t e s i s - instituto politécnico nacional · 2019-10-03 · la búsqueda de nuevas fuentes de...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE
PRODUCTOS BIÓTICOS
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS DE LA SEMILLA DE Jatropha
Curcas L.
T E S I S
QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA
OBTENER EL GRADO:
MAESTRO EN CIENCIAS EN
DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
PRESENTA:
Q.F.B. MARIA EUL URDES PERALTA FLORES
ALIA LO
Este trabajo titulado CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS DE LA
SEMILLA DE Jatropha curcas L. fue realizado en el Departamento de Biotecnología del
Centro de Desarrollo y Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional (CEPROBI-
IPN) en Yautepec Morelos bajo la dirección de la Dra. Alma Leticia Martínez Ayala, con
el apoyo del proyecto “Caracterización molecular de las proteínas en la semilla de
Jatropha curcas L.” CGPI-20010744.
La sustenta al realizar sus estudios obtuvo apoyo económico por parte del programa
Institucional de Formación de Investigadores (PIFI).
ii
INDICE Lista de Cuadros i
Lista de Figuras iii
Página
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1. INTRODUCCIÓN 3
2. ANTECEDENTES 5
2.1 El cultivo de Jatropha curcas L.. 5
2.1.1 Clasificación taxonómica de Jatropha curcas L. 5
2.1.3 Distribución geográfica de Jatropha curcas L. 6
2.1.4 Descripción Botánica de Jatropha curcas L. 9
2.1.4.1 Árbol 9
2.1.4.2 Hojas y Flores 11
2.1.4.3 Fruto 11
2.1.4.4 Semilla 12
2.1.4.4.1 Propiedades físicas de la semilla
de Jatropha curcas L 12
2.1.4.4.2 Composición química de la semilla 14
2.1.4.4.3 Uso de la semilla y planta 19
2.1.5 Proteínas de reserva 21
2.1.5.1 Albúminas 24
2.1.5.2 Globulinas 24
2.1.5.2.1 Globulinas 7S 24
2.1.5.2.2 Globulinas 11S 25
2.1.5.3 Prolaminas 25
iii
2.1.5.4 Glutelinas 26
2.1.5.5 Clasificación y Fraccionamiento de proteínas de reserva 26
3. JUSTIFICACIÓN 29
4. HIPÓTESIS 29
5. OBJETIVOS 30
5.1 Objetivo General 30
5.2 Objetivos Específicos 30
6. MATERIALES Y MÉTODOS 31
6.1 MATERIALES 31
6.1.1 Material Biológico 31
6.1.2 Semilla 31
6.1.3 Anticuerpos policlonales 31
6.1.4 Reactivos 31
6.1.5 Metodología 32
6.2. MATERÍA PRIMA 33
6.2.1 Caracterización Física de la semilla 34
6.2.2.1 Peso de 100 semillas 34
6.2.2.2 Determinación del tamaño 34
6.2.3 Análisis Químico proximal de la semilla 34
6.2.4 Obtención de las fracciones proteicas de la semilla método
Osborne (1924) 35
6.2.5 Método modificado Osborne 35
6.2.6 Caracterización bioquímica de las fracciones proteicas
de la semilla 37
6.2.6.1 Electroforesis 37
6.2.6.2 Nativa (ND-PAGE) 37
6.2.6.3 Desnaturalizante (SDS-PAGE) 39
6.2.6.4 Enfoque Isoeléctrico 40
6.2.6.5 Digestibilidad aparente 42
6.2.7 Fraccionamiento y caracterización bioquímica de las
Globulinas de la semilla 41
6.2.7.1 Cromatografía por filtración en gel 41
iv
6.2.7.2 Electroforesis 41
6.2.7.3 Ultracentrifugación 41
6.2.7.4 Inmunodetección 42
7. RESULTADOS 44
7.1 Caracterización física de las semillas de J. curcas L.. 44
7.2 Composición proximal de la harina 44
7.3 Fraccionamiento de las proteínas 46
7.4 Caracterización de las proteínas de reserva de la semilla de
Jatropha curcas L.. 47
7.4.1 Número de subunidades y peso molecular de las proteínas
de reserva 47
7.4.2 Punto isoeléctrico de las proteínas de reserva 52
7.4.3 Digestibilidad in Vitro de las proteínas 53
7.5 Fraccionamiento y caracterización Bioquímica de las Globulinas de
la semilla 54
7.5.1 Número de subunidades y peso molecularde las Globulinas
de Jatropha curcas L. 56
7.5.2 Determinación del coeficiente de Sedimentación de las
Globulinas de J. curcas 61
7.5.3 Determinación de la homología entre las Globulinas de
la semilla de J. curcas y las Globulinas de semilla de
Lupinus.camprestris 62
8. CONCLUSIONES. 64
9. BIBLIOGRAFIA 65
v
LISTA DE CUADROS
Número Pág.
1 Clasificación taxónomica de la planta de Jatropha curcas L 6
2 Características físicas de las semillas de cuatro variedades
de Jatropha curcas L
13
3 Composición quimica de las semillas de Jatropha curcas L.
de diferentes partes del mundo
14
4 Composición química de las partes que constituyen a la
semilla de Jatropha curcas L. de diferentes variedades
15
5 Composición química de las harinas de diferentes variedades
de Jatropha curcas L. y de soya
22
6 Contenido de aminoácidos esenciales de la harina de
Jatropha curcas comparada con el patrón FAO/OMS
20
7 Clasificación de las proteínas de reserva con base en criterios
genéticos y moleculares
23
8 Comparación de la distribución de las fracciones proteínicas
en el grano de maíz según Osborne
28
9 Preparación del gel 8% para electroforesis en condiciones
nativas
38
10 Preparación de los geles de archilamida al 10 y 13% para
electroforesis desnaturalizante (reductora y no reductora)
39
11 Composición química de la harina sin desgrasar y
desgrasada de semillas Jatropha curcas L. del Estado de
Morelos.
45
12 Composición de las proteínas de reserva de semilla de
Jatropha curcas L. obtenida por los métodos de Osborne y
Osborne Modificado.
47
i
13 Digestibilidad in vitro de harina y proteinas de reserva de la
semilla de Jatropha curcas L
54
14 Contenido de globulinas sometida a cromatografía de filtración en gel y resuelta en PI y PII*
56
ii
LISTA DE FIGURAS
Número Pág. 1 Distribución geográfica mundial de Jatropha curcas L. 8
2 Distribución de Jatropha curcas L. en México 8
3 Parte superior del árbol de Jatropha curcas L 9
4 Partes importantes de Jatropha curcas L 10
5 Frutos de Jatropha curcas L en diferentes estados de
maduración 11
6 Semillas de Jatropha curcas L con y sin testa 12 7 Estructura del ester de Forbol 17
8 Estrategia experimental para el fraccionamiento y
caracterización bioquímica y molecular de las proteínas de
reserva de Jatropha curcas L
32
9 Semillas de Jatropha curcas con y sin testa
33
10 Diagrama de flujo del método de Osborne modificado por
Ferreira
36
11 Semilla de Jatropha curcas L. del estado de Morelos A) con
testa B) sin testa 44
12 Patrón electroforetico nativo de las proteínas de reserva de
semillas de Jatropha curcas L
50
13 Patrón electroforético de las proteínas de reserva de la
semilla de J. curcas. A) Desnaturalizante (SDS-PAGE); B)
Desnaturalizante y reductor (SDS-PAGE-ME).
51
14 Enfoque isoeléctrico nativo y desnaturalizante 52
15 Perfil de elución de cromatografía de filtración en gel de las
globulinas de Jatropha curcas L.
55
iii
16 Patrón electroforético nativo de las globulinas presente en los picos I y II colectados por filtración en gel de Jatropha curcas L.
57
17 Patrón electroforético desnaturalizante de las globulinas en
semilla de Jatropha curcas L. y fracciones colectadas en los
picos I y II
58
18 Enfoque Isoeléctrico de Globulinas totales de semilla de Jatropha curcas L Nativo, Desnaturalizante
60
19 Perfil de ultracentrifugación de las globulinas de la semilla de
Jatropha curcas L.
62
20 Patrón electroforético de las globulinas de semilla de Jatropha curcas L y Lupinus campestris y Western-blot utilizando el anticuerpo contra la globulina 7S de L. campestris
63
iv
v
RESUMEN Jatropha curcas L. es una planta nativa de México que pertenece a la familia de las
Euphorbiaceae; las semillas han sido consideradas como proteaginosas por su alto
contenido de proteína (27 – 32 %) y aceite (58 – 60&). Aunque la pasta de la semilla
después de la extracción de aceite (harina) es rica en proteína (50 %), es tóxica para
ratas, ratones y rumiantes y además no puede ser usada en la alimentación animal.
Algunos casos de enveneamiento en humanos después del consumo accidental de la
semilla han sido reportados. Sin embargo, en México se han encontrado plantas de
Jatropha curcas L. no tóxicas. Los esteres de forbol no han sido detectados pero el
inhibidor de tripsina, las lectinas y los fitatos han estado presentes. Las proteínas de
reserva de semillas son de gran importancia nutricional y se clasifican de acuerdo a su
solubilidad en cuatro grupos. En este trabajo, las proteínas de la semilla de Jatropha
curcas L. fueron fraccionadas y caracterizadas. El contenido de proteína en la harina
desgrasada de la semilla fue de 45.3 % en base seca y las albúminas, globulinas
prolaminas y glutelinas fueron secuencialmente extraídas de acuerdo a su solubilidad.
Las fracciones mayoritarias fueron globulinas (42.2 %) y glutelinas (32.6 %), seguidas
por las albúminas (11.8 %) y las prolaminas fueron la fracción minoritaria con solamente
3.6 %). El patrón electroforético de la fracción de albúminas presenta cuatro
componentes principales, proteínas con peso molecular menores a 30 kDa, la fracción
de globulinas está compuesta de nueve bandas principales, siete entre 30 y 70 kDa y
dos menores a 19 kDa. Las prolaminas mostraron tres bandas y las glutelinas
constituidas solamente por dos cadenas polipeptídicas de 33 y 27 kDa. Las globulinas
fueron fraccionadas por filtración en gel, resultando en la separación de dos picos de
229 y 23 kDa. Los resultados sugieren que la fracción de globulinas en semillas de
Jatropha curcas L. es similar a las globulinas de leguminosas y el componente de 23
kDa podría corresponder a la globulina 2S rica en aminoácidos azufrados.
1
ABSTRACT
Jatropha curcas L. is a plant native from Mexico that belongs to the Euphorbiaceae
family; the seeds have been considered as proteaginous for their high protein content
(27 – 32 %) and oil (58 – 60 %). Although the seed cake (meal) is rich in protein (50%),
it is toxic to rats, mice and rumiants and therefore can no be used as animal feed.
Several cases of poisoning in humans after accidental consumption of seeds have been
recorded. However, in Mexico were found Jatropha curcas L. non-toxic. Phorbol esters
were none detected but trypsin inhibitor, lectin and phytate were present. The storage
proteins of the seeds are of great nutritional importance and they are classified into four
groups on the basis of their solubility. In this work the storage proteins were fractionated
and characterized. The protein content of defatted flour from seeds was of 45.3 % in dry
basis, albumins, globulins, glutelins and prolamins were sequentially extracted
according to their solubility. The major protein fractions were globulins (42.2 %) and
glutelins (32.6 %) followed of albumins (11.8 %) and prolamins was the minor fraction
with only 3.6%. Electrophoretic pattern of the albumin fraction presented four main
componentes lower than 30 kDa, the globulin fraction was composed of nine major
bands, seven between 30 to 70 kDa and two lower than 19 kDa. Prolamins whowed
three bands and glutelins were constituted only by two polypeptide chains of 33 and 27
kDa. The globulins were fractionated by gel filtration resulting in the separation two
major peaks corresponding to 229 and 23 kDa. Ther results suggest that the globulins in
Jatropha curcas L. are similar to the legumes globulins and the 23 kDa component could
be correspond to the globulin 2S sulphur rich.
2
1. INTRODUCCIÓN La búsqueda de nuevas fuentes de proteínas es una importante tendencia de
investigación, debido al alto índice de crecimiento demográfico, en los últimos años se
realizan investigaciones sobre el uso de proteínas no convencionales para el consumo
humano ya que los alimentos ricos en proteína como la carne, el huevo y la leche son
escasos en la mayoría de los países en vías de desarrollo los cuales, además de ser los
más costosos de producir son los más difíciles de adquirir (Altschul y col. 1981).
Con respecto a las proteínas vegetales, estas deben poseer un buen valor nutricional,
estar libres de todo contaminante o factor antinutricional, ser aceptadas por el
consumidor y poseer buenas propiedades funcionales para su incorporación como
ingredientes en la elaboración de alimentos destinados al consumo humano (Cheftel,
J.C 1989)
Se han estudiado para su utilización en forma de harinas, concentrados, aislados o
texturizados vegetales a partir de semillas tales como avena, girasol, sorgo, trigo, soya
coco, colza (Liener 1981). Estas fuentes de proteínas constituyen aproximadamente el
50% del suplemento mundial y, entre los cereales más importantes y de mayor
consumo se encuentran el trigo, maíz y arroz son deficientes en lisina, por otro lado la
harina de soya es abundante en lisina, por ende la combinación de ellos resulta un
buen producto alimenticio (Fauconneau, G., 1983).
Las semillas de Jatropha curcas L. presentan ventajas debido a que poseen un 20% de
proteínas y 60% de aceite, ambos de buena calidad, este último es utilizado con fines
industriales principalmente como sustituto del diesel, también para la elaboración de
jabones y cosméticos entre otros. Además la planta crece en zonas tropicales y
subtropicales (Makkar y col., 1998) y a diferencia de los cultivos de soya y otras
leguminosas no existen investigaciones sobre la caracterización y utilización de las
proteínas.
Por todo lo anterior y dada la disminución evidente de los recursos estratégicos del país
y de la falta de aplicación de procesos tecnológicos para la mejor utilización de dichos
recursos se ha estimado efectuar un trabajo de investigación en el que se incorporen
aspectos de naturaleza científica y tecnológica, que incida en algunos puntos de la
3
problemática alimentaría. El uso directo de las proteínas vegetales en la alimentación
humana puede ser un factor importante para satisfacer los requerimientos proteicos de
una población que aumenta constantemente y demanda una mejor alimentación
(Paredes López y col., 1980).
En general la combinación de cereal con leguminosa ofrecen un balance conveniente
de aminoácidos indispensables según el índice del valor biológico de los alimentos.
4
2. ANTECEDENTES
2.1 El cultivo de Jatropha curcas L.
El género Jatropha pertenece a la familia de las Euphorbiaceae que comprende
aproximadamente a 170 especies, su nombre deriva del griego “Iatros” que significa
doctor y “Trophe” que significa alimento (Salas y col., 1994). Es una planta cuyo origen
es México y Centroamérica, crece en la mayoría de los países tropicales, es conocida
en varios países con diferentes nombres en México como “Piñón purgante” o
“Piñoncillo”, “Nuez negra” y Skil-te por los mayas en la Península de Yucatán (Jones
1987; Münch 1986; Schultze–Motel 1986), en Inglaterra como “Purping nut”, en Costa
Rica como “Tempate” y “Coquillo”, en Portugal como “Habel Meluk” (Makkar y col.,
1998), en Nigeria como “Butuje”, en Puerto Rico como “Tártago”, Mundubi-assu en
Brasil, Piñol en Perú, Jarak budeg en Indonesia, Tabanani en Senegal, Kadam en
Nepal.
La planta es cultivada principalmente para producir aceite, la producción de semilla, es
de aproximadamente 5 Ton/ año de una plantación de una hectárea, se extraen 2
toneladas de aceite y una tonelada de harina de la semilla, esta última es rica en
proteína (Makkar y col., 1998; www.jatropha.org, 1998).
2.1.1 Clasificación taxonómica de Jatropha curcas L.
El género Jatropha pertenece a la tribu Joannesieae de Crotonoideae de la familia
Euphorbiaceae que contiene aproximadamente 170 especies conocidas. Una de ellas
es Jatropha curcas, Dehgan y Webster 1979, revisaron la subdivisión hecha por Pax
(1910) y distinguieron dos nuevos subgéneros (Curcas y Jatropha) (Heller, 1996). La
clasificación taxonómica de Jatropha curcas L. se presenta en el Cuadro 1.
Al realizar un análisis de 77 especies de Jatropha originarias del Nuevo Mundo y del
Viejo Mundo, estas fueron agrupadas jerárquicamente en diez secciones y diez
subsecciones, mostrando parte de concordancia con Dehgan y Webster (1979) y a su
vez con Dehgan y Schutzman (1994). La especie de Jatropha Neotropical, favorece el
análisis apoyado por Dehgan y Webster (1979) modelo evolutivo del género Jatropha
5
mostrando así que la semilla proveniente de una semilla ancestral presentando
cambios en el crecimiento y la estructura de las flores. Cuadro 1. Clasificación taxonómica de la planta de Jatropha curcas L.
REINO PLANTAE
Filo/División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
(Dicotiledónea)
Orden Euphorbiaceae
Género Jatropha
Especie curcas
Nombre científico Jatropha curcas
Jones, 1987.
2.1.2 Distribución geográfica de Jatropha curcas L.
Varios científicos han tratado de definir el origen y la fuente de donde proviene la planta
de Jatropha curcas. Ésta especie probablemente fue distribuida por los portugueses en
las Islas de Cabo Verde y en otros países de África y Asia (Serra, 1950). Dehgan y
Webster (1979) de la cita de Wilbur (1954) “sin duda pertenece a la flora de México y
probablemente al norte de Centroamérica antes de la llegada de Cortés”. Otras fuentes
plantean que las semillas son nativas de México, localizadas en zonas costeras
(Apontle 1978) y América central. Martín y Mayeux (1984) la identifican en el estado de
Ceare en Brasil como lugar de origen sin dar ningún argumento. Dehgan al visitar el
laboratorio Horticural Systematics, verifica centenares de especimenes, el material
6
había sido recolectado principalmente en México y todos los países Centroamericanos
como: Belice, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Honduras, Nicaragua Y Panamá.
Existen archivos donde todavía la localizan en el Caribe: Bahamas, Cuba, Republica
Dominicana, Haití, Puerto Rico, Santa Lucía, Santo Domingo y Trinidad, otros pueblos
del Oeste de la India. Igualmente se encontraron registros de otros países de América
del Sur como Argentina , Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador, Islas de Galápagos,
Paraguay, Perú y Venezuela. En la Florida también fue localizada.
Los especímenes del herbario de América eran reunidos normalmente de los setos
vivos a lo largo de los caminos como cercos. Standley y Steyermark (1949) confirman
y declaran que para Guatemala la semilla no es nativa del lugar. No se encuentra en
forma silvestre en África y Asia sino en forma cultivada. En la Figura 1, se muestra la
distribución mundial de la semilla. El cultivo de. Jatropha curcas L crece fácilmente en
lugares pedregosos de pobre calidad de nutrientes y es resistente a las sequías
(Makkar y col., 1999).
7
Centro de origen
Figura 1. Distribución geográfica mundial de J. curcas L. (Heller 1996)
En la Republica Mexicana Jatropha curcas L. se encuentra en forma silvestre en los siguientes estados: Sinaloa, Oaxaca, Quintana Roo, Veracruz, Yucatán, Morelos, Sonora, Tamaulipas, Chiapas, Hidalgo, Puebla, Guerrero y Tabasco (Figura 2) (Heller 1996).
Figura 2. Distribución de Jatropha curcas L. en México (Marttínez, 1979; Makkar y col. ,1998)
8
2.1.3 Descripción Botánica de Jatropha curcas L. La planta de Jatropha curcas L. es resistente a la sequías y es sembrado como cerco
viviente convirtiéndose en un árbol pequeño o arbusto grande.
2.1.4.1 Árbol Es un arbusto o árbol caducifolio, que mide entre 3-8 metros de altura, presenta una
morfología discontinua en sus articulaciones en sus ramas durante su crecimiento
(Figura 3). Las ramas contienen látex, normalmente se forman cinco raíces de los
arbolillos, una central y cuatro periféricas (Kobilke 1989). Puede tener hasta dos
épocas de floración y fructificación por ciclo anual. La propagación de la especie se
realiza principalmente de dos maneras una sexual por medio de semillas, tardando
aproximadamente 30 días en germinar y también de forma asexual, que es por
esquejes o estacas de 1 m de altura y 5 cm de diámetro, iniciándose el brote de las
yemas a los 20 días (Cano y col., 1984 y Makkar y col., 1998). En la Figura 4 se
muestran en forma general, las partes importantes de la planta de Jatropha curcas L.
Figura 3. Parte superior del árbol Jatropha curcas L.
9
Figura 4. Partes importantes de la planta Jatropha curcas L. a.- ramas floreciendo, b.- Corteza, c.- nervaduras de la hoja, d-.pistilos de la flor, e.- estambres de la flor, f.- corte transversal de fruto inmaduro, g.- fruto, h. corte longitudinal de fruto maduro, i semilla.- De a-c y f-h de Aponte 1978; d y f de Dehgan 1984. Heller, 1996.
10
2.1.4.2 Hojas, Flores y Fruto
En la figura 4a y 4c se puede observar la estructura de las hojas que son alternas de
color verde miden de 6-15 cm, presentan nervaduras, tres lóbulos cortos y peciolados.
Las flores Figuras 4e y 4d son unisexuales, ocasionalmente hermafroditas, (Dehgan y
Webster 1979) de color amarillo, con diez estambres arreglados en dos distintos
verticilos, cada uno con cinco en la columna del androceo y en proximidad de cierre uno
con otro.
Su fruto es una cápsula con 3 semillas, mide de 4-5 centímetros de ancho, como se
observa en la figura 4h, cuando esta aún inmaduro, es de color verde, amarillo cuando
está madura y café oscuro cuando el fruto esta seco (Figura 5).
Figura 5. Frutos de Jatropha curcas L. en diferentes
estados de maduración.
11
2.1.4.3 Semilla Las semillas son blancas (Figura 6), presentan testa obscura, de forma elipsoidal,
aceitosa de 2 cm de largo y pesan en promedio alrededor de 0.65 g (Heller 1996)
además de que su aceite y proteínas, tienen propiedades medicinales (Aderibigde y
col., 1997; Eroarome y col., 1998).
Figura 6. Semillas de Jatropha curcas L con y sin testa
2 cm
2.1.4.3.1 Propiedades físicas de la semilla de Jatropaha curcas L.
En el Cuadro 2 se presentan algunas características de variedades de semilla de
Jatropha curcas L provenientes de diferentes lugares como son Nicaragua (variedades
tóxicas de Cabo Verde cultivadas en Managua), Nigeria (una variedad silvestre de Ife;
con toxicidad desconocida) y México (una variedad silvestre no toxica recolectada en
Papantla) (Makkar y col., 1998). Se observan características físicas similares en cuanto
al peso promedio del fruto, semilla, peso promedio de semilla con cáscara o testa.
12
Cuadro 2. Características físicas de las semillas de cuatro variedades de Jatropha curcas L.
CABO VERDE
NICARAGUA
IFE NIGERIA
MÉXICO
Peso (g) del
fruto
-
-
2.1
-
% de semilla
del fruto
-
-
71.1
-
% de cáscara
de fruto
28.9
Peso (g) de la
semilla
0.69
0.86
0.53
0.65
%de la semilla
62.7
62.7
60.7
63.5
% de cáscara
de la semilla
37.3
37.3
40.0
36.5
(Makkar y col., 1998)
El peso promedio del fruto de Ife-Nigeria es de 2.1 g con un porcentaje de semilla y
cáscara (p/p) de 71:30 tomando en cuenta esta relación las semillas forman la mayor
proporción del fruto. El peso promedio de la semilla varía de 0.5 g en variedad Ife-
Nigeria hasta 0.86 g en Nicaragua. La relación en el porcentaje de la semilla y la
cáscara son relativamente similares 62.7:37.3 para Cabo Verde y Nicaragua, 60:40
para Ife-Nigeria y 63.5:36.5 para la semilla de México no tóxica (Papantla) (Makkar y
col., 1998).
13
2.1.4.3.2 Composición química de la semilla de Jatropha curcas L. En los Cuadro 3 y 4 se muestra la composición química de las semillas y cáscara de
Jatropha curcas L de diferentes partes del mundo. Los porcentajes relativos del
contenido de lípidos de las semillas están en un intervalo de 52 a 58% y de proteínas
en un intervalo de un 23 a 27% Las semillas provenientes de México (Morelos,
Veracruz, Papantla ) y Nicaragua presentan un contenido de proteínas similares en
comparación con los restantes orígenes (Makkar 1997;, Castil 1991), la cáscara
presenta un porcentaje mínimo de proteína que va de 4 a 6% y del contenido de, lípidos
presenta un porcentaje relativo de que va de 0.5 a 1%, sin embargo el porcentaje del
contenido de fibra fue mayor en la cáscara que va de 83% a 89% y en el grano va de
un 3 a 4% (Makkar 1997; Makkar 1998).
Cuadro 3. Composición química de las semillas de Jatropha curcas L. de diferentes partes mundo (g /100 g)
ORIGEN PROTEÍNA LÍPIDOS FIBRA CENIZAS Cabo Verde 25.6 53.5 4.7 3.4
Kenya, kitui 25.0 52.6 5.8 3.4
India,Kangra 24.1 58.4 ND 4.1
Nicaragua 25.6 56.8 3.5 3.6
Nigeria 27.8 53.9 4.1 5.0
México :
Veracruz 23.7 56.6 5.5 3.6
Papantla 27.2 58.5 3.8 4.3
Morelos 24.3 52.9 4.8 4.7
Determinaciones en base seca. ND no se determinó (Makkar 1997; Castil 1991) .
14
Cuadro 4. Composición química de las partes que constituyen a la semilla de Jatropha curcas L. de diferentes variedades
Cabo Verde Nicaragua Ife-Nigeria México no toxica
Grano Cáscara Grano Cáscara Grano Cáscara Grano Cáscara
Materia seca (%) 96.6 90.3 96.9 90.4 95.7 91.9 94.2 89.8
Proteína Cruda 22.2 4.3 25.6 4.5 27.7 5.8 27.2 4.4
Lípidos 57.8 0.7 56.8 1.4 53.9 0.8 58.5 0.5
Ceniza 3.6 6.0 3.6 6.1 5.0 4.6 4.3 2.8
Fibra cruda 3.8 83.9 3.5 85.8 4.1 86.1 3.8 89.4
Promedio en base seca Adaptado por(Makkar 1998.)
Comparando la composición química de las harinas de las diferentes procedencias
antes mencionadas de semillas de Jatropha curcas L. con la harina de soya se puede
observar en el Cuadro 5 que el contenido de proteína cruda va desde 56.1% en
variedad de Ife –Nigeria hasta un 64.4% en la variedad no tóxica de México siendo el
contenido de proteína cruda en harina desgrasada de soya menor. El contenido de
fibra cruda es de 29.4% en soya que en la harina desgrasada de semillas de Jatropha
curcas L. de diferentes variedades que va de un intervalo de 14.6 a 16.4% (Makkar
1998).
15
Cuadro 5. Composición química de las harinas de diferentes variedades de Jatropha curcas L. y de soya
Cabo Verde
Nicaragua
Ife-Nigeria
México no
tóxica
Soya
Proteína
Cruda
57.3
61.9
56.1
64.4
46.5
Lípidos 1.5 1.2 0.8 1.0 1.8
Cenizas 9.6 10.4 9.6 9.8 6.4
Fibra cruda 16.4 15.2 14.6 14.9 29.4
Hidratos de
carbono 15.1 11.3 18.9 9.9 16.7
Las harinas fueron desgrasadas antes de las determinaciones. (Makkar 1998).
% en base seca
La semilla de Jatropha curcas L. contiene cerca del 60% de aceite. El residuo que
permanece después de la extracción del aceite es una buena fuente de proteína, dentro
de está se encuentra la curcina o curcín que es una toxoalbúmina esta impide la
síntesis de proteína in vitro (Stirpe y col., 1976) es parecida a la proteína del Castor
bean (Ricinus communis ) está proteína es termolábil ya que al someterla a tratamiento
de calor pierde su efecto toxico. La presencia de antinutrientes restringe su uso en la
alimentación animal. En algunos lugares estas semillas no son comestibles ya que son consideradas tóxicas
debido a la presencia de saponinas, lectinas, fitatos, inhibidores de tripsina, pero el
principal tóxico es el éster de forbol, el cual le confiere el efecto purgante a la semilla
(Castill y col., 1991; Makkar y col., 1999).
Los ésteres de forbol (Figura 7 se muestra la estructura) en algunas variedades de
Jatropha curcas L provenientes de México están casi ausentes, lo cual ofrece la
posibilidad de incluir la semilla en productos destinados al consumo humano y animal (
Makkar y Becker, 1997).
16
Figura 7. Estructura de ester de forbol
Las saponinas son glucósidos que se distinguen por su propiedad espumante, su
estructura puede ser esteroidal o bien triterpénica. Las saponinas se encuentran
ampliamente representadas en el reino vegetal y varias plantas silvestres, en un
principio se consideraron nocivas para la salud debido a que pueden dañar a los
glóbulos rojos de la sangre, provocan trastornos nerviosos y depresión de la
funcionalidad cardiaca, algunas saponinas poseen propiedades oxitócicas y pueden
causar aborto (Roeske y col., 1975), sin embargo destaca un efecto positivo, debido a
que estas sustancias solo son absorbidas en mínimas cantidades por el intestino y
actúan especialmente en la luz del tracto gastrointestinal se les atribuye un efecto
protector de cáncer de estomago e intestinos, ejercen además un efecto inhibidor sobre
ciertos microorganismos, reducen la colesterolemia y son antiinflamatorios, tienen
influencia sobre diversos factores inmunitarios (Dwyer, 1996).
17
Los fitatos se encuentran en la capa más superficial de los cereales, leguminosas,
frutos secos y semillas oleaginosas. En la planta actúan como reservorio de fósforo.
Durante mucho tiempo se les considero una sustancia indeseable por su capacidad
para fijar minerales como el hierro, magnesio y zinc en el intestino, e impedir su
aprovechamiento por el organismo humano. Actualmente se aprecia su influencia sobre
el nivel de glucemia y su efecto positivo sobre el cáncer. Los fitatos presentes en la
alimentación (en experimentos de ratas) captan y bloquean los radicales férricos
promotores de cáncer y evitan el desarrollo de la enfermedad (Dwyer, 1996).
Las lectinas son proteínas o glicoproteínas, que se encuentran en los vegetales
principalmente en semillas de leguminosas, estas proteínas son capaces de aglutinar
células por lo que se les conoce también con el nombre de fitohemaglutininas, el cual
ha quedado exclusivamente referido para la lectina aislada del frijol Phaseolus vulgaris
(Goldstein, 1980). Actualmente se sabe que se encuentran muy extendidas y que
desempeñan una gran variedad de funciones, como por ejemplo intervienen en las
interacciones que se producen entre las células y las proteínas de la matriz intracelular,
como el colágeno, y ayudan a mantener la estructura tisular y orgánica (Mathews 1998).
El efecto antinutricional ha sido estudiado principalmente en leguminosas y se ha
podido demostrar la acción directa de las lectinas sobre la mucosa intestinal,
provocando modificación de alguna enzima como la hidrolasa o aún la inhibición de la
adherencia de algunas bacterias a la superficie de la pared provocando una mala
absorción de nutrientes (Rovanet y col., 1985).
Inhibidores de tripsina, la actividad de la enzima tripsina es inhibida por los aniones
cianuro, sulfuro, citrato, fluoruro, por metales pesados y por compuestos de fósforos
orgánicos. La albúmina de huevo, las bayas de soya, tilo, leguminosas, suero humano
contienen inhibidores de tripsina, proteínas de pequeño tamaño que se combinan
irreversiblemente con tripsina y la inactivan por bloquear el centro activo, (Tiez, 1972).
Estos factores antinutricionales se encuentran presentes en la mayoría de las semillas
de Jatropha curcas L. sin embargo las provenientes de Veracruz (México), presentaron
valores bajos en lectinas, fitatos, saponinas, inhibidores de tripsina, esteres de forbol,
después de un tostado de las semillas , lo cual conlleva a un compromiso en la
selección y multiplicación a gran escala de estas (Makkar y col. 1998).
18
2.1.4.4.3 Usos de la semilla y planta Jatropha curcas L.
Las semillas de Jatropha curcas L. identificadas como no tóxicas pueden tener un uso
potencial como fuente de proteína y aceite para el consumo humano y animal (Makkar y
col., 1998).
La planta puede ser propagada fácilmente y debido a los componentes químicos
presentes en está, no es consumida por el ganado y se mantiene como cerco viviente
en campos jardines y colonias, en Cabo Verde Nicaragua , Egipto y Malí es sembrada
para mejorar la fertilidad de la tierra y controla la erosión del suelo (Makkar y col., 1998).
En Madagascar se usa como una planta de apoyo para la vainilla; la madera y la
cáscara de la semilla se utilizan como material ardiente o combustible (Heller.1996).
El aceite de la semilla se caracteriza por tener las siguientes propiedades físicas de ser
incoloro, inodoro. La composición química del aceite de diferentes muestras de
semillas provenientes de Cabo Verde (Santiago y Fogo) Sao Tome y Principe muestra
los siguientes contenidos de ácidos grasos, ácido palmitico (C16:0) 15.38%, ácido
esteárico (C 18:0)6.24% ,Ácido Oleico (C18:1) 40.23%, ácido Linolénico (C18:2)
36.32%, dependiendo del origen de las semillas presentan contenidos altos de ácido
Oleico (C18:1) y ácido Linolénico (C18:2) (REM y Espig, 1991).
Después de la extracción del aceite, para la pasta residual se ha reportado la
composición química y calidad nutricional (Castill y col. 1991) presentando los
resultados correspondientes al contenido de aminoácidos esenciales de harina
desgrasada y en relación al patrón de la FAO/OMS la harina resulta ser deficiente en
lisina, siendo éste el aminoácido limitante, el contenido de triptofáno y azufrados son
superiores al patrón referido en el cuadro 6. Los parámetros utilizados para evaluar la
calidad de una proteína (coeficiente de digestibilidad, valor biológico o utilización neta
de proteína) a partir de experimentos con animales de laboratorio . En esta relación
biológica (Castill y col. 1991), reportan que REP (relación neta de la proteína) y UNP
(utilización neta de la proteína tuvieron valores similares a los de otras proteínas de
origen vegetal, posiblemente para el consumo humano de proteínas de Jatropha curcas
L. se podrá incrementar al eliminar algunos factores antinutricionales.
19
Recientemente estudios realizados a la curcina componente de la semilla de Jatropha
curcas L, mostraron que tiene un efecto antitumoral en ensayos con conejos, y los
mecanismos de efecto inhibitorio están relacionados en la actividad de N-glicosidasa,
(Lian y col. 2003).
También es utilizada como fertilizante o abono orgánico porque presenta un contenido
de nitrógeno similar al de la semilla Castor bean y del estiércol de pollo de 3.2% a 3.8%
(Julliet y col., 1955, Moreira; 1970; Vöhringer 1987) en 1998 la pasta residual y el
estiércol de vaca se aplicaron a cultivo de maíz como fertilizante orgánico teniendo
mejores resultados con la pasta residual de Jatropha curcas L. que con el estiércol de
vaca, actualmente se están realizando ensayos para determinar la proporción óptima
para su aplicación.
Cuadro 6. Contenido de aminoácidos esenciales de la harina de Jatropha curcas
comparadas con el patrón FAO/OMS
Aminoácidos
(g/100g)
Harina desgrasada
J. curcas Patrón FAO/OMS
Isoleucina 4.2 4.0
Leucina 7.4 7.0
Leucina 3.2a 5.5
Lisinaa 4.3 5.0
Treonina 1.2 1.0
Triptofáno 2.1 -
Metionina 1.7 -
cisteina 3.8 3.5
Total de azufrados 4.7
Fenilalanina 2.7
Tirosina 7.4 6
Total de aminoácidos 33.6 36.0
Adaptado por (Castil y col 1991)
20
a: Aminoácido limitante No todas las proteínas ingeridas en los alimentos son capaces de formar o reponer
proteínas corporales; solo lo hacen las de alto valor biológico es decir las que
contienen todos los aminoácidos esenciales, por lo cual las proteínas difieren del valor
nutritivo debido a las diferencias en la clase y cantidad de sus aminoácidos ((Vernon
1994).
En la medicina tradicional tiene múltiples usos, como té para la malaria, luxaciones,
antiséptico bucal, cicatrizante, purgante, antiinflamatorio, (Duke y Wain, 1981; Biehl y
Hecker, 1986), también el jugo de los peciolos se aplica para calmar el dolor de las
encías en niños pequeños, los indígenas Panaré de Venezuela usan la raíz aplastada y
hervida en agua para la disentería. (Muanza y col., 1995).
2.1.5 Proteínas de reserva.
Las proteínas en las semillas están constituidas principalmente por tres grandes grupos: a) Proteínas estructurales (forman parte estructural de la célula)
b) Proteínas con actividad biológica (generalmente son enzimas)
c) Proteínas de reserva o almacenamiento.
Las proteínas de reserva son las de mayor proporción, las cuales son depositadas en
cuerpos proteínicos durante el desarrollo del endospermo (Fukushima, 1991).
Su función fisiológica es la de proveer esqueletos carbonados y nitrogenados que serán
utilizados durante la germinación de la semilla. Se clasifican como proteínas de reserva
si se acumulan en cuerpos proteicos de las semillas en grandes cantidades, se
sintetizan durante el desarrollo del grano, se hidrolizan durante la germinación y el
crecimiento de la semilla y poseen altos niveles de aminoácidos ricos en nitrógeno
(Casey y Domoney, 1984). Debido a su abundancia, importancia económica y
alimentaría las proteínas de reserva fueron las primeras que se caracterizaron en las
semillas. De acuerdo a su solubilidad según Osborne (1924) en: albúminas,
globulinas, prolaminas y glutelinas.
21
Recientemente se ha propuesto una nueva clasificación para describir a las proteínas
de reserva (Fukushima, 1991), que se basa en la estructura genética, en la homología
de la estructura primaria y en la forma de acumulación dentro de la semilla. Según esta
nueva clasificación las proteínas de reserva de semilla incluyen a las prolaminas y
glutelinas (Utsumi, 1992), que se encuentran principalmente en los cereales y a las
globulinas presentes en forma mayoritaria en las leguminosas.
Estas proteínas de almacenamiento de los granos de las plantas son sintetizadas en la
membrana limítrofe de los polisomas del retículo endoplásmico rugoso (RER) como
precursores de alto peso molecular que tienen un péptido señal migratorio
vectorialmente descargado en el lumen del RER y eliminado cotraduccionalmente.
Posteriormente, en el caso de las prolaminas las proteínas resultantes son acumuladas
en el lumen del RER como proteínas insolubles y en el caso de las globulinas, estas
transportadas intracelularmente vía dictiosomas hacia las vacuolas, en donde se
acumulan como cuerpos proteínicos.
Durante el transporte los precursores polipeptídicos pueden sufrir modificaciones
postraduccionales, como son la unión de carbohidratos, deglicosilación, formación de
enlaces disulfuro o el rompimiento de ciertos enlaces peptídicos entre otros (Fukushima,
1991). Algunas características de esta clasificación se muestran en el Cuadro 7.
22
Cuadro 7. Clasificación de las proteínas de reserva con base en criterios genéticos y moleculares
GLOBULINAS PROLAMINAS
Mecanismo de
acumulación en cuerpos
proteínicos
Vacuolas Directa
Estructura genética Con intrones Sin intrones
Secuencia de amino ácidos Sin estructuras repetidas Con estructuras repetidas
Ejemplos: Globulina de arroz
Glutelina de arroz
Glicinina de soya
Conglicinina
Legumina
Vicilina
Faseolina
Globulina cebada
Prolamina de arroz
Zeina de maíz
Horneida cebada
Glutenina trigo
Gliadina trigo
Adaptado de:( Fukushima 1991).
23
2.1.5.1 Albúminas Las albúminas incluyen a las moléculas que poseen propiedades funcionales y muchas
son enzimas que metabolizan las sustancias almacenadas en la semilla, como por
ejemplo las glicosidasas y las proteasas. Estas últimas juegan un papel importante en la
degradación proteínica durante la germinación, otras proteínas juegan un papel muy
importante en la defensa de la planta como son los inhibidores de tripsina y las lectinas.
A las albúminas de tipo 2S se les ha atribuido un papel como proteína de reserva y de
proveer azufre durante la germinación. En la mayoría de las semillas de las
leguminosas las albúminas son buena fuente de lisina y de aminoácidos azufrados
principalmente la metionina (Guëguen y Cerletti, 1994).
2.1.5.2 Globulinas Dentro de las proteínas más estudiadas se tienen a las globulinas, estas se encuentran
en mayor proporción en las leguminosas y contribuyen tanto a la calidad nutricional de
los granos como a las propiedades funcionales de éstos (Argos y col., 1985).
Las globulinas constituyen el grupo de proteínas de reserva presente en mayor
proporción en la familia de las leguminosas. Pueden ser clasificadas por sus
coeficientes de sedimentación en dos grupos: las globulinas 7S o vicilinas y las
globulinas 11 S o leguminas (Derbyshire, 1976).
Contienen grandes cantidades de ácido glutámico, ácido aspártico, leucina,
aminoácidos básicos y amidas lo que concuerda plenamente con su función, ya que la
mayoría de estos tienen un alto porcentaje de nitrógeno (Cubero, 1983).
2.1.5.2.1 Globulinas 7S Vicilina (Globulina 7S).- Son proteínas triméricas deficientes en aminoácidos azufrados
con pesos moleculares de 150-190 kDa. Algunas de sus subunidades están
glicosiladas; la primera estructura tridimensional reportada de una proteína de reserva
del tipo 7S fue la de la faseolina (Lawrence y col., 1990) y posteriormente se obtuvo la
de la canavalina (Ko y col., 1993), actualmente las subunidades de la 7S de la soya y
el fríjol son las mas estudiadas (Coates y col., 1985).
24
2.1.5.2.2 Globulinas 11S Las leguminas (Globulinas 11S), son proteínas complejas que consisten de seis
subunidades, cada subunidad está compuesta por dos polipéptidos, uno de punto
isoeléctrico ácido y otro alcalino, estos dos polipéptidos están unidos mediante un
enlace disulfuro. Comúnmente son oligómeros hexaméricos, con enlaces no
covalentes su peso molecular va de 50 a 60 kDa dependiendo de la fuente botánica
(Plietz y col., 1987), contienen puentes disulfuro (Gueguen y Azanza 1985; Fukushima
1991), son deficientes en aminoácidos azufrados no están glicosiladas excepto las de
Lupinus (Duranti y col., 1996). Entre las globulinas 11S la legumina del chícharo y la
glicinina de soya son las más conocidas.
Las estructuras moleculares de las globulinas 11S han sido estudiadas mediante
microscopia electrónica y se han propuesto algunos modelos para la glicinina (Badley y
col., 1975, I´Anson y col., 1987), heliantinina, cruciferina (Plietz y col., 1983), legumina
de Canavalia ensiformis (Plietz y col., 1987), legumina de chícharo y α-globulina de
Sesanum indicum (Plietz y col., 1986).
2.1.5.3 Prolaminas
Las prolaminas constituyen la fracción proteínica principal en cereales como maíz y
trigo, son conocidas por su solubilidad en mezclas alcohol-agua y por sus altos niveles
de prolina y glutamina; sin embargo, la comparación de sus secuencias de aminoácidos
han mostrado que ésta definición debe ser ampliada para incluir a las proteínas que son
insolubles en soluciones alcohólicas en el estado nativo, debido a la presencia de
enlaces disulfuro ínter cadena. Por otro lado se ha conocido que las prolaminas, aún las
que son insolubles en soluciones alcohólicas, están relacionadas por su estructura y
constituyen una superfamilia de la cual esta excluida la α del maíz (Shewry, 1995).
Los análisis electroforéticos ya sea en forma nativa o después de la reducción de los
enlaces disulfuro, muestran que la fracción de prolamina es una mezcla compleja de
polipéptidos de aproximadamente 50 componentes, existiendo una extensa variación
entre el número y propiedades electroforéticas de ellos (Shewry y col., 1985).
25
2.1.5.4 Glutelinas
Las gluteninas, más estudiadas son las aisladas del trigo, las cuales tienen un
intervalo de peso molecular de unos cientos de miles de kDa (Huang y Khan, 1997).
Estas glutelinas son agregados insolubles en alcohol, en las que muchas subunidades
con pesos moleculares de 95 a 145 kDa, son estabilizadas por enlaces disulfuro; sin
embargo estas glutelinas son esencialmente un grupo de prolaminas, ya que cuando
son disociadas, las unidades se vuelven solubles en alcohol (Fukushima, 1991).
2.1.5.5 Clasificación y Fraccionamiento de proteínas de reserva. Las proteínas tienen diversas funciones en la naturaleza, si bien no existe un sistema
universal, las proteínas pueden clasificarse en base a su composición, solubilidad y
función biológica o estructura tridimensional.
De acuerdo a su composición se les puede dividir en proteínas simples, que son
aquellas que por hidrólisis sólo producen aminoácidos y en proteínas conjugadas, si es
que éstas contienen un grupo no proteico unido a la cadena polipeptídica. Dentro de las
proteínas conjugadas se encuentran metaloproteínas, glucoproteínas, fosfoproteínas,
lipoproteínas y la nucleoproteínas, que reciben el nombre por la naturaleza del grupo no
proteico que poseen (Braverman, 1980; Franks, 1988).
Por su forma se pueden dividir en globulares y fibrosas; estas últimas forman las fibras
de tejido conectivo, además son las proteínas de ligamentos y tendones, entre otras
(Braverman, 1980).
Las proteínas en las semillas están constituidas principalmente por tres grandes grupos:
a) Proteínas estructurales (forman parte estructural de la célula)
b) Proteínas con actividad biológica (generalmente son enzimas)
c) Proteínas de reserva o almacenamiento.
Las proteínas de reserva o almacenamiento, de acuerdo con su solubilidad, por el
método más conocido es el de Osborne (1924). Se dividen en: Albúminas solubles en
agua y en soluciones salinas diluidas; precipitan en soluciones de sulfato de amonio a
una concentración cercana a la saturación. Globulinas, generalmente insolubles en
26
agua pero solubles en soluciones salinas diluidas. Prolaminas, estas proteínas son
solubles en etanol 50-80%. Glutelinas, se caracterizan por ser solubles en medio
ácido o alcalino. Por otra parte, existen algunos puntos clave a considerar en el proceso
de fraccionamiento los cuales son:
a). En función de las condiciones de extracción, algunas proteínas estarán presentes
en la fracción de globulinas, en la de glutelinas o ambas.
b). Independientemente de las condiciones de extracción, otras proteínas pueden estar
presentes en sólo una de las fracciones.
c). La extracción con alcohol (1-propanol 50%) y un agente reductor, después de la
extracción de las globulinas, produce una fracción (que contiene proteínas relacionadas
con su localización, función y características químicas, incluyendo su solubilidad) como
subunidades reducidas.
d). Es primordial establecer las condiciones óptimas para la extracción de las fracciones
proteínicas para cada tipo de tejido, con monitoreo, por la contaminación cruzada que
pueda ocurrir, por electroforesis y análisis de aminoácidos .
Otros autores, como Landry y Moreaux (citado por Wilson, 1994), desarrollaron un
método de separación por su solubilidad empleando isopropanol así como dodecil
sulfato de sodio (SDS) y 2-mercaptoetanol y aplicándolo al grano de maíz separaron las
fracciones en LMI, LMII, LMIII, LMIV y LMV. En el cuadro 8 se puede observar la
comparación de estas fracciones con las de Osborne. Estos autores sugieren que las
fracciones se agrupen solamente en dos tipos de proteínas básicas, de naturaleza
esencialmente metabólica (proteínas solubles en sal, glutelina G3 y proteína residual) y
proteínas específicas del endospermo (zeína y glutelinas G1 y G2).(Shwery y Miflin,
1985)
27
Cuadro 8. Comparación de la distribución de fracciones
Proteínicas en el grano de maíz según Osborne.
FRACCIONES DISOLVENTES L y M
Albúminas
Globulinas I. 0.5M NaCl
prolaminas
Zeína I II. Isopropanol 55%
Zeína II (G1) III. Como II + Me 0.6%
Glutelinas totales
Glutelina 2 (G2) IV. regulador pH 10 + 0.6 Me
Glutelina 3 (G3) V. Como IV + 0.5% SDS
Adaptado por (Wilson ,1994). Me: 2 mercaptoetanol. SDS: dodecilsulfato de sodio Por lo que se refiere al reino vegetal. Las fracciones más importantes en el caso de las
leguminosas son las albúminas y las globulinas, mientras que para el caso de los
cereales las prolaminas y las glutelinas.
Este procedimiento general de fraccionamiento de las proteínas presenta una serie de
factores que afectan la extracción de las fracciones (Pernollet y Mossé, 1983; Shewry y
Miflin, 1985), como son: El tamaño de partícula de la harina, la fuerza de agitación, la
relación harina disolvente y el número de extracciones por etapa.
Dentro de la función biológica están las proteínas de reserva que se encuentran
principalmente en plantas con semilla, y sirven como deposito de energía nutricional y
de aminoácidos.
28
3. JUSTIFICACIÓN La caracterización bioquímica de las proteínas de reserva permite investigar fuentes
alternativas de otras especies, que posiblemente tengan un buen balance nutricional y
puedan ser utilizadas para la conservación, mejora y promoción de estos cultivos.
Jatropha curcas L. es originaria de México y sus semillas son consideradas como una
alternativa para proveer proteínas vegetales ya que contienen un 20-25% de proteína,
valor que se incrementa en la harina desgrasada hasta un 60%, y aunque presenta un
buen perfil de aminoácidos esenciales, no son aprovechados en su totalidad debido a
que no existe una cultura de consumo. Esto significa, que esta semilla representa una
materia prima potencial que puede ser usada en el desarrollo de tecnología para su
aprovechamiento como proteínas vegetales u otros nutrimentos. Esto aunado a la
demanda de alimentos e ingredientes obliga a fijar la atención en la caracterización de
las proteínas de esta fuente.
29
4. HIPÓTESIS
Las proteínas de reserva de la semilla de Jatropha curcas L. Podrían tener
características comunes con las de cereales o leguminosas y bien de algunas semillas
oleaginosas.
5. OBJETIVOS.
5.1 OBJETIVO GENERAL “Aislar y realizar la Caracterización Bioquímica de las fracciones proteicas de la semilla
de Jatropha curcas L.”.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Obtener las fracciones proteicas de la semilla de J. curcas con base en el criterio
de solubilidad en diferentes disolventes.
Comparar el rendimiento de extracción de las diferentes fracciones protéicas
obtenidas por los métodos de Osborne y de Osborne modificado.
Caracterizar bioquímicamente cada una de estas fracciones protéicas.
Determinar la posible homología estructural de las globulinas de Jatropha curcas
L. con globulinas de L. campestris.
30
6. MATERIALES
6.1 Material biológico
6.1.2 Semillas Las semillas de Jatropha curcas fueron colectadas en el mes de Agosto del 2001, en el
campo experimental del CEPROBI-IPN. Ubicado en Yautepec Morelos.
6.1.3 Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos anti 7S de semillas de L. campestris y anti γ-conglutina de L.
campestris fueron proporcionados por las Dra. Alma L. Martínez Ayala y Dra. Gloria
Dávila Ortiz, respectivamente.
6.1.4. Reactivos Todos los reactivos utilizados en el presente trabajo fueron grado analítico.
6.1.5 Metodología El presente trabajo se realizó en tres etapas:
Primera etapa: Aislamiento de las fracciones protéicas presentes en la semilla de
Jatropha curcas L. utilizando el método de Osborne (1924) (Figura 8) y un método
modificado de Osborne reportado por Ferreira y col. (2000) (Figura 10).
Segunda etapa: Caracterización bioquímica de las diferentes fracciones obtenidas por
ambos métodos.
Tercera etapa: Fraccionamiento y caracterización de las globulinas.
En la Figura 8 se muestra la estrategia experimental utilizada en el presente trabajo.
31
Figu
Colecta de frutos de Jatropha curcas
Separación de la semilla
Obtención de harinas
Colecta de frutos de Jatropha curcas
Separación de la semilla
Obtención de harinas
3
1ª Etapa
2ª Etapa
ra 8. Estrategia experimental para el fraccionamiento y caracterización bioquímica y molecular de las proteínas de reserva de Jatropha curcas L
Fraccionamiento de Proteínas
Albúminas Globulinas Prolaminas Glutelinas
Fraccionamiento
Caracterización
Fraccionamiento de Proteínas
Albúminas Globulinas Prolaminas Glutelinas
Fraccionamiento
Caracterización
ª Etapa
32
6.2. Materia Prima Los Frutos de Jatropha curcas fueron colectados de manera manual de los arbustos
que se encuentran en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi-IPN), el
cuál se ubica en el Kilómetro 8 de la carretera de Yautepec–Jojutla en el Estado de
Morelos. Cada fruto contenía tres semillas.
Las semillas de Jatropha curcas L. fueron secadas al sol y se les eliminó la testa
manualmente (Figura 9), posteriormente se trituraron en un mortero y fueron
desgrasadas parcialmente con hexano en una proporción 1:3 (P/V). Los fragmentos se
molieron hasta obtener la harina esta se tamiza en una malla del # 80. La harina
obtenida se desgrasó nuevamente con hexano en una proporción 1:3 (P/V) con
agitación continua durante un periodo de 12-24 h a 4 ºC. Una vez transcurrido este
tiempo se eliminó el exceso de disolvente por decantación y la harina se colocó sobre
papel absorbente para evaporar el resto del solvente, este procedimiento se llevó a
cabo dos veces para eliminar el máximo contenido de grasa.
Figura 9 . Semillas de Jatropha curcas con y sin testa
2° Etapa
33
6.2.1 Caracterización física de las semillas de J. curcas
6.2.2.1 Peso de 100 semillas
Se determinó el peso de 100 semillas seleccionadas al azar efectuando tres
repeticiones. (Makkar y col. 1998)
6.2.2.2 Determinación del tamaño de las semillas
Se determinó la longitud, ancho y grosor utilizando un calibrador tipo Vernier analógico ,
de 10 semillas seleccionadas al azar.
6.2.3 Análisis químico proximal de la semilla de Jatropha curcas
El análisis químico proximal se realizó en las semillas de Jatropha curcas siguiendo las
técnicas propuestas por la AOAC (1990).
a) La humedad (método 925.10) se determinó midiendo la pérdida en peso de 2 g
de muestra después de colocarla a 80±1ºC por un tiempo de 90 min una
termobalanza (marca Ohaus modelo MB 200 NJ, USA).
b) Para la determinación de nitrógeno total (método 979.09) se utilizó el método
de MicroKjeldahl (marca Labconco Mod.23080 Kansas City USA), con un factor de
conversión de 6.25.
c) El contenido de grasa (método 939.05) se evaluó utilizando un sistema de
extracción Soxhlet a partir de 3 g de muestra empleando hexano como
disolvente.
d) Las cenizas (método 923.03), se determinaron utilizando la pérdida en peso de
3 g de muestra, la cual fue incinerada a 600 ºC durante 3 h en una mufla (marca
Thermolyne, modelo Furnace 1400, IOWA, USA.
e) Fibra (método 962.029), este método cuantifica las sustancias de la muestra
libre de humedad y grasas resistentes a la digestión ácida y alcalina.
f) Los carbohidratos. Fueron determinados por diferencia.
34
6.2.4 Obtención de las fracciones proteicas de la semilla de Jatropha curcas utilizando el método de Osborne (1924)
La harina libre de grasa fue utilizada para la separación las fracciones con base al
criterio de solubilidad (Osborne 1924). La fracción de albúminas fue extraída con agua
en una proporción de 1:10 (p/v) con agitación constante por 2h a 4°C. La suspensión se
centrifugo a 10,000 g durante 30 min y el sobrenadante conteniendo la fracción de
albúminas fue almacenado a 4°C hasta su utilización. Para la extracción de globulinas
el precipitado se resuspendió en una solución de NaCl al 10% pH 7.0 y se mantuvo en
agitación continua 2h a 4°C. La suspensión fue centrifugada y las globulinas presentes
en el sobrenadante fueron almacenadas. La pastilla se resuspendió en isopropanol al
70% y la suspensión se agito durante 2 h 4°C, se centrifugó y el sobrenadante
correspondió a la fracción de las prolaminas. Finalmente la fracción glutelinas fue
extraída resuspendiendo la pastilla en NaOH 0.1M. Las fracciones se guardaron a -4°C
hasta utilizarlas.
6.2.5. Método modificado de Osborne
Se han realizado diversas modificaciones y adaptaciones al método de fraccionamiento
de Osborne para el aislamiento y estudio de las fracciones proteicas, utilizando agentes
extractantes modificados con la finalidad de que las fracciones de albúminas no
interfieran en las globulinas y las prolaminas no interfieran en la obtención de glutelinas,
con este propósito en este trabajo se utilizó un método modificado de Osborne
reportado por Ferreira y col. (2000) (Figura 10). Se ha reportado que la presencia de
CaCl2 y MgCl2 durante la extracción de albúminas y de EDTA y EGTA durante la
extracción de globulinas, incrementa la eficiencia de extracción de estas proteínas y
evita la contaminación cruzada.
35
Harina:Agua 1: 30 pH 8 10 mM CaCl2 10 mM MgCl2
Agitación 4 h a 4°C
Centrifugar 10,000 g /1h a 4°C
sobrenadante
Albúminas
Precipitado resuspender en: Tris-HCl 10 mM pH 7.5
NaCl 10% (P/V) EDTA 10mM EGTA 10mM
Agitar 4 h a 4°C Centrifugar 10,000 g/1h a 4°C
Sobrenadante
Globulinas
Precipitado resuspender en: etanol 75% (V/V)
Agitar una noche a 4°C
Centrifugar 10,000 g/1 h a 4°C
Precipitado resuspender en: Borato de sodio 50 mM pH10 β-mercaptoetanol 1% (V/V) SDS 1% (5ml/g peso seco)
Agitar 4 h a 20°C
Centrifugar 10,000g/1h
Figura. 10 Diagrama de Flujo del método de Osborne Modificado por Ferreira y Col. 2000
Sobrenadante
Glutelinas
Sobrenadante Prolaminas
36
6.2.6 Caracterización bioquímica de las fracciones proteicas de la semilla de Jatropha curcas L. 6.2.6.1 Electroforesis Se utilizó electroforesis en geles de poliacrilamida: nativa, desnaturalizante (SDS-
PAGE), en ausencia y presencia de β-mercaptoetanol (ME) y enfoque isoeléctrico (IEF).
Los diferentes tipos de electroforesis fueron realizados en una minicámara de
electroforesis vertical (Mini-Protean II electrophoresis cell, Bio-Rad, CA) y los geles
fueron teñidos utilizando Azul de Coomassie R-250.
6.2.6.1.1 Electroforesis nativa (ND-PAGE) La electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes,
Fundamento de la técnica; en un sistema no disociante, las condiciones están
encaminadas a fraccionar una mezcla de proteínas conservando la interacción de
subunidades, la conformación nativa y la actividad biológica. En tal caso, la separación
de las proteínas sucede en base a su tamaño y a su carga y por tanto el pH del sistema
es una condición clave. Cambios en el pH pueden alterar la carga neta de un
componente de una proteína y con ello su movilidad electroforética y grado de
separación.
Para la electroforesis nativa se utilizaron geles de poliacrilamida al 8%, de acuerdo a la
metodología de Laemmli (1970) sin dodecil sulfato de sodio (SDS). El gel nativo fue
cargado con 15 µg de proteína por carril. Se utilizaron las soluciones siguientes:
a) Solución (Stock acrilamida) 100 ml
Para 100 ml se mezclaron 30 g de acrilamida y 0.8 g de bis-acrilamida.
Se almacenó en refrigeración en frasco ámbar.
b) Solución B (4X) 100 ml
Se pesaron 18.2 g Tris 1.5 M y se le añadieron 40 ml de agua, se aforó a
100 ml y ajustó pH 8.8.
37
c) Solución C (4X) 100 ml
Para 100 ml se pesaron 6.0 g de Tris 0.5 M y 40 ml de agua destilada
finalmente se ajustó a pH 6.8.
d) Persulfato de amonio al 10 % (10 ml)
Se pesó 1 g de persulfato y se aforó en 10 ml de agua. Esta solución se
mantuvo en refrigeración.
e) Regulador de Muestra
Se mezclaron 3.1 ml de Tris 1 M pH 6.8, 5.0 ml glicerol al 50 %, 0.5 ml
azul de bromofenol 1 % y 1.4 ml de H2O.
Cuadro 9. Preparación del gel al 8 % para electroforesis en condiciones nativas
SOLUCIONES SEPARADOR
ml
CONCENTRADOR
ml
A 2.66 0.67
B 2.5 -
C - 1.0
H2O 4.84 2.3
P.A. 50 µl 30 µl
TEMED 10 µl 10 µl
Adaptado de (Laemmli 1970).
Se preparó primero el gel separador, se le agregó un poco de agua para alinear el gel y
observar la polimerización del mismo, posteriormente se eliminó el agua y finalmente se
le agregó el gel concentrador. El gel se corrió a 20 mA.
38
6.2.6.3 Electroforesis desnaturalizante (SDS PAGE) Fundamento de la técnica; el empleo de un sistema diseñado para disociar a todas las
proteínas es útil para estudiar la complejidad y el peso molecular de los polipéptidos
que constituyen una muestra. Los reactivos disociantes más comúnmente utilizados son
el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) y la urea. Otros agentes reductores tales
como el 2-mercaptoetanol o el ditiotreitol (DDT) pueden ser usados para romper los
enlaces disulfuro.
Las electroforesis SDS-PAGE y SDS-PAGE-ME fueron realizadas de acuerdo con el
método de Shagger y von Jagow (1987), cuadro 10. Para calcular los pesos
moleculares de las proteínas se utilizó un paquete de calibración de estándares
preteñidos (Bio-Rad, CA) que contiene: fosforilasa b (97.4 kDa), albúmina de suero
bovino (BSA) (66 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (31 kDa), inhibidor
de tripsina de soya (20.1kDa) y lisozima (14.4 kDa).
Cuadro 10. Preparación de los geles de acrilamida al 10 y 13 %, para electroforesis desnaturalizante (reductora y no reductora)
SEPARADOR 10% 13% CONCENTRADOR Acri-Bis 2.0 ml 3.0 ml 0.7 ml
Reg-Gel 3.3 ml 3.3 ml 1.55 ml
Glicerol 1.3 g 1.3 ml -
H2O 3.3 ml 2.3 ml 4.0 ml
P.A. 50 µl 50 µl 32 µl
TEMED 10 µl 10 µl 10 µl
Adaptado de:(Shagger y von Jagow,1987)
6.2.6.4 Enfoque Isoeléctrico (IEF) Enfoque Isoeléctrico es una técnica usada para la caracterización de proteinas, basada
en mantener una corriente eléctrica directa a través de un sistema de electrolitos de tal
forma que el pH se incremente en forma gradual del ánodo al cátodo.
El gradiente natural y estable es formado por anfolinas, nombre dado a una mezcla de
anfolitos que son sustancias del tipo de ácidos poliamido-policarboxilo. Todas estas
39
sustancias tienen pequeñas diferencias en pI (punto isioeléctrico) distribuidas en el
gradiente de pH.
El enfoque isoeléctrico nativo fue efectuado de acuerdo con el método de Bollag y
Edelstein (1991). Los geles de poliacrilamida al 5% (2% p/v de anfolinas pH 3-10,
1% de glicerol) fueron preenfocados durante 10 min a 100 V, posteriormente se
enfocaron 10 µg de proteína durante 15 min a 150 V, 15 min a 200 V y 15 min a 300
V. Para calcular los puntos isoeléctricos se utilizó el paquete de estándares de pI 9.6
– 4.75 “IEF Standards” de Bio Rad (CA, USA).
6.2.6.5 Digestibilidad Aparente
La digestibilidad es una variable de primera importancia para la determinación de la
calidad proteínica, ya que da la medida en la cual se digieren las proteínas, así como la
absorción de los aminoácidos, lo cual constituye una parte integral del valor nutritivo.
La digestibilidad aparente se determino de acuerdo al método de Hsu y col., (1997), es
un método multienzimatico para estimar la digestibilidad de la proteína con alta
sensibilidad que se basa en el cambio de pH que se presenta después de que la
muestra es sometida a la acción de las enzimas (tripsina pancreática de porcino tipo IX,
quimotripsina pancreática de bovino tipo II y peptidasa intestinal de porcino tipo III.
Cálculos:
Y = 210.264 – 18.103 X
Donde: X = pH de la suspensión proteica después de la digestión con la solución
multienzimática
40
6.2.7 Fraccionamiento y caracterización bioquímica de las globulinas de la semilla de Jatropha curcas L Como una primera estrategia en el estudio de las proteínas de la semilla de Jatropha
curcas L, en este trabajo las globulinas aisladas fueron fraccionadas por cromatografía
de filtración en gel y caracterizadas bioquimicamente.
6.2.7.1 Cromatografía por filtración en gel La cromatografía es una técnica de separación selectiva de moléculas, en la que los
componentes de una mezcla compleja pueden ser identificados y/o purificados. Esta
técnica permite la separación de moléculas de acuerdo a su tamaño molecular.
Las globulinas totales fueron aplicadas en una columna de Sephacryl S-300, con
límite de corte 5000 – 350 000 (Pharmacia Biotechnology, Suecia), de 1 m de altura
con un diámetro interno de 1.5 cm; empleando un sistema de cromatografía de líquidos
de baja resolución (econosystem) con un flujo de 0.2 ml/min usando como regulador de
elución una solución de fosfato 0.15 M pH 7. El eluyente se colectó en 80 fracciones de
2 ml por tubo, las fracciones fueron monitoreadas para la detección de proteína
mediante absorbancia a 280 nm.
6.2.7.2 Electroforesis Las globulinas de la semilla de Jatropha curcas L. fueron sometidas a electroforesis
para determinar sus características bioquímicas utilizando los métodos descritos
anteriormente.
6.2.7.3 Ultracentrifugación El coeficiente de sedimentación de las globulinas fue determinado por
ultracentrifugación utilizando una ultracentrifuga Beckman XL y un rotor SW 40 Ti
(Beckman Instruments, Inc., Fullerton CA). La separación de las proteínas se realizó
usando gradientes de sacarosa de 5 – 20 % establecidos en solución amortiguadora y
centrifugando a 218 000 g durante 21 h a 20 ºC. Se colectaron fracciones de 0.5 ml y la
41
detección de las proteínas se llevó a cabo con un detector UV a 280 nm (Gueguen y
Barbot, 1988). Para la calibración de los gradientes se utilizaron como proteínas de
referencia: catalasa (11S), g globulina (7.9S), albúmina de suero bovino (4.4S) y
lisozima (1.9S).
6.2.7.4 Inmunodetección Para determinar la posible homología estructural de las globulinas de la semilla de J.
curcas con globulinas de otras semillas se utilizaron anticuerpos contra las globulinas
7S y γ-conglutina de L. campestris.
La inmunodetección se realizó de acuerdo con la metodología propuesta por Dumbroff
y Gepstein (1993). Como se distingue a continuación:
a) Transferencia a membranas de nitrocelulosa Las proteínas a analizar fueron separadas en geles de poliacrilamida. Una vez
terminada la corrida de electroforesis los geles se preequilibraron con la solución de
transferencia, Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20% y se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa. La transferencia se llevó a cabo a 250 mA por 1h a 4 ºC y
una vez terminada, la membrana se lavó con la solución de Tris-HCl 20 mM pH 8.5,
NaCl 140 mM, tween 20 0.05%.
b) Bloqueo y enlace de anticuerpos La membrana se bloqueó con la solución de lavado conteniendo 5% de leche
descremada en polvo y 0.5% de albúmina de suero bovino. Después del bloqueo se
lavó y se añadió el anticuerpo contra la globulina de lupino y se incubó 1 h en
agitación constante. La membrana se lavó y posteriormente se añadió el segundo
anticuerpo anti-conejo, conjugado con fosfatasa alcalina.
42
c) Detección de anticuerpos La membrana se reveló con los sustratos BCIP (sal de 5-bromo-4-cloro-3-endolilfosfato-
toluidina) y NBT (cloruro de p-nitroacultetrazolio). Los sustratos se añadieron en el
amortiguador de la fosfatasa, Tris 100 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, de acuerdo a
las instrucciones del provedor (GIBCO-BRL). Se agitaron suavemente hasta la aparición
de bandas color púrpura.
43
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Caracterización física de las semillas de Jatropha curcas
El fruto es una drupa de forma oval de 4 – 5 cm de largo y de 3 – 4 cm de ancho. Cada
fruto contiene tres semillas ovoides con testa color negro y la almendra color crema. Las
semillas mostraron las siguientes características físicas: 100 semillas pesaron 47.8 g ±
0.9 g. Cada semilla peso alrededor de 0.48 ± 0.05 g y tuvo las dimensiones siguientes:
12 ± 1 mm de largo, 3 ± 0.5 mm de grosor y 4 ± 1 mm de ancho. El 60 % del peso lo
constituyo la almendra y 40 % esta representado por la cáscara (Figura 11). Las
características físicas de las semillas utilizadas en el presente trabajo están dentro del
intervalo de los valores reportados para las semillas provenientes de otras regiones, en
México (Vercruz, Quintana Roo y Yucatán) (0.53 - 0.83 g) y en otros países (Cabo
Verde, Nigeria y Nicaragua) (0.49 – 0.86 g) (Makkar y col., 1998; Aderibigbe y col.,
1997).
7.2 CEn e
desg
cont
acon
m
4 ±
12± 1 mm de largo
3 ± 0.5 m grosor
A. B
Figura 11. Semilla de Jatropha curcas L. del estado de Morelos A) con testa B) sin testa
omposición proximal de la harina de J. curcas l Cuadro 11 se presenta el análisis químico proximal de la harina sin desgrasar y
rasada de la semilla de J. curcas. Se encontró en la harina sin desgrasar un
enido de proteína de 24. 3 ± 0.05 % y de grasa de 52.9 ± 0.1 %, en el
dicionamiento de la harina para la extracción de proteínas se eliminó la grasa
1 mm de ancho.
44
mediante extracciones en frió con hexano; se puede observar en la harina desgrasada
un incremento en el contenido de proteína de 24.3 ± 0.05 % a 45.3 ± 0.1 % y la
consecuente disminución del nivel de grasa a 2.9 ± 0.05 %. Los niveles de cenizas, fibra
y carbohidratos también se incrementaron al eliminar la grasa. Los resultados obtenidos
de la composición química de las semillas de Jatropha curcas L. en este trabajo son
similares a los reportados para proteína y grasa por otros autores, de Morelos 27.5 % y
49.6 % (Castil y col., 1991), de Veracruz 26.1 – 29.7 % y 55.3 – 62.2 % (Makkar y col.,
1998) y de Nigeria 27.7 % y 53.8 % (Makkar y col., 1998).
La harina de la semilla de Jatropha curcas L. tiene un contenido de proteína superior al
de los cereales (7-13 %) y dentro del intervalo de valores reportado para las semillas de
leguminosas (22 – 30 %). Por otra parte el contenido de aceite en la semilla de Jatropha
curcas L. es superior al reportado para las semillas de soya (18 – 20 %), Lupino (15 –
20 %), cacahuate (50 %) y girasol (40%) (Vioque y col., 1999).
Cuadro 11. Composición química de la harina sin desgrasar y desgrasada de semillas Jatropha curcas L. del Estado de Morelos
COMPONENTE HARINA SIN DESGRASAR DESGRASADA
PROTEINA 24.3 ± 0.05 45.3 ± 0.1
GRASA 52.9 ± 0.1 2.9 ± 0.05
CENIZAS 4.7 ± 0.05 8.6 ± 0.04
FIBRA 4.8 ± 0.05 8.1 ± 0.07
CARBOHIDRATOS* 13.3 35.0
En base seca Promedio de tres repeticiones * Por diferencia
45
7.3 Fraccionamiento de las proteínas Las proteínas presentes en las semillas de J. curcas se fraccionaron con base en su
solubilidad en cuatro diferentes fracciones una soluble en agua (albúminas), una soluble
en sal (globulinas) una soluble en alcohol (prolaminas) y una soluble en álcali
(glutelinas). Esta clasificación de las proteínas ha sido de gran controversia en los
últimos años, lo cual ha sido discutido ampliamente en la literatura (Franco y col., 1997;
Ferreira y col., 2000) y se ha propuesto otra clasificación para estas proteínas basada
en la estructura genética, homologías de la estructura primaria y la forma de
acumulación en la semilla. Según esta nueva clasificación las proteínas de reserva de
semillas incluyen a las albúminas, las prolaminas y las globulinas, dentro de este
esquema las glutelinas quedan agrupadas dentro de las globulinas (Fukushima, 1991).
Sin embargo, el sistema basado en el criterio de solubilidad y con algunas
modificaciones resulta conveniente para iniciar la caracterización de las proteínas de
reserva de semillas de cualquier especie que no haya sido estudiada (Sood y col.,
1995), no sólo para comparación sino también como paso inicial de purificación.
En el Cuadro 12 se observa la composición de las proteínas de reserva en la semilla de
Jatropha curcas L. obtenidas por los métodos de Osborne y Osborne modificado, en
donde, las fracciones mayoritarias fueron globulinas y glutelinas, seguida por las de
albúminas y prolaminas. Cabe destacar que el rendimiento de globulinas en el método
de Osborne modificado es mayor, se ha reportado para otras semillas que la presencia
de EDTA y EGTA en la extracción de estas proteínas incrementa el rendimiento en esta
fracción debido a que se permite mayor estabilidad a las moléculas (Ferreira y col.,
2000).
Si se considera que las glutelinas están incluidas en la fracción de globulinas de
acuerdo al criterio de Fukushima (1991), la composición de las proteínas de reserva de
semillas de Jatropha curcas L. (globulinas 42.2 % y glutelinas 32.6 %) podría
compararse con la composición de las proteínas de reserva de leguminosas como fríjol,
lupino, chíncharo, soya, en las cuales la principal fracción proteica corresponde a las
globulinas (70 – 90%), mientras que en los cereales como el maíz, trigo y cebada las
principales fracciones proteicas corresponden a prolaminas (40 – 55 %) y glutelinas (23
– 46 %) (Shewry, 1999).
46
Cuadro 12. Composición de las proteínas de reserva de semilla de Jatropha curcas L. obtenidas por los métodos
de Osborne y Osborne modificado*
Fracción Osborne Osborne modificado Albúminas 15.1 11.8 Globulinas 20.1 42.2 Prolaminas 6.4 3.6 Glutelinas 37.8 32.6 Residuo 20.6 9.8
• % de cada fracción con relación al contenido total de proteína en la
• harina Promedio de cuatro determinaciones
7.4 Caracterización de las proteínas de reserva de semillas de Jatropha curcas L.
7.4.1 Número de subunidades y peso molecular
Las albúminas representan el 15.1 – 11.8 % de las proteínas presentes en la semilla de
Jatropha curcas L. se observó para esta fracción de proteínas en condiciones nativas
un patrón complejo de subunidades con un componente mayoritario de 430 kDa (Figura
12). En condiciones desnaturalizantes mostró cadenas polipeptídicas en un intervalo
amplio de pesos moleculares (70 - < 10 kDa) mientras que en condiciones
desnaturalizantes reductoras se observaron 5 componentes principales con peso
molecular menor a los 30 kDa. Las albúminas constituyen principalmente las proteínas
metabólicas de las semillas, varias albúminas tienen funciones fisiológicas, tales como
actividades enzimáticas de lipoxigenasa, glicosidasa o proteasa involucradas en la
degradación de las proteínas de almacenamiento y la germinación. Otras albúminas,
tales como los inhibidores de proteasas o las lectinas están implicadas en los
mecanismos de defensa de la planta contra ataques de plagas (Vioque y col., 1999).
Las albúminas son buena fuente de lisina y aminoácidos azufrados (Shewry y Casey,
1999), la presencia de aminoácidos azufrados en estas proteínas da lugar a la
formación de agregados de alto peso molecular los cuales después de reducción con
mercaptoetanol son resueltos en cadenas polipeptídicas de bajo peso molecular.
47
Las albúminas con una función de almacenamiento son encontradas en muchas plantas
dicotiledóneas y están compuestas de polipéptidos de bajo peso molecular (alrededor
de 12 kDa) con enlaces disulfuro y un coeficiente de sedimentación de 2. Las semillas
de diversas especies de plantas incluyendo la nuez de Brasil, algodón, girasol, lupino y
amaranto contienen albúminas 2S (Radovic y col., 1999).
En la semilla de Jatropha curcas L. se ha reportado la presencia de curcina una
proteína presente en la fracción de albúminas con peso molecular de alrededor de 28
kDa a la cual se le ha atribuido actividad de lectina y ha sido probada su actividad anti
tumoral (Felke, 1914 y Lin y col., 2003).
Las globulinas de leguminosas han sido muy estudiadas debido a su abundancia en
esta familia de plantas y a sus propiedades nutricionales y funcionales. En la semilla de
Jatropha curcas L. las globulinas constituyen del 20.1 - 42.2 % y presentaron en
condiciones nativas (Figura 12) un componente principal de 440 kDa, en condiciones
desnaturalizantes (Figura13A) se observan bandas con pesos moleculares entre 80 - <
20 kDa y bajo condiciones reductoras (Figura 13B) se observaron nueve bandas
principales: siete entre 30 a 66 kDa y dos menores de 20 kDa. Las diferentes
subunidades y sus pesos moleculares mostrados en los patrones electroforéticos para
las globulinas de la semilla de Jatropha curcas sugieren que esta fracción en particular
podría tener alguna relación estructural con las globulinas de leguminosas.
Las globulinas se han clasificado por su coeficiente de sedimentación en dos grupos:
globulinas 7S o vicilinas y globulinas 11S o leguminas y globulinas (Cegrí y Pandya
1999). Las globulinas 7S presentan tres subunidades iguales o diferentes de 50 a 70
kDa, como la globulina 7S de L. campestris la cual esta constituida por tres
subunidades con pesos moleculares de 50, 53 y 60 kDa, la canavalina (proteína 7S de
Canavalia ensiformis) presenta tres subunidades de 50 kDa y en el caso de las
globulinas de Jatropha curcas L. las bandas de 50 – 60 kDa presentes en el patrón
electroforético en condiciones reductoras podrían corresponder a las proteínas 7S. Las
globulinas 11S de las semillas de leguminosas son hexámeros con pesos moleculares
de 300 – 400 kDa y subunidades de 50 – 60 kDa. La estructura básica de cada
subunidad es un dímero constituido por dos cadenas polipeptídicas entre 20 – 40 kDa
unidas por un enlace disulfuro. En el patrón electroforético (Figura 13B carril 2)
48
correspondiente a la fracción de globulinas se observan bandas que podrían estar
relacionadas con esta fracción.
Las prolaminas y glutelinas son proteínas de reserva restringidas a las semillas de una
familia de plantas, Gramineae, la cual incluye a los cereales, en semilla de Jatropha
curcas L. Las prolaminas fueron la fracción minoritaria constituyendo 6.4 – 3.6 % de las
proteínas totales, presentaron en condiciones nativas un componente de 430 kDa, en
condiciones desnaturalizantes y reductoras se observaron tres bandas principales
menores a 30 kDa, las cuales de acuerdo a la clasificación de las prolaminas de
cereales corresponderían a las prolaminas de bajo peso molecular. Los pesos
moleculares de las prolaminas de maíz, trigo y centeno varían entre 30 y 90 kDa. Las
prolaminas de bajo peso molecular presentan gran cantidad de glutamina y prolina,
mientras que las de alto peso molecular (60 – 90 kDa) son ricas en glutamina y glicina
pero pobres en prolina (Shewry y Tatham, 1990; Shewry y col., 1994).
Las glutelinas constituyen una fracción principal en la semilla de Jatropha curcas L.
representando 37.8 – 32.6% con un componente principal de 430 kDa en condiciones
nativas y componentes en el intervalo de 100 - <20 kDa en condiciones
desnaturalizantes, bajo condiciones reductoras presentaron dos cadenas polipeptídicas
principales de 33 y 27 kDa. Las glutelinas son polímeros de alto peso molecular
estabilizados por enlaces disulfuro, en el patrón electroforético de la Figura 13B carril 4
puede observarse un barrido debido al gran número de componentes en esta fracción
Estas proteínas presentaron características de subunidades y masa molecular similares
a las de maíz y trigo (Cegrí y Halford, 2002).
Después de la extracción secuencial por el método de Osborne la harina residual
(residuo) contenía 20.7 % de proteína, con las modificaciones al método de Osborne
recomendadas por Franco y col., 1997 incluyendo en las soluciones de extracción
cationes como Ca++ y Mg++ que podrían modificar las características de
asociación/disociación de las proteínas se logró incrementar el rendimiento de
extracción, quedando en el residuo 9.8% de proteína.
49
Figura 12. Patró
M, marcado
kDa
669
440
232
M 1 2 3 4
n electroforético nativo de las proteínas de reserva de semillas de Jatropha curcas L.
res; 1, albúminas; 2, globulinas; 3, prolaminas; 4, glutelinas
50
(A)
4 3 2 1 M
kDa
50.3
kDa
3
Figura 13. Patrón electroforético de las pJ. curcas. A) Desnaturalizante (SDS-PA(SDS-PAGE-ME). M, Marcadores de pglobulinas; 3, prolaminas y 4, glutelinas.
10
76 49 33 28 19113.0
93.035.
28. 21.(B)
4 2 3 1 M
roteínas de reserva de la semilla deGE); B) Desnaturalizante y reductoreso molecular; 1, albúminas; 2,
51
7.4.2 Puntos isoeléctricos de las proteínas de reserva de la semilla de Jatropha curcas L. El enfoque isoeléctrico en condiciones nativas de las proteínas de reserva de la semilla
de Jatropha curcas L. (Figura 14A) mostró que las albúminas están constituidas por
cuatro bandas principales con puntos isoeléctricos de 9.6, 4.75, 4.65 y 4.45; las
globulinas presentaron seis bandas con puntos isoeléctricos de 7.5, 7.1, 7.0, 6.5, 6.0 y
4.75; las prolaminas presentaron cuatro componentes de punto isoeléctrico 9.6, 6.5, 6.0
y 4.45 y las glutelinas mostraron seis componentes de pI 8.0, 7.8, 7.5, 7.1, 6.5 y 6.0. El
conocimiento del punto isoeléctrico de las proteínas es importante en el diseño de
estrategias para su purificación, así un paso inicial en sería por ejemplo separar
proteínas ácidas de las proteínas básicas, en el caso del estudio de globulinas se sabe
que las proteínas tipo 7S presentan puntos isoeléctricos alrededor de pH 7.0 mientras
que las proteínas tipo 11S precipitan a pH 4.5 (Martínez-Ayala y Paredes-López, 2001;
Nagano y col., 1992).
pI 9.60 8.20 8.00 7.80 7.50 7.10 7.00 6.80 6.50 6.00 5.10 4.75 4.65 4.45
M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 Figura 14. Enfoque isoeléctrico nativo (A) y desnaturalizante (B) M, Marcadores de peso molecular; 1, albúminas; 2, globulinas; 3, prolaminas y 4, glutelinas.
52
El enfoque isoeléctrico en condiciones desnaturalizantes (Figura 14B) mostró patrones
complejos de subunidades para las diferentes fracciones proteicas de la semilla de J.
curcas. Para las albúminas con intervalo de puntos isoeléctricos de 8.0 a 4.65,
globulinas de 9.6 a 4.65, para prolaminas con intervalo de punto isoeléctrico de 9.6,
4.25, para glutelinas bandas de punto isoeléctrico en el intervalo de pH de 8.0 a 4.25.
Los patrones para el enfoque isoeléctrico de las diferentes fracciones estudiadas
mostraron un gran número de proteínas las cuales podrían también corresponder a
diferentes formas de estas moléculas, asimismo, se sugieren pasos adicionales de
purificación para un mejor estudio de estas.
7.4.3 Digestibilidad in vitro de las proteínas de reserva de la semilla de Jatropha curcas L. La digestibilidad “in vitro” en harina y proteínas de reserva de la semilla de Jatropha
curcas L. se muestra en el Cuadro 12. El valor obtenido para la harina desgrasada es
similar a los valores digestibilidad que han sido reportados para otras proteínas
vegetales. Las proteínas de reserva mostraron niveles de digestibilidad para las
diferentes fracciones en el intervalo de 68.4 – 81%. Las diferencias que se tienen en los
valores de digestibilidad pueden estar dadas por la composición de las proteínas
obtenidas por cada uno de los métodos utilizados.
53
Cuadro 12. Digestibilidad in vitro de harina y proteínas
de reserva de la semilla de Jatropha curcas L
Componente Osborne Osborne modificado
Harina desgrasada 75.3
Globulinas 79.9 75.4
Albúminas 78.1 68.4
Prolaminas 75.6 70.2
Glutelinas 81.0 ND
Caseína 88.4
Soya 80.1
γ-conglutina L campestris 75.5
ND. No determinado
La fracción de glutelinas por el método modificado de Osborne no se le determinó la
digestibilidad debido a que no fue posible conocer su contenido proteico ya que para su
extracción se utilizaron componentes que interfieren con el reactivo de Bradford.
7.5 Fraccionamiento y caracterización bioquímica de las globulinas de la semilla de Jatropha curcas L. Como una primera estrategia en el estudio de las proteínas de J. curcas, en este trabajo
las globulinas aisladas de la semilla fueron fraccionadas por cromatografía de filtración
en gel utilizando una columna empacada con Sephacryl S-300 y calibrada con
proteínas de peso molecular conocido. Se resolvieron dos picos principales tal como lo
muestra el perfil de elución (Figura 15) con pesos moleculares de 229 y 23 kDa.
54
Figura 15. Perfil de elución de cromatografía de filt
de Jatropha curcas L
En el Cuadro 14, se muestra el contenido de prote
sometida a cromatografía de filtración en gel y la pro
aproximadamente el 60 % de las globulinas totales co
pico II.
-0.20
0.20.40.60.8
11.21.41.61.8
22.22.4
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50No. de fracción
Abso
rban
cia
a 28
0 nm
S5 S2 S3 S4
Vo
S1
PII
PI
Vo Volumen vacío S1 Tiroglobulina (670 kDa) S2 Gammaglobulina (158 kDa) S3 Ovalbumina (44 kDa) S4 Mioglobina (17 kDa) S5 Vitamina B-12 (1350 Da)
ración en gel de las globulinas .
ína en la fracción de globulinas
teína resuelta en los picos I y II,
rresponden al pico I y el 40 % al
55 60 65 70 75 80 85
55
Cuadro 14. Contenido de globulinas sometida a cromatografía de filtración en gel y resuelta en PI y PII*
Muestra Proteína
(mg/ml) Globulinas totales 9.6
PI 6.2
PII 4.4
*Proteína soluble determinada por el método de Bradford
Las globulinas totales, de la semilla de Jatropha curcas y fracciones obtenidas de la
filtración en gel fueron caracterizadas mediante electroforesis y ultracentrifugación.
7.5.1 Número de subunidades y peso molecular de las globulinas de Jatropha curcas L.
En la Figura 16 se muestra el patrón electroforético bajo condiciones nativas, en el cual
se observa que la fracción PI, presenta una clara similitud a las globulinas totales y la
fracción PII corresponde a una fracción minoritaria de estas, cabe señalar que los
resultados obtenidos por electroforesis nativa deberían ser similares a los conseguidos
en la filtración en gel, sin embargo dicha variación se atribuye a que en la electroforesis
nativa la movilidad esta fuertemente influenciada por la carga total de proteína, dada
por su composición de aminoácidos y las masas moleculares de las proteínas en ambos
picos, no corresponde con los resultados obtenidos por filtración.
56
67
140
232
669
kDa
440
M 1 2 3
Figura 16 Patrón electroforético nativo de las globulinas presente en los picos I y II colectados por filtración en gel de Jatropha curcas L.
(M, marcadores, 1 Globulinas totales, 2 Pico I, 3 Pico II)
En el patrón electroforético bajo condiciones desnaturalizantes(Figura 17) se presentan
las globulinas totales constituidas por 9 bandas de las cuales 7 se encuentran en el pico
I y podrían corresponder a las globulinas tipo 11S (36, 29, 26 y 24 kDa) y 7S (60 y 47
kDa), en el pico II se observaron 3 bandas de peso molecular menor a 30 kDa que
podrían corresponder a las proteínas tipo 2S.
57
kDa
M 1 2 3
103 76
9
3 8
9 1
2 3
4
Figura 17. Patrón electroforético desnaturalizante de las globulinas en semilla de Jatropha curcas L. y fracciones colectadas en los picos I y II (de la Figura 21) (M, Marcador PM; 1, Globulinas totales; 2, PI; 3,PII )
Las globulinas constituyen el grupo de proteínas de reserva presente en mayor
proporción en la familia de las leguminosas y han sido clasificadas por sus coeficientes
de sedimentación en dos grupos: las globulinas 7S o vicilinas y las globulinas 11 S o
leguminas (Derbyshire, 1976). Las globulinas 7S son proteínas triméricas que están
constituidas por subunidades de 40-70 kDa, están unidas por enlaces no covalentes.
Contienen grandes cantidades de ácido glutámico, ácido aspártico, leucina,
aminoácidos básicos y amidas, las globulinas 11 S comúnmente son olígomeros
hexaméricos con un peso molecular de 50-60 kDa, dependiendo de la fuente botánica
(Plietz y col., 1987).
58
Los pesos moleculares obtenidos para las principales subunidades presentes en las
globulinas de Jatropha curcas L. sugieren que se podría tratar de subunidades con
posible relación con las globulinas de leguminosas.
Los pesos moleculares de las 2 primeras subunidades podrían estar relacionadas con
las globulinas 11 S, que presenta una cadena de 35 kDa y otra de 20 kDa enlazadas
por un puente disulfuro (Gueguen y Azanza 1985, Fukushima 1991).
Las globulinas 2S son proteínas de bajo peso molecular entre 10 y 14 kDa, algunas
subunidades presentes principalmente en la fracción correspondiente al PII mostradas
en el patrón electroforético muestran similitud para las globulinas de este tipo.
En glicinina de soya existen 5 subunidades, estas subunidades corresponden a varias
combinaciones de cadenas polipeptídicas ácidas y básicas (Kitamura y col., 1976.,
Peterson,1978), se conoce que las subunidades ácidas de la glicina son de naturaleza
hidrofilica, se ha encontrado en presencia o ausencia de reductores, componentes
menores de bajos pesos moleculares 10-20 kDa, el origen de estas proteínas se
desconoce, quizá sean el resultado de la proteólisis de una de las subunidades de
mayor peso molecular, siendo la subunidad A, la de mayor propención a hidrólisis
(Bacón y col.,1987; Nielsen y col., 1988).
Los patrones electroforéticos en condiciones desnaturalizantes obtenidos para las
globulinas de semilla de Jatropha curcas L sugieren que podría existir alguna relación
estructural con las globulinas 11S, 7S y 2S de otras semillas.
La fracción 11S de las globulinas está constituida por dos grupos que se distinguen por
su tamaño y contenido de azúcares. El primer grupo lo forman proteínas hexaméricas
con pesos moleculares de 300 – 400 kDa y generalmente no contienen carbohidratos.
Las globulinas 11S de leguminosas, ajonjolí, son moléculas hexámericas compuestas
por seis subunidades, con los mismos pesos
moleculares. La vicilina de la Pisum sativum es una proteína 7S, tiene una estructura
trimérica de 330 - 190 – 125 kDa (Newbigin y col., 1990).
59
El enfoque isoeléctrico en condiciones nativas y desnaturalizante de las globulinas y
fracciones obtenidas por cromatografía de filtración en gel (Figura 18) mostró 10
bandas principales para las globulinas totales, con puntos isoeléctricos en un rango de
4.45 a 8.2, 9 bandas para el PI (proteínas ácidas y alcalinas) y 1 banda en el PII
(proteínas alcalinas).
4
44
5
7.5
8.2 8
7.1
9.6
9.6 7.8 8.0 8.2 7.5 7.1 7.0 6.5 6.0 5.14.4 4.4 4.6 4.7
A
Figura 18. Enfoque Isoeléctrico de Globul
curcas L A) Nativo, B) DM, Marcador PM; 1, Globulin
Se ha reportado para la legumina 11S (proteín
tipos de complejos AB unidos por puentes disu
pesos moleculares de 43 – 23 kDa pI de 4.9 –
pesos moleculares de 20-30 kDa y pI de 6.2-7.2
6
6.57
7.8
.7
.4 .6
.1
inas toesnat
as tota
a del c
lfuro, su
5.6, la
(Gueg
M 1 2 3
M 2 3B
tales de semilla de Jatropha uralizante les; 2, PI; 3, PII
hícharo), forma cinco diferentes
s subunidades ácidas (A) tienen
s subunidades básicas (B) tiene
uen y col., 1990).
60
7.5.2 Determinación del coeficiente de sedimentación de las globulinas de semilla de Jatropha curcas L.
El perfil de ultracentrifugación obtenido para las globulinas de la semilla de J. curcas se
observa en la Figura 19.
En la fracción de globulina de la semilla de Jatropha crucas L. presentaron proteínas
con diferentes coeficientes de sedimentación, las fracciones principales están
representadas principalmente por proteínas desde 2S a 7S, las globulinas 11S se
encuentran en menor proporción.
El coeficiente de sedimentación es dependiente de la concentración de la proteína en
solución, así mismo del pH y fuerza iónica (Brooks y Morr, 1985; Wright, 1987). La
globulina de soya experimenta una isomerización típica de las formas 7S a 11S cuando
la fuerza iónica de la solución a pH neutro cambia de 0.5 a 0.1 (Brooks y Morr, 1985).
Para tener un mejor conocimiento del comportamiento de las globulinas de la semilla de
Jatropha curcas L. será necesario en principio tener una mejor separación de las
proteínas entre las estrategias que podrían utilizarse seria ampliando el gradiente de
sacarosa o sometiendo a ultracentrifugación las proteínas separadas por cromatografía
de filtración en gel.
61
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0.900
1.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
No de fracción
Ab
so
rban
cia
280
1.9S 4S 7S 11.2S
Figura 19 . Perfil de ultracentrifugación de las globulinas de la semilla de Jatropha
curcas L. Las flechas indican los valores de S para las proteínas empleadas como estándares: lisozima 1.9 S, albúmina de suero bovino (BSA) 4.4S, �-globulina 7S y catalasa 11.2 S.
7.5.3 Determinación de homología entre las globulinas de la semilla de Jatropha curcas L. y las globulinas de semilla de L. campestris
La Figura 20 muestra el patrón electroforético de las globulinas de la semilla de
Jatropha curcas L. y las globulinas 7S y γ-conglutina de L. campestris y el “Western-
blot” realizado con los anticuerpos policlonales de la globulina 7S de L. campestris. Se
realizó esta prueba para detectar la posible existencia de homología entre las globulinas
de lupino (leguminosa) y las globulinas de la semilla de J. curcas L.
62
Los anticuerpos de la proteína 7S de lupino mostraron inmunoafinidad por una fracción
de las globulinas de semilla de J. curcas L. de alrededor de 45-50 kDa presente en el
pico I resuelto por cromatografía de filtración en gel, esto sugiere la posible relación
estructural debido a la presencia de regiones de secuencia conservada, entre las
globulinas de J. curcas L y las globulinas de L. campestris y que probablemente
provienen de un gen ancestral común.
M 1 2 3 4 5 2 4
B 200
116
97
66
45
31
A
14 6
21
Figura 20. A) Patrón electroforético de las globulinas de semilla de Jatropha curcas L y Lupinus campestris y B) Western-blot utilizando el anticuerpo contra la globulina 7S de L. campestris M, Marcador de PM; 1, globulinas totales de J. curcas; 2, pico I; 3, pico II; 4, 7S de L. campestris y 5, γ-conglutina de L. campestris.
63
8. CONCLUSIONES
La semilla de Jatropha curcas L mostró un contenido de proteína de 24.3% el
cual se incrementó al eliminar la grasa a 45.3%, similar a la reportada por Castill
y.col., Makkar y col, así mismo por las características se puede dentro se las
semillas proteaginosas.
Las proteínas de reserva de la semilla de J. curcas fueron fraccionadas con base
en el criterio de solubilidad utilizando el método de Osborne y un método
modificado propuesto por Franco y col., 2000. Las fracciones principales fueron
globulinas y glutelinas, seguido por albúminas y prolaminas se concluye que el
método modificado de Osborne para la separación de las fracciones presenta
mejores rendimientos de estas proteínas.
Las proteínas de reserva de semillas de J. curcas mostraron características de
subunidades y masa molecular similares a las reportadas para proteínas de
leguminosas y cereales.
Los patrones electroforéticos obtenidos para las globulinas de la semilla de J.
curcas L. sugieren que podría existir alguna relación estructural con las
globulinas 2S, 7S y 11S de otras semillas. En los ensayos inmunológicos
realizados por Western blot se observó que una fracción de las globulinas mostró
reacción cruzada contra los anticuerpos 7S de L. campestris confirmando una
relación estructural entre las globulinas de J. curcas L y las globulinas de L.
campestris.
64
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