiểu 50%

Xơ gan 10%

Ung thư gan 2%

Các triệu chứng thường gặp: Nhiều người không có hoặc có một ít triệu chứng

trong giai đoạn nhiễm HCV cấp tính. Phần lớn các người mang bệnh HCV kinh

niên cũng không có triệu chứng nào và vẫn sống gần như bình thường. Tuy nhiên,

những người khác có triệu chứng giống như bị cảm cúm nhẹ như buồn nôn, mệt

mỏi, sốt, nhức đầu, ăn không ngon, đau vùng bụng, và nhức bắp thịt hay ở khớp.

Một số người lại có những triệu chứng như bị cảm cúm nặng, cũng như vàng da và

mắt bị đục, nước tiểu đậm. Sau một thời gian (thường là nhiều năm hoặc vài chục

năm), người có bệnh HCV kinh niên có thể có những triệu chứng liên quan đến hư

gan. Viêm Gan C kinh niên có thể liên quan đến nhiều triệu chứng khác.


19

1.3.3. Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh viêm gan virut C

1.3.3.1. Các xét nghiệm kháng thể HCV

+ ELISA II là một cuộc thử nghiệm máu đơn giản để phát hiện kháng thể HCV

+ RIBA là cuộc thử nghiệm kháng thể thứ nhì, có thể được dung sau cuộc thử

nghiệm Elisa,để xác nhận sự hiện diện của kháng thể HCV

1.3.3.2. Xét nghiệm số lượng siêu vi C

Cuộc xét nghiệm đo số lượng HCV lưu truyền trong máu. Đơn vị đo lường siêu

vi HCV là số lượng mỗi mili-lít(ml) máu hoặc đơn vị đo lường tiêu chuẩn được gọi

là Đơn Vị Quốc Tế (International Units).

1.3.3.3. Xét nghiệm chức năng và sinh hóa của gan

Có một số cuộc thử nghiệm máu để đo lường sức hoạt động của gan. Bảng thử

nghiệm gan (hepatic panel) gồm các số đo lường chức năng của gan. Số đo lường

phổ thông nhất là ALT và AST (alanine aminotransferase & aspartate

aminotransferase - mà trước đây gọi là SGPT và SGOT). ALT và AST là những

chất men (enzymes) được tiết vào trong máu khi gan bị hư và thường tăng cao ở

người bị nhiễm HCV. Nhiều người có HCV có chỉ số cao của hai loại men gan này,

thường là dấu hiệu đầu tiên là họ đã bị nhiễm bệnh. Những cách đo lường khác là

ALK và GGT. (alkaline phosphatase & gamma-glutamyl transpeptidase) cũng được

sử dụng trong việc thử nghiệm.

1.3.3.4 Sinh thiết gan

Sinh thiết ( hay thử mẫu tế bào) gan được dùng để đo lường mức độ viêm, số

lượng sẹo, và tình trạng sức khỏe của gan. Việc này cũng có thể dùng để xác định

cách chữatrị. Cách thức thông thường nhất là làm tê da và bắp thịt rồi nhanh chóng


20

đưa một kim dài và nhỏ vào gan và rút ra để lấy mẫu thử nghiệm. Cách thức này

làm nhiều người sợ, nhưng rất hiếm có biến chứng.

1.3.3.5 Xét nghiệm phân định loại HCV (Genotype HCV)

Cuộc xét nghiệm phân định loại HCV được dùng để xác định bạn bị nhiễm loại

HCV nào. Ðiều này rất hữu ích cho việc quyết định cách chữa trị, như là chọn lựa

loại thuốc, và cần điều trị bao lâu.

1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV

Hiện nay kỹ thuật được ứng dụng trong xác định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ

thuật Real-time PCR và giải trình tự gen ( InoLIPA và Sequencing).

1.4.1. Kỹ thuật Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR( Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi

polymerase) mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ

nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là Real-time. Như vậy, có thể nói

Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỉ bản

sao dựa vào chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị

cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được.


21

1.4.1.1. Lịch sử phát hiện kỹ thuật PCR

Vào một buổi tối cuối tuần tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe trên đường

ở gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng lóe lên trong đầu của Kary Mullis

khi ông phải lùi xe lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai

làn bánh xe cũ:” Dùng nhiệt độ tách đôi sợi AND thành hai mạch đơn’’. Lúc đó

Kary Mullis chỉ là một nhà hóa sinh học bình thường, đang làm việc tại một phòng

thí nghiệm nhỏ.

Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR ( phản ứng chuỗi

polymerase) vào năm 1985, tạo nên cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa

học. Chỉ sau 8 năm (1993), K. Mullis đã được trao giải Nobel về hóa học nhờ

phát minh này.

1.4.1.2. Nguyên lý kỹ thuật PCR

Từ một đoạn ADN chọn lọc, nó sẽ được nhân lên gấp hàng triệu lần hoặc hơn

nữa trong một thời gian ngắn. Trong thời gian này, sự sao chép ADN được tạo ra

trong môi trường in vitro như trong quá trình phân bào.

Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi ADN kép được làm nóng đến mức

bị tách thành hai nhánh đơn. Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của

enzyme ADN polymerase và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh

ADN bổ sung được tổng hợp. Trong ống nghiệm, quá trình này không thể tự xảy ra

được mà phải có các đoạn ADN mồi (primer) sẽ tổng hợp với những vị trí bổ sung

trên hai chuỗi đơn. Các đoạn mồi khởi động đặc thù thường được tổng hợp nhân

tạo. Từ vị trí gắn của mồi khởi đông, nhánh bổ sung sẽ được tổng hợp. Mồi khởi

động mang tính đặc thù riêng cho mỗi AND có trình tự nhất định. Với mỗi loại mồi

khởi động thì chỉ ADN đặc hiệu với nó được sao chép.


22

Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành

qua quá trình này sẽ lại được dùng nhiệt để tách ra và quá trình tổng hợp lại được

lặp lại như thế để sản sinh ra 4 chuỗi ADN và cứ như thế tiếp diễn.

Hình 1.7 : Minh họa kỹ thuật PCR ( P1 và P2: các đoạn mồi primer )

1.4.1.3. Nguyên lý kỹ thuật RT-PCR

Phương pháp dựa sự phiên mã ngược của bộ gên RNA của HCV thành cDNA

bằng mồi ngẫu nhiên rồi sau đó sử dụng PCR để khuếch đại một đoạn đặc hiệu dài

khoảng 240bp trên vùng 5’NC của HCV-cDNA. Trong khi chạy PCR,một khi có

sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc hiệu

với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị thủy giải bởi men taq

polymerase ( nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn

kéo dài. Sự thủy giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang

(fluorophore) FAM ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ của

probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser

và sự phát huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real time của máy.


23

Hình 1.8: Nguyên lý kĩ thuật Real time PCR sử dụng Taqman Probe (phát

hiện , đinh lượng và định type HCV).

1.4.1.4. Máy Real-time PCR [10]

Điều kiện đầu tiên để có thể thực hiện được Real-time PCR (RT - PCR) là phải

có máy RT - PCR. Máy này cũng có một buồng ủ nhiệt chạy được chương trình


24

luân nhiệt như máy PCR bình thường, nhưng có thêm một thiết bị được gọi là thiết

bị real-time. Đây là một thiết bị quang học có hai chức năng:

+ Có các nguồn sáng phát ra được các tia sáng kích thích có bước sóng xác định

lên các tube phản ứng RT- PCR.

+ Có được camera hay cảm biến quang ghi nhận được ánh sáng huỳnh quang

phát ra từ các tube phản ứng RT- PCR khi các tube phản ứng này được chiếu các tia

sáng kích thích.

1.4.2. Kỹ thuật Sequencing

Nguyên lý: Kỹ thuật Sequencing dựa trên phương pháp enzyme Sanger (phương

pháp đầu tận cùng của chuỗi). Chìa khóa của phản ứng này là sử dụng

dideoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp ADN.

Do đó khi enzyme AND polymerase gắn chúng vào sợi AND thì quá trình tổng hợp

bị ngừng lại. Vì vậy phương pháp này còn được gọi là phương pháp dideoxy[5].


25

Hình 1.9 : Qúa trình tổng hợp chuỗi AND khi có mặt của didNTP

Hình 1.10: Xác định trình tự nucleotid


26

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2011 đến tháng 1/2012.

Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm - Khoa truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai.

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là những mẫu huyết thanh các bệnh nhân đã xác định

Anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai.

Tổng số mẫu xét nghiệm antiHCV (+) là 239 mẫu trong đó có 228 mẫu có số lượng virut >102copies/ml máu mới xác định kiểu gen bằng kỹ thuật RT- PCR.

Bệnh nhân có các tiêu chuẩn sau:

+ Đã xác định Anti HCV (+).

+ Không đồng nhiễm với các virut gây viêm gan khác như HBV, HGV.

+ Không đồng nhiễm với HIV.

+ Số lượng virut >102copies/ml máu.

2.2. Dụng cụ và hóa sinh phẩm

2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị

Dụng cụ: Kim tiêm các loại,Tube các loại, Pipet các loại, Đầu côn các loại.

Trang thiết bị: Hệ thống máy Real-time PCR CFX96TM, Máy ủ nhiệt khô

MS0030, Máy li tâm Microfuge 16, Máy li tâm, Máy Vortex Biocote, Máy

Spindow, Pipet Man Nichipet EX, Máy hút chân không 7A-230, Tủ lạnh, máy giải

trình tự gen 3130XL do Công ty Nam Khoa thực hiện.


27

2.2.2. Hóa chất sinh phẩm

Bộ hóa chất do Công Ty Nam Khoa sản xuất và cung cấp bao gồm:

+Sinh phẩm dùng để tách chiết ARN:Bộ thuốc thử NK RNA PREP.

+ Sinh phẩm dùng để tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên:Bộ thuốc thử NKcDNAsynthesys kit (cung cấp cho 50 mẫu thử).

+ Sinh phẩm dùng để phát hiện và định lượng HCV-RNA:Bộ thuốc thử NK

HCV-TQPCRHEX kit.

+ Sinh phẩm dùng để định type HCV

+ Hệ thống mồi và mẫu dò được thiết kế dựa vào trình tự các gen trên vùng

5’NC trên bộ gen HCV được công bố trên ngân hàng gen được tổng hợp và cung

cấp bởi công ty Nam Khoa và có trình tự như sau:


28

Bảng 2.1. Mồi và mẫu dò trên vùng 5’ NC của HCV

Tên

Chức

năng Trình tự

Chiều

dài

(bp)

Kích

thước

sản phẩm

PCR (bp)

Primer F

Mồi

xuôi

5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3’ 22 99

Primer R Mồi

ngược

5’-ACGCCCAAATBTCCRGGCATTGA-3’ 17

Probe1

Mẫu dò 5’-FAM-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTG-

BHQ1-3’

22

Probe2

Mẫu dò 5’-Cy5-AAGGACCCAGTCTTCCCGGCAATTC-

BHQ2-3’

25

Probe 3

Mẫu dò 5’-ROX-ACCCGGTCACCCCAGCGATTCC-

BHQ2-3’

23

Probe 6

Mẫu dò 5’-HEX-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCCAT-

BHQ1-3’

26

Hóa chất để thực hiện giải trình tự gen do Công ty Nam Khoa thực hiện:

Bygdye Terminal V1.3, mồi HCV thiết kế trên NS5B.

2.3. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu.

Mẫu có đủ các điều kiện như trên sẽ được tách chiết và tinh sạch ARN sau đó

tổng hợp thành cDNA nhờ men phiên mã ngược Reverse Transciptase, sản phẩm

cDNA của các mẫu bệnh nhân sẽ được định lượng bằng phương pháp Real-time


29

PCR dựa trên các cặp mồi đặc hiệu. Những mẫu có nồng độ > 102copies/ml máu sẽ

được lựa chọn để định type.

2.3.1. Kĩ thuật tách chiết ARN

Kỹ thuật dựa trên phương pháp do Chomczynski và Sacchi sáng chế. Nguyên

tắc là dùng Guanidine 14M và urea, phối hợp với phenol và các chất tẩy khác để

làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein trong mẫu thử sẽ bị

vón lại, DNA sẽ tan trong phase phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và

sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay li tâm lắng

tách. RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hỗ trợ

của tRNA và glycogen.

Các bước tiến hành:

Bước 1: 20µl IC-HCV ARN ,100µl huyết thanh, 300µl R1 ủ 10 phút nhiệt

độ phòng.

Bước 2: 80µl R2 úp ngửa 5-6 lần ủ 10 phút nhiệt độ phòng sau đó li tâm

15 phút.

Bước 3: Hút 200 dịch nổi chứa ARN vào tube có 200µl R3 úp ngửa 5-6 lần ủ 10

phút nhiệt độ phòng sau đó li tâm 10 phút.

Bước 4: Hút bỏ hết dịch nổi cho 700µl R4 li tâm 5 phút.

Bước 5: Hút bỏ dịch nổi ủ 560C trong 10 phút cho 300µl R5 sau đó mix nhẹ sau

đó ủ ở 560C trong 10 phút.

Qua năm bước trên ta có được dung dịch cần tách chiết.

2.3.2. Kĩ thuật tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên

Phương pháp này sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexamer

primers) mà không cần dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp toàn bộ RNA từ mẫu thử

thành cDNA từ ARN nhờ men Reverse Transciptase. Ngoài ra trong hệ thống phản


30

ứng còn có men RNAse H để cắt bỏ ARN bị bắt cặp vào cDNA sau khi phiên mã

ngược thành cDNA.

RNA

250C

RNAse H 420C cDNA

RNAse H 420C

RNAse H 850C

cDNA

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên

Các bước tiến hành

Trong 1 tube PCR 0.2 có chứa sẵn 5µl NKRT+RTmix đang ngâm trong đá, cho

vào mẫu trích biệt RNA 15µl.

Sau đó, thực hiện tổng hợp cDNA bằng cách ủ ống phản ứng trong máy luân

nhiệt theo các bước sau:

5 phút

30 phút

5 phút

Giữ

250C,

420C

850C

40C

Sản phẩm cDNA (2-20 µl) được dùng để thực hiện phản ứng PCR.


31

2.3.3. Kỹ thuật Real - time PCR sử dụng Taqman Probe phát hiện và đinh

lượng HCV-RNA.

Các bước tiến hành

Sau khi tách chiết RNA ta tổng hợp cDNA sử dụng NKcDNAsynthesis kit để

thực hiện phản ứng revers transcription với mồi ngẫu nhiên phiên mã ngược RNA

trong các dịch trích biệt RNA ở trên (mẫu bệnh phẩm và mẫu chứng âm) thành

cDNA. Cho vào PCR mix để chuẩn bị chạy PCR.

Phải thực hiện giai đoạn này với các PCR mix giữ trong khay lạnh hay đá bào

Cho PCR mix vào low-profile white PCR tube: Tính toán số phản ứng cần phải

thực hiện để lấy đủ số tube chứa master mix vào tube PCR. Để các tube Master mix

ở 40C-100C trong tối cho đến khi rã đông hoàn toàn; lăc nhẹ để trộn sau đó li tâm

nhẹ để lắng. Cho vào các tube PCR, mỗi tube 20�l NKHCV-TQPCRHEX mix. Giữ

các tube này trong đá bào hay các giá lạnh.

Đối với mỗi mẫu cDNA từ bệnh phẩm và mẫu chứng âm: cho 5�� mẫu cDNA

vào một tube PCR chứa 20�� NKHCV-TQPCRHEX mix.

Đối với các NK

HCVDNA chuẩn : cho vào 3 tube PCR khác chứa 20�� NKHCV-

TQPCRHEX mix, mỗi tube 5�� một độ pha loãng NKHCVDNA chuẩn.

Chạy real-time PCR

Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình luân nhiệt.

Cho tất cả các ống PCR mix đã chuẩn bị ở trên vào buồng ủ nhiệt của máy real-time

PCR. Chọn plate set-up để chọn vị trí các giếng mà các tube phản ứng được đặt vào.

Chọn hai kênh huỳnh quang là “ FAM” và “HEX” phát được huỳnh quang khi các

taqman probe tương ứng bị thủy giải, và máy chọn được các kính lọc huỳnh quang

tương ứng các camera của máy ghi nhận được các ánh sáng huỳnh quang phát ra.


32

Chọn thể tích phản ứng là 25��. Sau đó chạy chương trình luân nhiệt real-time PCR

như sau:

1 chu kỳ 400C trong 10 phút

1 chu kỳ 950C trong 5 phút

40 chu kỳ 940C trong 15 giây

650C trong 1 phút

Chụp hình Real-time ở giai đoạn này.

2.3.4. Kĩ thuật Real-time PCR sử dụng taqman probe để xác định kiểu gen

HCV

Sản phẩm cDNA sau khi đem định lượng, nếu mẫu nào có số lượng

>102copies/ml ta đem xác định kiểu gen.

Tiến hành:

Cho 20µl đã Mix sẵn vào tube loại nhỏ, sau đó cho 3µl cDNA của bệnh nhân đã

định ARN-HCV (+) cho vào máy Real-time PCR để định type.

2.3.5. Kỹ thuật sequencing trong xác định kiểu gen HCV

2.4. Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả có đối chứng.

Thống kê mẫu theo độ tuổi giới tính, sự phân bố lưu hành kiểu gen trong mẫu đã được lựa chọn.


33

Sơ đồ nghiên cứu:

Định lượng HCV-ARN bằng kỹ thuật Real-time PCR trên máy CFX96TM

Bệnh nhân chẩn đoán với virut viêm gan C bằng test nhanh

Chọn mẫu bệnh phẩm anti-HCV dương tính

Tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên

Chạy Eliza

Tách chiết ARN

Chọn mẫu có HCV-ARN >= 102 copies/ml máu

Mẫu có HCV-ARN < 102 theo dõi kiểm tra lại sau 6 tháng

Định type bằng kỹ thuật Real-time PCR trên máy CFX 96TM

Type 1 Type 2 Type 6 Không xácđịnh

Type 3

Giải trình tự gen trên máy 3130XL

Chọn ngẫu nhiên 30 mẫu


34

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu

Độ tuổi trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu thấp nhất là 21 tuổi và cao nhất là 75

tuổi, tuổi trung bình trong nhóm nghiên cứu là 41 tuổi.

3.1.1. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính

Trong thời gian từ tháng 01/2011 đến tháng 01/2012 có tổng số 239 mẫu huyết

thanh xét nghiệm dương tính với HCV bằng phương pháp Eliza và không bị đồng

nhiễm HIV, HBV,HGV. Trong đó số bệnh nhân nam được xác định là 171 trường

hợp, bệnh nhân nữ là 68 trường hợp (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính

Anti-HCV* Nam Nữ Tổng

Số lượng 171 68 239

Tỉ lệ % 71.55% 28.45% 100%

Anti-HCV*: Anti-HCV dương tính ( Anti-HCV (+))

Trong tổng số 239 mẫu huyết thanh đã xác định là anti-HCV(+) thì có 171 mẫu

huyết thanh là bệnh nhân nam chiếm tỉ lệ 71,55%, chỉ có 68 mẫu huyết thanh chiếm

28,45% là của bệnh nhân nữ. Vậy số lượng bệnh nhân nam nhiễm HCV (+) cao

hơn số lượng bệnh nhân nữ, điều này có thể do sự khác biệt về lối sống theo giới

tính hoặc có thể do sự lây nhiễm ở nam giới cao hơn ở nữ giới do sự khác nhau về

kiểu gen. Tuy nhiên hiện nay chưa đủ bằng chứng để chứng minh và giải thích vấn

đề trên.

Phương Thị Hà

Tỉ lệ này được biểu di

Hình 3.1. T

3.1.2. Tỉ lệ bệnh nhân

Qua xét nghiệm

hiện và định lượng số

mới đọc được ta kí hiệ

máy không đọc được ta kí hi

Bảng 3.2

HCV-ARN

Giới tính

Nam

Nữ

Tổng số

Tỉ lệ %

Nhận xét: qua bảng 3.2 t

và chỉ có 4,6 % là có HCV

chẩn đoán viêm gan C m

tễ học đưa ra [17,33,36

Luận văn Th

35

u diễn ở hình 3.1

. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo gi

nh nhân chẩn đoán viêm gan C mạn

Real-time PCR (RT-PCR)dùng mồi Taqman probe

lượng copies/1ml máu, nếu số lượng HCV

ệu là HCV-ARN (+), còn nếu số lượng HCV

c ta kí hiệu là HCV-ARN (-), ta có bảng sau đ

ng 3.2 Kết quả bệnh nhân chẩn đoán HCV

ARN HCV-ARN

dương tính

HCV- ARN

âm tính

163 8

65 3

ố 228 11

95,4% 4,6%

ng 3.2 tỉ lệ xác định HCV-ARN (+) là rất cao chi

có 4,6 % là có HCV-ARN (-) (người lành mang bệnh). V

oán viêm gan C mạn là rất cao, tỉ lệ này tương đồng với t

a ra [17,33,36].

Nam, 71.55%

Nữ, 28.45%


theo giới tính

i Taqman probe để phát

ng HCV-ARN≥ 102 thì máy

ng HCV-ARN < 102 thì

ng sau đây:

-ARN

Tổng số

171

68

239

100%

t cao chiếm tới 95,4%

nh). Vậy tỉ lệ bệnh nhân

i tỉ lệ mà các nhà dịch

Nam, 71.55%


36

Cũng qua bảng 3.2 ta thấy rằng trong tổng số 239 mẫu huyết thanh xác định với

antiHCV(+), ta đem định lượng số lượng copies thì có 228 mẫu có số lượng HCV-

ARN(+) và có 11 mẫu có HCV-ARN(-), theo khuyến cáo của nhà sản xuất và cung cấp

bộ kit xác định genotype thì những mẫu có HCV-ARN(-) thì không định được type tuy

nhiên để kiểm định khuyến cáo trên, nhóm đã thực hiện trong số 11 mẫu huyết thanh

HCV-ARN (-) chọn ngẫu nhiên lấy 3 mẫu đem xác định kiểu gen, qua xét nghiệm

Revers transcription RT - PCR dùng mồi taqman probe đặc hiệu 5’NC ta không xác

định được kiểu gen trong 3 mẫu ngẫu nhiên đó.Như vậy số lượng HCV-ARN (+) thì ta

mới có thể xác định được kiểu gen HCV bằng kỹ thuật RT- PCR.

3.2. Tỉ lệ kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật RT-PCR

3.2.1. Mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type

Trong số 228 mẫu bệnh phẩm đã định lượng HCV-ARN (+) đem định type ta

được kết quả định lượng tương ứng với kết quả xác định genotype được trình bày

trong bảng 3.2

Bảng 3.3 Kết quả định genotype so với kết quả định lượng

Kết quả định lượng Số

mẫu

Type

1 2 6 Không

xác định

100-999 17 13 0 3 1

1000-9.999 47 29 1 16 1

10.000-99.999 61 33 1 27 0

100.000-999.999 75 55 2 21 0

>=1.000.000 28 24 1 3 0

Từ kết quả định lượng so với kết quả định type ta thấy rằng tại ngưỡng định

lượng nào thì type 1 cũng có số lượng nhiều nhất sau đó là type 6 và cuối cùng là

type 2, kết quả được biểu diễn trong hình 3.2.

Phương Thị Hà

Hình 3.2

Lượng siêu vi C dao gen 1,2,6 có số lượng sisố lượng siêu vi dưới 1,0x10có sự khác nhau có ý ngh

Từ bảng trên cho ta thsố lượng virut có trong máu.

3.2.2. Tỉ lệ kiểu gen trong 228 b

Kiểu gen

HCV

Type 1

Số mẫu 151

Tỉ lệ % 66.23%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Luận văn Th

37

Hình 3.2: Kết quả định lượng so với kết quả đị

dao động từ 1,0x102 bản sao/1ml đến 1,2x10ợng siêu vi trên 1,0x105 bản sao /ml là 76-3-24. Kiới 1,0x105 bản sao/ml là : 75-2-46 qua đó nh

khác nhau có ý nghĩa giữa lượng siêu vi trong máu và kiểu gen c

ên cho ta thấy kiểu gen của virut viêm gan C không bng virut có trong máu.

u gen trong 228 bệnh nhân được xác định genotype

Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV

Type 2 Type 3 Type 6

5 0 70

2.19% 0% 30.7%


ả định type

n 1,2x107 bản sao/ml, kiểu 24. Kiểu gen 1,2,6 có

đó nhận thấy rằng không ểu gen của siêu vi.

êm gan C không bị ảnh hưởng bởi

nh genotype

Không xác

định được

Tổng

2 228

0.88% 100%

Tổng sốmẫu

Type 1

Type 2

Type 6

Không xác định


38

Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì

tỉ lệ type 1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70

mẫu chiếm 30.7% tỉ lệ thấp nhất là type 2 chỉ có 5 mẫu chiếm tỉ lệ là 2.19%, không

xác định được type có 2 mẫu với tỉ lệ là 0.88%, trong đó không phát hiện được type

3 trong 228 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu.

Tỉ lệ phân bố kiểu gen được biểu diễn ở hình 3.3

Hình 3.3. Tỉ lệ phân bố các kiểu gen

Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy cùng cộng sự năm 2006, tác giả đã

sử dụng kỹ thuật Real-time Rever Transcription PCR trong định kiểu gen HCV đã

ghi nhận có 28 trường hợp là type 1 chiếm 56 %, 15 trường hợp là type 6 chiếm

30%, và 7 trường hợp là type 2 chiếm 14%, không có trường hợp nào là type 3[50].

Cũng tương đồng với kết quả trên trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng cộng

sự tại trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả đã sử dụng kỹ

thuật LIPA để xác định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan

siêu vi C mạn tính, tác giả cũng đã xác định được 3 kiểu gen chính là 1,2 và 6.

Trong đó kiểu gen 1 chiếm 58,4% ( type 1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type

Type

1, 66.23%

type 2, 2.19%

Type 3, 0.00%

Type

6, 30.70%

Không xác định, 0.88%


39

1b:45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6 (toàn bộ là 6a) 23,9% và kiểu gen 2 là 13,1%

(type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), chỉ có một trường hợp là kiểu gen 3b (0,3%)[ 50].

Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy và luận văn của tôi là sử dụng kỹ

thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại trên vùng 5’NC còn trong

nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen cũng trên vùng

5’NC, cho thấy kết quả nghiên cứu của tôi có sự tương đồng về kết quả cùng với hai

tác giả trên, như vậy nếu dựa trên vùng gen 5’NC đa số kiểu gen của HCV tập trung

ở genotype 1 và 6 trong đó genotype 1 là chiếm cao nhất. Tuy nhiên tỉ lệ này chưa

thể phản ánh thật sự phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV trên những người nhiễm HCV tại

Việt Nam.

3.2.3. Tỉ lệ kiểu gen lưu hành theo giới tính

Trong số 228 bệnh nhân có HCV-ARN (+) ta xác định được kiểu gen,tỉ lệ kiểu

gen được phân chia theo giới tính ta có bảng sau đây:

Bảng 3.5 Tỉ lệ kiểu gen HCV theo giới tính

Giới tính

Kiểu gen

Nam Nữ

Số bệnh

nhân

Tỉ lệ (%) Số bệnh

nhân

Tỉ lệ (%)

Type 1 112 68.71 39 60.00

Type 2 2 1.23 3 4.61

Type 3 0 0.00 0 0.00

Type 6 48 29.45 22 33.85

Không xác định 1 0.61 1 1.54

Tổng số 163 71.50 65 28.50

Theo bảng 3.5 ta thấy rằng số bệnh nhân Nam được xác định HCV-ARN(+)

nhiều hơn bệnh nhân nữ trên tổng số 228 trường hợp bệnh nhân được nghiên cứu,

trong đó:

Số bệnh nhân Nam là 163 chiếm 71,50%,Số bệnh nhân Nữ là 65 chiếm 28.50%.


40

Trong số 163 mẫu huyết thanh của bệnh nhân nam xác định HCV-ARN (+) sau

khi đem định kiểu gen ta có tỉ lệ kiểu gen trên số bệnh nhân Nam là :

+Type 1có 112 trường hợp chiêm tỉ lệ là 68.71%, type 2 có 2 trường hợp chiếm

tỉ lệ là 1.23% ,type 6 có 48 trường hợp chiếm tỉ lệ là 29.45%, type 3 không có

trường hợp nào được xác định.

+ Trong đó có 1 trường hợp không xác định được chiếm tỉ lệ là 0.61%.

Trong số 65 mẫu huyết thanh bệnh nhân nữ có HCV-ARN (+) ta cũng xác định

được tỉ lệ kiểu gen trên số bệnh nhân nữ như sau:

+ Type 1có 39 trường hợp chiếm tỉ lệ là 60%, type 2 có 3 trường hợp chiếm tỉ

lệ là 4.61%, type 6 có 22 trường hợp chiếm tỉ lệ là 33.85%, type 3 cũng không có

trường hợp nào được xác định lưu hành trên bệnh nhân nữ

+ Không xác định được type có 1 trường hợp chiếm tỉ lệ là 3,92%.

Tỉ lệ %

Hình 3.4: Tỉ lệ kiểu gen phân bố ở nam và nữ

68.71%

1.23% 0.00%

29.45%

0.61%

60%

4.61%0.00%

33.85%

1.54%

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

Type 1 Type 2 Type 3 Type 6 Không xác định

Nam Nữ


41

Qua bảng 3.5 và hình 3.4 ta thấy rằng sự phân bố tỉ lệ các kiểu gen ở hai giới là

như nhau, type 1 là cao nhất sau đó là type 6 và thấp nhất là type 2.

3.2.4. Sự phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi

Độ tuổi trong tổng số 228 bệnh nhân được nghiên cứu thấp nhất là 21 tuổi, cao

nhất là 75 tuổi.

Bảng 3.6 Phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi

Độ tuổi

Type1

Type2

Type6

Không

xác định Tổng số Tỉ lệ

21-29

14

1

11

0

26

11.4%

30-39

59

0

30

0

89

39.06%

40-49

37

1

14

1

53

23.24%

50-59

26

3

13

1

43

18.85%

60-69

12

0

2

0

14

6.14%

>70

3

0

0

0

3

1.31%

Theo bảng 3.6 ta thấy rằng sự phân bố kiểu gen ở các nhóm độ tuổi là có sự

chênh lệch trong đó:

+ Nhóm tuổi từ 30-39 chiếm tỉ lệ nhiều nhất là 39.06%

+ Nhóm tuổi từ 40-49 tuổi chiếm tỉ lệ cao thứ hai là 23.24%


42

+ Nhóm tuổi từ 50-59 tuổi chiếm tỉ lệ cao thứ ba là 18.85%

+ Nhóm tuổi từ 20-29 tuổi chiếm tỉ lệ là 11.4%

+ Nhóm tuổi từ 60-69 tuổi chiếm tỉ lệ 6.14%

+ Nhóm tuổi >70 tuổi chiếm tỉ lệ 1,97%.

Sự phân bố các kiểu gen theo từng nhóm tuổi được thể hiện trong hình 3.3

Tỉ lệ %

Nhóm tuổi

Hình 3.5 Sự lưu hành kiểu gen ở các nhóm tuổi

Trong những nhóm tuổi từ 21 đến 59 thì sự lưu hành của virut là có tỉ lệ

cao, mà trong những nhóm tuổi này đều nằm trong độ tuổi lao động chính của

xã hội, như vậy ảnh hưởng đến kinh tế của gia đình nói riêng và của xã hội

nói chung là khá lớn.

11.4

39.06

23.24

18.85

6.14

1.31

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

21-29 30-39 40-49 50-59 60-69 >70

Tỉ lệ % theo nhóm tuổi


43

3.3. Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải tình tự gen (Sequencing) trên đoạn NS5B.

Đối với hệ mồi và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV thiết kế thí nghiệm sử dụng

RNA chứng dương là HCV genotype 1 được đưa vào hỗn hợp cho phản ứng revers

transcription RT- PCR chứa các probe đặc trưng cho HCV genotype 1,2,3 và 6.

Việc bố trí thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự cho các genotype còn lại. Kết

quả chỉ có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe 1 đặc trưng cho HCV genotype 1 mới cho

tín hiệu dương tính. Kết quả tương tự cho các genotype còn lại (Hình 3.6)

HCV genotype 1

HCV genotype 3

HCV genotype2

HCV genotype 6

Chứng âm

Hình 3.6 Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên

vùng 5’NC của HCV

Hình 3.6 cho thấy các phản ứng nếu có các kiểu gen tương ứng với các mẫu dò

đặc trưng thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, các mẫu chứng âm

(được thiết kế với các thành phần tương tự cho phản ứng real-time PCR và real-time

RT PCR) có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền.

Tuy nhiên trong 228 bệnh phẩm xác định genotype HCV có 59 trường hợp kết

quả cho hai tín hiệu dương tính đặc trưng cho HCV genotype 1 và 6 (Hình 3.7).


44

Hình 3.7 Tín hiệu dương tính genotype 1 và 6

Vậy tín hiệu mẫu dò giữa type 1 và type 6 là có sự tương đồng cao.Theo một số

nhà nghiên cứu trên thế giới [18] chứng minh là nếu định genotype HCV trên vùng

NS5B thì sẽ phân biệt các subtype tốt hơn là dựa trên vùng 5’NC, cũng như là phân

biệt được type 6 với subtype 1b.

Trong số 151 mẫu của bệnh nhân đã xác định là genotype l ta l ấy ngẫu nhiên 30

trường hợp đem giải trình tự gen trên đoạn NS5b được kết quả như bảng sau:

Bảng 3.7 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b của HCV

Kiểu gen

Type 1 Type 6 Không xác định được

Type 1a Type 1b Type 6k Type 6e Type 6f Type 6h

Số mẫu 9 7 2 6 1 2 3

Tổng 16 11

3

Tỉ lệ % 53.33 36.67 10.0

Tín hiệu mẫu dò type 6





45

Trong 30 mẫu giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1 và 11 mẫu huyết

thanh xác định là type 6 và có 3 mẫu là không giải được trình tự gen, không chỉ xác

định type mà giải trình tự gen còn xác định đến subtype. Như vậy có 11 mẫu huyết

thanh định type bằng phương pháp RT- PCR dùng taqman probe gắn huỳnh quang

FAM phát hiện genotype HCV cho tín hiệu dương tính với genotype 1 còn phương

pháp giải trình tự gen cho kết quả là type 6, trong đó có 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là

type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h (Bảng 3.7 ).

Kết quả định type bằng kỹ thuật RT- PCR cho tín hiệu dương tính với

genotype1 ta đem giải trình tự được kết quả như hình dưới,kết quả giải trình tự gen

là type 6h (Hình 3.8).

78 HCV

GAGGTACTTGCCACATATTGCGGCTTTCCCTCCTTGGGCGATAAGTTTGGCCCTGACCGCTCGGGCTC

GGTGTCTCCAAGCTCTCAAGGGAGGAGCCCCAAGTTTTCTGAGGCATGATGCCACCCGATTGAGTTCGCCG

GGAGAGTACCCATGGAGTGAGAATGCGGCCATGCCGTGGAGTCTTTGAATGATCACTGGGAGATCAAGCG

GAGTGATTGAATATGTGACTCCGTAGATATCGAAGTCAAGTGCCCTGTCCAAAGTCTCCTGTGCCTGGAGT

ATTTGAAAGAAATGGGTCATGAGTACCATACGCACCCAAATGGTGGGGGCATACATAATGATGTTCCCTAA

CCATGAATTCACAGGAGTGTGGCGAGCGGTCTCCCAGGCCGCCCTCGCCAGTGGAGTGACAGGGTCACGA

GTGAGGTAGTAATATCTTCTGCCGTCTCCATCGTGGGCCACGGAAACATTGGATGAGCATGATGTTA

Hình 3.8 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b

Trong 3 mẫu không giải trình tự gen được thì có 2 mẫu có ARN-HCV thấp nhất

là 1,1x102 và 4,2x102 và có 1 mẫu là 5,8x103. Như vậy tuy giải trình tự gen có xác


46

định kết quả chính xác đến subtype tránh được sự nhầm lẫn giữa type 1 và type 6

nhưng nếu định lượng ARN-HCV có số copies< 103 thì ta không định được type,

điều này cũng được các nhà sản xuất bộ kit và hóa chất khuyến cáo.

Ta thấy rằng tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng

phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 11/27 mẫu bằng

40,74%.

Như vậy định type bằng phương pháp Real-time PCR xét về mặt kinh tế thì phù

hợp với đa số điều kiện của bệnh nhân, tuy nhiên không xác định được subtype và tỉ

lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 là 40,74% vì vậy sẽ ảnh hưởng đến kết quả điều

trị của bệnh nhân,do các genotype HCV có sự khác nhau về độc lực, khả năng gây

bệnh và khả năng đáp ứng điều trị và genotype 1 thường đáp ứng thấp hơn với các

genotype khác (Genotype 1 thường điều trị trong vòng 48 tuần còn các genotype

khác điều trị trong 24 tuần). Do đó bệnh nhân khi đã xác định là type 1 bằng

phương pháp RT- PCR và có kết quả định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại

bằng phương pháp giải trình tự gen.


47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Qua kết quả nghiên cứu định genotype HCV bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Real-time PCR cho tỉ lệ genotype 1 là cao nhất chiếm 66,23%, tiếp đó là type 6

chiếm tỉ lệ 30,7%, type 2 có tỉ lệ thấp nhất là 2,19%, type 3 không có trong 228

trường hợp nghiên cứu

2. Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu đã xác định là genotype 1 bằng kỹ thuật Real-time

PCR giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1trong đó có 9 mẫu là type 1a

và 7 mẫu là type 1b , có 11 mẫu huyết thanh xác định là type 6 trong đó 2 mẫu là

type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h . Ta thấy rằng tỉ lệ

nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng phương pháp Real-

time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 40,74%, tuy nhiên khi nồng độ virut

thấp không làm được giải trình tự gen.

KIẾN NGHỊ:

1. Vẫn có thể dùng kỹ thuật Real-time PCR để định type khi nồng độ virut

thấp.

2. Khi đã xác định là type 1 bằng phương pháp Real-time PCR và có kết quả

định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự

gen (Sequencing).


48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng viêt:

1. Nguyễn Thanh Bảo, Phạm Hùng Vân (2008), “ Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp

sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT Real-time PCR vùng 5’-NC để làm

xét nghiệm định kiểu gen HCV”, Y học TP. Hồ Chí Minh, 13(1), pp.243-248.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh.

3. Lê Thanh Hòa, Lê Thanh Hà, Hoàng Quang (2007), “ Định typ (genotyping), virus

viêm gan C (HCV) sử dụng chỉ thị 5’ UTR trên bệnh nhân viêm gan virus ở Hà

Nội”, Tạp chí y học Việt Nam, 7, pp.29-36.

4. Học viện quân y (2008), Bệnh học truyền nhiễm và nhiệt đới, NXB y học. Hà Nội.

5. Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà

Nội.

6. Hà Văn Mạo (2006), Ung thư gan nguyên phát, NXB y học, Hà Nội.

7. Phạm Song (2009), Viêm gan virut B,D,C,A,E,GE cơ bản, hiện đại và cập nhật, NXB

Y học, Hà Nội.

8. Trường Đại học Y Hà Nội (2006), Bài giảng vi sinh vật y học, NXB y học, Hà Nội.

9. Phạm Văn Ty (2005),Virut học, NXB giáo dục, Hà Nội.

10. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng

thường gặp, NXB y học, TP Hồ Chí Minh.

Tài liệu tiếng Anh

11. Akazawa D., Date T., Morikawa K., Murayama A., Miyamoto M., Kaga M., Barth

H., Baumert T.F., Dubuisson J., Wakita T. (2007), “ CD81 expression is important

the permissiveness of huh7 cell clones for heterogeneous hepatitis C virus

infection”, Journal of Virology, 81, pp.5036-5045.


49

12.Alfonso V., Mbayed V.A., Sookozian S., Campos R.H. (2005), “Intra-host

evolutionary dynamies of hepatitis C virus E2 in treated patients”, Journal of

General Virology, 86, pp.2781-2786.

13.Alter M.J. (2007), “Epidemiology of hepatitis C virus infection”, World J

Gastroenterol, 13(17), pp.2436-2441.

14. Batey R.G. (2007), “ Controversies in and challenges to our understanding of

hepatitis C”, World Journaly Gastroenterology,13(31), pp.4168-4176.

15. Barth H., Schafer C., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Toyoda A.K.,

Toida T., Kuppevelt T.H., Depla E., Weisackev F.V., Blum H.E., Bacmert T.F.

(2003), “ Cellular Binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires

cell surface heparin sulfate”, The Journal of Biologycal chemistry, 278 (42), pp.

41003-41012.

16. Blanchard E., Blouzard S., Goueslain L., Wakita T., Dubuisson J., Wychowski C.,

Rouille Y. (2006), “ Hepatitis C virus entry depends on clathrin-mediated

endocytosis”, Journal of Virology, 80(14), pp.6964-6972.

17. Branch A.D., Stump D.D., Gutierrez J.A., Eng F., Walewski J.L. (2005), “ The

hepatitis virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the

alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift, and others”,

Seminars in liver disease 2005, 25(1), pp.105-117

18. Donahue J.G., D.V.M., Munoz A., Paul M., Ness M.D., Donald E., Broun J.R., David

H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D. (1992), “ The

declining risk of post-transfusion hepatitis C virus in fection”, The new England

Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373.

19. Duvet S., Beeck A.O.D., Cocquerel L., Wychowski C., Cacan R., Dubuisson J.

(2002), “ Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 occurs

posttranslationally in a mannosylphosphorylclolichol-deficient CHO mutant cell


50

line”, Insttutde Biologie delille/ Instiut Pasteur delille, BP447,59021 LILLE Cedex,

France.

20. Esfahani S.N., Shahhosseing M.H., Yaghmai P., Praivar K., Moslemi E., Amini H.K.

(2010), “ Rapid and simple detection of Hepatitis C virus by reverse transcriptase-

loop-mediated isothermal amplification method”, African Journal of Microbiology

Research, 4(23), pp.2580-2586.

21. Friebe P., Bartenschlager R. (2002), “Genetic analysis of sequences in the 3’

nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication”,

Journal of Virology, 76(11), pp.5326-5338.

22. Friebe P., Boudet T., Simorre J.P., Bartenschlager R. (2005), “ Kissing-loop

interation in the 3’ end of the hepatitis C virus genome essential for RNA

replication”, Journal of Virology, 79(1), pp.380-392.

23. Fu Y., Wang Y., Xia W., Pybus O.G., Qin W., Lu L., Nelson K. (2011), “New treds of

HCV infection in China revealed by genetic analysis of viral sequences deter mined

from firt-time volunteer blood donors”, Journal of viral hepatitis, 18, pp.42-52.

24. Germer J.J., Rys P.N., Thorvilson., Persing D.H. (1999), “ Determination of hepatitis

C virus genotype by direct sequence analysis of products generated with the

amplicon HCV test”, Journal of Clinical Microbiology, 37(8), pp.2625-2630.

25. Gastaminza P., Cheng G., Wieland S., Zhong J., Liao W., Chisari F.V. (2008), “

Cellular determinants of hepatitis C virus assembly, maturation, degradation and

seretion”, Journal of Virology, 82(5), pp.2120-2129.

26. Halfon P., Trimoulet P., Bourliere M., Khiri H., Deledinghen V., Couzigou P., Feryn

J.M., Alcaraz P., Renou C., Fleury H.J.A., Ouzan P. (2001), “ Hepatitis C virus

genotyping based on 5’ noncoding sequence analysis (Trugene)”, Journal of

Clinical Microbiology, 39(5), pp.1771-1773.


51

27. Haqshenas G., Mackenrie J.M., Dong X., Gowans E.J. (2007), “ Hepatitis C virus p7

protein is localized in the endoplasmic reticulum when it is encoded by a

replication-competent genome”, Journal of General Virology, 88, pp.134-142.

28. Helle F., Dubuisson J. (2008), “Hepatitis C virus entry into host cells”, Cellularand

Molecular Life Sciences, 65, pp. 100-112.

29. Honda M., Beared M.R., Ping L.H., Lemon S.M. (1999), “ A phylogenetically

conserved stem-loop structure at the 5’ border of the internal ribosome entry site of

hepatitis C virus is required for cap-independent viral translation”, Journal of

Virology, 83(2), pp.1165-1174.

30. Hotta H., Handajami R., Lusida M.I., Soemarto W., Doi H., Miyajama H., Homma

M. (1994), “ Subtype analysis of hepatitis C virus in Indonesia on the basis of NS5b

region sequences”, Journal of Clinical Microbiology, 32(12), pp.3049-3051.

31. Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C., McKeating J.A.

(2003), “ Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of

pseudotyped retro viral particles”, 1230 York Avenue, New York.

32. James G., Donahue Jr., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A.,

Rettz M.D., Kenrad E. (1992), “The declining risk of post-transfusion hepatitis C

virus infection”, The new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373.

33. Kapadia S.B., Barth H., Baumert T., Mekeating J.A., Chisari F.V. (2007), “ Initiation

of hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between

CD81 and scavenger receptor B type 1”, Journal of Virology, 81(1), pp.374-383.

34. Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M. (1996), “ Identification of a highly

conserved sequence element at the 3’ terminus of hepatitis C virus genome RNA”,

Journal of Virology, 70(6), pp. 3363-3371.


52

35. Marshall D.J., Heisler L.M., Lyamichev V., Murvine C., Olive D.M., Ehrlich G.D.,

Neri B.P., deArruda M. (1997), “ Determination of hepatitis C virus genotypes in

the United States by Cleavase fragment length polymorphism analysis”, Journal of


36. Martell M.,Gomez J., Esteban T., Sauleda S., Quer J., Cabot B., Esteban R., Guardia

J. (1999), “ High-throughput Real-time reverse transcription – PCR quantitation of

hepatitis C virus RNA”, Journal of Clinical Microbiology, 37(2), pp.327-332.

37. Martial J., Morice Y., Albel S., Cabie A.,Rat C., Lombard F., Edouard A., Bierre-

louis S., Chout R., Gordien E., Deny P., Cesaire R. (2004), “ Hepatitis C virus

(HCV) genotypes in the Caribbean island of martinique: evidence for a large

radiation of HCV for a recent introduction from Europe of HCV-4”, Journal of


38. McOmish F., Yap P.L., Dow B.C., Follett E.A.C., Seed C., Lin C., Lai C., Leong S.,

Medgyesi G.A., Hejjas M., Kiyokawa H., Fukada K., Cuypers T., Saeed A.A., Al-

rasheed A.M. (1994), “ Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in

blood donors : an international collaborative survey”, Journal of Clinical

microbiology, 32(4), pp.884-892.

39. Moradpour D., Cerny A., Heim M..H., Blum H.E. (2003), “ Hepatitis C: an update”,

Swiss Med Wkly, 131, pp.291-298.

40. Ndjomou J., Dybus O.G., Matz B. (2003), “ Phylogentic analysis of hepatitis C virus

isolates indicates a unique pattern of endemic infection in Cameroon”, Journal of

General Virology, 84, pp. 2333-2341.

41. Pybus O.G., Barnes E., Taggart R., Lemey P., Markov P.V., Rasachak B., Syhavong

B., Phetsouvanah R., Sheridan I., Humphrey I.S., Lu L., Newton P.N., Klenerman

P. (2009), “ Genetic history of hepatitis C virus in East Asia”, Journal of Virology,

83(2), pp.1071-1082.


53

42. Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F., Irvine B., Beall E.,

Yap P.L., Kolberg J., Urdea M.S. (1993), “ Classification subtype by phylogenetic

analysis of the NS-5 rigion”, Journal of General Virology, 74, pp. 2391-2399.

43. Simmonds P. (2004), “Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus-15 years

on”, Journal of General Virology, 85, pp.3173-3188.

44. Simmonds P., Bukh J., Combet C., et al. (2005), “ Consensus proposals for a unified

system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes”, Hepatology 2005, 42, pp.

962-973.

45. Song Y., Friebe P., Tzima E., Junemann C., Bartenschlager R., Niepmann M. (2006),

“ The hepatitis C virus RNA 3’-untranslated region entry site”, Journal of Virology,

80(23), pp.11579-11588.

46. Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., et al. (2001), “ Evidence for a new hepatitis

C virus antigen encoded in an overlapping reading frame”, RNA 2001, 7, pp.710-

721.

47. Xu Z., Fan X., Xu Y., Bisceglie A.M.D. (2008), “ Comparative analysis of nearly

full-length hepatitis C virus quasispecies from patients experiencing viral break

through during antiviral therapy: clustered mutations in three functional genes,

E2,NS2 and NS5a”, Journal of Virology, 82(19), pp.9417-9424.

48. You S., Rice C.M. (2008), “ 3’RNA elements in hepatitis Cvirus replication: kissing

partners and long poly (U)”, Journal of Virology, 82(1), pp.184-195.

Trang web

49. http://www.drthuthuy.com

50. http://www.HepatologyTextbook.com

51. http://www.ncbi.nlm.nih.gov


54


55

45-42,40,38-37,35,33,30,25-22,13,11,5-3

1-2,6-10,12,14-21,26-29,31-32,34,36,39,41,46-53

ĐẶt v Ấn ĐỀ...ph ươ ng th ị hà lu ận v ăn th ạc s ĩ khoa h ọc 1 ĐẶt v Ấn...

Documents