tẾ bÀo gỐc mỠ ĐỊnh ... - trung tâm thông...
TRANSCRIPT
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------
ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG
NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH
TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN
TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------
ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG
NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH
TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN
TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS.BS. Đinh Văn Hân
2. PGS. TS. Nguyễn Lai Thành
Hà Nội - 2016
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS.BS.
Đinh Văn Hân và PGS. TS. Nguyễn Lai Thành – những người thầy đã tận tâm, nhiệt
tình chỉ bảo, hướng dẫn cũng như động viên, cổ vũ tinh thần cho em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em trong
những năm qua, những kiến thức nền tảng mà thầy cô nhiệt tâm truyền lại sẽ là hành
trang giúp em vững bước trong tương lai.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ
môn Sinh học Tế bào - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà
Nội đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cho em hoàn thành khóa học.
Xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh, chị, em tại Khoa Labo nghiên cứu ứng
dụng trong điều trị Bỏng, khoa Liền vết thương – Viện Bỏng Quốc Gia đã quan tâm,
hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực hiện đề tài.
Cuối cùng, xin được gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và tất cả những người thân
yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong quá trình học tập để em hoàn thành
bản luận văn này!
Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2016
Học viên
Địch Thị Kim Hương
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1 ........................................................................................................................ 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3
1.1. Tổng quan về tế bào gốc ....................................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm tế bào gốc ..................................................................................... 3
1.1.2. Phân loại tế bào gốc ....................................................................................... 3
1.2. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) và tế bào gốc trung mô
từ mô mỡ ...................................................................................................................... 5
1.3. Vết thương và các yếu tố tham gia liền vết thương .............................................. 9
1.3.1. Diễn biến quá trình liền vết thương ............................................................... 9
1.3.2. Các thành phần tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương ............................ 11
1.4. Vết thương mạn tính ........................................................................................... 12
1.4.1. Các đặc điểm chính của vết thương mạn tính ............................................. 12
1.4.2. Một số loại vết thương mạn tính điển hình ................................................. 13
1.4.3. Nguyên nhân và điều trị vết thương mạn tính ............................................. 15
1.5. Vai trò của tế bào gốc trong liền vết thương ...................................................... 18
1.6. Một số ứng dụng tiêu biểu của tế bào gốc trung mô trên lâm sàng.................... 20
1.6.1. Ứng dụng trên điều trị tổn thương mạn tính do xạ trị ................................. 20
1.6.2. Ứng dụng trên điều trị vết loét mạn tính do tiểu đường .......................... 2021
1.7. Đánh giá an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh ............................ 221
1.7.1. Đánh giá tính an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua
nhiễm sắc thể đồ .................................................................................................. 223
1.7.2. Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua định
lượng enzyme telomerase .................................................................................... 245
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 28
2.1. Đối tượng, nguyên - vật liệu nghiên cứu ............................................................ 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 28
2.2.2. Hóa chất cơ bản cho nghiên cứu ................................................................. 28
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 299
2.2.1. Thu mô mỡ và phân lập tế bào .................................................................. 299
2.2.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào ASCs .................................................................. 30
2.2.3. Xác định số lượng tế bào ............................................................................. 30
2.2.4. Bảo quản và phục hồi tế bào sau bảo quản .................................................. 31
2.2.5. Xác định đặc điểm hình thái tế bào trong nuôi cấy tăng sinh ..................... 32
2.2.6. Xác định khả năng tạo dòng của tế bào ....................................................... 32
2.2.7. Lập kiểu nhân của tế bào ............................................................................. 32
2.2.8. Tách chiết và định lượng enzyme telomerase của tế bào sau nuôi cấy tăng
sinh......................................................................................................................... 33
2.2.9. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến nguyên bào
sợi in vitro .............................................................................................................. 34
2.2.10. Theo dõi bệnh nhân có vết thương mạn tính được ghép tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ ........................................................................................................ 35
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ........................................ 377
3.1. Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ........................................................... 377
3.2. Đặc điểm phân lập và hình thái tế bào ............................................................... 38
3.3. Khả năng tạo colony của tế bào gốc mỡ ............................................................. 40
3.4. Nuôi cấy tăng sinh và nhân rộng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ .................... 444
3.5. Về việc đánh giá tính an toàn của ASCs sau nuôi cấy tăng sinh ...................... 455
3.6. Tác động của tế bào gốc mỡ bệnh nhân lên nguyên bào sợi da in vitro ............ 51
3.7. Theo dõi quá trình liền vết thương ở một ca sau ghép tế bào gốc trung mô từ mô
mỡ .............................................................................................................................. 52
KẾT LUẬN ................................................................................................................. 56
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả xử lý mẫu mô mỡ và test mycoplasma ........................................... 36
Bảng 3.2. Số lượng tế bào thu được từ mô sau khi xử lý bằng collagenase ................. 38
Bảng 3.3. Tỷ lệ tạo colony của hỗn dịch tế bào thu được từ mô mỡ …… ............... …41
Bảng 3.4. Khả năng tạo CFU-F theo các thế hệ tế bào ................................................ 44
Bảng 3.5. Thời gian đạt trạng thái cận che phủ hoàn toàn của tế bào gốc mô mỡ ........ 46
Bảng 3.6. Nồng độ Telomerase của các thế hệ tế bào nuôi cấy tăng sinh .................... 49
Bảng 3.7. Số lượng tế bào ở mẫu nghiên cứu và đối chứng ........................................ 51
Bảng 3.8. Tỷ lệ sống của nguyên bào sợi sau khi trypsin ............................................. 52
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vết thương do nhiễm trùng ........................................................................... 11
Hình 1.2. Vết thương sau xạ trị ..................................................................................... 12
Hình 1.3. Vết loét mạch máu ......................................................................................... 13
Hình 1.4. Vết loét chi dưới do bệnh tiểu đường ............................................................ 13
Hình 1.5. Vết loét do tì đè ............................................................................................ 14
Hình 1.6. Cấu trúc vùng T-loop của telomere ............................................................... 24
Hình 1.7. Chiều dài telomere và hoạt tính của telomerase ở các dòng tế bào ung thư
phổi .............................................................................................................................. 26
Hình 3.1. Hình thái tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy .......................................................... 39
Hình 3.2. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa (mẫu số 1) ....................................... 42
Hình 3.3. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa (mẫu số 15) ..................................... 42
Hình 3.4. Hình thái colony của các mẫu nghiên cứu theo thời gian ............................ 43
Hình 3.5. Đường cong tăng trưởng của tế bào gốc mỡ ................................................. 44
Hình 3.6. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào gốc mỡ định dạng theo từng nhiễm sắc thể .... 47
Hình 3.7. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào gốc mỡ ở lần cấy truyền thứ 5 (P5) ................. 48
Hình 3.8. Chiều dài telomere và sự biểu hiện của telomerase ở một số dòng tế bào .... 50
Hình 3.9. Vết thương sau khi ghép ở các thời điểm theo dõi ........................................ 53
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AB Antibiotic/Antimycotic - Kháng sinh
ASCs Adipose-derived Stem Cells - Tế bào gốc mỡ
bFGF Basic fibroblast growth factor – Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi
D’MEM Dubeco’s Modified Eagle Medium – Môi trường nuôi cấy tế bào
DMEM
EGF Epidermal Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng biểu bì
FBS Fetal Bovine Serum - Huyết thanh bào thai bò
FGF Fibroblasts Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi
MSCs Mesenchymal stem cells - Tế bào gốc trung mô
P Passage- Cấy truyền
PBS Phosphat Buffer Saline - Dung dịch đệm phosphate
TNF – β Tumor Necrosis Factor – β – Nhân tố gây hoại tử khối u β
TB Tế bào
VEGF Vessle Endothelial Growth Factor – Nhân tố tăng trưởng tế bào nội mô
1
MỞ ĐẦU
Ứng dụng của tế bào gốc đã tạo ra tiềm năng lớn cho y học tái tạo nhờ khả
năng duy trì được đặc tính gốc trong thời gian dài cùng với đặc tính biệt hóa thành
nhiều loại tế bào khác nhau trong những điều kiện nhất định. Tế bào gốc có khả
năng thay thế các tế bào bị hư hỏng và nhờ đó có khả năng điều trị bệnh. Đặc tính
thay thế này đã được sử dụng trong điều trị bỏng sâu, rộng; khôi phục hệ thống máu
ở những bệnh nhân bị các bệnh rối loạn về máu; chữa trị các tổn thương trong gan
và não bộ. Đồng thời, nó mở ra triển vọng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư.
Tế bào gốc là công cụ rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tật và có tiềm
năng lớn để sử dụng trong lâm sàng. Cho đến nay, các loại tế bào gốc không phải là
tế bào gốc phôi được ứng dụng trong y học thành công hơn cả mặc dù tiềm năng
của chúng đã ít nhiều bị hạn chế hơn so với tế bào gốc phôi. Loại tế bào gốc hiện
đang được sử dụng cho điều trị bao gồm 3 nhóm chính: Tế bào gốc tạo máu; Tế bào
gốc trung mô và Tế bào gốc biểu mô. Trong số 3 nhóm nói trên, tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ (Adipose Derived Stem Cells – ASCs) đã và đang được quan tâm rất
nhiều bởi tiềm năng to lớn trong ứng dụng điều trị. Thứ nhất, mô này rất phổ biến,
có nhiều trong cơ thể người, dễ dàng thu nhận mà không gây xâm hại lớn tới cơ thể
như tủy xương. Điều này đồng nghĩa với việc thu nhận được lượng tế bào gốc trung
mô trong mỡ phong phú hơn so với tủy xương. Hơn nữa, để thu thập mô mỡ, bệnh
nhân chỉ cần phải gây tê cục bộ và vết thương trên bệnh nhân sau khi thu mỡ dễ
dàng liền lại trong thời gian ngắn. Thứ hai, mô này dễ dàng được tự bồi đắp trong
cơ thể. Thứ ba và đây là lý do quan trọng nhất, nó là nguồn tế bào gốc thuận lợi cho
sử dụng để ghép tự thân. Với những lý do nói trên, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
được coi là nguồn tế bào gốc trưởng thành tự thân lý tưởng cho các nghiên về y học
tái tạo, công nghệ mô và liền vết thương.
Vết thương mạn tính là hệ quả của nhiều căn bệnh như dị ứng, tiểu đường,
bỏng sâu, bệnh về hệ cứu thống miễn dịch da hoặc các trường hợp tai nạn giao
thông dẫn tới liệt hoặc những người già ốm nằm một chỗ lâu ngày gây loét da... Các
vết thương này nếu không điều trị nhanh chóng thì sẽ gây viêm nhiễm kéo dài làm
cơ thể mất dịch, mất chất dinh dưỡng và suy kiệt. Trường hợp cơ thể có sức đề
2
kháng kém sẽ dẫn tới viêm phổi, viêm đường tiết niệu, thậm chí là nhiễm trùng máu
và gây tử vong.
Có rất nhiều phương pháp điều trị vết thương mạn tính như dùng thuốc kích
thích sự phát triển tế bào, dùng oxy cao áp, tia laser nhưng hiệu quả thấp, các can
thiệp phẫu thuật thường thất bại hoặc ít khi được áp dụng do sức khỏe bệnh nhân
không cho phép phẫu thuật hoặc khổng thể tự phục hồi vết thương. Vì vậy, nhu cầu
điều trị vết thương bằng ghép tế bào gốc là rất lớn, nhu cầu này đặc biệt tăng cao ở
những bệnh nhân lớn tuổi.
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc mỡ,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu, phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế
bào gốc mỡ định hƣớng ghép tự thân trong điều trị vết thƣơng mạn tính” nhằm
hai mục tiêu sau:
1. Đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong nuôi cấy ở bệnh nhân
có vết thương mạn tính
2. Đánh giá tính an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về tế bào gốc
1.1.1. Khái niệm tế bào gốc
Tế bào gốc là loại tế bào có khả năng phân chia không giới hạn để tạo ra các
tế bào gốc có chức năng tương tự (duy trì tính gốc) và trong những điều kiện nhất
định, chúng có thể biệt hóa thành các loại tế bào có chức năng riêng biệt nhằm bổ
sung và/ hoặc thay thế các tế bào bị tổn thương hay già cỗi.
Tế bào gốc được phân biệt với tế bào thông thường bởi 2 đặc điểm chính:
Thứ nhất, chúng là các tế bào chưa biệt hóa có khả năng tự đổi mới thông qua quá
trình nguyên phân, thường ở trạng thái ít hoạt động (đôi khi chúng ở trạng thái bất
hoạt trong thời gian dài). Thứ hai, dưới tác động của các điều kiện môi trường xung
quanh, chúng có thể biến đổi thành các tế bào đặc hiệu cho mô hoặc cơ quan với các
chức năng đặc biệt. Ở một số cơ quan như niêm mạc ruột, biểu bì da hay tủy xương,
các tế bào gốc thường phân chia liên tục để sửa chữa và thay thế các tế bào già yếu
hoặc bị tổn thương. Tuy nhiên, ở nhiều cơ quan khác như tụy, tim, cơ, thần kinh thì
các tế bào gốc chỉ phân chia dưới các điều kiện đặc biệt [14].
1.1.2. Phân loại tế bào gốc
Dựa theo khả năng biệt hoá, tế bào gốc có thể phân loại thành các loại sau
[51]:
- Tế bào gốc toàn năng (Totipotent Stem Cells): chỉ thấy ở thời kỳ sớm của
phôi thai trong giai đoạn phôi 8 tế bào. Mỗi tế bào đều có khả năng tạo thành một
cơ thể hoàn chỉnh với khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào trong cơ thể.
- Tế bào gốc vạn năng (Pluripotent Stem Cells): Loại tế bào này tồn tại dạng
không biệt hoá ở lớp tế bào trong của túi phôi, có thể biệt hóa thành hơn 200 loại tế
bào khác nhau trong cơ thể.
- Tế bào gốc đa tiềm năng (Multipotent Stem Cells): Đây là loại tế bào có
nguồn gốc từ mô của bào thai, máu cuống rốn, và tế bào gốc trưởng thành. Chúng
có thể biệt hóa thành một số loại tế bào có quan hệ mật thiết với nhau.
4
- Tế bào gốc vài tiềm năng (Oligopotent stem cells): Loại tế bào này sở hữu
khả năng biệt hóa thành một số ít loại tế bào như các tế bào gốc lympho.
- Tế bào gốc đơn tiềm năng: Đây là loại tế bào có khả năng biệt hóa thành một
loại tế bào nhất định. Hầu hết các mô biểu mô đều được tự đổi mới trong suốt đời
sống nhờ sự có mặt của các tế bào gốc đơn tiềm năng này.
Theo nguồn gốc tế bào, cho đến nay, các nhà khoa học đã tiếp cận với 4 loại
tế bào gốc trong cơ thể người và động vật: Tế bào gốc phôi, tế bào gốc trưởng
thành, tế bào gốc ung thư và tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng (iPSCs).
Tế bào gốc phôi là các tế bào gốc được tách từ phôi dâu và phôi nang ở giai
đoạn phát triển trước khi làm tổ trong tử cung. Sự biệt hóa đầu tiên ở tế bào gốc
phôi người xảy ra vào khoảng ngày thứ 3 - 5 của sự phát triển. Khi đó, các tế một
bào ở lớp ngoài trở thành phần của nhau thai và phân biệt với khối tế bào bên trong
(Inner cell mass – ICM) – tế bào nút phôi. Mỗi tế bào nút phôi đều có tiềm năng
biệt hóa thành tất cả các loại tế bào thuộc các có quan khác nhau trong cơ thể như
như tim, phổi, tinh trùng, trứng và các mô khác nhưng khả năng này của chúng
giảm nhanh chóng sau khi làm tổ. Tuy nhiên, nếu khối tế bào bên trong được tách
khỏi môi trường bình thường của phôi và được nuôi cấy trong một số điều kiện
thích hợp, các tế bào có nguồn gốc từ nút phôi có thể tiếp tục phân chia và vẫn duy
trì được tiềm năng biệt hóa để tạo ra bất kỳ loại tế bào nào trong cơ thể. Chúng là
những tế bào vạn tiềm năng [51].
Tế bào gốc trưởng thành là tế bào gốc của cơ thể từ giai đoạn thai nhi đến cơ
thể trưởng thành, được tìm thấy ở mô hay cơ quan xác định và thường tồn tại trong
các ổ (stem cell niche) như máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối, tủy xương,... Chúng
là các tế bào gốc đơn tiềm năng hay đa tiềm năng vì có thể tự đổi mới và biệt hóa
thành một hay một số loại tế bào đặc hiệu mô. Vai trò chính của các tế bào gốc
trưởng thành trong cơ thể sống là duy trì và sửa chữa mô mà chúng có khả năng biệt
hóa thành các tế bào chuyên hóa cho mô đó. Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung
khai thác các tế bào gốc từ bánh nhau, dây rốn. Thành công về công nghệ đã có thể
tách và nhân lên các tế bào gốc nhưng chỉ có những bệnh nhân có bảo quản dây rốn
- bánh nhau khi sinh ra mới có cơ hội được dùng những nguồn tế bào gốc này. Hiện
nay, chỉ có số ít người lưu trữ dây rốn hay bánh nhau của em bé sau khi sinh do chi
5
phí bảo quản khá tốn kém và xác suất những người lưu trữ mô lại có bệnh cần được
điều trị bằng tế bào gốc này cũng không phải cao.
Các tế bào gốc ung thư được định nghĩa là những tế bào gốc có mặt trong
khối u. Chúng có khả năng tự biến đổi và phân chia mà không có khả năng kiểm
soát số lượng tế bào. Tuy chiếm tỷ lệ rất ít trong khối u nhưng chúng lại có trách
nhiệm trong sự tăng trưởng của khối u. Các tế bào gốc ung thư hiếm gặp đã được
phân lập từ một số khối u của con người, bao gồm ung thư máu, não, ruột và ung
thư vú. Các khái niệm ung thư tế bào gốc có ý nghĩa quan trọng trong điều trị ung thư.
Năm 2006, các nhà khoa học đã tạo ra một bước đột phá bằng cách xác định
các điều kiện có thể cho phép các yếu tố và gen quan trọng biểu hiện nhằm duy trì
các đặc tính của tế bào gốc phôi ở tế bào đã biệt hóa. Đây là loại tế bào gốc nhân
tạo, được gọi là tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng (Induced Pluripotent Stem Cells
- iPSCs). Các iPSCs của chuột đã chứng tỏ các đặc tính quan trọng của tế bào gốc
vạn tiềm năng, bao gồm biểu hiện một số marker đặc trưng cho tế bào gốc, hình
thành các tế bào u có nguồn gốc từ 3 lớp mầm và có thể tham gia vào tạo nhiều mô
khác nhau khi tiêm vào phôi chuột ở giai đoạn phát triển phôi sớm. Các iPSCs của
người cũng biểu hiện các marker tế bào gốc và có khả năng tạo ra các tế bào với các
đặc tính của 3 lớp mầm (ngoại phôi bì, trung phôi bì và nội phôi bì).
Mặc dù cần có các nghiên cứu bổ sung về iPSCs nhưng loại tế bào này đã
trở thành những công cụ hữu ích cho việc phát triển thuốc và nghiên cứu bệnh tật.
Các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu và hy vọng sẽ sử dụng chúng trong y
học cấy ghép đặc biệt là ghép tự thân. Công nghệ tạo tế bào iPSCs vạn tiềm năng
cùng với những nghiên cứu về các loại tế bào gốc đa tiềm năng khác sẽ góp phần
giúp các nhà nghiên cứu tìm ra cách tái lập trình các tế bào để sửa chữa các mô tổn
thương trong cơ thể người.
1.2. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) và tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ
Đặc điểm chung và sự phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô
Việc phát hiện ra tính chất đa tiềm năng của tế bào gốc trung mô là một bước
đột phá trong lĩnh vực tế bào gốc. Tế bào gốc trung mô lần đầu tiên được mô tả là
dạng tế bào từ tủy xương có khả năng tạo dòng, bám dính bề mặt nuôi cấy và có khả
6
năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào xương và tế bào sụn. Ngoài ra, chúng còn
được tìm thấy trong nhau thai, máu cuống rốn, lớp Wharton's jelly, dịch ối, tủy
răng, mô mỡ, lớp trung bì của da [61]. Chúng có khả năng duy trì tính gốc và biệt
hóa thành một vài loại tế bào chuyên hóa khác nhau như tế bào xương, sụn, mỡ và
mô liên kết. Vai trò nội sinh của MSC nói chung là duy trì các ổ tế bào gốc và từ đó,
chúng tham gia vào cân bằng nội môi, chữa lành vết thương, và tái tạo mô. Nguồn
tế bào gốc này vượt trội hơn so với tế bào gốc phôi hay tế bào gốc trưởng thành bởi
những ưu điểm sau:
- Không gặp phải vấn đề về y đức: Việc sử dụng mỗi tế bào gốc phôi đồng
nghĩa với việc phá hủy một cá thể người nên tế bào gốc phôi bị cấm sử dụng trong
các nghiên cứu khoa học. Trong khi đó, việc sử dụng tế bào gốc mỡ rất ít ảnh hưởng
tới sức sống của người hiến và mô mỡ khá dễ được tái tạo trở lại.
- Giảm thiểu hiện tượng đào thải miễn dịch
- Có khả năng sinh sản mạnh mẽ khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp và
tiềm năng biệt hoá cao
Nhờ những ưu điểm này mà MSCs thu hút được nhiều sự quan tâm của các
nhà nghiên cứu và là nguồn tế bào hứa hẹn đầy triển vọng trong tái tạo mô. Trước
đây, nguồn tế bào gốc tạo máu như tủy xương và tế bào gốc máu cuống rốn được
đưa vào sử dụng trong nghiên cứu và điều trị các bệnh về máu, còn các bệnh nhân
cần có sự tái tạo thuộc hệ thống trung mô rất thường gặp như các vết thương, vết
loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim,…thì lại rất ít được ứng dụng.
Nuôi cấy và phân lập tế bào gốc trung mô
Tế bào gốc trung mô ở người được phân lập dựa trên đặc tính bám dính và có
khả năng phân chia tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Tuy nhiên, phương pháp này
dẫn tới sự hình thành nhiều loại tế bào không đồng nhất (các tế bào gốc tồn tại cùng
các tế bào tiền thân của chúng). Vì vậy, thiết lập một quy trình hoàn thiện về phân
lập, xác định đặc điểm và nuôi cấy tăng sinh MSCs là điểm mấu chốt để sử dụng
chúng một cách thành công trong y học tái tạo [34]. MSCs từ tủy xương, máu ngoại
vi và dịch khớp đã được phân lập bằng phương pháp ly tâm phân lớp theo tỷ trọng
nhờ sử dụng dung dịch Ficoll rồi cấy vào các đĩa nhựa [60, 46, 37]. Trong quá trình
phân lập MSCs từ tủy xương, một số tế bào gốc tạo máu cũng bám dính vào đĩa
7
nuôi cấy nhưng chúng dần dần được loại bỏ thông qua các lần cấy truyền và cuối
cùng, chỉ còn lại các tế bào tương tự nguyên bào sợi [14]. MSCs từ các nguồn
khác như mô mỡ, tủy răng, nội mạc tử cung, da, nhau thai, Wharton’s Jelly
thường được phân lập sau khi sử dụng collagenase và được nuôi cấy ở các mật
độ khác nhau [53, 63].
Gần đây, một phương pháp hiệu quả để phân lập MSCs từ tủy xương là sử
dụng thiết bị lọc tủy xương. Phương pháp này giúp tiết kiệm thời gian và tránh
nguy cơ nhiễm do các yếu tố bên ngoài. MSCs từ các mô khác nhau đều được nuôi
cấy trong môi trường D’MEM, D’MEM-F12, αMEM, D’MEM-LG, D’MED-HG
và RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) [51, 63]. Môi trường nuôi cấy
nguyên thủy được bổ sung 10% FBS hoặc huyết thanh bê (FCS - fetal calf serum).
Bên cạnh môi trường cùng các yếu tố bổ sung, nồng độ oxy cũng ảnh hưởng tới sự
phát triển của MSCs [45]. Sự tăng trưởng của MSCs trong môi trường D’MEM có
nồng độ glucose thấp cũng được ghi nhận khi có sự tham gia của FGF, EGF và B27
[48]. Môi trường D’MEM có bổ sung 10% FBS là loại môi trường được sử dụng
phổ biến nhất trong nuôi cấy MSCs in vitro.
Kỹ thuật đánh giá sự tăng sinh, phát triển của MSCs sau nuôi cấy
Phương pháp phổ biến nhất để đánh giá sự phát triển của MSCs trong môi
trường in vitro là xác định tỷ lệ sống/ chết của các tế ở đĩa sau một thời gian nuôi
cấy dựa trên sự hấp thụ với một số loại thuốc nhộm nhất định. Chẳng hạn, xanh
trypan, xanh methylene, eosin,…được dùng để nhuộm tế bào chết. Theo đó, các tế
bào sống và tế bào chết được phân biệt bởi khả năng bắt màu thuốc nhuộm của tế
bào bị chết do màng tế bào thay đổi tính thấm và cho phép thuốc nhuộm đi qua
màng. Trái lại, tế bào sống không cho phép thuốc nhuộm hay các chất gây độc tế
bào đi qua màng nên không bắt màu thuốc nhuộm. chúng. Phức tạp hơn, người ta có
thể sử dụng kỹ thuật đánh giá sự hô hấp nội sinh ở tế bào còn sống như kỹ thuật
MTT (MTT assays). Phương pháp này dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có
màu xanh tím nhờ enzyme hô hấp ở ty thể. Số lượng tế bào tỷ lệ thuận với nồng độ
formazan, thể hiện qua giá trị OD -570 nm.
8
Để phân tích sự tăng sinh của tế bào có khả năng bám dính vào bề mặt
nuôi cấy theo thời gian, người ta còn sử dụng hệ thống xCELLigence dựa trên việc
sử dụng các đĩa nuôi cấy được tráng một lớp fibronection hoặc laminin,
collagen,…và có gắn điện cực vàng ở đáy. Thông thường, tế bào được nuôi cấy ở
mật độ 2x105
tế bào/ giá thể trong 14 ngày cho đến khi độ che phủ đạt khoảng 80 -
90%. Điện trở của hỗn dịch tế bào được đo sau mỗi 1h và liên tục trong khoảng thời
gian chừng 10 ngày. Từ đó, đường cong tăng trưởng của tế bào được xây dựng dựa
trên thời gian tăng sinh của chúng.
Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (Adipose-derived stem cells – ASCs)
Tế bào gốc đa tiềm năng được phát hiện trong mô mỡ của người được gọi là
tế bào gốc mô mỡ (ASC). Tế bào gốc mô mỡ lần đầu tiên được xác định là tế bào
gốc trung mô vào năm 2001 [71] và từ đó mô mỡ được nghiên cứu trong công nghệ
mô và y học tái tạo.
Các nhà nghiên cứu đề xuất nhiều cách thức phân lập và nuôi cấy tế bào gốc
trung mô chủ yếu dựa vào hình thái cùng đặc tính bám dính vào bề mặt nuôi cấy
trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường nuôi cấy cũng được công bố ở
nhiều dạng công thức khác nhau. Các môi trường cơ bản thường được dùng là
D’MEM, DMEM-F12, CMRL1066... với thành phần và hàm lượng các chất bổ
sung như glucose chưa có sự thống nhất. Do tế bào gốc mô mỡ biểu hiện các
marker tế bào đặc hiệu cho tế bào gốc trung mô: CD34, CD44, CD106, CD117, và
STRO-1 mà không biểu hiện các marker dòng tạo máu (CD31, CD144, yếu tố von
Willebrand) nên các nhà nghiên cứu dựa vào sự liên kết giữa kháng thể và kháng
nguyên bề mặt tế bào gốc trung mô để tách tế bào gốc trung mô khỏi nhóm các tế
bào khác [31]. Các tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trong điều kiện nuôi cấy có thể
biệt hóa thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn, nguyên bào cơ, và các dòng tế
bào mầm của mô mỡ [51]. Ngày nay, tế bào gốc trung mô từ tủy xương và mô mỡ
được xác định là rất giống nhau về quần thể tế bào và kiểu hình tế bào [34, 58].
Có hai kiểu mô mỡ chính khác nhau về hình thái và chức năng: mô mỡ
màu trắng và mô mỡ nâu. Mỡ trắng trữ năng lượng dưới dạng lipid (triglyceride) và
sản xuất các hormone trong khi mỡ nâu cung cấp nhiệt lượng cho cơ thể. ASCs
được tìm thấy ở mô mỡ trắng ở khu vực quanh mạch máu. Zuk và cs [71] đã phát
9
triển một phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân lập ASCs từ mô mỡ trắng
vào năm 2001: Mô mỡ được cắt nhỏ và bị phân cắt với enzym collagenase loại II
rồi ly tâm. Sau khi ly tâm, phần lắng được gọi là phân lớp mạch nền (stroma
vascular fraction - SVF) chứa khoảng 2.000.000 - 6.000.000 tế bào sau khi tách từ
1ml mỡ hút được sau khi xử lý. SVF chứa gồm các loại tế bào khác nhau như tế bào
gốc trung mô, tế bào gốc mỡ, tế bào gốc tạo máu và các tế bào không phải tế bào
gốc như nguyên bào sợi, tế bào máu, tiền thân tế bào mỡ và tế bào quanh mao
mạch, các tế bào nội mô, tế bào tiền thân nội mô, các tế bào cơ trơn, bạch cầu, hồng
cầu. Nhưng hiệu quả của kỹ thuật này còn thấp do tỷ lệ tế bào gốc trong phân lớp
mạch nền không cao [31]. Để phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, tất cả các tế
bào đều được nuôi trên bề mặt nuôi cấy plastic trong một khoảng thời gian. Khi đó,
các tế bào có khả năng bám dính bám trên bề mặt nuôi cấy có khả năng sống sót
trong khi các tế bào phát triển huyền phù như tế bào tạo máu không có khả năng
tăng sinh sẽ bị loại bỏ trong quá trình nuôi cấy. Sau vài lần cấy truyền, các tế bào
không phải tế bào gốc như tế bào nội mô có khả năng tăng sinh và chu kỳ sống có
giới hạn không thể duy trì trong điều kiện nuôi cấy nên cũng mất đi trong quá trình
nuôi. Quần thể tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy này có thể được duy trì trong
điều kiện in vitro trong thời gian tương đối dài với khả năng tăng sinh ổn định và có
khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào khác nhau.
1.3. Vết thƣơng và các yếu tố tham gia liền vết thƣơng
Vết thương là tình trạng tổn thương thường gặp do tai nạn hoặc do các thủ
thuật can thiệp chẩn đoán và điều trị. Ngoài ra, vết thương còn là biến chứng của
nhiều bệnh nội – ngoại khoa khác như loét do tỳ đè, loét do tiểu đường, loét do suy
tĩnh mạch hay xạ trị,…[1].
1.3.1. Diễn biến quá trình liền vết thương
Diễn biến liền vết thương nói chung đều trải qua 4 giai đoạn chính: giai đoạn
đông máu, giai đoạn viêm, giai đoạn tăng sinh và giai đoạn tái lập mô [22]. Đây là
quá trình mà mô bị tổn thương được phục hồi, tái tạo các tế bào mới và tổ chức, sắp xếp
lại các thành phần của mô để tạo sẹo hoặc phục hồi chức năng của mô/ cơ quan.
Giai đoạn đông máu: Ngay sau khi bị thương, tiểu cầu cùng các yếu tố tăng
trưởng, các yếu tố đông máu được hoạt hóa và tác động tới các mao mạch nhỏ. Từ
10
đó, cục máu đông hình thành và ngăn chặn sự chảy máu tại vết thương. Khi vết
thương quá sâu hoặc mạch máu lớn bị tổn thương thì cục máu đông này khó kịp
hình thành nên cần garo, băng gạc để ngăn chặn sự chảy máu.
Giai đoạn viêm: Giai đoạn này diễn ra trong khoảng thời 24 – 48h sau khi bị
thương, tính thấm thành mạch tăng lên để các kháng thể và các protein chủ chốt
tham gia liền vết thương như fibrin, fibronectin đi vào mô. Bạch cầu đa nhân trung
tính tham gia dọn dẹp những vật thể lạ xâm nhập vào vết thương bằng cách thực
bào. Sự kích hoạt quá trình viêm sẽ gửi đi các tín hiệu mang tính hóa ứng động để
lôi kéo các bạch cầu đơn nhân tới vết thương để loại bỏ những vật ngoại lai còn lại
và thúc đẩy các yếu tố tăng trưởng tạo ra nhiều tín hiệu liền vết thương khác nhau.
Giai đoạn tăng sinh: Sau giai đoạn cầm máu và loại bỏ các yếu tố ngoại lai
thì giai đoạn tăng sinh bắt đầu diễn ra, thường ở ngày thứ 2 sau khi bị thương. Giai
đoạn này được đặc trưng bởi hàng loạt các sự kiện nhằm duy trì tính toàn vẹn của
mạch, thay thế mô bị tổn thương và tái tạo vết thương. Trong đó, các mạch mới
được tạo ra trong vùng tổn thương, các nguyên bào sợi tăng sinh và sản xuất chất
nền ngoại bào, mép vết thương co rút và tế bào sừng di cư che phủ kín vết thương.
Để tạo được mạch máu mới đưa dinh dưỡng đi tới mô tổn thương, tế bào nội
mô được tách khỏi những mạch máu lành lặn, di cư tới vùng tổn thương và tăng
sinh tại đó. Các yếu tố tăng trưởng, các yếu tố hóa ứng động và các protein do các tế
bào viêm tiết ra có trách nhiệm khởi đầu sự di cư của các tế bào nội mô mạch máu.
Các yếu tố tăng trưởng đóng vai trò chính trong điều khiển toàn bộ quá trình tăng
sinh mạch gồm: FGF, TNF – β, EGF và yếu tố tăng sinh mạch vùng tổn thương
(WAF – Wound Angiogenesis Factor). TNF – β tác động trực tiếp bằng cách kích
thích đại thực bào di cư và sau đó giải phóng yếu tố sinh mạch, từ đó tạo ra hệ
thống mao mạch mới nuôi dưỡng vết thương [44].
Quá trình tăng sinh nguyên bào sợi diễn ra khi những nguyên bào sợi ở
những vùng xung quanh di chuyển tới vết thương, những nguyên bào sợi này tăng
sinh, kết hợp với collagen, proteoglycan, glycosamin sẽ hình thành nên chất nền mô
liên kết tế bào hạt. Thời kỳ này thường diễn ra trong vòng 7 – 14 ngày sau khi bị
thương, trong đó có sự giảm nhanh của đại thực bào và thay thế vào đó là sự tăng
sinh của nguyên bào sợi. Thêm vào đó, nguyên bào sợi được kích thích tiết ra
11
PDGF, TNF – β để điều khiển quá trình tổng hợp và lắng đọng các thành phần đệm
gian bào bao gồm: fibronectin, laminin, glycosaminoglycans (GAGs) và collagen
[50]. Sự kết hợp giữa nguyên bào sợi với các thành phần đệm gian bào hình thành
chất nền mô liên kết, thúc đẩy quá trình hình thành cấy trúc mô bị tổn thương và tạo
ra độ bền vững cho vết thương.
Sau khi có đệm gian bào, quá trình tăng sinh biểu mô diễn ra nhằm tái lập
hàng rào bảo vệ bề mặt vết thương và được xem là quá trình then chốt của quá trình
liền vết thương. Với vết thương nhỏ, quá trình tăng sinh biểu mô diễn ra nhanh hơn
và vì vậy vết thương mau lành. Ở vết thương lớn hoặc vết thương mạn tính, quá
trình tăng sinh biểu mô diễn ra khó khăn hơn, đôi khi phải nhờ tớiphẫu thuật cấy
ghép để hỗ trợ quá trình liền vết thương.
Giai đoạn tái lập mô và liền sẹo: Giai đoạn này bắt đầu vào khoảng tuần thứ
3 sau khi bị thương và kéo dài nhiều tháng tới nhiều năm nhằmđảm bảo tính toàn
vẹn về cấu trúc và chức năng của mô. Đặc trưng của giai đoạn tái lập mô là tăng
liên kết chéo collagen để tăng tính bền vững của mô liên kết; collagenase được kích
hoạt để giảm sự tích tụ quá mức của collagen, hạn chế sẹo; giảm mạng lưới mao
mạch; giảm thành phần proteoglycan và thay thế bằng thành phần nước của mô.
1.3.2. Các thành phần tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương
Diễn biến liền vết thương nói chung đều trải qua các giai đoạn đông máu,
viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo. Tuy quá trình liền vết thương có nhiều cơ
chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tạo ra các tế bào mới thay thế các tế bào đã
bị tổn thương. Yếu tố tế bào chủ yếu tham gia vào liền vết thương trên da bao gồm
2 loại tế bào: nguyên bào sợi (Fibroblasts) và tế bào sừng (Keratinocytes). Nguyên
bào sợi là tế bào tạo ra lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì. Hai loại tế
bào này có những chức năng khác nhau nhưng lại tương tác, kết hợp với nhau để tạo
ra cấu trúc da hoàn chỉnh. Khi da bị tổn thương, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp
ra đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện cho tế bào sừng từ bờ mép
vết thương tăng sinh che phủ bề mặt và kết quả là làm lành vết thương [1].
Nguyên bào sợi: là tế bào quan trọng nhất trong giai đoạn tăng sinh, chúng
tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hoá và cung cấp
các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để tế bào biểu mô bám và trượt trên đó
12
giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hoá che phủ vết thương. Chúng tạo ra các protein
đệm mà trong đó collagen tạo nên sự bền vững và toàn vẹn của mô. Đồng thời,
nguyên bào sợi là nguồn cung cấp các yếu tố tăng trưởng có tác dụng kích thích liền
vết thương như TGF-β, PDGF, KGF. Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành
myofibroblasts (nguyên bào sợi dạng cơ) tạo nên sự co rút và liền vết thương nhanh
hơn. Ngoài ra, nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo sau khi liền
ở những vết thương lâu năm.
Tế bào sừng: tạo nên lớp biểu bì bảo vệ da nhờ sự sắp xếp chặt chẽ thành
nhiều lớp tế bào. Lớp mầm (còn gọi là lớp đáy) chứa các tế bào gốc biểu bì có khả
năng tự tái sinh nhiều lần và nhanh trong suốt đời sống của cơ thể người. Giữa các
tế bào sừng có các thể liên kết (desmosome) giúp chúng kết nối chặt chẽ với nhau.
Các tế bào lớp đáy có cấu trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ dàng
bị xoá bỏ và cũng tự tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển lên trên tạo
ra các lớp tế bào biệt hoá ở phía trên. Bình thường sự phân chia tế bào sừng lớp
mầm cân bằng với sự sừng hoá bong vảy của biểu bì nhưng khi da bị tổn thương thì
chúng tăng cường phân chia để tạo ra nhiều tế bào biểu mô. Các tế bào biểu mô sẽ
di cư vào trung tâm của vết thương ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế bào tiếp xúc
trực tiếp với nhau thì tốc độ phân chia chậm lại và biệt hoá thành các lớp gai, lớp
hạt, lớp sừng ở phía trên để thực hiện chức năng bảo vệ của biểu bì. Trong quá trình
di cư chúng cần đệm gian bào đủ chất lượng như trung bì, chúng cần có các sợi
decorin, laminin…để bám vào và trượt dọc theo các sợi đó để di chuyển vào trung
tâm vết thương.
Thông thường, một vết thương sẽ lành trong vòng một vài tuần. Tuy nhiên,
có những vết thương lại không lành mặc dù đã trải qua các quá trình điều trị phục
hồi về mặt giải phẫu và chức năng trong thời gian trên 3 tháng - những vết thương
này được xếp vào nhóm vết thương mạn tính khó lành [22].
1.4. Vết thƣơng mạn tính
1.4.1. Các đặc điểm chính của vết thương mạn tính
Vết thương mạn tính có các đặc điểm chính sau:
- Các quai mạch máu thoái triển, già và ít, các tế bào nội mô giảm phân chia
nên tân mạch giảm, chất lượng mô hạt kém
13
- Các tế bào biểu mô quanh vết thương giảm hoặc ngừng phân bào, do đó
chúng không phát triển được vào phía trung tâm vết thương
- Có sự giảm các thành phần đệm gian bào do nguyên bào sợi tiết ra, từ đó
các tế bào biểu mô vốn đã phân chia chậm lại ít chỗ bám và di chuyển vào vết
thương để thực hiện quá trình biểu mô hóa [1].
1.4.2. Một số loại vết thương mạn tính điển hình
Vết thương do nhiễm trùng: Tác nhân gây ra nhiễm trùng vết thương có thểlà
vi khuẩn, nấm hay virus, hay ký sinh trùng. Nếu vết thương có nhiễm trùng không
được điều trị bằng các thuốc thích hợp, vết thương sẽ không lành trong thời gian dự
kiến.
Hình 1.1. Vết thương do nhiễm trùng (Theo Lipsky BA, 2012)
Vết thương sau xạ trị: Nguồn gốc của bức xạ có thể là trị liệu tia gamma
hoặc tia X hoặc vô tình tiếp xúc với các chất phóng xạ từ vụ tai nạn hạt nhân nhà
máy hoặc các thiết bị phóng xạ phát nổ. Việc tiếp xúc quá nhiều ion hóa vật liệu
bức xạ có thể làm suy yếu hệ miễn dịch hệ thống, gây tổn thương cho các mô tiếp
xúc và kéo dài thời gian chữa lành vết thương.
Hình 1.2. Vết thương sau xạ trị (Theo Bernier J, 2008)
14
Vết thương phẫu thuật: Những vết thương gây ra bởi vết mổ được thực hiện
trong quá trình phẫu thuật có thể tiến triển thành các vết thương mạn tính nếu việc
cung cấp máu đến vùng mô phẫu thuật không đủ hoặc nếu chăm sóc vết thương
không đúng cách, hoặc có nhiễm trùng vết thương nhiễm trùng. Cả ba yếu tố trên
kéo dài thời gian chữa lành vết thương.
Loét động mạch: Loại loét này có thể gặp ở bệnh nhân tăng huyết áp, xơ vữa
động mạch gây hẹp tắc, và do cục huyết khối. Các nguyên nhân trên làm giảm
nguồn cung cấp máu dẫn đến một tình trạng thiếu máu cục bộ. Khi việc cung cấp
máu và oxy cùng chất dinh dưỡng đến vết thương bị suy giảm, quá trình lành vết
thương có thể bị trì hoãn làm cho nó trở nên khó liền hoặc không bao giờ liền được.
Trong những trường hợp này cần tới sự xử trí của bác sỹ chuyên khoa vì nếu xử trí
sai thì có thể dẫn tới hậu quả nặng nề, thậm chí tử vong do nhiễm trùng.
Hình 1.3. Vết loét mạch máu (Theo Andrew J.M. Boulton, 2008)
Loét tĩnh mạch: Loét tĩnh mạch chiếm hơn một nửa số trường hợp loét, đặc
biệt là ở chi dưới. Bệnh thường gặp trong các trường hợp có huyết khối ở tĩnh mạch
sâu hay suy giãn các van tĩnh mạch. Loét tĩnh mạch có thể dẫn đến ứ trệ máu ở
ngoại vi, máu không lưu thông được một cách bình thường.
Loét trong bệnh tiểu đường: Đây là một biến chứng thường gặp trong bệnh
đái tháo đường. Do đường máu không được kiểm soát tốt, dẫn đến chức năng miễn
dịch bị suy yếu, thiếu máu do máu lưu thông kém, xơ vữa động mạch và tổn thương
dây thần kinh, cuối cùng dẫn đến tổn thương của da và loét.
15
Hình 1.4. Vết loét chi dưới do bệnh tiểu đường (Theo Lauren Collins và cs, 2010)
Loét áp lực: Sức ép liên tục và ma sát do trọng lượng cơ thể tì lên một vùng
cơ thể trong thời gian kéo dài có thể dẫn đến tổn thương của da và loét; hay gặp ở vị
trí tì đè trên cơ thể.
Hình 1.5. Vết loét do tì đè (Theo William T Wake, 2010)
1.4.3. Nguyên nhân và điều trị vết thương mạn tính
Tất cả các vết thương đều có khả năng trở thành vết thương mạn tính [5].
Nguyên nhân dẫn tới vết thương mạn tính có thể là thiếu một hoặc nhiều các yếu tố
cần thiết để lành vết thương. Các yếu tố đó bao gồm: nguồn cung cấp máu, oxy và
chất dinh dưỡng cùng với môi trường vết thương sạch. Ngoài ra, các lực tác động
vào vết thương cũng là một yếu tố quan trọng gây ra vết thương mạn tính. Một khía
cạnh cơ bản và quan trọng điều trị vết thương mạn tính là ngăn chặn các yếu tố có
hại cho quá trình liền vết thương [42].
Vết thương mạn tính là một gánh nặng không chỉ đối với bệnh nhân mà còn
là áp lực đối với các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và các hệ thống chăm sóc y tế
16
của mỗi quốc gia. Tại Mỹ, các chuyên gia ước tính hàng năm có khoảng 6,5 triệu
bệnh nhân có vết thương mạn tính và tiêu tốn khoảng 20 tỷ USD mỗi năm.Hằng
năm, tại Tây Âu có khoảng 150.000 người cần được điều trị bằng da nhân tạo và
con số này vẫn ít hơn số bệnh nhân bị loét mạn tính, tập trung chủ yếu ở nhóm bệnh
nhân mắc bệnh tiểu đường, tĩnh mạch, và loét do tỳ đè. Ở Đức, có khoảng 3 triệu
người bị loét mạn tính mỗi năm và tiêu tốn tới hơn 1 tỷ Euro cho điều trị [22]. Tại
nước ta, trung bình mỗi năm tại các bệnh viện có khoảng 4.000 bệnh nhân phải chịu
những vết thương mạn tính do hệ quả của nhiều căn bệnh. Phần lớn bệnh nhân bị
loét là do tai nạn giao thông dẫn tới liệt, những người già ốm nằm một chỗ lâu ngày
hoặc người bị dị ứng gây loét, bệnh nhân tiểu đường, suy tĩnh mạch, viêm tĩnh
mạch, suy van tĩnh mạch, vết bỏng lâu lành, bệnh về hệ thống miễn dịch da... Đáng
chú ý, khá nhiều bệnh nhân bị ung thư phải xạ trị dẫn tới loét.Trên thực tế, nhu cầu
trị liệu vết thương mạn tính rất lớn, đặc biệt ở những bệnh nhân lớn tuổi.
Trong những năm gần đây, thế giới đã có nhiều tiến bộ trong điều trị vết
thương khó lành. Điều đó không chỉ dừng lại ở một vài phương pháp đơn lẻ mà đã
trở thành quá trình trị liệu có hệ thống. Để nâng cao hiệu quả trong điều trị, nhiều
quốc gia đã thành lập các hiệp hội, trung tâm nghiên cứu và điều trị vết thương khó
lành như World Union of Wound Healing Societies (WUWHS), Wound Care
Associates, The Wound Healing Center,…
Ở Việt Nam, khoa Liền vết thương của Viện Bỏng quốc gia (Học viện Quân
y) đã được chính thức thành lập năm 2012 với nhiều trang bị, máy móc hiện đại
nhằm điều trị vết thương khó lành. Đây là cơ sở chuyên khoa đầu tiên trong cả nước
về lĩnh vực liền vết thương, đánh dấu sự phát triển mới của chuyên ngành liền vết
thương tại nước ta với tư cách là một chuyên ngành độc lập. Tại đây, các phương
pháp điều trị vết thương khó lành có thể chia thành các nhóm gồm: Nhóm phương
pháp điều trị cơ bản; nhóm phương pháp điều trị tiến bộ và nhóm phương pháp tích
cực.
Nhóm phương pháp tích cực kích thích quá trình liền vết thương diễn ra
nhanh hơn bình thường. Ngoài các phương pháp truyền thống như thay băng, phẫu
thuật chuyển vạt da, ghép da…, các chuyên gia y tế đã sử dụng các vật liệu sinh
học, các yếu tố tăng trưởng để kích thích quá trình tăng sinh và tăng cường chức
17
năng của các thành phần tế bào tham gia liền vết thương, sử dụng kỹ thuật ô-xy cao
áp; điều trị hút áp lực âm, laser. Tuy nhiên, hiệu quả của những kỹ thuật này tương
đối hạn chế, các can thiệp phẫu thuật ghép da dễ thất bại do cơ thể bệnh nhân không
chấp nhận mảnh ghép, hoặc khả năng nuôi dưỡng mảnh ghép tương đối kém. Hơn
nữa, những bệnh nhân lớn tuổi thường có bệnh kết hợp nên trong nhiều trường hợp
không cho phép phẫu thuật. Vài năm gần đây, việc điều trị vết thương mạn tính tại
đã có nhiều tiến bộ dựa trên công nghệ nuôi cấy tế bào gốc, bước đầu khắc phục
được những hạn chế của những phương pháp trước đây. Trong đó, ghép biểu bì có
tác dụng kích thích liền vết thương, tạo lớp biểu bì che phủ tổn thương quyết định
liền vết bỏng sâu, do đó tăng khả năng cứu sống bệnh nhân bị bỏng sâu đến 85%.
Tế bào biểu bì được nuôi cấy từ mô da hoặc nang lông. Từ vài cm2 da, tế bào gốc
được tách ra và nuôi cấy trong môi trường tăng trưởng làm tăng diện tích da lên
hàng nghìn lần chỉ trong thời gian ngắn. Mới đây, các bác sĩ Viện Bỏng quốc gia đã
nghiên cứu áp dụng thành công phương pháp ghép nguyên bào sợi đồng loại nuôi
cấy điều trị cho các bệnh nhân có vết thương mạn tính và các vết loét khó lành do
nhiều căn nguyên bệnh lý khác nhau. Phương pháp này lần đầu tiên được áp dụng
tại Việt Nam. Theo đó, chỉ cần một phần da rất nhỏ, sau khi nuôi cấy có thể tạo ra
số lượng nguyên bào sợi đủ lớn theo yêu cầu điều trị. Điều này mở ra tiềm năng lớn
trong điều trị hiệu quả những tổn khuyến da cũng như các vết loét sâu, rộng.
Trên thế giới, trong 25 năm qua, công nghệ nuôi cấy tế bào da đã phát triển
nhằm tạo ra các vật liệu thay thế mang tính bắt chước da người với mục đích và sửa
chữa, thay thế da tạm thời và hỗ trợ cho việc tái tạo vết thương mạn tính [20]. Các
vật liệu thay thế da này được chế tạo dựa trên các tiến bộ của công nghệ mô vàđã
đượcứng dụng trong lâm sàng nhằm thúc đẩy sự liền vết thương cấp và mạn tính.
Tại Viện Bỏng Quốc Gia, đã có nhiều nghiên cứu đã được ứng dụng trên lâm sàng
trong điều trị vết thương bỏng. Trong những năm 2000, các ứng dụng chủ yếu sử
dụng các vật liệu da hoặc tương đương da có sẵn để điều trị vết bỏng. Nguồn vật
liệu này có thể là da đồng loại, da tự thân, màng ối đông khô tiệt khuẩn, da ếch, da
lợn...Trong khoảng 10 năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy tế bào được nghiên cứu
sâu hơn nhằm tăng cường hiệu quả điều trị. Điển hình là nhóm nghiên cứu của
PGS.TS.BS Đinh Văn Hân đã chế tạo được vật liệu tương đương trung bì từ tế bào
18
gốc trung mô màng dây rốn, nguyên bào sợi và gần đây, nguồn tế bào gốc mỡ đang
được tập trung nghiên cứu [58, 71].
Một vấn đề chính trong cấy ghép là cần có đủ số lượng tế bào cần thiết, trong
khi vẫnđảm bảo tính chất bình thường của tế bào về mặt cấu trúc và chức năng của
chúng. Mảnh ghép cần phải đạt yêu cầu không gây đáp ứng miễn dịch, che phủ và bảo
vệ nền vết thương, làm nhanh liền vết thương, ít gây đau và ít tạo sẹo.
1.5. Vai trò của tế bào gốc trong liền vết thƣơng
Cho đến nay, việc điều trị các tổn khuyết da diện rộng và vết thương mạn
tính vẫn còn là một thách thức lớn đối với y học. Người ta nhận thấy, các tế bào gốc
đảm nhiệm việc đánh giá sự thiếu hụt các thành phần đệm và cytokines; Chúng sửa
chữa các thiếu hụt đó bằng cách tạo ra những yếu tố thích hợp thúc đẩy liền vết
thương. Điều này nghĩa là các tế bào gốc hoạt động như cỗ máy có kiểm soát tương
tác các thông tin ngược một cách thông minh. Khi nguồn tế bào gốc này không đủ
đáp ứng với những tổn thương thì sẽ gây ra vết thương lâu lành, thậm chí không liền
được. Do đó, công nghệ tế bào gốc đang mang lại những triển vọng lớn trong việc
khắc phục những nan giải hiện nay trong liền vết thương.
Những tế bào gốc phôi có tiềm năng lớn để thay thế toàn bộ các tế bào chức
năng trong cơ thể [51]. Mặc dù tế bào gốc phôi có khả năng phát triển không giới
hạn nhưng việc nghiên cứu và sử dụng chúng còn rất khó khăn về công nghệ, đặc
biệt là việc lấy tế bào gốc phôi lấy từ cơ thể mẹ sử dụng trong nghiên cứu là vi
phạm y đức do điều này đồng nghĩa với việc phá hủy một hay nhiều cơ thể sống. Do
vậy, hầu hết các phôi được sử dụng cho nghiên cứu được thu thập từ trứng đã được
thụ tinh trong điều kiện in vitro. Ở người, việc thu thập chúng phải được chấp thuận
hiến tặng cho nghiên cứu khoa học từ phía người cho. Hơn nữa, một số báo cáo cho
thấy tế bào gốc phôi của người sau nuôi cấy có biểu hiện protein lạ [58]. Do đó, tính
an toàn của tế bào gốc phôi cần được nghiên cứu sâu hơn.
Một số nguồn tế bào gốc khác nhau như tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống
rốn đã và đang được nghiên cứu sử dụng trong điều trị vết thương mạn tính để thúc
đẩy các đáp ứng liền vết thương [20]. Trong đó, hiệu quả điều trị vết thương mạn
tính của tế bào gốc tủy xương được quan tâm đặc biệt. Một nghiên cứu in vivo cho
thấy sự tổng hợp collagen và mức độ biểu hiện của bFGF và VEGF trong tế bào liên
19
kết của tủy xương cao hơn rất nhiều so với trong nguyên bào sợi của trung bì. Điều
này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tủy xương tại vết thương để thúc đẩy sự tái tạo
[34]. Tác giả khác sử dụng tủy xương tự thân để điều trị vết thương bỏng không
liền, vết loét gót chân mạn tính cho thấy: Vết thương bỏng chuyển từ dạng mạn tính
không liền sang dạng tái biểu mô hóa và liền sau khi được ghép da [5]. Nghiên cứu
khác với MSCs tủy xương đã cho thấy việc điều trị vết thương bằng MSCs tủy
xương có tác dụng làm tăng nhanh quá trình biểu mô hóa và tăng tạo mạch [65].
Tuy nhiên, do các nguồn tế bào gốc từ các mô của cơ thể như máu tủy
xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn, não, gan...đều hạn chế về số lượng nên tính
ứng dụng chưa cao. Trong khi đó, việc khai thác các nguồn tế bào gốc trung mô
trưởng thành đang là một hướng rất quan trọng trong nghiên cứu điều trị liền vết
thương. Ngoại trừ các trường hợp ghép tế bào gốc trung mô đồng loại vốn sẵn có
nguồn tế bào rất trẻ như tế bào gốc trung mô từ màng ối, dây rốn và máu cuống rốn;
các trường hợp ghép tế bào gốc trung mô tự thân chỉ có thể lấy từ hai nguồn chính:
tủy xương và mô mỡ. Các nguồn tế bào gốc từ mô khác như gan, não, và cơ hầu
như không có khả năng ứng dụng trong điều trị vết thương. Nguồn tế bào gốc tủy
xương chủ yếu là các tế bào gốc tạo máu nhưng có khá ít tế bào gốc trung mô tham
gia vào tái tạo vết thương. Vì vậy, chúng đã được ứng dụng chủ yếu trong điều trị
các bệnh liên quan tới tạo máu như leukemia. Do đó, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
được coi là nguồn tế bào gốc trưởng thành tự thân lý tưởng cho các nghiên cứu về y
học tái tạo, công nghệ mô và liền vết thương.
1.6. Một số ứng dụng tiêu biểu của tế bào gốc trung mô trên lâm sàng
Một đặc tính quan trọng của tế bào gốc trung mô là khả năng sản xuất và tiết
ra nhiều các cytokines cũng như các chất hóa ứng động khác nhau vốn có vai trò
quan trọng trong các hoạt động sửa chữa mô [53].
Việc phát hiện sự tồn tại của nguồn tế bào gốc trung mô trong mỡ đã mở ra
một tiềm năng to lớn trong ứng dụng điều trị. Thứ nhất, mô này có ưu thế về số
lượng mô lớn và tái tạo nhanh. Thứ hai, mô mỡ dễ dàng thu nhận mà không gây
xâm hại lớn như khi thu nhận tủy xương. Thứ ba, tế bào gốc mỡ là nguồn tế bào gốc
tự thân. Thứ tư, số lượng tế bào gốc trung mô thu được từ mô mỡ thường cao hơn
so với tủy xương [31].
20
Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ sau khi được phân lập bằng cách nuôi cấy
phân lớp mạch nền đã được sử dụng trên vết thương bằng cách tiêm dưới da hoặc
bôi trực tiếp. Dưới đây là một vài ứng dụng tiêu biểu của tế bào gốc trung mô:
1.6.1. Ứng dụng trên điều trị tổn thương mạn tính do xạ trị
Akita và cs đã mô tả trường hợp đầu tiên có tổn thương mạn tính do trị xạ đã
được điều trị với dung dịch có chứa tế bào gốc mỡ tự thân [5]. Bệnh nhân là một
phụ nữ 89 tuổi bị loét xương cùng (5 cm × 10 cm) từ 40 năm trước do xạ trị điều trị
ung thư tử cung. 250 ml mỡ đã được hút ra và tách được 5 ml hỗn dịch giàu tế bào,
có chứa 3,8 × 107 tế bào. Sau khi mở ổ, vết thương được phủ bởi tấm da nhân tạo có
tẩm dung dịch có chứa tế bào gốc mỡ tự thân cùng với yếu tố tạo mạch và kích
thích phân bào bFGF. Vết thương đã lành ở ngày 82 sau khi mổ. Phác đồ điều trị
ngoài sử dụng tế bào gốc còn bổ sung FGF.
Rigotti và cs tiêm khoảng 60 – 80 ml hỗn hợp tế bào có nguồn gốc từ mô mỡ
tự thân của 20 bệnh nhân bị tổn thương da do xạ trị gây ra (xơ hóa, teo, co rút da,
loét) [40]. Các bệnh nhân được tiêm 1 – 6 lần (trung bình 2 lần) tùy mức độ nặng
nhẹ và được theo dõi từ 18 – 33 tháng. Họ quan sát thấy có sự cải thiện trong thang
điểm LENT-SOMA ở 19 bệnh nhân (chiếm 85%). Có 8 bệnh nhân loét và tất cả
trong số họ đã lành vết thương. Các kết quả sinh thiết da sau điều trị đều cho thấy
có sự hình thành mạch máu mới.
1.6.2. Ứng dụng trên điều trị vết loét mạn tính do tiểu đường
Han và cs đã sử dụng tế bào được phân lập từ mô mỡ vào việc điều trị vết
loét ở chân do tiểu đường. 54 bệnh nhân có vết thương không lành dù đã được điều
trị theo quy trình tiêu chuẩn trên 6 tuần được chọn ngẫu nhiên vào nhóm đối chứng
(n = 26) và nhóm điều trị (n = 28). Mô mỡ bụng được thu thập và xử lý với
collagenase và lọc để có hỗn hợp tế bào với số lượng khoảng 4 × 106 -8 × 10
6. Hỗn
hợp này sau đó được trộn với fibrinogen và thrombin rồi bôi lên các vết thương.
Bệnh nhân trong nhóm đối chứng chỉ được bôi hỗn hợp fibrinogen và thrombin mà
không có tế bào. Hai bệnh nhân trong nhóm điều trị đã được loại ra do bị nhiễm
trùng. Sau 8 tuần, 100% bệnh nhân trong nhóm điều trị đã lành vết thương hoàn
toàn trong khi con số này ở nhóm đối chứng chỉ là 16 bệnh nhân, chiếm 62%. Toàn
bộ thời gian chữa bệnh là 33,8 ± 11,6 ngày ở nhóm điều trị và 42,1 ± 9,5 ngày ở
21
nhóm đối chứng. Các tác giả không nhận thấy bất kỳ biến chứng nào liên quan đến
việc bôi các tế bào gốc mỡ lên vết thương [23].
Bên cạnh một số ứng dụng kể trên, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ còn được
sử dụng để tái tạo da, xương [34, 41, 46], tái tạo mô gan và cải thiện chức năng gan
[6], sửa chữa một số tổn thương trên tim và mạch máu [52],…
1.7. Đánh giá an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh
Liệu pháp điều trị sử dụng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ là một liệu pháp
đầy hứa hẹn trong điều trị nhiều bệnh khó nhờ những ưu điểm lớn như sự có mặt
của chúng trong cơ thể trưởng thành tương đối phong phú và dễ tái tạo, việc phân
lập và nhân rộng tế bào không mấy khó khăn và không bị hệ miễn dịch đào thải.
Cho tới nay, đã có hàng trăm thử nghiệm lâm sàng sử dụng MSCs đã được đăng ký
ở Mỹ tại https://clinicaltrials.gov/ và nhiều nghiên cứu lâm sàng tương tự tại các
quốc gia khác. Do lượng tế bào MSCs có sẵn trong cơ thể khá hạn chế và có xu
hướng tỷ lệ nghịch với tuổi của bệnh nhân [49] nên để ứng dụng được trên lâm sàng
thì các tế bào gốc từ mô mỡ cần được nuôi cấy ngoài cơ thể nhằm thu được một số
lượng tế bào đủ lớn cung cấp cho việc ghép. Tuy nhiên, các tế bào gốc sở hữu một
số đặc điểm đặc trưng của tế bào ung thư: tuổi thọ dài, có khả năng chống lại
apotosis trong chừng mực nhất định, và có khả năng phân chia trong thời gian dài.
Thêm vào đó, các cơ chế điều kiểm soát và các yếu tố điều hòa tăng trưởng đều
tương tự nhau ở cả tế bào ung thư và tế bào gốc [51]. Thêm vào đó, trong quá trình
nuôi cấy in vitro, tế bào gốc trải qua rất nhiều lần phân chia nên vật chất di truyền
dễ bị hư hại dưới ảnh hưởng của các yếu tố nội bào và ngoại bào. Do đó, các bất
thường về di truyền có thể được tích lũy và dẫn tới sự biến đổi thành các tế bào ác
tính [52]. Vì vậy, khả năng tế bào gốc có thể biến thành ác tính được xem là trở ngại
chính trong việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ tế bào gốc vào việc điều trị.
Đặc biệt, đối với bệnh nhân lớn tuổi có vết thương mạn tính - đối tượng có nguy cơ
mắc ung thư tăng theo tuổi tác thì tính an toàn của các tế bào ASCs dùng để ghép
càng cần được đánh giá kỹ lưỡng. Ngoài ra, huyết thanh bê là thành phần bổ sung
được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy có thể là trung gian truyền bệnh
cho bệnh nhân và gây ra phản ứng miễn dịch [31]. Trên lâm sàng, ASCs được đưa
vào sử dụng có thể là ASCs tự thân hoặc đồng loại nên cần có các tiêu chuẩn cho
22
quá trình phân lập, nuôi cấy, bảo quản và sử dụng ASCs trong các ứng dụng lâm
sàng và đánh giá an toàn.
Trên thế giới, việc đánh giá các nguy cơ có thể xảy ra khi sử dụng tế bào gốc
mỡ đã được nghiên cứu khá đầy đủ qua nhiều tiêu chí ở nhiều thế hệ tế bào sau nuôi
cấy tăng sinh [49, 56, 27,], Theo một nghiên cứu của Chua và cộng sự, ASCs sau
khi được nuôi cấy tăng sinh tới thế hệ ít hơn P20 (sau khoảng 42 lần phân chia tế
bào) thì được đánh giá sự thay đổi về hình thái, mức độ biểu hiện gen ức chế khối u,
đột biến p53, hoạt tính telomerase, xác định chiều dài telomere và tiến hành kiểm
tra khả năng hình thành khối u trong điều kiện in vivo. Người ta nhận thấy mức độ
tổn thương DNA xảy ra từ P15 tới P20, không có sự thay đổi đáng kể trong sự biểu
hiện của gen p53 và p21, không có sự thay đổi đánh kể trong nồng độ telomerase và
chiều dài telomere ở tất cả các thế hệ tế bào. Tiếp đó, ASCs ở thế hệ P15 và P20
được cấy trên chuột và tác giả không quan sát thấy sự hình thành khối u trong môi
trường in vivo sau khi cấy ghép 4 tháng. Những dữ liệu này cho thấy, ASCs sau
nuôi cấy tới P20 có rất ít nguy cơ tạo khối u và điều này chỉ ra rằng, mô mỡ là
nguồn tế bào gốc an toàn cung cấp cho liệu pháp tế bào [50].
Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, việc đánh giá sự an toàn của ASCs sau
nuôi cấy tăng sinh thông qua sự đánh giá về mặt hình thái, nhiễm sắc thể đồ
(Karyotype) và định lượng enzyme telomerase của tế bào từ P1 tới P5.
1.7.1. Đánh giá tính an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua
nhiễm sắc thể đồ
Nhiễm sắc thể là một cấu trúc nằm trong nhân của tế bào, được cấu tạo bởi
sợi nhiễm sắc (chromatin), đó là phức hợp giữa DNA và protein. Trong nhân tế bào,
chất nhiễm sắc tồn tại thường xuyên dưới dạng sợi nhiễm sắc mảnh, khó quan sát.
Khi bước vào thời kỳ phân bào, sợi nhiễm sắc bắt đầu đóng xoắn và đạt độ nén cực
đại ở kỳ giữa. Lúc này, nhiễm sắc thể (chromosome) dày hơn và đã ở dạng kép gồm
hai nhiễm sắc tử (chromatid) đính nhau ở tâm động (centromere), chúng có hình
dạng và kích thước đặc trưng nên có thể quan sát và đếm số lượng thông qua kính
hiển vi quang học.
Công thức nhiễm sắc thể ở người hay còn gọi là Nhiễm sắc thể đồ
(Karyotype) được viết dưới dạng: 46,XX hoặc 46,XY. Bất kỳ một thay đổi nào về
23
số lượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể của một tế bào/ quần thể tế bào trong cùng đĩa
nuôi cấy so với công thức nhiễm sắc thể chuẩn, đều có thể dẫn đến các bất thường
trong quá trình phát triển của tế bào/ quần thể tế bào đó.
Trong lâm sàng, nhiễm sắc thể đồ được ứng dụng rộng rãi trong các chẩn
đoán trước sinh, sau sinh để phát hiện ra các bệnh hay dị tật hay hội chứng có liên
quan tới những bất thường về nhiễm sắc thể. Ngoài ra, nhiễm sắc thể đồ còn được
sử dụng trong phân loại và tiên lượng điều trị một số loại ung thư. Chẳng hạn, sự
lặp đoạn của gen NMYC trong nhiễm sắc thể, đặc biệt là mất đoạn nhánh ngắn
nhiễm sắc thể số 1 và thêm đoạn nhánh dài nhiễm sắc thể số 7 có giá trị phân loại và
tiên lượng điều trị u nguyên bào thần kinh [7] .
Việc đánh giá xu hướng biến đổi thành ác tính của các tế bào gốc trung mô
bằng các nghiên cứu di truyền tế bào là việc cần thiết, đặc biệt là nhiễm sắc thể đồ
vì việc duy trì một kiểu nhân bình thường là một chỉ số đáng tin cậy về sự ổn định
về mặt di truyền của MSCs. Nhiễm sắc thể đồ cần được coi là một tiêu chí đánh giá
tế bào trước khi đưa vào sử dụng trong lâm sàng [12].
Kỹ thuật phân tích công thức nhiễm sắc thể là một kỹ thuật di truyền tế bào
được sử dụng trong đánh giá sự ổn định bộ gen của các dòng tế bào, đặc biệt các
dòng tế bào từ các khối u. Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể thường gặp bao gồm: Kỹ
thuật nhuộm băng C, Kỹ thuật nhuộm băng Q, Kỹ thuật nhuộm băng G, Kỹ thuật
nhuộm băng R và Kỹ thuật nhuộm băng N. Trong các kỹ thuật lập karyotype, kỹ
thuật nhuộm band G cho biết nhiều thông tin nhất về đánh giá di truyền của các
dòng tế bào bởi nó cho phép xác định những bất thường cả về mặt số lượng và cấu
trúc của nhiễm sắc thể [12]. Khi sử dụng kỹ thuật nhuộm băng G, trên NST hiện lên
các dải vạch có độ đậm nhạt khác nhau. Đó là do sự bắt màu khác nhau của vùng dị
nhiễm sắc (heterochromatin) và vùng nhiễm sắc thực (euchromatin). Kỹ thuật này,
được thực hiện bằng thuốc nhuộm Giemsa sau khi đã xử lý NST bằng trypsin và
chọn vào kỳ giữa (metaphase) hoặc kỳ tiền giữa (prometaphase) của nguyên phân.
Ở 2 kỳ này, NST cho hình ảnh rõ nét nhất giúp đánh giá được số lượng và cấu trúc
của NST một cách dễ dàng. Đây là phương pháp nhuộm được sử dụng rộng rãi để
đánh giá các bất thường của nhiễm sắc thể về số lượng và cấu trúc. Phương pháp
này đơn giản, dễ làm, chi phí thấp và được ứng dụng rộng rãi.
24
Khi ASCs được cấy chuyền nhiều lần có thể gây ra những biến đổi trong cấu
trúc vật chất di truyền. Meza-Zepeda và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật nhuộm band G
cơ bản và kỹ thuật CGH (comparative genomic hybridization) để phân tích tính ổn
định về mặt di truyền ở mức độ dưới khả năng phát hiện của kính hiển vi của ASCs
sau khi nuôi cấy tăng sinh qua nhiều thế hệ. Kết quả, nhóm nghiên cứu đã nhận thấy
karyotype của ASCs vẫn giữ được trạng thái bình thường [12]. Một nghiên cứu
đánh giá rằng ASCs rất bền vững về mặt di truyền trong điều kiện nuôi cấy, công
thức nhiễm sắc thể vẫn duy trì trạng thái bình thường sau 100 lần phân chia. Tuy
nhiên, nhiễm sắc thể đồ bất thường của MSCs và ASCs của người sau khi cấy
truyền đã được phát hiện trong một số nghiên cứu khác. Chẳng hạn, nhóm nghiên
cứu của C. Bellotti đã tìm thấy 1 đột biến chuyển đoạn của 1 trong số 4 người hiến
mẫu mỡ ở lần cấy chuyền thứ 7 và một người khác trong số 4 người nói trên có đột
biến trisomy trong lần cấy truyền thứ 15 [12].
Công nghệ tế bào gốc gần đây đã và đang được ứng dụng rất nhiều trong y
học để điều trị nhiều bệnh như ung thư hay các tổn thương khó lành,... Tuy nhiên,
để có thể ứng dụng tế bào gốc qua nuôi cấy vào điều trị bệnh thì các nhà nghiên cứu
cần phải chứng minh được rằng tế bào thông qua nuôi cấy phải đảm bảo không bị
thay đổi về cấu trúc và chức năng của NST bởi việc xác định kiểu nhân của ASCs
sau nuôi cấy là một tiêu chí quan trọng trong đánh giá sự ổn định về mặt di truyền
của tế bào ở cấp độ tế bào.
1.7.2. Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua định
lượng enzyme telomerase
Telomere
Telomere là một phức hệ nằm ở mút nhiễm sắc thể. DNA của telome ở động
vật có xương sống là TTAGGG và chiều dài trung bình của telomere khác nhau ở
các cá thể người, dao động từ 5 đến 20 kb tùy theo độ tuổi, tùy cơ quan và số lần
phân chia của mỗi tế bào. Trong quá trình tổng hợp và phân chia DNA, telomere bị
ngắn lại vì một đoạn của telomere không được sao chép bởi enzyme DNA
polymerase. Hiện tượng ngắn lại của telomere là một trong các cơ chế phân tử của
hiện tượng lão hóa do sự giảm chiều dài trầm trọng của các telomere gây ra sự lão
hóa nhiễm sắc thể và khiến cho tế bào bị chết. Nhằm ngăn chặn sự ngắn lại của
25
telomere gây ra bởi sự phân hủy của các exonuclease, sợi đơn telomere đầu 3’ tự do
được cuộn vào vùng D-loop của DNA telomere để tạo ra phức hệ T-loop. Thêm vào
đó, T-loop còn được tăng cường độ bền vững với TRF2 và các protein liên kết với
DNA của telomere như TRF1, POT1, TIN2, TPP1, RAP1…[11]
Hình 1.6. Cấu trúc vùng T-loop của telomere ((theo Blasco, 2003)
Nhờ sự bảo vệ chặt chẽ của các protein cùng cấu trúc “cài then” mà telomere
giúp các nhiễm sắc thể không có “cơ hội” gắn kết với nhau ở đầu tận cùng của
chúng. Telomere của các sinh vật nhân chuẩn có các đặc điểm cấu tạo như sau:
- Có các protein đặc trưng liên kết ở phần đuôi của nhiễm sắc thể.
- Phần DNA tận cùng của nhiễm sắc thể ở dạng sợi đơn, mang trình tự lặp,
cuộn lại thành dạng kẹp tóc.
Mỗi lần phân bào, một người mất trung bình 30 – 200 cặp base ở các
telomere của tế bào đó. Những tế bào bình thường chỉ có thể phân chia khoảng 40 –
70 lần cùng với sự ngắn dần của các telomere cho đến khi lão hóa, chết hoặc duy trì
những sai sót di truyền dẫn đến ung thư. Tuy nhiên, có những trường hợp chiều dài
của telomere không bị ngắn đi (như ở mô cơ tim) do chúng không liên tục phân
chia. Telomere có các chức năng sau:
- Giúp tế bào phân chia mà không làm mất gene. Nếu không có telomere,
những gene cấu trúc quy định những tính trạng của cơ thể sẽ bị rút ngắn dần sau
mỗi lần phân bào.
- Giữ cho các nhiễm sắc thể không bị dung hợp với nhau hoặc tự dung hợp ở
những vị trí tận cùng: Khi cắt bỏ đoạn telomere ở 2 đầu của các nhiễm sắc thể,
26
người ta phát hiện ra nhiều nhóm nhiễm sắc thể dính nhau ở đầu tận cùng, hoặc tự
dính vào nhau ở 2 đầu gây nên sự khép vòng. Chức năng này có được do sự hình
thành cấu trúc kẹp tóc trong telomere: phần DNA tận cùng cuộn xắn lại, giúp cho những
phần DNA mạch đơn không thể kết cặp bổ sung một cách ngẫu nhiên với nhau.
Telomerase và mối liên quan giữa telomerase với bệnh ung thư
Telomerase là một enzyme phiên mã ngược có chứa một phân tử RNA mẫu
cho phép sự sao chép đoạn lặp lại TTAGGG vào đuôi nhiễm sắc thể nhằm duy trì
chiều dài của vùng telomere. Nếu không có telomerase, độ dài của telomere sẽ ngắn
lại sau mỗi lần tế bào phân chia. Khi telomere ngắn đến một độ nào đó, tế bào sẽ
không phân chia nữa và chết theo chương trình.
Tế bào ung thư khác với tế bào bình thường ở hai đặc điểm, đó là sự bất quy
tắc và không giới hạn trong phân chia tế bào. Bệnh ung thư phát sinh khi một tế bào
tích lũy các đột biến di truyền cùng với việc tế bào đó thoát khỏi sự kiểm soát bình
thường trong quá trình phân chia và di cư. Khi các tế bào và các thế hệ tế bào của
nó phân chia không có kiểm soát, chúng sẽ xâm nhập và gây hại mô lân cận. Một số
tế bào đi vào mạch máu và di cư đến các bộ phận trong cơ thể và tạo ra mô ung thư
mới. Telomerase hoạt động trên telomere, có thể góp phần vào sự phát sinh nhiều
bệnh ung thư ở người [10].
Lĩnh vực nghiên cứu ung thư bắt đầu quan tâm tới telomerase và chiều dài
telomere từ những năm 1990. Các thí nghiệm ban đầu cho thấy các telomere bị ngắn
đi ở các nguyên bào sợi khi nuôi cấy nguyên bào sợi qua nhiều thế hệ và telomerase
gần như không hoạt động ở những thế hệ nuôi cấy đầu tiên. Trái lại, khi kéo dài số
lần cấy truyền trên 20 thế hệ, các tế bào bắt đầu có sự biến đổi về hình thái và phân
chia, chiều dài telomere trở nên ổn định và telomerase được hoạt hóa, thể hiện ở sự
gia tăng nồng độ. Điều này gợi ý rằng, telomerase có vai trò nhất định đối với sự
tăng trưởng của các tế bào bất tử trong nuôi cấy. Một số thí nghiệm khác cũng cho
thấy các khối u có telomere ngắn hơn mô bình thường và telomerase được hoạt hóa
ở nhiều khối u mà không biểu hiện ở nhiều mẫu mô lành [10].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng telomerase hoạt động mạnh ở tế bào gốc phôi và
khoảng 85% tế bào ung thư [11, 12, 31].
27
Hình 1.7. Chiều dài telomere và hoạt tính của telomerase ở các dòng tế bào ung
thư phổi (SCLC: Small Cell Lung Cancer): tế bào ung thư biểu mô tuyến và
tế bào ung thư biểu mô vảy (theo Broccoli, 1995)
Trái lại, nồng độ của nó lại rất thấp hoặc gần như không biểu hiện trong các
tế bào soma hay các loại tế bào gốc khác (trong đó có tế bào gốc trung mô). Trên cơ
sở này, telomerase đã trở thành một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán, dự đoán và
điều trị ung thư. Do đó, việc đánh giá tính an toàn của các tế bào gốc mỡ sau nuôi
cấy thông qua đánh giá hoạt tính của enzyme telomerase một tiêu chí lựa chọn quan
trọng và rất cần thiết trước khi cấy ghép chúng vào cơ thể [71].
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tiếng Việt
1. Đinh Văn Hân, Phan Minh Hoàng (2012), “Phân lập, đặc điểm hình thái và khả
năng tạo dòng của tế bào gốc trung mô màng dây rốn”, Tạp chí Y học thảm họa và
Bỏng 1 (2012); pp. 35-43.
2. Đoàn Hoàng Thu (2014), Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ
và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết
thương, Luận văn Thạc sỹ khoa học Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự
nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3. Nguyễn Gia Tiến, Đinh Văn Hân, Đoàn Hoàng Thu (2012), “Chế tạo vật liệu
tương đương trung bì từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều kiện nuôi cấy
không giá đỡ để điều trị vết thương bỏng”, Tạp chí Y học thảm họa và bỏng 3
(2012), pp. 36-42.
4. Trần Văn Hanh (1997), “Quan điểm mô học hiện đại trong quá trình liền vết
thương”, Tài liệu đào tạo sau đại học – chuyên đề mô học, Đại học Y Hà Nội, tr.
141-156.
B. Tiếng Anh
5. Akita S, Akino K, Hirano A, Ohtsuru A, Yamashita S. (2010), “Noncultured
autologous adipose-derived stem cells therapy for chronic radiation injury”, Stem
Cells International, pp. 1-8.
6. Al Battah F, De Kock J, Vanhaecke T, Rogiers V (2011), “Current status of
human adipose-derived stem cells: differentiation into hepatocyte-like cells”,
Scientific World Journal, 11 (), pp.1568-81.
7. Ana CC Paula, Thaís MM Martins, Alessandra Zonari, Soraia PPJ Frade,
Patrícia C Angelo, Dawidson A Gomes, and Alfredo M Goes (2015), “Human
adipose tissue-derived stem cells cultured in xeno-free culture condition enhance c-
MYC expression increasing proliferation but bypassing spontaneous cell
transformation”, Stem Cell Research & Therapy, 6(1), pp. 76.
8. Andrew J.M. Boulton, David G. Armstrong, Stephen F. Albert, Robert G.
Frykberg, Richard Hellman, M. Sue Kirkman, Lawrence A. Lavery, Joseph W.
LeMaster, Joseph L. Mills, Michael J. Mueller, Peter Sheehan and Dane K. Wukich
(2008), “Comprehensive Foot Examination and Risk Assessment. Diabetes
Care, 31(8), pp. 1679-1685.
9. Lauren Collins, Samia Seraj, Thomas Jefferson (2010), “Diagnosis and
Treatment of Venous Ulcers”. American Family Physician, 81(8), pp. 989-996.
10. Armanios M, Greider CW (2005), “Telomerase and cancer stem cells.” Cold
Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 2005 (70), pp. 205-8.
11. Blasco MA (2003), “Mammalian telomeres and telomerase: why they matter
for cancer and aging”, European Journal of Cell Biology; 82(9), pp. 441-6.
12. C. Bellotti, D. Stanco, S. Ragazzini, L. Romagnoli, E. Martella, S. Lazzati, C.
Marchetti, D. Donati, E. Lucarelli (2013), “Analysis of the Karyotype of Expanded
Human Adipose-Derived Stem Cells for Bone Reconstruction of the Maxillo-Facial
Region”, International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 26 (1),
pp. 3-9.
13. Carol W. Greider (1998), “Telomerase activity, cell proliferation, and cancer”,
Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(1), pp. 90–92.
14. Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J (2007), “Concise review:
mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological
features, and potential for homing”. Stem Cells, 25(11), pp. 2739-49.
15. D Broccoli, J W Young, and T de Lange (1995), “Telomerase activity in
normal and malignant hematopoietic cells”, Proceedings of the National Academy
of Sciences 92 (20), pp. 9082–9086.
16. De Lange T, Shiue L, Myers RM, Cox DR, Naylor SL, Killery AM, Varmus
HE (1990), “Structure and variability of human chromosome ends”, Molecular and
Cellular Biology, 10(2), pp. 518-27.
17. E Hiyama, K Hiyama (2007), “Telomere and telomerase in stem cells”, British
Journal of Cancer, 96(7), pp. 1020–1024.
18. Ebrahimian TG, Pouzoulet F, Squiban C, Buard V, André M, Cousin B (2009),
“Cell therapy based on adipose tissue-derived stromal cells promotes physiological
and pathological wound healing”, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular
Biology. 29 (4), pp. 503-10.
19. Erices A, Conget P, Minguell JJBr (2000), “Mesenchymal progenitor cells in
human umbilical cord blood”, British Journal of Haematology, 109(1), pp. 235-42.
20. Frank Werdin MD, Mayer Tennenhaus, MD, Hans-Eberhardt Schaller,
MD, and Hans-Oliver Rennekampff, MdcEplasty (2009), “Evidence-based
Management Strategies for Treatment of Chronic Wounds”, Eplasty.
21. Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Latsinik NV, Panasyuk AF, Keiliss-Borok
IV (1974) “Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the
hemopoietic tissues”, Transplantation, 17(4), pp. 331-40.
22. Fromm-Dornieden C, Koenen P. (2013) “Adipose-derived stem cells in wound
healing: recent results in vitro and in vivo”, Molecul ar & Cell Biology, 20; pp. 1-8.
23. Frykberg RG, Banks J. (2015), “Challenges in the Treatment of Chronic
Wounds”, Advance Wound Care, 4 (9), pp. 560-582.
24. Garcia-Olmo D, Herreros D, Pascual M, Pascual I, De-LaQuintana P, Trebol J
(2009) “Treatment of enterocutaneous fi stula in Crohn’s Disease with adipose-
derived stem cells: A comparison of protocols with and without cell expansion”
International Journal of Colorectal Disease, (24), pp. 27-30.
25. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S (2000), “Postnatal human
dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo”, Proceedings of the National
Academy of Sciences, 97(25), pp. 13625-30.
26. Han SK, Kim HR, Kim WK (2010) “The treatment of diabetic foot ulcers with
uncultured, processed lipoaspirate cells: A pilot study” Wound Repair and
Regeneration, (18), pp. 342-8.
27. Haniffa MA,WangXN, Holtick U, Rae M, Isaacs JD, Dickinson AM, Hilkens
CM, Collin MP (2007), “Adult human fibroblasts are potent immunoregulatory
cells and functionally equivalent to mesenchymal stem cells”, Journal Immunology,
179(3), pp. 1595-604.
28. Harley CB, Futcher AB, Greider CW (1990), “Telomeres shorten during
ageing of human fibroblasts”, Nature, 345(6274), pp. 458-60.
29. Hastie ND, Dempster M, Dunlop MG, Thompson AM, Green DK, Allshire RC
(1990),“Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing”,
Nature, 346(6287), pp. 866-8.
30. J. Bernier, J Bonner, J. B. Vermorken R., J. Bensadoun, R. Dummer, J.
Giralt, G. Kornek, A. Hartley, R. Mesia, C. Robert, S. Segaert K, K. Ang
(2008), “Consensus guidelines for the management of radiation dermatitis and
coexisting acne-like rash in patients receiving radiotherapy plus EGFR inhibitors
for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck”. Annals of
Oncology, 19 (1), pp. 142-149.
31. Josh F1, Kobe K, Tobita M, Tanaka R, Suzuki K, Ono K, Hyakusoku H,
Mizuno H (2012, “Accelerated and safe proliferation of human adipose-derived
stem cells in medium supplemented with human serum’, Journal of Nippon Medical
School, 79(6), pp. 444-52.
32. Jung JW, Kwon M, Choi JC, Shin JW, Park IW, Choi BW, et al. Familial
occurrence of pulmonary embolism after intravenous, adipose tissue-derived stem
cell therapy. Yonsei Medicine Journal. 2013;54:1293-6.
33. K. Kishi, N. Imanishi, H. Ohara (2010), “Distribution of adipose-derived stem
cells in adipose tissues from human cadavers,” Journal of Plastic, Reconstructive
and Aesthetic Surgery, 63(10), pp. 1717–1722.
34. Knippenberg M., Helder M. N., Doulabi B. Z., Semeins C. M., Wuisman P. I.
J. M., Klein-Nulend J. (2005), “Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
acquire bone cell-like responsiveness to fluid shear stress on osteogenic
stimulation”, Tissue Engineering, 11(11-12), pp.1780–1788.
35. Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M.,
Benayahu D., Robey P.G (1997), “Single-colony derived strains of human
marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo”. Journal of
Bone and Mineral Research, 12 (9), pp. 1335–1347.
36. Lin Y, Uemura H, Fujinami K, Hosaka M, Harada M, Kubota Y (1997),
“Telomerase activity in primary prostate cancer”, The Journal of Urology, 157 (3),
pp. 1161–1165.
37. Lipsky BA, Berendt AR, Cornia PB, Pile JC, Peters EJ, Armstrong DG, Deery
HG, Embil JM, Joseph WS, Karchmer AW, Pinzur MS, Senneville E (2012),
“Infectious Diseases Society of America clinical practice guideline for the diagnosis
and treatment of diabetic foot infections”. Clinical Infectious Diseases; 54(12),
pp.132-73.
38. Mamidi MK, Nathan KG, Singh G, Thrichelvam ST, Mohd Yusof NA,
Fakharuzi NA, Zakaria Z, Bhonde R, Das AK, Majumdar AS (2012), “Comparative
cellular and molecular analyses of pooled bone marrow multipotent mesenchymal
stromal cells during continuous passaging and after successive cryopreservation”.
Journal of Cellular Biochemistry, 113(10), 3153-64.
39. Marta García-Contreras, César David Vera-Donoso, José Miguel Hernández-
Andreu, José Manuel García-Verdugo, and Elisa Oltra (2014), “Therapeutic
Potential of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs) from Cancer Patients: A
Pilot Study”, PLoS One, 9(11).
40. Mesimäki K, Lindroos B, Törnwall J, Mauno J, Lindqvist C, Kontio R,
Miettinen S, Suuronen R (2009), “Novel maxillary reconstruction with ectopic bone
formation by GMP adipose stem cells”, International Journal of Oral and
Maxillofacial Surgery, 38(3), pp. 201-9.
41. Meza-Zepeda LA, Noer A, Dahl JA, Micci F, Myklebost O, Collas P (2008),
“High-resolution analysis of genetic stability of human adipose tissue stem cells
cultured to senescence”, Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12(2): 553–
563.
42. Mustoe TA, O'Shaughnessy K, Kloeters O (2006), “Chronic wound
pathogenesis and current treatment strategies: a unifying hypothesis”, Plastic and
Reconstructive Surgery, 117(7), pp. 35-41.
43. Nambu M, Ishihara M, Nakamura S, Mizuno H, Yanagibayashi S, Kanatani Y,
Hattori H, Takase B, Ishizuka T, Kishimoto S, Amano Y, Yamamoto N, Azuma R,
Kiyosawa T. (2007), “Enhanced healing of mitomycin C-treated wounds in rats
using inbred adipose tissue-derived stromal cells within an atelocollagen matrix”,
Wound Repair and Regeneration, 15(4), pp. 505-10.
44. Nie C, Yang D, Xu J, Si Z, Jin X, Zhang (2011), “Locally administered
adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and
vasculogenesis”,Cell Transplantation, 20(2), pp. 205-16.
45. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD,
Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR (1999), “Multilineage
potential of adult human mesenchymal stem cells”, Science 284 (5411), pp. 143-
147.
46. Ranera B, Remacha AR, Álvarez-Arguedas S, Castiella T, Vázquez FJ,
Romero A, Zaragoza P, Martín-Burriel I, Rodellar C (2013), “Expansion under
hypoxic conditions enhances the chondrogenic potential of equine bone marrow-
derived mesenchymal stem cells”. The Veterinary Journal, 195(2), pp. 248-51.
47. Raynaud CM, Maleki M, Lis R, Ahmed B, Al-Azwani I, Malek J, Safadi FF,
Rafii A (2012), “Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from
human placenta and fetal membrane and their response to osteoactivin stimulation”.
Stem Cells International, 2012 (658356).
48. Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk
JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL (2004), “Secretion of
angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells”, Circulation,
109 (10), pp. 1292-8.
49. Riekstina U, Muceniece R, Cakstina I, Muiznieks I, Ancans J (2008),
“Characterization of human skin-derived mesenchymal stem cell proliferation rate
in different growth conditions”. Cytotechnology, 58(3), pp. 153-62.
50. Rigotti G, Marchi A, Galiè M, Baroni G, Benati D, Krampera M (2007),
“Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant: A
healing process mediated by adipose-derived adult stem cells”, Plastic and
Reconstructive Surgery (119), pp. 1409-22.
51. Robert Lanza, John Gearhart, Brigid Hogan, Douglas Melton, Roger
Pedersen, E. Donnall Thomas, James Thomson and Sir Ian Wilmut (2009),
Essentials of Stem Cell Biology, Elsevier, Canada.
52. Rotter N, Oder J, Schlenke P, Lindner U, Böhrnsen F, Kramer J, Rohwedel J,
Huss R, Brandau S, Wollenberg B, Lang S (2008), “Isolation and characterization
of adult stem cells from human salivary glands”. Stem Cells and Development,
17(3), pp. 509-18.
53. Roufosse CA, Direkze NC, Otto WR, Wright NA (2004), “Review Circulating
mesenchymal stem cells”, The International Journal of Biochemistry & Cell
Biology, 36(4), pp. 585-97.
54. Schüring AN, Schulte N, Kelsch R, Röpke A, Kiesel L, Götte M (2011), “
Characterization of endometrial mesenchymal stem-like cells obtained by
endometrial biopsy during routine diagnostics”. Fertility and Sterility, 95(1), pp.
423-6.
55. Sessarego N, Parodi A, Podestà M, Benvenuto F, Mogni M, Raviolo V,
Lituania M, Kunkl A, Ferlazzo G, Bricarelli FD, Uccelli A, Frassoni F (2008),
“Multipotent mesenchymal stromal cells from amniotic fluid: solid perspectives for
clinical application, Haematologica, 93(3), pp. 339-346.
56. Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW (1998),
“Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells”,
Proceedings of the National Academy of Sciences, 95, pp.13726-13731.
57. Tamara Borgonovo, Isadora May Vaz, Alexandra Cristina Senegaglia, Carmen
Lucia Kuniyoshi Rebelatto, Paulo Roberto Slud Brofman (2014) “Genetic
evaluation of mesenchymal stem cells by G-banded karyotyping in a Cell
Technology Center”, Rev Bras Hematol Hemoter, 36(3), pp. 202–207.
58. Umesh D. Wankhade, Michael Shen, Ravindra Kolhe, and Sadanand Fulzele
(2016), “Advances in Adipose-Derived Stem Cells Isolation, Characterization, and
Application in Regenerative Tissue Engineering”, Stem Cells International,
2016(5), pp. 1-9.
59. Vériter S, André W, Aouassar N, Poirel HA, Lafosse A, Docquier PL, Dufrane
D (2015), “Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Cell Therapy:
Safety and Feasibility in Different "Hospital Exemption" Clinical Applications”,
PLoS One, 10 (10).
60. Wan Safwani Wan Kamarul Zaman, Suzana Makpol, Somasundaram
Sathapan, Kien Hui Chua (2014), “Long-term in vitro expansion of human adipose-
derived stem cells showed low risk of tumourigenicity”, Journal of Tissue
Engineering and Regenerative Medicine, 8(1), pp. 67-76.
61. Wang HS, Hung SC, Peng ST, Huang CC, Wei HM, Guo YJ, Fu YS, Lai MC,
Chen CC (2004), “Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human
umbilical cord”. Stem Cells, 22(7), pp. 1330-7.
62. Wellinger R.J., Ethier K., Labrecque P., Zakian V.A.(1996), “Evidence for a
new step in telomere maintenance”,Cell, 85, pp. 423–433.
63. William T Wake (2010), “Pressure Ulcers: What Clinicians Need to Know”.
The Permanente Journal, 14(2), pp. 56–60.
64. Wu XB, Tao R (2012), “Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem
cells”. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International, 11(4), pp. 360-71.
65. Y. Wang, D.L. Huso, J. Harrington, J. Kellner, D.K. Jeong, J. Turney (2005),
“Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM
mesenchymal stem cell culture”, Cytotherapy, 7, pp. 509–519.
66. Young DA, DeQuach JA, Christman KL (2011), “Human cardiomyogenesis
and the need for systems biology analysis”, WIREs Systems Biology and Medicine,
3(6), pp. 666-80.
67. Youwei Wang, Zhi-bo Han, Yong-ping Song, and Zhong Chao Han (2012),
“Safety of Mesenchymal Stem Cells for Clinical Application”, Stem Cells
International, 2012 (2012), pp.1-4.
68. Z.X. Zhang, L.X. Guan, K. Zhang ((2007), “Cytogenetic analysis of human
bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro”, Cell Biology
International, 31 (2007), pp. 645–648.
69. Zimmerlin L, Donnenberg VS, Pfeifer ME, Meyer EM, Péault B, Rubin JP
(2010), “Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue”, Cytometry
Part A , (77), pp. 22-30.
70. Zoe Marie MacIsaac, Hulan Shang, Hitesh Agrawal, Ning Yang, Anna Parker,
and Adam J Katz (2011) ”Long-term In-Vivo Tumorigenic Assessment of Human
Culture-expanded Adipose Stromal/Stem Cells”, Experimental Cell Research,
318(4), pp. 416–423.
71. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC,
Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH (2002) Human adipose tissue is a source of
multipotent stem cells. Mol Biol Cell., 13(12), pp. 4279-95.
72. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz
HP, Hedrick MH (2001), “Multilineage cells from human adipose tissue:
implications for cell-based therapies”. Journal of Tissue Engineering, 7(2), pp.
211-28.