synthese und charakterisierung von limbusepithel-amnion
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Synthese und Charakterisierung
von
Limbusepithel-Amnion-Transplantaten
aus
langzeitorgankonservierten Hornhäuten
und kryokonservierten Amnionmembranen
Inauguraldissertation
zur Erlangung eines doctor medicinae (Dr. med.)
der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus
der Technischen Universität Dresden
vorgelegt von
Tassilo Henkel
geboren am 28.04.1979
in Bad Salzungen
Dresden 2010
Erstgutachter: Prof. Dr. med. K. Engelmann
Zweitgutachter: Prof. Dr. med. G. Breier
Verteidigungstermin: 07.12.2010
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. rer. nat. H. Morawietz
Inhaltsverzeichnis 3
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS...………….……………………………………………………………… 3 1 Einführung .................................................................................................. 5
1.1 Einleitende Gedanken................................................................................................ 5 1.2 Der Aufbau des menschlichen Auges......................................................................... 5 1.3 Die Hornhaut (Cornea) .............................................................................................. 6
1.3.1 Das vordere Hornhautepithel ................................................................................ 7 1.3.2 Die anderen Schichten der Hornhaut ....................................................................8 1.3.3 Versorgung der Hornhaut ...................................................................................... 9
1.4 Die Regeneration des Hornhautepithels.................................................................. 10 1.4.1 Allgemeiner Mechanismus der Zellerneuerung................................................... 10 1.4.2 Stammzellen......................................................................................................... 10 1.4.3 Der Limbus............................................................................................................12 1.4.4 Migration der Hornhautepithelzellen ...................................................................13 1.4.5 Charakterisierung des Zelltypus ...........................................................................15
1.4.5.1 Problematik der eindeutigen Identifizierung................................................15 1.4.5.2 Morphologie ..................................................................................................15 1.4.5.3 Eigenschaften und Verhalten........................................................................16 1.4.5.4 Zellmarker .....................................................................................................17 1.4.5.5 Die Umgebung der Zellen ............................................................................20
1.5 Limbusstammzellinsuffizienz ...................................................................................21 1.5.1 Ätiologie und Pathogenese....................................................................................21 1.5.2 Klinische Manifestation ....................................................................................... 22 1.5.3 Therapiestrategien ............................................................................................... 23
1.6 Das Amnion.............................................................................................................. 24 1.6.1 Embryogenese ...................................................................................................... 24 1.6.2 Aufbau der Eihäute .............................................................................................. 25 1.6.3 Zellmarker ............................................................................................................ 27
1.7 Amnionmembran in der Augenheilkunde ............................................................... 28 1.7.1 Operationstechniken............................................................................................ 28 1.7.2 Klinische Ergebnisse ............................................................................................ 29 1.7.3 Verwendung bei Limbusstammzellinsuffizienz ................................................... 29
1.8 Ex-vivo-Anzüchtung von Limbusepithelzellen auf Amnionmembran....................30 1.8.1 Prinzip und Methodik ..........................................................................................30 1.8.2 Amnionmembran versus andere Unterlagen........................................................31 1.8.3 Konservierung der Amnionmembran.................................................................. 32 1.8.4 Intakte versus deepithelialisierte Amnionmembran ........................................... 32 1.8.5 Explantat versus Zellsuspension.......................................................................... 32 1.8.6 Wachstumsgeschwindigkeit, Morphologie und Auswachsrate ........................... 33 1.8.7 Klinische Ergebnisse ............................................................................................ 33
1.9 Biologische Wirkmechanismen der Amnionmembran............................................ 34 1.9.1 Antientzündlich.................................................................................................... 34 1.9.2 Antiangiogen ........................................................................................................ 35 1.9.3 Antifibrotisch ....................................................................................................... 35 1.9.4 Unterstützung von Proliferation, Migration, Erhaltung des Zellcharakters ....... 35 1.9.5 Immunogenität .................................................................................................... 36
1.10 Ziel dieser Arbeit ...................................................................................................... 37 2 Material und Methodik .............................................................................. 38
2.1 Material .................................................................................................................... 38 2.1.1 Geräte ................................................................................................................... 38 2.1.2 Hilfsmittel und Instrumente................................................................................ 39 2.1.3 Chemikalien .........................................................................................................40
2.1.3.1 Medien und Supplemente ............................................................................40 2.1.3.2 Enzyme und Pufferlösungen .........................................................................41
Inhaltsverzeichnis 4
2.1.3.3 Antikörper und zugehörige Reagenzien........................................................41 2.1.3.4 Sonstiges....................................................................................................... 42
2.1.4 Herstellung von Medium und Pufferlösungen .................................................... 43 2.1.4.1 Kulturmedium für Limbusepithelzellen ...................................................... 43 2.1.4.2 Tris-Puffer .................................................................................................... 44 2.1.4.3 Citrat-Puffer ................................................................................................. 44
2.1.5 Gewebe ................................................................................................................. 44 2.1.5.1 Amnion......................................................................................................... 44 2.1.5.2 Hornhäute und Corneoskleralringe ............................................................. 44
2.2 Methodik .................................................................................................................. 45 2.2.1 Amnionmembran................................................................................................. 45 2.2.2 Hornhäute und Corneoskleralringe ..................................................................... 47
2.3 Ex-vivo-Anzüchtung von Limbusepithelzellen........................................................ 47 2.3.1.1 Isolierung und Wachstum in einer Kulturschale ......................................... 47 2.3.1.2 Kultivierung auf Amnionmembran..............................................................48
2.3.2 Fixierung und Einbettung .................................................................................... 49 2.3.3 Färbungen ............................................................................................................ 50
2.3.3.1 Histochemische Färbungen ......................................................................... 50 2.3.3.2 Immunhistochemische Färbungen .............................................................. 50
2.3.4 Aufbereitung der Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie ............ 52 2.3.5 Statistische Auswertung....................................................................................... 52
2.3.5.1 Einfluss der Kultivierungsmethode ............................................................. 52 2.3.5.2 Einfluss von Spenderalter, Post-mortem-Zeit und Organkultur-Dauer ..... 53
3 Ergebnisse ................................................................................................. 54 3.1 Amnionmembran..................................................................................................... 54
3.1.1 Kryokonservierung............................................................................................... 54 3.1.2 Vernetzung ........................................................................................................... 54 3.1.3 Epithelentfernung ................................................................................................ 56 3.1.4 Immunhistochemie .............................................................................................. 57
3.2 Hornhautepithel....................................................................................................... 59 3.2.1 Morphologie ......................................................................................................... 59 3.2.2 Immunhistochemie ..............................................................................................60
3.2.2.1 Zentrales Hornhautepithel...........................................................................60 3.2.2.2 Limbusepithel .............................................................................................. 62
3.3 Ex-vivo-Anzüchtung von Limbusepithelzellen........................................................ 64 3.3.1 Wachstum in einer Kulturschale.......................................................................... 64 3.3.2 Kultivierung auf Amnionmembran...................................................................... 65 3.3.3 Die Limbusepithel-Amnion-Transplantate ......................................................... 67
3.3.3.1 Morphologie ................................................................................................. 67 3.3.3.2 Immunhistochemie ......................................................................................68
3.4 Statistische Auswertung........................................................................................... 70 3.4.1 Einfluss der Kultivierungsmethode auf die Auswachsrate .................................. 70 3.4.2 Einfluss von Spenderalter, Post-mortem-Zeit und Organkultur-Dauer ............. 72
4 Diskussion ..................................................................................................77 4.1 Amnionmembran......................................................................................................77 4.2 Hornhautepithel.......................................................................................................80 4.3 Limbusepithel-Amnion-Transplantate....................................................................82 4.4 Stammzellen oder TACs? .........................................................................................84 4.5 Statistische Auswertung........................................................................................... 87
5 Zusammenfassung ......................................................................................91 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS………………………………………………………………….. 92 ABBILDUNGSVERZEICHNIS……………………………………………………………………. 93 TABELLENVERZEICHNIS………………………………………………………………………… 95 LITERATURVERZEICHNIS………………………………..……………………………………..96
Einführung 5
1 Einführung
1.1 Einleitende Gedanken
„Um klar zu sehen, genügt oft ein Wechsel der Blickrichtung.“ (Antoine de Saint-Exupéry)
„Klar sehen“ ist, wie man diesem Zitat entnehmen könnte, keine Selbstverständlichkeit – dies
gilt sowohl im übertragenen als auch im eigentlichen Sinne. Das Sehen ist eines der
wichtigsten Sinnessysteme für uns Menschen. Visuelle Eindrücke sind oft die dominantesten.
Durch Sehen nehmen wir unsere Umwelt wahr, treten mit anderen Menschen in Kontakt,
lernen und genießen. Das, was wir mit unseren eigenen Augen sehen, begreifen wir als
Realität. Es gibt viele Vorraussetzungen für ein funktionierendes Sehvermögen. Der
offensichtlichste Teil davon ist natürlich das Auge. Als sehr empfindliches Organ besteht es
aus einer Reihe von verschiedenen hochspezialisierten Geweben. Nur bei unversehrter
Funktion und feinem Zusammenspiel der einzelnen Teile ist ein unbeeinträchtigtes Sehen
möglich.
1.2 Der Aufbau des menschlichen Auges
Einen kurzen Überblick über den Aufbau des Auges soll Abbildung 1.1 geben. Das Licht fällt
durch das Auge und bildet hinten auf der Netzhaut (Retina) ein umgekehrtes, verkleinertes
Bild der Umwelt. Die Netzhaut, wie auch andere Teile des Auges, ist embryologisch
ektodermaler Herkunft, dass heißt, sie ist als Ausstülpung des Gehirns zu verstehen. Hier
wird Licht in elektrische Signale umgewandelt, verarbeitet und zum Gehirn weitergeleitet.
Voraussetzung dafür, dass ein Bild auf der Netzhaut entstehen kann, ist der vorgeschaltete
optische Apparat. Dieser besteht von vorne betrachtet aus Hornhaut, vorderer Augen-
kammer, Linse und Glaskörper. Wie z. B. in einem Mikroskop wird das einfallende Licht an
den einzelnen Teilen gebrochen. Das ist nur möglich, wenn diese Gewebe auch durchsichtig
sind und das Licht in seinen Eigenschaften wie Wellenlänge, Polarisation und Stärke
möglichst wenig verändern. Diese Lichtdurchlässigkeit ist in anderen Organen kaum zu
finden und wird durch verschiedene aktive und passive Mechanismen erreicht. Ganz
entscheidend ist dabei der Aufbau der Gewebe. Hier gibt es immer gleich ausgerichtete und
parallel verlaufende Fasern mit einheitlichem Durchmesser, kaum Zellen und keine
Blutgefäße. Daneben existieren aber auch aktive Prozesse wie z. B. Pumpen, die ständig
Wasser aus der Hornhaut entfernen, und sie so durch die relative Wasserarmut entquollen
und damit klar halten.[12]
Einführung 6
1.3 Die Hornhaut (Cornea)
Die Hornhaut ist der vorderste Teil des Auges und seine Begrenzung nach außen. Neben
einer Barriere- und Schutzfunktion ist sie wichtiger Bestandteil des optischen
Abbildungsapparates. Embryologisch ist nur das vordere Corneaepithel ektodermaler
Herkunft,[152] was die gelegentliche Beteiligung bei endogenen Hauterkrankungen erklärt.
Alle tieferen Bestandteile stammen vom Mesenchym ab. Auf der Hornhautvorderfläche
schwimmt der dünne Tränenfilm. Er hat einen dreischichtigen Aufbau, bewirkt eine glatte
optische Oberfläche und ist zudem für die Ernährung der oberen Hornhautschichten von
entscheidender Bedeutung. Die unterste Schleimschicht des Tränenfilms ist verbunden mit
der relativ dicken Glykokalyx (in der Zellmembran verankerte Zuckereiweiße) der
Hornhautepithelzellen. Man sieht in Abbildung 1.1, dass die Hornhaut eine stärkere
Krümmung als der restliche Augapfel hat, was ihre starke Brechkraft von mehr als 40
Dioptrien bewirkt. Am Rand ist sie keilförmig, wie ein Uhrglas in die Lederhaut (Sklera)
eingesetzt. Die etwa einen Millimeter breite Übergangszone bezeichnet man als Limbus, was
aus dem Lateinischen kommt und soviel wie Saum bedeutet. Bis zu dieser Stelle reicht auch
von außen die Bindehaut (Conjunctiva). Die Cornea ist nicht an allen Stellen gleich dick, so
ist sie im Zentrum mit 0,52 mm etwas dünner als in der Peripherie mit 0,67 mm. Auch ist sie
Abbildung 1.1: Aufbau des Auges
modifiziert aus Netter[126]
Einführung 7
Abbildung 1.2:
Aufbau der Hornhaut
modifiziert aus Benninghoff[12]
nicht kreisrund, sondern hat eine leicht elliptische Form. Der horizontale Durchmesser ist
mit 11,6 mm etwas größer als der vertikale mit 10,6 mm. Der zentrale Abschnitt von 4 mm ist
absolut sphärisch. Hier liegen die vordere und hintere Fläche parallel zueinander. Die
Hornhaut besitzt an ihrer Vorderfläche (gegen die Luft) die stärkste Brechkraft. Aus diesem
Grunde werden die Maßverhältnisse hier extrem konstant gehalten. Schon kleinste
Abweichungen führen zu gravierenden Abbildungsfehlern. Sie ist frei von Gefäßen und wird
über Lymphspalten ernährt.[125]
Die Hornhaut hat einen charakteristischen 5-schichtigen Aufbau:
1. Vorderes Hornhautepithel (Epithelium anterius)
2. Bowman-Membran (Lamina
limitans anterior)
3. Stroma (Substantia propria)
4. Descemet-Membran (Lamina limitans posterior)
5. Hornhautendothel (Epithelium
posterius)
1.3.1 Das vordere Hornhautepithel
Eigentlich ist der Name Hornhaut falsch, denn sie, bzw. das Epithel, welches ihr aufliegt, ist
keinesfalls verhornt. Es ist ein mehrschichtiges, unverhorntes Plattenepithel, das aus fünf bis
sechs Zelllagen besteht. Mit einer Höhe von ca. 50-70 µm stellt es ca. 1/10 der gesamten
Hornhautdicke dar. In der Limbusregion geht es in das Bindehautepithel über. Es finden sich
besonders am Rand der Cornea zwischen den Epithelzellen auch vereinzelt Langerhans-
Zellen, Melanozyten, Histiozyten und Lymphozyten. Die Epithelzellen sitzen auf einer
typischen Basallamina (Kollagen Typ IV und verschiedene Laminine), welche von ihnen
gebildet wird und regenerationsfähig ist. Man unterscheidet verschiedene Zelltypen, die, je
nachdem in welcher Schicht des Epithels sie liegen, eine andere, charakteristische Form
haben. Dies kann man sehr gut in Abbildung 1.2 erkennen. Die unterste Schicht (Stratum
basale) besteht aus den Basalzellen. Diese sind relativ hoch, kubisch bis säulenförmig und
über Hemidesmosomen in der Basalmembran verankert. Verankerungsfibrillen (Kollagen
Typ VII) reichen in die Bowman-Membran hinein. Die mittleren Zellen (Stratum
intermedium) sind nach außen hin konvex gekrümmt und werden Flügelzellen genannt. Die
oberste Schicht, das Stratum superficiale, besteht aus abgeplatteten Epithelzellen, die im
Einführung 8
Durchmesser ca. 5 µm groß sind. Die Spalten zwischen ihnen sind durch Zonulae occludentes
verschlossen. Die äußere Oberfläche ist vielfach gefaltet (Mikroplicae) und von unzähligen
kleinsten Ausstülpungen (Microvilli) übersät. Auf diesen sitzt die oben schon erwähnte
Glykokalyx. Einerseits ist diese Zuckerschicht die essentielle Verbindung zum Tränenfilm,
andererseits besitzt sie auch Bindungsstellen für die Immunglobuline, die im Tränenfilm
vorhanden sind. Alle Epithelzellen sind durch Desmosomen, Adhärenskontakte und Nexus
miteinander verbunden. Für Transportvorgänge sind sie deshalb wie eine Einheit, ein
Synzytium, zu betrachten. Es eliminiert z. B. Lactat (anaerobe Glykolyse der Cornea) aus dem
Stroma und Epithel und gibt es in den Tränenfilm ab. Diese Transportleistung des vorderen
Epithels ist für die Transparenz der Hornhaut notwendig.
Die normale Erneuerungsrate des Hornhautepithels beträgt sieben bis zehn Tage. Bei
Verletzungen des Hornhautepithels entwickeln benachbarte Epithelzellen schon nach einer
Stunde Pseudopodien, lösen sich und können wie Amöben über die erodierte Oberfläche
auswandern und sie innerhalb kurzer Zeit wieder mit einer kontinuierlichen Epithelschicht
bedecken. Bei kleineren Verletzungen geschieht dies innerhalb von 24 Stunden, bei voll-
ständigem Verlust des Epithels erfolgt die Reepithelialisierung vom Rand aus und benötigt
vier bis sieben Tage. Fehlt eine Basallamina, kommt es zwar zur ebenso schnellen Re-
epithelialisierung, eine feste Verbindung mit dem Stroma ist dann aber stark verzögert. Das
neue Epithel kann selbst durch minimales Trauma, z. B. einen Lidschlag, wieder abradiert
werden Die Synthese einer neuen Basallamina mit einer normalen Verbindung zur darunter
liegenden Bowman-Membran bzw. zum Stroma dauert bis zu mehreren Monaten. Bio-
mikroskopisch erscheinen neugebildete apikale Epithelzellen hell (noch wenige Mikrovilli),
mit zunehmendem Alter werden sie dunkler.[125]
1.3.2 Die anderen Schichten der Hornhaut
Bowman-Membran
Die Bowman-Membran darf nicht mit der Basalmembran des Epithels verwechselt werden.
Sie ist eine 8-14 µm dicke unelastische Schicht aus verschiedenen Kollagenfasern. Sie ist
zellfrei und setzt Verletzungen einen stärkeren Widerstand entgegen als das Epithel, im
Gegensatz zu diesem ist sie allerdings nicht regenerationsfähig.
Stroma
Das Stroma nimmt mit 500 µm rund 90 % der gesamten Hornhautdicke ein. Es besteht aus
kollagenen Fasern, Hornhautzellen (Keratozyten) und der sogenannten Kittsubstanz. Die
Fasern liegen in Lamellen gebündelt und kreuzen und verflechten sich untereinander.
Zueinander und zur Oberfläche verlaufen die einzelnen Schichten jedoch parallel. Die
Keratozyten liegen als platte Zellen dazwischen, bilden die Fasern und die Kittsubstanz und
sind mit Ausläufern untereinander verbunden. Das Stroma ist ein ausgesprochen
Einführung 9
bradytrophes Gewebe, das sich aufgrund seiner Gefäßfreiheit nur langsam und unter
Narbenbildung regeneriert. Es ist nicht elastisch.
Descemet-Membran
Die Descemet-Membran schließt sich dem Stroma nach hinten an. Im Gegensatz zur
Bowman-Membran ist sie elastisch und regenerationsfähig. Sie ist ca. 10 µm dick und wird
von den Endothelzellen gebildet.
Endothel
Das Endothel ist eine einschichtige Lage aus hexagonalen Zellen, deren Interzellularspalten
durch Zonulae occludentes abgedichtet sind. Durch seine Pumpfunktion wird die Hornhaut
von Wasser befreit und so klar gehalten. Die Zellen sind nicht regenerationsfähig. Defekte
können also lediglich durch Zellvergrößerung und gleichzeitige Abplattung ausgeglichen
werden. Die Zelldichte nimmt mit zunehmendem Alter ab. Eine hohe Zelldichte ist z. B. sehr
entscheidend für den Erfolg einer Hornhauttransplantation.
1.3.3 Versorgung der Hornhaut
Die Hornhaut besitzt im Normalfall keine Blutgefäße, jegliche Vaskularisation ist also
krankhaft. Die Gefäße reichen von der Lederhaut und Bindehaut nur bis zum Limbus und
bilden dort ein Randschlingennetz, welches einen Teil der Versorgung übernimmt. Die
Hornhaut ist von beiden Seiten von hypertonen Flüssigkeitsschichten, dem Kammerwasser
und der Tränenflüssigkeit, umgeben. Das Epithel wird über den Tränenfilm versorgt. Die
wichtigste Sauerstoffquelle ist im Wachzustand der atmosphärischen Sauerstoff, beim
Schlafen die Bindehautgefäße des Oberlides. Für die Versorgung des Endothels ist das
Kammerwasser zuständig. Nähr- und andere Stoffe dringen aus den Gefäßen in die
Flüssigkeiten und gelangen so zur Hornhaut, jedoch nimmt die Konzentration zur Mitte hin
erheblich ab. Sowohl das Epithel an der Vorder- als auch das Endothel an der Rückseite
entziehen dem kornealen Stroma durch verschiedene Pumpmechanismen ständig aktiv
Wasser und führen dies den angrenzenden Flüssigkeitsschichten zu. Somit ist die
Transparenz der Hornhaut eine Stoffwechselleistung dieser beiden Zellschichten, die auch
den Hauptenergieverbrauch aufweist.[7] [125] [144]
Einführung 10
1.4 Die Regeneration des Hornhautepithels
1.4.1 Allgemeiner Mechanismus der Zellerneuerung
Alle mehrschichtigen Epithelien unterliegen einer steten Erneuerung. An der Oberfläche
werden ständig Zellen abgestoßen, die dann durch die darunterliegende Schicht ersetzt
werden. So wandern die Zellen quasi von unten nach oben, was man auch als vertikale
Migration bezeichnet. Die unterste, der Basalmembran aufsitzende Schicht, besteht aus
sogenannten Stammzellen. Diese teilen sich und schieben damit die anderen Zellen nach
oben. Hierbei zeigen sich jedoch einige Besonderheiten der Hornhaut:
1. Die basale Zellschicht erscheint reifer und differenzierter als bei anderen
mehrschichtigen Epithelien.
2. Tumore, die meist von undifferenzierten Zellen abstammen, treten in der Hornhaut
so gut wie nie auf, wenn, dann werden sie nur peripher in der Übergangszone zur
Bindehaut beobachtet.[30]
3. Die Epithelzellen der Hornhaut unterliegen einer zentripetalen Migration, das heißt,
sie wandern ständig vom Rand zum Zentrum.[93]
Diese zunächst seltsam anmutenden Eigenschaften kann man besser verstehen, wenn man
die Stammzellen des Hornhautepithels genauer analysiert.
1.4.2 Stammzellen
Definition
Was genau sind Stammzellen? Stammzellen sind definiert als Zellen, die undifferenziert sind
und sich unbegrenzt teilen können. Sie stellen im Embryo das Ausgangsmaterial jeglicher
Organentwicklung und im erwachsenen Organismus die Grundlage aller regenerations-
fähigen Gewebe dar (z. B. Haut, Schleimhäute, blutbildende Zellen des Knochenmarks). Aus
ihnen entwickelt sich mindestens eine Art von hochdifferenzierten Zellen. Man unterscheidet
verschiedene Formen: zum einen pluripotente Stammzellen, welche verschieden aus-
differenzierte Zellen eines Gewebes bilden können und monopotente Stammzellen, die nur
eine Zellart bilden.
Eigenschaften von Stammzellen
Die Stammzellen im erwachsenen Organismus haben charakteristische Eigenschaften: Sie
haben ein hohes Proliferationspotenzial, teilen sich im gesunden Gewebe jedoch selten
(sogenanntes slow-cycling). So muss die DNA nur selten repliziert, damit verbundene
Ablesefehler können minimiert werden. Durch verschiedene Stimuli, wie z. B. eine
Verwundung, ist es jedoch möglich, eine hohe Teilungsrate zu induzieren. Es sind relativ
kleine Zellen, die strukturell und biochemisch eher primitiv erscheinen und keine oder
Einführung 11
wenige differenzierte Produkte enthalten (z. B. wenige Zell-Granula).[147] An sonnenexponier-
ten Stellen sind sie oft stark pigmentiert.[93] Dies dient dem Schutz vor DNA-schädigender
Strahlung, die zum Tod der Zelle oder zu Tumoren führen kann.
Asymmetrische Teilung
Stammzellen haben Strategien, einerseits differenzierte Zellen zu bilden, andererseits aber
auch sich selbst zu erhalten. Die Grundlage hierfür ist die sogenannte asymmetrische
Teilung. Aus einer Stammzelle entstehen zwei Tochterzellen. Eine davon ist wiederum eine
Stammzelle, die andere jedoch reift zur ausdifferenzierten Zelle. Dieser Vorgang erfolgt über
verschiedene Vorläuferzellen, die man auch oft „transient amplifying cells“ (TACs) nennt,
was soviel wie „vorübergehend proliferierende Zellen“ bedeutet.[194] In Abbildung 1.3 wird
dieser Mechanismus schematisch dargestellt.
Transient amplifying cells (TACs)
Transient amplifying cells (TACs) besitzen andere Eigenschaften als Stammzellen. Sie
können sich nur noch begrenzt oft teilen, tun dies im Gegensatz zu diesen jedoch häufig. Ihre
Hauptaufgabe ist es, die Anzahl der ausdifferenzierten Zellen, die sich aus einer
Stammzellteilung ergeben, zu erhöhen. Während der Teilungen und des Reifungsprozesses
verlieren sie immer mehr ihrer Proliferationskapazität und nähern sich der aus-
differenzierten Zelle an – in Morphologie, Bildung verschiedener charakteristischer Produkte
und Funktionen.[93] So kann man frühe, unreifere und späte, reifere Vorläuferzellen (TACs)
unterscheiden.
Abbildung 1.3: Stammzellteilung
modifiziert nach Watt FM et al.[194] Eine Stammzelle (S) teilt sich asymmetrisch. Es entstehen wiederum eine Stammzelle (dünner gebogener Pfeil) und eine zur Ausdifferenzierung bestimmte Zelle (P). Diese reift und teilt sich über Vorläuferzellen (transient amplifying cells – TACs) zu differenzierten Zellen. Die Regulation der Teilung und die Entscheidung für entweder den Erhalt des Stammzellcharakters oder die Differenzierung geschieht einerseits durch intrinsische Mechanismen, aber auch durch Kommunikation mit der Umgebung (dicke Pfeile). Diese sind z. B. Nischenzellen oder die extrazelluläre Matrix.
Stammzelle
Nischenzelle extrazelluläre Matrix
differenzierte Zelle Vorläuferzelle (TAC)
Einführung 12
Regulation des Zellcharakters – die Stammzellnische
Hier stößt man auf eine der wichtigsten Fragen der Stammzellforschung: Wie wird bestimmt,
welche Tochterzelle eine Stammzelle bleibt und welche zur Differenzierung bestimmt ist?
Welche Mechanismen und Regulationen erhalten bei einer Zelle den Stammzellcharakter?
Welche bestimmen die Ausdifferenzierung und Reifung? Man weiß inzwischen, dass das
Schicksal einer Zelle sowohl von ihr selbst als auch von ihrer Umgebung abhängt. Zelleigene,
autonome Regulatoren können von äußeren moduliert werden. Beispiele für zelleigene
Mechanismen sind Proteine, die verantwortlich für die asymmetrische Teilung sind;
Kernfaktoren, die die Genexpression und chromosomale Modifikationen steuern; und
chronologische Faktoren, die bestimmen, wie oft sich die Zelle noch teilen kann. Externe
Signale bekommt die Zelle von ihrer Umgebung – einer speziellen Nische, in der sie lebt.
Hier spielen lösliche Faktoren, Zell-Zell-Interaktionen, Integrine und die extrazelluläre
Matrix eine große Rolle.[194] Es besteht also eine enge Beziehung zwischen der Lokalisation
und dem dort residierenden Zelltyp. Ein gutes Beispiel ist die Darmkrypte: am Kryptenboden
befinden sich die Stammzellen, in den unteren zwei Dritteln die Vorläuferzellen (TACs) und
im oberen Drittel der Krypte die postmitotischen, differenzierten Zellen.[162] Die Nischen der
Stammzellen liegen meist sehr versteckt und geschützt. Sie bieten den Zellen einen guten
Schutz gegenüber Beeinflussungen verschiedener Art (mechanisch, physikalisch etc.). Dies ist
von entscheidender Bedeutung, da bei Stammzellen unbedingt eine fehlerfreie Teilung
gewährleistet sein muss. Eine Schädigung der Erbsubstanz kann fatale Folgen haben, wie
etwa den Tod der Zelle oder den Beginn eines Tumors.
1.4.3 Der Limbus
Auch den geschützen Platz der Hornhautstammzellen kennt man mittlerweile. Die ca.
1-2 mm breite, stärker pigmentierte Übergangszone zwischen Cornea und Bindehaut nennt
man Limbus. Hier findet man morphologische Strukturen, die auch als ‚Vogts Palisaden’
bekannt sind.[100] Wie in Abbildung 1.4 c dargestellt, sind diese mikroskopisch als dunkle,
radiär angeordnete Streifen zu erkennen.
Im Limbusbereich ist an manchen Stellen die Oberfläche der Hornhaut etwas erhaben. Hier
senken sich Vertiefungen, sogenannte Krypten, in das Hornhautstroma, welche Epithelzellen
und deren Stammzellen enthalten.[25] Die Zellen sind hier durch die Pigmentierung gut vor
Sonnenlicht geschützt und dadurch, dass sie tiefer liegen, auch sicherer vor anderen äußeren
Einflüssen. Die Öffnungen der Krypten zeigen zur Hornhautmitte hin. Somit beherbergt der
Limbus als Übergangsregion einerseits die Stammzellen des Hornhautepithels, stellt aber
andererseits auch eine Barriere gegenüber dem Bindehautepithel dar,[9] dessen Zellen aus
einer anderen Stammzellpopulation im Fornix entstammen.[93]
Einführung 13
1.4.4 Migration der Hornhautepithelzellen
Das oben erläuterte Modell von Stammzellnische, asymmetrischer Teilung und
Differenzierung lässt sich sehr gut auf das Hornhautepithel übertragen. Man unterscheidet
auch hier die verschiedenen Differenzierungsstufen: die Stammzelle (stem cell, SC), die
Vorläuferzelle (transient amplifying cell, TAC) und die ausdifferenzierte Zelle (terminally
differentiated cell, DC).
Die Krypten im Limbusbereich enthalten die Stammzellen. Durch Teilung entstehen
wiederum Stammzellen und Vorläuferzellen (TACs). Einige TACs bewegen sich Richtung
Zentrum, reifen und differenzieren dabei immer mehr. So unterscheidet man jüngere TACs
in der peripheren Hornhaut von älteren TACs im Zentrum, wobei die jüngeren noch ein
a
Limbus
d
Hornhaut
c
b
Abbildung 1.4: Die Limbusregion in Aufsicht (a, c) und Querschnitt (b, d)
modifiziert nach www.univ-lille3.fr (a), www.city.ac.uk (b), Investigative Ophthalmology & Visual Science[31] (c) a) Der Limbus ist die schmale Übergangszone zwischen Hornhaut und Bindehaut. c) ‚Vogts Palisaden’ erkennt man als radiäre, dunkle Streifen. b) Im Limbusbereich liegt unter dem Epithel ein lockeres Bindegewebe mit Blutgefäßen. d) Schnitt durch eine Krypte. HE-Färbung. Die Hornhautoberfläche ist etwas erhaben und im Stroma befindet sich eine Ansammlung von Epithelzellen. Die Öffnung der Krypte zeigt in Richtung Hornhaut. Darunter erkennt man lockeres Bindegewebe, das einige Blutgefäße (rot) enthält.
Einführung 14
größeres Proliferationspotenzial haben als die älteren. Zu jedem Zeitpunkt gibt es neben
dieser zentripetalen, horizontalen Migration auch eine vertikale. Die Zellen wandern
schichtweise nach oben und reifen dabei zu differenzierten Zellen (DC). Die Antriebskraft
hinter diesen Bewegungen ist nicht genau bekannt. Man vermutet, dass einerseits die
Abschilferungsrate des Epithels im Zentrum höher sein könnte als in der Peripherie und so
eine Art Sog entsteht, oder andererseits dass sich die jüngeren TACs in der Peripherie
häufiger teilen als die älteren im Zentrum und so ein Druck zur Mitte hin entsteht.[93]
Veranschaulicht wird dies in Abbildung 1.5.
Bowman-Membran
Blutgefäße
Stammzellnische
Abbildung 1.5: Migration
und Differenzierung des
Hornhautepithels
modifiziert nach Lavker et al.[93] In der Stammzellnische im Limbusbereich sitzen die Stammzellen (SC). Durch Teilung entstehen transient amplifying cells (TACs), die zum Zentrum der Hornhaut migrieren, und dabei reifen (TAC-1, TAC-2, TAC-3). Neben dieser zentripetalen Migration gibt es eine vertikale Wanderung der Zellen nach oben, bei der sie zu reifen Zellen (differentiated cells – DC) werden. Die dicken senkrechten Pfeile stellen die Abschilferung des Epithels dar.
Einführung 15
1.4.5 Charakterisierung des Zelltypus
1.4.5.1 Problematik der eindeutigen Identifizierung
Es gibt keine exakten Angaben, welchen Anteil die Stammzellen an der Gesamtpopulation
der Hornhautzellen haben, man schätzt zwischen 0,5 und 10 %.[147] Leider ist zur Zeit auch
noch kein biochemischer Marker bekannt, der spezifisch für diese Stammzellen ist. Eine
eindeutige Identifizierung und Unterscheidung ist demzufolge sehr schwierig. Aus diesem
Grund bedient man sich ihrer Morphologie, Eigenschaften und ihrem Verhalten wie
Zellkinetik, um sie mit Kombinationen aus verschiedenen Markern zu identifizieren.[91]
1.4.5.2 Morphologie
Die Zellen in der Basalschicht der Limbusregion sind mit 10,1±0,8 µm deutlich kleiner als die
Basalzellen des übrigen Hornhautepithels (17,1±0,8 µm). Mittels Elektronenmikroskop kann
man schon rein morphologisch in den Krypten der Limbusregion mehrere Zelltypen
unterscheiden. Kleinere primitiv erscheinende Zellen sind umgeben von größeren, melanin-
haltigen Zellen. In den kleineren Zellen, die wahrscheinlich die Stammzellen sind, findet man
einen heterochromatinreichen Kern ohne deutlich abgrenzbare Nucleoli. Die Kern-Plasma-
Relation ist groß. Das spärliche Zytoplasma enthält winzige Melanin-Granula und nur wenige
Mitochondrien, Ribosomen und Intermediärfilamente. Zytoplasmaausstülpungen, Hemi-
desmosomen und interzelluläre Kontakte sind kaum vorhanden. Die größeren Zellen, die
wahrscheinlich die erste Generation der transient amplifying cells (TACs) darstellen, besitzen
in ihrem Kern mehr Euchromatin und deutliche Nucleoli. Im Zytoplasma entdeckt man
prominente Melanin-Granula und Filamentbündel. Zellausstülpungen sind mit der Matrix
verzahnt und es finden sich zahlreiche (Hemi)desmosomen.[150]
Einführung 16
1.4.5.3 Eigenschaften und Verhalten
Die Eigenschaften und das Verhalten der Hornhautepithelstammzellen bzw. -TACs
entsprechen denen der Stammzellen im allgemeinen und wurden oben schon erwähnt.[82] [90]
[20] [87] [183] [96] [92] [150] [29] [48]
Tabelle 1.1 listet diese noch einmal auf und unterscheidet hierbei zwischen zentraler
Hornhaut und Hornhaut der Limbusregion.
Weitere Untersuchungen zur Barrierefunktion der kornealen Epithelstammzellen ergaben,
dass die Limbusepithelzellen eine durch Fibroblasten aktivierte Angiogenese hemmen und so
entscheidend zur kornealen Avaskularität beitragen.[108]
Eigenschaft experimenteller Nachweis Limbusregion Zentrale Hornhaut
Slow-cycling label-retaining cells +++ -
Hohes proliferatives Potenzial
in-vitro-Vermehrung und Passagierung
+++ -
Relativ undifferenzierter Phänotyp
Fehlen relativ differenzierter Keratine oder anderer
Marker
++++ -
Spezielle stromale Nische Gruppe von label-retaining cells in Kontakt mit
speziellem Mesenchym
+++ locker und vaskularisiert
- dicht und nicht vaskularisiert
Physikalische Nische normalerweise in einer gut geschützten Umgebung
gelegen
++ ‚Vogts Palisaden’/Krypten
- glatte Oberfläche
Pigmentschutz in exponierten Gebieten
Melanin-Anreicherung +++ -
Ursprung von Tumoren vorwiegender Ort der Tumorlokalisation
++++ -
Tabelle 1.1: Eigenschaften der Hornhautstammzellen
modifiziert aus [92]
Einführung 17
1.4.5.4 Zellmarker
Eine umfassende Übersicht über die wesentlichen Zellmarker gibt Tabelle 1.2. Im Text
werden jedoch nur solche näher erläutert, welche in dieser Arbeit verwendet wurden.[89] [72]
Corneaepithel Limbusepithel Konjunktivaepithel
Marker basal suprabasal basal suprabasal basal suprabasal
Zytoplasma- und
Kernmarker
Keratin K3/K12 ++ ++ − + − −
Keratin K5/K14 − oder (+) − + (+) ++ −
Keratin K19 − − ++ − (+) ++
Vimentin − − ++ (+) − −
α-enolase (+) − ++ (+) ++ −
Metallothionein − + (+) + − +
p63 (+) − ++ (+) (+) −
Nestin ++ ++ − − − −
Oberflächenmarker
Connexin 43 ++ + − + − −
E-cadherin ++ ++ (+) ++ (+) oder + ++
P-cadherin (+) − − oder (+) − (+) −
β-catenin ++ ++ ++ ++ ++ ++
Integrin α2 ++ + − oder ++ + ++ ++
Integrin α3 ++ + − oder ++ + ++ +
Integrin α6 ++ + − oder ++ + ++ +
Integrin αv ++ + ++ + ++ +
Integrin β1 ++ + ++ + + +
Integrin β2 + + + + + +
Integrin β4 ++ + − oder ++ + ++ +
Integrin β5 + − + (+) + −
Integrin α3β1 ++ + − oder ++ + ++ +
EGF-R ++ + ++ + ++ +
KGF-R bek − − (+) − − −
HGF-R met (+) − (+) − − −
NGF-R TrkA + (+) + − − oder (+) −
Transferrin-R CD71 − oder (+) + − oder (+) + − oder (+) +
TGF-β-RI ++ + ++ + ++ (+)
TGF-β-RII ++ + ++ + ++ −
ABCG2 − − ++ − − −
Tabelle 1.2: Semiquantitative immunhistochemische Verteilung von Markern auf Epithelzellen der
menschlichen Augenoberfläche
modifiziert aus Experimental Eye Research,[150] – negativ, (+) schwach positiv, + mäßig positiv, ++ stark positiv
Einführung 18
Cytokeratine (CK)
Intermediärfilamente durchziehen die gesamte Zelle und dienen ihr als Stützgerüst. Sie
haben eine eher passive mechanische Funktion und sind bevorzugt in Bündeln angeordnet.
Cytokeratine sind die Intermediärfilamente der Epithelzellen. Diese Proteine sind aus
verschiedenen Untereinheiten aufgebaut. Je ein saures (Typ I) und ein basisches (Typ II)
Molekül lagern sich zu Paaren zusammen. Die Cytokeratine sind außerordentlich heterogen,
man kennt 20 verschiedene Proteine. Unterschiedliche Kombinationen gibt es in
verschiedenen Epithelien und selbst innerhalb verschiedener Schichten desselben Epithels.
Auch die Zellen des Hornhautepithels produzieren mehrere Cytokeratine.[69] Als relativ
spezifisch wird das Cytokeratinpaar CK3/CK12 angenommen. Daneben kommen z. B. aber
auch Cytokeratine von mehrschichtigen Plattenepithelien vor (u. a. CK4, CK15). CK3/12 lässt
sich mit Immunfärbungen in der ganzen Dicke des zentralen Hornhautepithels nachweisen,
im Limbus jedoch nur in den oberen Schichten, nicht in der Basalzellschicht. So nimmt man
an, dass die unreifen Stammzellen diese Filamente noch nicht besitzen, jedoch mit
zunehmender Differenzierung diese exprimieren.[91] [29] [36] [25] [93] [9] [83] [119] [147]
Vimentin
So wie die Cytokeratine in Epithelzellen, ist Vimentin das Intermediärfilamentprotein der
Bindegewebszellen. Nichtepitheliale und nichtneuronale Zellen, wie Fibroblasten,
Endothelzellen sowie andere nichtmuskuläre Mesenchymzellen exprimieren Vimentin.
Ausnahmen sind z. B. Embryonalzellen, manche Epithelzellen und auch andere Zellen, die,
werden sie in vitro kultiviert, dieses Protein exprimieren.
In der Hornhaut sind die Stroma- und Endothelzellen positiv, die Epithelzellen jedoch
negativ für Vimentin. Eine Ausnahme bilden vereinzelte Zellen in der Basalschicht des
Limbusepithels. Diese lassen sich auch mit einer Antikörperfärbung gegen Vimentin
anfärben.[69] [150]
p63
p63 ist ein Transkriptionsfaktor und als solcher nukleär lokalisiert. Das Protein kann zwei
unterschiedliche N-Termini (TA und ∆N) sowie drei unterschiedliche C-Termini (α, β und γ)
haben. Aus der Kombination ergeben sich 6 verschiedene Isoformen.[190] p63 gehört zwar zur
gleichen Familie wie das Tumorsupressorprotein p53, aber über die biochemischen
Funktionen ist viel weniger bekannt. Man nimmt an, dass es bei der Regulation der
Zellteilung und evtl. auch bei der Tumorunterdrückung eine Rolle spielt. Der Faktor wird
hauptsächlich in den stark proliferierenden Zellen der Basalschicht von mehrschichtigen
Plattenepithelien gefunden. Diese Zellen sind Vorläuferzellen und durchlaufen Differen-
zierung und Apoptose. Mäuse mit p63-Mangel besitzen daher keine mehrschichtigen
Plattenepithelien. Zunächst wurde angenommen, mit p63 einen Stammzellmarker gefunden
zu haben.[131] Er findet sich jedoch in fast allen Basalzellen der unterschiedlichsten
Einführung 19
Epithelien,[93] [197] welche aber hauptsächlich zur Gruppe der Vorläuferzellen (transient
amplifying cells – TACs) gehören. Mittlerweile ist bekannt, dass die ∆N-Isoformen wichtig
für das Proliferationsvermögen sind, und die TA (transcriptional activation)-Isoformen eine
große Rolle im Erhalt eines weniger differenzierten Phänotyps spielen. Der Nachweis von
p63 in einer Zelle zeigt demzufolge eine geringe Differenzierung und ein hohes
Proliferationspotenzial an.
Bei dem Hornhautepithel findet sich das p63-Protein nur in der Basalzellschicht und dort
wiederum im Limbus sehr stark, in der peripheren Cornea etwas schwächer und im Zentrum
nur gelegentlich oder gar nicht.[197] So kann die Menge an p63 als Indikator für den Zelltyp
herangezogen werden: Stammzellen besitzen sehr viele, weniger reife TACs weniger und
reifere TACs und ausdifferenzierte Zellen kein p63.[15] [41]
Connexin 43 (Cx43)
Ein Kommunikationskontakt wie der Nexus (gap junction) verbindet zwei Zellen und erlaubt
die Passage kleiner Moleküle von einer Zelle in die Nachbarzelle. Man kann ihn mit einem
Kanal vergleichen, der aus mehreren Bausteinen, den Connexinen, zusammengesetzt ist. Es
gibt verschiedene Connexine, die je nach Zellart und -differenzierung unterschiedlich vor-
kommen. Die Aufgabe solcher Nexus ist die metabolische und elektrische Kopplung zweier
oder mehrerer Zellen. Auf diese Weise miteinander verbundene Zellen bilden eine große
Funktionseinheit – ein Synzytium. Bei der Bezeichnung der Connexine gibt die Indexzahl das
Molekulargewicht an.
Connexin 43 hat demzufolge ein Molekulargewicht von 43 kDa. Connexin 43 (Cx43) wird
z. B. im Herzmuskel, in vielen glatten Muskeln, Nervenzellen, Gefäßendothelzellen und im
Hornhautepithel exprimiert. Im Zentrum der Cornea ist es in allen Epithelschichten sehr gut
nachweisbar, in der Limbusregion dagegen deutlich schwächer. Die Basalschicht färbt sich
hier kaum, so dass man annimmt, dass die Stammzellen kein Connexin 43 exprimieren. Das
Fehlen solcher Kommunikationskontakte zu den Nachbarzellen könnte dazu beitragen, den
Stammzellcharakter zu erhalten.[160] [112] [93] [29]
Einführung 20
1.4.5.5 Die Umgebung der Zellen
Wie schon oben erwähnt, beeinflusst auch die Umgebung den Charakter einer Zelle. Bei
Stammzellen ist dies die Nische, in der sie existieren und sich selbst erhalten können. Auch
im Falle des Hornhautepithels kann man das sehr gut nachvollziehen. Die Limbusregion
unterscheidet sich sehr deutlich von der sonstigen Hornhaut. Die Hornhaut ist frei von
Blutgefäßen, die Epithelzellen sitzen auf ihrer Basalmembran und der darunterliegenden
dichten, zellfreien Bowman-Membran. Im Limbusbereich hingegen findet man ein lockeres,
zellreiches Bindegewebe, das sehr gut innerviert ist und von zahlreichen Blutgefäßen
durchzogen wird.[91] [150] [29]
Basalmembran
Auch die Beschaffenheit der Basalmembran unterscheidet sich an verschiedenen Stellen. Im
Limbusbereich ist sie nur diskontinuierlich vorhanden und weist weniger Hemidesmosomen
als in der übrigen Hornhaut auf. Wahrscheinlich um dies zu kompensieren besitzen die
basalen Zellen hier eine unregelmäßigere Oberfläche und ragen mit ankerartigen Vor-
wölbungen des Zellkörpers in die darunterliegende Matrix. Die Basalmembran im
Limbusbereich besteht weiterhin aus anderen Komponenten als die der zentralen
Hornhaut.[150] Ausführliche Untersuchungen zu der großen Anzahl extrazellulärer
Matrixkomponenten führte die Arbeitsgruppe um Schlötzer-Schrehardt durch.[149]
Einführung 21
1.5 Limbusstammzellinsuffizienz
1.5.1 Ätiologie und Pathogenese
Neben der squamösen Metaplasie durch Störung des Tränenfilms ist die Limbusstamm-
zellinsuffizienz mit folgender Konjunktivalisierung die zweite Form der Augenoberflächen-
dekompensation. Hierbei ist die Regeneration des Hornhautepithels gestört. Dies kann
verschiedene Ursachen haben: einerseits können die Stammzellen selbst primär geschädigt
sein oder das Limbusstroma, d. h. die umgebende spezifische Nische weist primär de-
struktive Veränderungen auf. Weiterhin unterscheidet man angeborene von erworbenen
Erkrankungen. Eine gute Einteilung der verschiedenen Krankheitsbilder ist in Tabelle 1.3
dargestellt.
Verlust von Limbus-
stammzellen
Veränderungen der
Stammzellnische
Hereditär
Aniridie x
Keratitis assoziiert mit multipler endokriner Insuffizienz x
Epidermale Dysplasie (Ectactydyle Epidermal Cleft syndrome) x
Erworben
Verätzungen und Verbrennungen x
Stevens-Johnson-Syndrom, toxische epidermale Nekrolyse x
Multiple chirurgische Eingriffe am Limbus x
Kontaktlinsenassoziierte Keratopathie x
Schwere mikrobielle Infektion mit Limbusbeteiligung x
Anti-Metabolit-Behandlung (5-FU oder Mitomycin C) x x
Bestrahlung x x
Chronische Limbitis x
Periphere ulzerative Keratitis (Mooren’s ulcer) x
Neutotrophe Keratopathie x
Chronische bullöse Keratopathie x
Pterygium x x
Idiopathisch ? ?
Tabelle 1.3: Hornhauterkrankungen mit Limbusstammzellinsuffizienz
modifiziert nach [51] [30] [147]
Einführung 22
1.5.2 Klinische Manifestation
Klinisch äußert sich die Limbusstammzellinsuffizienz durch Einwachsen blutgefäßhaltiger
Bindehaut auf die sonst avaskuläre Hornhaut. Diese sogenannte Konjunktivalisierung geht
einher mit einer chronischen entzündlichen Infiltration des darunterliegenden Stromas,
einer Destruktion der Basalmembran und einer irregulären Hornhautoberfläche mit Ver-
narbungen, rezidivierenden Erosionen und nichtheilenden Hornhautulzera. Die Patienten
klagen häufig über erhöhte Lichtempfindlichkeit, vermindertes Sehvermögen, Lidkrämpfe,
erhöhte Tränensekretion und Schmerzen.[51] Weiterhin ist die Erfolgsprognose einer kon-
ventionellen Hornhauttransplantation bei diesen Patienten sehr schlecht. Zum einen enthält
das klare zentrale Spendergewebe nicht die am Limbus lokalisierten Stammzellen, zum
anderen ist das Risiko einer Transplantatabstoßung durch die bestehende Hornhaut-
vaskularisierung und die chronisch entzündlichen Veränderungen des Stromas erhöht. Zwei
Beispiele einer Limbusstammzellinsuffizienz sind in Abbildung 1.6 dargestellt.
a b
Abbildung 1.6: Klinische Bilder der Limbusstammzellinsuffizienz
a) Bei kontaktlinsen-induzierter Keratopathie, modifiziert aus ‚Der Ophthalmologe’.[118] b) Nach Verätzung mit Abbeizmittel, modifiziert aus ‚Der Ophthalmologe’.[168]
Einführung 23
1.5.3 Therapiestrategien
Als Grundvoraussetzung gilt die Sicherung und ggf. Wiederherstellung der Schutz-
mechanismen der Augenoberfläche. Hierunter versteht man den intakten Tränenfilm, einen
ausreichenden Lidschluss und das Fehlen jeglicher Irritationen. Das weitere Vorgehen richtet
sich nach dem Ausmaß der Limbusstammzellinsuffizienz.
Superfizielle Keratektomie
Bei milden Formen reicht oft die (ggf. wiederholte) Abtragung des konjunktivalisierten
Hornhautepithels. Daraufhin überwächst das benachbarte gesunde Limbusepithel das nun
freigelegte Stroma.
Autologes Konjunktiva-Limbus-Transplantat
Liegt jedoch eine schwerere Erkrankungsform vor, reicht diese Methode oft nicht aus und
eine Limbusstammzelltransplantation wird erforderlich. Bei sektoriellem oder alleinigem
Befall eines Auges entnimmt man gesundes Limbusgewebe ipsi- oder kontralateraler
Hornhaut und transplantiert dieses auf das zuvor präparierte erkrankte Areal. Die Größe des
erforderlichen Transplantates hängt entscheidend vom Ausmaß der Limbusinsuffizienz ab.
So sind z. B. bei einer kompletten Limbusinsuffizienz eines Auges zwei Transplantate
erforderlich. Diese sollten je ca. 90° umfassen und neben der eigentlichen Limbusregion
noch ca. 1-2 mm benachbarter Hornhaut und Konjunktiva enthalten. Der Nachteil dieser
Methode ist somit offensichtlich. Durch die Entnahme großer Flächen intakten Limbus-
gewebes besteht die Gefahr einer iatrogenen Limbusinsuffizienz an zuvor gesunden Arealen.
Weiterhin sind eine Keratitis filamentosa, Pseudopterygien, Mikroperforationen, Hornhaut-
trübungen und -dellen als Komplikationen beschrieben. Der große Vorteil jedoch ist, dass
eine Immunsuppression nicht notwendig wird.
Allogenes/Homologes Konjunktiva-Limbus-Transplantat
Sind beide Augen stark betroffen, wird Limbusgewebe eines fremden Spenders benötigt.
Dieses kann entweder als Lebendspende von einem HLA-typisiertem Verwandten[22] oder
von einem Verstorbenen stammen. Im letzteren Falle ist es möglich, ein lamelläres 360°-
umfassendes Ringtransplantat zu entnehmen. Aufgrund der vorliegenden HLA-
Inkompatibilität ist aber eine systemische Immunsuppression erforderlich.
Amnionmembran
Eine weitere Möglichkeit ist die Anwendung von Amnionmembran. Hier haben sich
vielfältige Verwendungsmöglichkeiten entwickelt, sei es als Verband, Füllmaterial oder
Unterlage für Limbusepithelzellen. Darauf wird genauer in Kapitel 1.7 eingegangen.
Einführung 24
Abbildung 1.7:
Die Plazenta mit den Eihäuten Amnion und Chorion
modifiziert nach: www.adam.com[63]
1.6 Das Amnion
Der Name ‚Amnion’ kommt aus dem
Griechischen und bedeutet soviel wie
Schafshaut – Haut um die Leibes-
frucht.[137] Wie in Abbildung 1.7
veranschaulicht, liegt der Fetus in der
Fruchtblase (auch Amnionhöhle ge-
nannt), die mit Fruchtwasser ausgefüllt
ist. Über die Nabelschnur ist er mit dem
Mutterkuchen (Plazenta) verbunden,
worüber seine Versorgung mit Sauerstoff,
Nährstoffen etc. durch die Mutter
sichergestellt ist. Die Hülle der
Fruchtblase besteht aus verschiedenen
Schichten, wobei die innerste dieser
sogenannten Eihäute das Amnion ist.
1.6.1 Embryogenese
Um zu verstehen, woher das Amnion kommt, wie es entsteht und wovon es abstammt, ist es
nötig, sich zunächst etwas mit der Embryonalgeschichte zu befassen. Man kann die
Entwicklung gut an der Abbildungsfolge 1.8 nachvollziehen. Die befruchtete Eizelle teilt sich
mehrmals und wandert durch die Tube in Richtung Gebärmutter. Zwischen den
entstandenen Zellen bildet sich bald eine kleine Höhle, die Exozölom oder primärer
Dottersack genannt wird. Bald lassen sich zwei verschiedene Zellarten unterscheiden: Der
Embryoblast (rosa), aus dem sich später der eigentliche Embryo entwickelt und der
Trophoblast (ocker), der diesen umgibt und für dessen Ernährung verantwortlich ist. Circa
am 8. Tag kommt es zur Einnistung in die Gebärmutterschleimhaut. Der Embryoblast
differenziert sich wiederum in zwei verschiedenen Zellarten, das Ektoderm (blau) und das
Entoderm (gelb). Aus diesem Grund nennt man ihn zu diesem Zeitpunkt die zweiblättrige
Keimscheibe. Nun entsteht innerhalb des Ektoderms (blau) eine weitere Höhle, die
Amnionhöhle und spätere Fruchtblase. Sie wird zur Embryoseite hin von dem Ektoderm
begrenzt und zur mütterlichen Seite von dem Amnionepithel. Das Amnionepithel entwickelte
sich also aus dem Ektoderm und ist damit kindlicher Herkunft. Im Laufe der Entwicklung,
auf die hier nicht näher eingegangen werden soll, vergrößert sich die Amnionhöhle stetig und
stülpt sich förmlich um den entstehenden Embryo. Sie liegt nun als innerste Auskleidung der
Fruchtblase auf den anderen Eihäuten, der Plazenta und der Nabelschnur.[12] [145]
Amnion
Chorion Nabelschnur
Plazenta
Einführung 25
1.6.2 Aufbau der Eihäute
Die Eihäute haben einen typischen Aufbau, der in Abbildung 1.8 dargestellt ist. Die
verschiedenen Gewebe sind alle kindlichen Ursprungs.
Abbildung 1.8: Frühe Embryonalentwicklung
modifiziert aus Sadler[145]
Amnionepithel
Amnionbindegewebe lockeres
kompaktes
Zwischenschicht
Chorionbindegewebe gerichtetes
ungerichtetes
primärer Cytotrophoblast
Fibrinoid mit Trophoblastzellen Synzytiotrophoblast
Amnion
Chorion
Abbildung 1.9: Aufbau der Eihaut
modifiziert aus Bender[10]
Einführung 26
Das Amnionepithel
Die Amnionmembran ist gefäßfrei. Das Epithel besteht aus einer Schicht polygonaler Zellen,
die einer Basalmembran aufliegen. Die Größe und Form der Zellen kann variieren, je nach
Lage, Schwangerschaftsdauer und Schwangerschaftsunregelmäßigkeiten, aber auch physio-
logisch bedingt. Die Zellen können flach, kubisch oder hochprismatisch aussehen und eine
Größe von 15-35 µm haben. In den meisten Fällen liegt jedoch die kubische Form vor. Trotz
dieser großen Verschiedenheit in der Morphologie gehören die Zellen alle zu einem Typus.
Sie sind untereinander netzwerkartig durch seitliche zytoplasmatische Ausläufer verbunden.
Die Zellgrenzen sind durch Desmosomen verschlossen, so dass die Amnionepithelschicht für
Wasser undurchlässig ist. Ihr Zytoplasma ist meist intensiv zyanophil anfärbbar und der
runde bis ovale Kern ist oft relativ groß. Die Oberfläche des Epithel wird durch Mikrovilli
vergrößert, deren Anzahl zum Ende der Schwangerschaft hin zunimmt. Wie auch am
Hornhautepithel befindet sich auf den Mikrovilli eine dicht gepackte Glykokalyx mit vielen
anionischen Bindestellen. Intrazellulär fallen ein deutliches raues endoplasmatisches
Retikulum, zahlreiche Lipidtröpfchen und Glykogenspeicher auf. Das Amnionepithel ist
während der Schwangerschaft metabolisch sehr aktiv, was über den Nachweis zahlreicher
Enzyme bestätigt werden kann. Durch die eingeschränkte Versorgung mit Sauerstoff scheint
es hauptsächlich auf die anaerobe Glykolyse zur Bereitstellung von Energie eingestellt zu
sein. Die Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff findet durch Diffusion aus den
darunterliegenden Schichten oder aus dem Fruchtwasser statt. Auch die Unterseite der
Zellen ist gefaltet und über Hemidesmosomen fest mit der Basalmembran verbunden. Diese
enthält große Mengen an Proteoglykanen und Heparansulfaten und stellt eine
Permeabilitätsbarriere für Makromoleküle dar. Die Amnionmembran spielt eine große Rolle
im Stoffwechsel des Fruchtwassers. Inwieweit sie die Flüssigkeit produziert, ist noch
umstritten, sie ist jedoch mitverantwortlich für die Homöostase der Zusammensetzung. Der
hohe Gehalt an Carboanhydrase (Bikarbonat-/CO2-Stoffwechsel) in den Epithelzellen zeigt,
dass sie zumindest an der Regelung des pH-Wertes Anteil hat. Immunhistochemisch wurden
verschiedene Hormone wie HCG und Somatotropin gefunden, jedoch es ist eher
wahrscheinlich, dass sie ein Ergebnis der Resorption von Fruchtwasser mit nachfolgendem
Abbau als einer Hormonsynthese sind. Die Zellen vermehren sich durch normale Mitose.[10]
[11] [33] [53] [120] [165]
Einführung 27
Die weiteren Schichten
Im darunterliegenden Bindegewebe kann man verschiedene Schichten unterscheiden, die in
Abbildung 1.8 dargestellt sind.
• Das Amnionbindegewebe (15-30 µm dick) ist eine kompakte Schicht mit vielen
Kollagenfasern. Hier können Falten im Amnion auftreten.
• Eine Zwischenschicht, die in ihrer Dicke recht variabel ist und relativ wenige Zellen
und Fasern enthält. Hier können zwischen Chorion und Amnion leicht Ablösungen
auftreten.
• Das Chorionbindegewebe (15-20 µm dick) mit einer inneren und äußeren Schicht. Die
innere Schicht enthält gerichtete Kollagenfasern, hierin verlaufen auch die Blut-
gefäße. In der äußeren Schicht liegende Kollagenfasern verlaufen ungerichtet.
• Der Tropho- und Synzytiotrophoblast
1.6.3 Zellmarker
HCG/LH-Rezeptor
Das humane Choriongonadotropin (HCG) ist ein Schwangerschaftshormon, das vom
Trophoblasten (kindlicher Teil der Plazenta und der Eihäute) gebildet wird. Seine Haupt-
aufgabe ist die Erhaltung des Corpus luteum (Gelbkörper) im Eierstock der Frau bis zur 10.
Schwangerschaftswoche. Weitere Funktionen sind z. B. die Stimulation der mütterlichen
Schilddrüsenhormonproduktion und die Stimulation der Leydig-Zwischenzellen, die beim
männlichen Fetus Testosteron produzieren. Das luteinisierende Hormon (LH) wird im
Hypophysenvorderlappen produziert und ist identisch mit dem ICSH (interstitial cell
stimulating hormone) beim Mann. Es besteht aus einer Alpha- und Betakette, wobei die
Alphakette mit der von HCG identisch ist. Die Betakette ist spezifisch für LH und für die
biologische Wirkung verantwortlich. Das Hormon wirkt über Hormonrezeptoren und
verursacht das Auslösen der Follikelreifung und Ovulation, die Entwicklung und Funktion
des Corpus luteum sowie beim Mann die Anregung des Wachstums der Leydig-
Zwischenzellen und der Androgensynthese.
HCG und LH sind strukturell und funktionell homologe Gonadotropine. Beide wirken an ein-
und demselben Rezeptor. Dieser G-Protein-gekoppelte Rezeptor ist ein Glykoprotein,
welches sich in der Zellmembran befindet. Die klassischen Zielorgane der beiden Hormone
und damit auch das Vorkommen von HCG/LH-Rezeptoren sind das Corpus luteum im
Eierstock der Frau und die Leydig-Zwischenzellen im Hoden des Mannes, jedoch finden sich
diese Rezeptoren auch in vielen nichtgonadalen Geweben des weiblichen und männlichen
Reproduktionssystems sowie im zentralen Nervensystem.[103] So ist z. B. auf den Amnion-
epithelzellen der HCG/LH-Rezeptor vorhanden, die Anzahl nimmt jedoch im Verlauf der
Einführung 28
Schwangerschaft ab.[178] [141] [143] Im menschlichen Auge wurde bisher der Rezeptor nur in der
Netzhaut nachgewiesen.[175]
Aquaporin (AQP)
Aquaporine sind Poren- oder Kanalproteine, die sich in der Zellmembran befinden. Man
kennt momentan elf verschiedene Typen und findet sie vorwiegend dort, wo
Flüssigkeitstransport eine große Rolle spielt, z. B. in Endo- oder Epithelzellen. Sie lassen
selektiv Wasser (AQP0, 1, 2, 4, 5, 8, 10) oder Wasser mit kleinen Molekülen (z. B. Glycerol,
Harnstoff: AQP3, 7, 9; Nitrat: AQP6) in die Zelle hinein bzw. aus ihr heraus.[104] Die
unterschiedlichen Arten sind in den Geweben spezifisch verteilt. So besitzen die Epithelzellen
der Hornhaut das Aquaporin 5,[188] [39] die Amnionepithelzellen hingegen exprimieren die
Aquaporine 1, 8 und 9.[111] [192] [193]
1.7 Amnionmembran in der Augenheilkunde
1.7.1 Operationstechniken
Die erste überlieferte chirurgische Verwendung von Amnion geht auf das Jahr 1910
zurück.[21] Seitdem hat sich das Spektrum stark erweitert. Heute wird Amnionmembran z. B.
verwendet zur Wundbehandlung, hier insbesondere als Auflage für Verbrennungswunden
und chronische Ulzera, zur chirurgischen Rekonstruktion künstlicher Vaginae oder in der
operativen Versorgung von Omphalozelen.[24] In der Augenheilkunde spielt sie vor allem in
der Wiederherstellung der Augenoberfläche eine große Rolle. Hier gibt es, je nach zugrunde
liegendem Krankheitsbild, unterschiedliche Einsatzmöglichkeiten.[35] [44] [124] [177]
Verwendung als Transplantat
Für Epitheldefekte beschrieben Lee und Tseng 1997[95] zuerst eine Methode, bei der die
Amnionmembran als neue Unterlage und Leitschiene für das Hornhautepithel dient und so
auf der Hornhaut fixiert wird, dass die Epithelzellen darüberwachsen können. Hierbei zeigt
die Epithelseite der Amnionmembran nach oben und die Stromaseite nach unten. In den
aktuellen Publikationen ist diese Technik die am häufigsten verwendete. Bei tiefen
Hornhautulzera führten Kruse et al. 1999[84] [85] eine etwas andere Operationsmethode ein,
wobei das Ulkus mit mehreren übereinander gelegten Membranen aufgefüllt wird.
Im Laufe der Zeit kommt es zu einem langsamen Abbau der Membran und Ersatz durch
körpereigenes Gewebe, wobei die Geschwindigkeit jedoch unterschiedlich ist und vom
Patienten, der Grunderkrankung und der Membran selbst abhängig zu sein scheint.[82]
Einführung 29
Verwendung als Verband
Viele Autoren verwenden auch, entweder als alleinige Intervention oder zusätzlich
postoperativ, die Amnionmembran als eine Art natürlichen Verband. Hierbei wird ein
größeres Membranstück auf die gesamte Augenvorderfläche gelegt und zirkulär in der
Bindehaut befestigt. Die Hornhaut ist dadurch komplett von Amnion bedeckt, wobei die
Orientierung der Membran in der Literatur differiert und keine entscheidende Rolle zu
spielen scheint.[8] Am häufigsten wird sie in diesem Fall mit der stromalen Seite nach oben
und der epithelialen nach unten aufgenäht. In Ermangelung klinischer Studien kann man
sich hier jedoch nur auf eine tierexperimentelle Studie berufen, bei der die Ausrichtung der
Membran keinen Einfluss auf das Ergebnis hatte.[71] Nach einer gewissen Zeit wird die
Amnionmembran wieder entfernt oder ggf. erneuert.
1.7.2 Klinische Ergebnisse
Der Einfluss von Amnionmembran auf den Verlauf unterschiedlicher Erkrankungen der
Hornhautoberfläche wurde in vielen klinischen Studien untersucht. Persistierende
Epitheldefekte, Hornhautulzera, chemische oder thermische Verletzungen, bullöse Kerato-
pathie und Pterygien sind nur einige Diagnosen, bei denen eine Amnionmembran-
transplantation eine positive Wirkung zeigt.[148] [13] [161] [173] [105] [8] [148] [84] [95] [14] [97] [26] [40] [45] [86]
[138] [163] [114] [167] [135] [68]
Das zuerst beobachtbare Resultat ist eine Reduktion des präoperativ bestehenden Reiz-
zustandes. Es kommt zu einem deutlichen Rückgang der Entzündung und Förderung der
Reepithelialisierung. Bei den meisten Patienten kommt es nach einiger Zeit wieder zu einem
kontinuierlichen Verschluss des Hornhautepithels. In histologischen Untersuchungen von
Augen, die mit einem Amniontransplantat versorgt wurden, kann man ein mehrschichtiges
Epithel nachweisen, das auf der transplantierten Amnionmembran wächst. Langfristig wird
die Frequenz von Sekundärveränderungen, wie Narbenbildung und Vaskularisation,
reduziert. Insgesamt führt dies zu einem Anstieg der Sehschärfe und einer Verringerung von
Schmerzen und Photophobie.[82] [6] [158]
1.7.3 Verwendung bei Limbusstammzellinsuffizienz
Auch bei Rekonstruktion des Limbus, eines der schwierigsten Probleme in der Chirurgie der
Augenoberfläche, zeigt die Amnionmembrantransplantation gute Ergebnisse. So kann sie bei
einer partiellen Limbusinsuffizienz eine Stammzelltransplantation ersetzen, und ist dieser
wegen der geringeren Invasivität und wegfallenden Immunsuppression überlegen. Bei
schwereren Erkrankungsformen ist eine Amnionmembrantransplantation alleine nicht mehr
ausreichend. Hier führt jedoch eine zusätzlich zur Limbusstammzelltransplantation durch-
Einführung 30
geführte Amniondeckung zu einer besseren Prognose. Es kommt zu einer deutlichen Re-
duktion von Entzündung und Vaskularisation, wodurch die Überlebensrate der Limbus-
transplantate verbessert wird.[82] [180] [182] [118] [6] [134] [117] [156] [184] [113] [168] [146] [67]
1.8 Ex-vivo-Anzüchtung von Limbusepithelzellen auf
Amnionmembran
1.8.1 Prinzip und Methodik
Ein neuer Ansatz in der Behandlung der Limbusstammzellinsuffizienz stammt aus dem
Bereich des tissue engineering.[51] [140] [32] [73] [57] [127] Das Ziel ist, aus einem kleinen Limbus-
stückchen in der Kulturschale eine komplette intakte Hornhautepithelschicht anzuzüchten,
die anschließend auf die erkrankte Augenoberfläche transplantiert wird. Hierbei sollen
möglichst viele Stammzellen enthalten sein, um den Stammzellverlust des Patienten auszu-
gleichen und die Grundlage für eine dauerhafte Epithelialisierung zu bilden.
Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass bei einer Lebendspende nur eine minimale
Limbusbiopsie benötigt wird. Zum einen ist so die iatrogene Schädigung minimal, zum
anderen kann diese Technik auch bei Patienten zur Anwendung kommen, die einen großen
Teil ihres Limbus verloren haben. Weiterhin meint man, bei allogener Transplantation kann
die Abstoßungsreaktion vermindert oder sogar verhindert werden, da nur Epithelzellen
transplantiert werden, die antigenpräsentierenden Langerhans-Zellen bei der Vermehrung
jedoch eliminiert werden.[93]
Bis heute hat sich noch keine einheitliche Methode für die ex-vivo-Anzüchtung von
Limbusepithelzellen etabliert.[29] Es herrscht noch wenig Konsens darüber, welche die beste
Art ist, Limbusepithelzellen zu gewinnen, anzuzüchten, diese Konstrukte zu bewerten und zu
transplantieren.[55] Den ersten Versuch dieser Art führte die Arbeitsgruppe um Pelligrini im
Jahre 1997 durch.[132] Seitdem gab es zahlreiche Experimente, Limbusepithelzellen in einer
Kulturschale[31] [79] [81] [197] [23] [195] [170] [171] [129] oder auf speziellen Unterlagen zu vermehren. Als
solche Träger dienten z. B. Fibrin,[139] [58] verschiedene Gele[37] oder Amnionmembran. Eine
weitere Möglichkeit war, 3T3-Fibroblasten als feeder layer (Fütter-Schicht) zu Hilfe zu
nehmen.[73] [76] [78] [79] [81] [109] [123] [151] [196] Auch bei der Verwendung von Amnionmembran
ergaben sich zahlreiche Variationen: man konnte die Limbuszellen auf der epithelialen[23] [41]
[42] [46] [47] [49] [50] [75] [78] [80] [102] [109] [170] [171] [180] oder stromalen[28] Seite der Amnionmembran
wachsen lassen. Oder man entfernte vorher das Amnionepithel mechanisch bzw.
enzymatisch und vermehrte die Hornhautzellen auf der deepithelialisierten Amnion-
membran.[23] [34] [46] [49] [73] [75] [78] [79] [81] [102] [109] [122] [123] [151] [154] [170] [179] [187] [191] [195]
Einführung 31
Weitere Variabilitäten ergaben sich bei der Gewinnung der Limbusepithelzellen. Einige
Arbeitsgruppen gewannen diese von lebenden Personen, andere von Spenderhornhäuten. Im
ersten Fall konnte, soweit möglich, gesundes Limbusgewebe des Patienten selbst (autolog)[47]
[122] [123] [151] [180] oder einer anderen Person (allogen) entnommen werden.[76] [79] [81] [151] [154] Im
zweiten Fall waren die Kulturbedingungen, denen die Spenderhornhäute vorher ausgesetzt
waren, sehr unterschiedlich. Grundsätzlich wurden zwei verschiedene Kultivierungs-
methoden verwendet: Zellsuspension[73] [74] [78] [197] und Explantat-Kultur.[34] [41] [42] [46] [47] [49] [50]
[74] [79] [81] [102] [154] [170] [179] [180] [187] [191] [197] Die Suspension wurde aus Zellen hergestellt, die zuvor
im Limbusbereich einer Hornhaut entfernt worden waren. Als Explantat benutzte man ein
Hornhautstück aus dem Limbusbereich, welches man auf den Boden der Kulturschale oder
auf die gewünschte Unterlage legte. Um zuvor eine Lockerung des Epithels zu erreichen,
behandelten einige Autoren die Hornhäute mit Enzymen wie z. B. Dispase enzymatisch
vor.[23] [49] [50] [55] [78] [115] [179]
1.8.2 Amnionmembran versus andere Unterlagen
Galindo et al.[41] [42] konnten zeigen, dass Limbusepithelzellen, die auf Amnionmembran
wachsen, im Vergleich zu solchen auf Plastik einen höheren Gehalt an p63 und eine geringere
Menge an Connexin 43 exprimieren, d. h. untereinander eine geringere Kommunikation über
Nexus aufweisen. Die geringere Menge Cx43 mit der entsprechend geringeren Nexus-
Kommunikation und der hohe Gehalt an p63 als Merkmale des Stammzellcharakters zeigen,
dass die Zellen auf der Amnionmembran ihren typischen limbalen Phänotyp eher bewahren,
während die auf Plastik gezüchteten Zellen sich eher in einen kornealen Typ differenzieren.
Du et al.[23] konnten dies bestätigen und zeigten zudem eine geringere Expression des
kornealen Cytokeratins 3 bei den auf Amnion gewachsenen Zellen. Weiterhin ist die Anzahl
apoptotischer Limbuszellen auf Amnionmembran geringer als auf Plastik. (Sun et al.[171])
Auch die Fibrinschicht scheint der Amnionmembran in dieser Hinsicht unterlegen zu sein, es
zeigte sich auch hier eher eine Differenzierung als auf Amnion. (Higa et al.[58]) Die
Arbeitsgruppe um Ma et al.[109] konnte zudem nachweisen, dass die antiangiogene Wirkung
der Limbusepithelzellen verstärkt wird, wenn diese auf Amnionmembran wachsen.
Neben Amnionmembran und Fibrin wurden natürlich eine Reihe weiterer Materialien, wie
Gele oder Kontaktlinsen, als Träger für die zu kultivierenden Limbusepithelzellen
untersucht.[4] Zeigten sich in einigen Eigenschaften, wie z. B. der Handhabbarkeit oder
Sterilität Vorteile, so war die Amnionmembran in wesentlichen Punkten und in der
Gesamtheit dennoch überlegen.[98] Anhand der aktuellen Publikationen kann man sagen,
dass humane Amnionmembran, und hier insbesondere die intakte, ein geeignetes Substrat
ist, die Limbusstammzellnische zu ersetzen und wiederherzustellen.[48] Auf ihr vermehrte
Einführung 32
Limbusepithelzellen behalten in der Regel ihren limbalen Phänotyp bei und differenzieren
nicht zum kornealen Typ aus.[47] [109] [191]
1.8.3 Konservierung der Amnionmembran
Gegen die Verwendung frischer Amnionmembran spricht, dass in diesem Falle die
Amnionzellen noch vital sind. Auch diese könnten in Kultur proliferieren und bei einer
Transplantation hätte man Interaktionen zwischen Zellen dreier verschiedener Individuen.
Doch auch in der Konservierung der Amnionmembran gibt es verschiedene Möglichkeiten.
Durchgesetzt hat sich weitestgehend die Kryokonservierung.[124] Sie ist anderen Methoden
wie Luft- oder Gefriertrocknung überlegen,[174] da sie z. B. viele Eigenschaften der Membran
erhält und gleichzeitig die Amnionepithelzellen devitalisiert.
1.8.4 Intakte versus deepithelialisierte Amnionmembran
Auch der Problematik, ob und wie man die Amnionepithelzellen entfernen soll, bevor man
die Limbuszellen darauf wachsen lässt, wurde nachgegangen. Die Frage ist in der Hinsicht
wichtig, da dies die Wachstumsbedingungen der Limbuszellen grundlegend beeinflusst. In
einem Fall wachsen die Zellen auf intakten, aber devitalisierten Amnionepithelzellen, im
anderen auf der Basallamina des Amnionepithels, die je nach Methode der De-
epithelialisierung mehr oder weniger freigelegt und/oder beschädigt ist. Hopkinson et al.[60]
wiesen z. B. nach, dass eine enzymatische Vorbehandlung zwar das Epithel vollständig ablöst,
aber dies auch mit einer Zerstörung der Basalmembran einhergeht. Koizumi et al.,[75] Sun et
al.[170] und Grüterich et al.[46] konnten zeigen, dass die Limbusepithelzellen auf de-
epithelialisierter Amnionmembran schneller auswachsen als auf intakter, auch ist der
Auswachsrand viel glatter und einheitlicher. Allerdings zeigen diese Zellen einen höheren
Gehalt an Cx43 und CK3/12, einen schnelleren Zellzyklus und eine geringere Konzentration
von p63. Im Phänotyp ähneln sie somit eher kornealen als limbalen Zellen.
Intakte Amnionmembran scheint in den daraufwachsenden Limbusepithelzellen eher einen
undifferenzierten, den Stammzellen ähnelnden Charakter zu erhalten, während deepitheli-
alisierte Amnionmembran eher eine Differenzierung in Richtung TACs bewirkt.[46] [48] [49] [102]
1.8.5 Explantat versus Zellsuspension
Experimente, die systematisch die beiden Kulturtechniken Explantat und Zellsuspension
miteinander vergleichen, sind dagegen kaum vorhanden. Koizumi et al.[74] fanden licht-
mikroskopisch keine Unterschiede. In beiden Fällen hatten die ausgewachsenen Limbus-
zellen einen Durchmesser von 50-60 µm und waren von zahlreichen Mikrovilli übersät.
Einführung 33
Lediglich mittels Elektronenmikroskop zeigten sich bei den Zellen, die nach Aussaat als
Zellsuspension wuchsen, mehr Desmosomen und kleinere Interzellularabstände. Diese
Versuche wurden mit deepithelialisierter Amnionmembran durchgeführt.
Auf Plastik fanden Zhang et al.[197] bei der Explantatkultur eine geringere Schichtung,
weniger p63-Expression und auch einige Fibroblasten, verglichen mit den als Suspension
ausgesäten Zellen. Vergleiche der beiden Techniken auf intakter Amnionmembran fehlen
jedoch.
1.8.6 Wachstumsgeschwindigkeit, Morphologie und
Auswachsrate
Zur Wachstumsgeschwindigkeit, Morphologie und Auswachsrate der ex vivo gewachsenen
Limbusepithelzellen gibt es in der Literatur unterschiedliche Angaben. So differieren die
Wachstumsgeschwindigkeiten je nach Methode und Autor von 1 cm Durchmesser in
2 Wochen[191] bis 2-3 cm Durchmessser in 2-3 Wochen.[115] [46] Morphologisch wird in den
meisten Fällen als Resultat ein unverhorntes, mehrschichtiges Plattenepithel beschrieben,
nur gelegentlich wurde ein Monolayer[50] beobachtet. Da das Spendermaterial zur Gewinnung
der Limbusepithelzellen wie oben beschrieben sehr inhomogen ist, gibt es kaum
vergleichende Veröffentlichungen zu Auswachsraten. In einer Publikation berichteten
Vemuganti et al.,[187] dass diese bei frischen Hornhäuten höher ist als bei organkonservierten.
In Wachstumsverhalten und Histologie waren jedoch keine Unterschiede feststellbar.
1.8.7 Klinische Ergebnisse
Die ersten klinischen Studien zur Transplantation von in vitro kultivierten
Limbusstammzellen erbrachten vielversprechende Therapieergebnisse, jedoch muss man
berücksichtigen, dass die Fallzahlen stets sehr klein sind und die Erfolgsraten stark
differieren. Aus einigen Studien liegen bereits Ergebnisse vor, die auch bei totaler
Limbusinsuffizienz über gute Ergebnisse der Transplantation zuvor kultivierter
Limbusstammzellen berichten. So sei bereits nach 48 Stunden kein Epitheldefekt mehr
nachweisbar.[76] [180] Neben der Reepithelialisierung konnte außerdem eine deutliche
Entzündungsreduktion, Avaskularität und Visusverbesserung erreicht werden.[122] [151]
Shimazaki et al.[154] beschrieben ähnliche Erfolgsraten wie bei herkömmlichen Limbus- und
Amnionmembrantransplantationen. Nachuntersuchungen nach 12[76], 19[151] und 21[48]
Monaten zeigten in den meisten Fällen eine dauerhafte Stabilität der Augenoberfläche und
somit eine Nachhaltigkeit der Therapie. Brachte ein einmaliger Therapieversuch keine
Besserung, konnten durch erneute, ggf. mehrmalige Transplantationen Erfolge erzielt
werden.[123] Cooper et al.[18] untersuchten Transplantate, die versagt hatten, histologisch. Es
Einführung 34
zeigten sich intakte Amnionmembranen, die nicht absorbiert und nicht mit der Cornea
verbunden waren. Sie waren vaskularisiert und in der Epithelschicht und im Stroma fanden
sich Entzündungszellen. Die Oberfläche war mit Bindehautepithel und -becherzellen bedeckt.
Von den angezüchteten und transplantierten Limbusepithelzellen waren nur noch einige
aufzufinden. Als sehr wichtiger Einflussfaktor für den klinischen Erfolg wird auch hier eine
zusätzliche Amnionmembran als Verbandskontaktlinse angesehen.[176]
1.9 Biologische Wirkmechanismen der Amnionmembran
1.9.1 Antientzündlich
Eine regelmäßige Beobachtung bei der Verwendung von Amnionmembran ist die Reduktion
der Entzündung. Entzündungsreaktionen können unter anderem den empfindlichen
Regulationsmechanismus stören, dem die Stammzellen und TACs unterliegen. Unter-
suchungen an anderen Geweben lassen darauf schließen, dass Zytokine, die von
Entzündungszellen oder aktivierten Gewebszellen gebildet werden, die Umwandlung von
Stammzellen zu TACs beschleunigen und somit einen bestehenden Stammzellschaden
verstärken können.[83] Der antiinflammatorische Effekt der Amnionmembran beruht zum
einen auf einem einfachen mechanischen Effekt. Die Membran als Verbandskontaktlinse
behindert die Invasion von Leukozyten aus dem Tränenfilm in die Hornhaut.[164] Shimmura
et al.[157] konnten zusätzlich zeigen, dass die Stromaseite des Amnion in der Lage ist,
Entzündungszellen zu binden und sie anschließend einem programmierten Zelltod zu
unterwerfen. Die Amnionmembran greift aber auch in das komplexe Zusammenspiel von
pro- und antientzündlichen Faktoren ein. Dies geschieht auf zwei verschiedene Arten:
einerseits enthalten die Amnionepithelzellen und das -stroma selbst antiinflammatorische
Zytokine[54], andererseits wird in den daraufwachsenden Limbusepithelzellen die Bildung
oder Hemmung dieser induziert. So konnten Solomon et al.[164] nachweisen, dass die
Amnionmembran eine durch Lipopolysaccharide induzierte Hochregulation der Produktion
von Interleukin-1α und -1β in den Limbusepithelzellen unterdrückt. Diese Botenstoffe lösen
normalerweise die Infiltration von Entzündungszellen und die Produktion weiterer Zytokine
aus. Die Konzentration des antiinflammatorisch wirkenden Interleukin-1-Rezeptor-
Antagonisten hingegen steigt an.[106] Durch Herunterregulation von TGF-β und des Smad-
2/3-Signalübertragungsweges kommt es zu einer weiteren Entzündungsreduktion. In
Amnionmembran ist weiterhin das antiinflammatorische Interleukin-10 enthalten.[107] Auch
Proteinasen spielen bei Entzündungszuständen eine große Rolle. Das Amnionstroma enthält
zahlreiche Inhibitoren wie α1-Antitrypsin, α2-Makrotrypsin, Inter-α-Trypsininhibitor, α2-
Antichymotrypsin, α2-Plasmainhibitor[121] und die TIMP-1, -2, -3 und -4 (Tissue Inhibitor of
Metalloproteinase).[107] Kim et al.[71] konnten zeigen, dass hierdurch die Aktivität der
Einführung 35
Proteinasen in der Hornhaut nach einer Amnionmembrantransplantation deutlich reduziert
wird. Weiterhin berichtet Gomes[44] über die Anwesenheit von Lactoferrin und die
Modulation der Produktion von Aktivin.
1.9.2 Antiangiogen
Ein weiterer Effekt der Amnionmembrantransplantation ist eine Reduktion oder
Verhinderung der Vaskularisation. Da das Amnion in natura frei von jeglichen Gefäßen ist,
könnte man vermuten, dass über bestimmte Mechanismen eine Gefäßneubildung verhindert
wird und/oder vorhandene oder invadierende Blutgefäße zum Absterben gebracht werden.
So beschrieben Shao et al.[153] das Vorkommen von PEDF (Pigment Epithelium Derived
Factor) in der Amnionmembran. Dieser hemmt das Endothelzellwachstum und wirkt so
einer Gefäßneubildung entgegen. Als weitere antiangiogene Faktoren wurden Thrombo-
spondin-1 und Endostatin gefunden.[35] Bei den darüberwachsenden Limbusepithelzellen
bewirkt die Amnionmembran eine erhöhte Konzentration von Restin und Endostatin, was
zur Apoptose von vaskulären Epithelzellen in der Hornhaut führt.[107]
1.9.3 Antifibrotisch
Als Langzeiteffekt ist die narbenreduzierende Wirkung des Amnion sehr erwünscht.[155] [156]
[182] Hier stellt man sich den hauptsächlichen Wirkmechanismus über eine Herrunter-
regulierung des TGF-β (Transforming Growth Factor) und seines Rezeptors vor. Dieser
aktiviert normalerweise Fibroblasten, fördert so eine Narbenbildung und behindert die
epitheliale Proliferation.[99] [181] Außerdem konnten Choi et al.[17] einen hemmenden Effekt der
Amnionmembran auf die Umwandlung von Fibroblasten in Myofibroblasten nachweisen. Die
Umwandlung in Myofibroblasten ist für die korneale Wundkontraktion verantwortlich.[77]
1.9.4 Unterstützung von Proliferation, Migration, Erhaltung
des Zellcharakters
In vielen Experimenten ist festgestellt worden, dass durch die Anwendung von
Amnionmembran eine bessere Reepithelialisierung der Hornhautoberfläche eintritt. So
verbessert sich die Migration der Limbuszellen, wenn diese über devitalisierte Amnion-
epithelzellen wachsen.[75] [81] Amnionmembran verhindert weiterhin Apoptose in den darauf-
wachsenden Zellen. Dies stellt man sich über verschiedene Signalübertragungswege,[56] wie
z. B. dem Mitogen-activated Proteinkinase (MAPK)-Weg[169] oder die Expression des
Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten vor.[171] Koizumi et al.[79] wiesen nach, dass die
Epithelzellen der Amnionmembran verschiedene Wachstumsfaktoren enthalten, wie z. B.
Einführung 36
KGF (Keratinocyte Growth Factor), FGF (Fibroblast Growth Factor), HGF (Hepatocyte
Growth Factor) und EGF (Epidermal Growth Factor). Gicquel et al.[43] zeigten daraufhin, dass
die Konzentration von EGF zwischen verschiedenen Amnionmembranen variiert. Touhami et
al.[179] konnten das Vorkommen von NGF (Nerve Growth Factor) belegen. Die genannten
Faktoren stimulieren sowohl die Proliferation als auch die Migration der
Limbusepithelzellen.[155]
Aber auch in den daraufwachsenden Limbuszellen beeinflusst die Amnionmembran die
Expression verschiedener Faktoren, welche eine wichtige Rolle spielen könnte. Sun et al.[170]
zeigten eine Hochregulierung der Matrix-Metallo-Proteinase 9, Lee et al.[94] eine Induktion
des Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1), Yam et al.[195] eine vermehrte Sekretion des oben
schon erwähnten TIMP-1. Dieser bewirkt unter anderem eine verminderte Produktion von
TGF-β1 und -β2 und eine vermehrte Expression des EGF-Rezeptors. TGF behindert, aber
EGF, FGF und NGF unterstützen die Proliferation und den Erhalt von Stammzellen und
TACs.[179] Gut zu sehen ist dies an der Tatsache, dass die undifferenzierteren Stammzellen
und TACs eine 4-5fach höhere Konzentration des EGF-Rezeptors aufweisen als die weiter
differenzierten kornealen basalen Zellen.[195] Nach Deepithelialisierung liegt die Basallamina
der Amnionepithelzellen frei und die darauf gezüchteten Zellen treten in direkten Kontakt
mit ihr. So wurde die Zusammensetzung der Basallamina intensiv untersucht[110] [29] [19] und in
ihrer Zusammensetzung Ähnlichkeiten sowohl zur Basalmembran der Binde-[38] als auch der
Hornhaut gefunden.[27] Es konnte gezeigt werden, dass durch den Kontakt mit ihr die
Expression intermediärer Filamente beeinflusst wird, was den Phänotyp der
daraufwachsenden Zellen determiniert.[88]
Interessanterweise eignet sich die Amnionmembran auch für die Differenzierung eines
funktionellen Bindehautphänotyps. Sowohl in vitro als auch in vivo behalten Bindehaut-
zellen den für sie charakteristischen Phänotyp und transdifferenzieren nicht zu Hornhaut-
epithelzellen.[16] [116] [136] Letztendlich werden der Amnionmembran sogar antimikrobielle und
antivirale Wirkungen zugeschrieben.[172]
1.9.5 Immunogenität
Da es nach Amniontransplantation zu keiner Abstoßungsreaktion kommt, dachte man lange
Zeit, sie würde keine HL-Antigene exprimieren.[3] [5] [62] Mittlerweile hat man aber doch auf
epithelialen und stromalen Zellen der Amnion unterschiedliche HLA-Moleküle nachweisen
können (-A, -B, -C, -DR, -G, -E). Da die Amnionzellen nach Kryokonservierung avital sind,
scheinen diese keine Rolle zu spielen. Weiterhin stellt sich die Amnionmembran als eine Art
immunprivilegiertes Gewebe dar und enthält immunregulative Faktoren, wie HLA-G und
FasLigand.[35] Sie ist in der Lage, eine alloreaktive T-Zell-Antwort zu unterdrücken, indem
die Proliferation und Zytokinsynthese dieser Leukozyten supprimiert wird.[186] Higa et al.[59]
Einführung 37
konnten zusätzlich nachweisen, dass Limbusepithelzellen, die auf Amnionmembran
wachsen, mehr HLA-G produzieren. Dieses Antigen schützt vor dem Angriff von natural
killer cells und könnte ein weiterer Vorteil von Amnionmembran als Unterlage sein.
1.10 Ziel dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit war es, Limbusepithel-Amnion-Transplantate aus organkonservierten
Hornhäuten und intakten, kryokonservierten Amnionmembranen herzustellen. Hierzu
sollten die verschiedenen Methoden Zellsuspension und Explantat-Technik auf ihren Erfolg
hin miteinander verglichen werden. Zuvor musste untersucht werden, ob eine
Vorbehandlung der Amnionmembran bezüglich Deepithelialisierung und/oder Vernetzung
einen Vorteil erbringt.
Als weiteres Ziel galt es, die Eignung von organkonservierten Hornhäuten zu prüfen, indem
ein möglicher Zusammenhang zwischen Spenderalter, Post-mortem-Zeit und Organkultur-
Dauer auf die Auswachsrate untersucht und beschrieben werden sollte.
Material und Methodik 38
2 Material und Methodik
2.1 Material
2.1.1 Geräte
Gerät Typ Hersteller
Adapter für Mikroskop und Digitalkamera
Mikroadapter für Nikon Coolpix 950/990
TSO (Thalheim Spezial Optik)
Analysewaage BP 110S Sartorius
Ausgießvorrichtung Histo embedder Leica
Autoklav, Dampfsterilisator Varioklav, Zyclondampf H+P Labortechnik GmbH
Brutschrank BB 6220 Heraeus instruments
Digitalkamera Coolpix 995 Nikon
Einbettautomat ASP 300 Leica
Elektronenmikroskop EM 906 Zeiss
Fluoreszenzmikroskop BX 60 Olympus
Gefrierschrank –20°C Typ 311104 Liebherr
Gefriertruhe –80°C Modell ECC 3085-5 Profiline
Kameraaufsatz F-View Soft Imaging System
Kameraaufsatz arc 6000c Baumer optronic
Kryostat CM 3000 Leica
Kühlschrank 4°C KT 135 Foron
Kurzzeitwecker TR 118 Oregon Scientific
Mikrobiologische Sicherheitswerkbank
CA/RE 4 Clean Air Techniek, Woerden
Mikroskop- und Imaging- software
arc Viewer, Version 1.21 Baumer optronic
Mikroskop- und Imaging- software
analySIS, Docu 3.2 Soft Imaging System GmbH
Mikrotom Biocut 2035 Leica
Mikrowelle Micromat AEG
Phasenkontrastmikroskop Axiovert 25 Zeiss
Phasenkontrastmikroskop Optiphot-2 Nikon
Pipettierhilfe accupetta Ratiolab
Rasterelektronenmikroskop Leo 430 Leo Electron Microscopy Ltd.
Sterilwerkbank Airflow Controller AC2 Waldner
Material und Methodik 39
Streckbad für Paraffinschnitte WB7 Memmert
Vortexer MS2 Minishaker IKA
Wärmeschrank T 6030 Heraeus instruments
Wasserbaderhitzer Typ 1052 GFL (Gesellschaft für Labortechnik)
Zentrifuge Biofuge primo Heraeus instruments
Tabelle 2.1: Geräte
2.1.2 Hilfsmittel und Instrumente
Name Bezeichnung Hersteller
Augenschere, gebogen, spitz Modell „Bonn“ Geuder
Chamberslides Chambered Coverglass, 2 well Lab-Tek, Nalge Nunc International
Chamberslides CultureSlide 8 chamber on glass
BD Falcon
Deckgläser 24×46 mm Marienfeld
Einbettkapseln cellsafe biopsy capsule Leica
Einbettkassetten Leica
Einmalhandschuhe SafeSkin SatinPlus Kimberly Clark
Einmalpipetten, steril Stripette 1 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml
Corning Incorporated, costar
Einmalspritzen, steril Injekt 2 ml, 5 ml, 10 ml Braun
Filteraufsatz PES Bottle Top Filter, 500 ml Nalgene Filtration Products
Glasküvette für die Histologie Glaswerk Wertheim
Hockeymesser Hornhautschaber nach Kuhnt Geuder
Kanülen, steril Microlance 3 BD (Becton Dickinson)
Kulturschalen, steril Polystyren, unbeschichtet, 6well, 12well, 24well
Corning Incorporated, costar
Kunststoffröhrchen Cellstar, PP-Tubes, 15 ml, 50 ml
Greiner Bio-One GmbH
Mikrotomklingen S35 Feather
Objektträger SuperFrostPlus Menzel
Parafilm Parafilm “M” Pechiney Plastic Packaging
Pasteurpipetten Länge 150 mm Roth
Petrischalen, Glas verschiedene Durchmesser
Pinzette, anatomisch 160 mm AGESA Medizintechnik
Material und Methodik 40
Mikropipetten reference, 0,5-10 µl 10-100 µl 100-1000 µl
Eppendorf
Pipettenspitzen für Mikropipetten 0,5-1000µl Eppendorf
PTFE(Teflon)scheiben
Schottflaschen 250 ml, 500 ml Davalier
Skalpell 13,5 cm AGESA Medizintechnik
Skalpellklingen, steril EMG Größe 2 Aesculap
Spritzen-Sterilfilter Millex – GV Millipore Corporation
Transferpipetten 3,5 ml Sarstaedt
Überleitungskanüle, klein Pfm (Produkte für die
Medizin AG)
Universal-pH- Indikatorpapier
pH 1-10 Kallies Feinchemie AG
Tabelle 2.2: Hilfsmittel und Instrumente
2.1.3 Chemikalien
2.1.3.1 Medien und Supplemente
Name Firma
3,3,5-Triiodo-L-Thyronin Sigma
Adenin Sigma
Amphotericin B Biochrom KG
Choleratoxin Sigma
DMEM + 4500 mg/l Glucose + L-Glutamine + Pyruvat
Gibco
Epidermal Growth Factor (EGF) Seromed, Biochrom KG
Ham´s Nutrient Mixture F-12 (Ham) + L-Glutamine
Gibco
Fetales Kälberserum (FCS) Gibco
Gentamicin Gibco
Hydrochlorid, HCl Merck
Hydrocortison (Cortisol, 17- Hydroxycorticosteron)
Sigma
Insulin, bovin Sigma
L-Glutamin Biochrom AG
Material und Methodik 41
Natriumhydroxid, NaOH Merck
Transferrin Sigma
Tabelle 2.3: Medien und Supplemente
2.1.3.2 Enzyme und Pufferlösungen
Name Firma
Accutase PAA Laboratories GmbH
Cell dissociation buffer, enzyme-free, PBS- based
Gibco
Tri-Natriumcitratdihydrat Merck
Citronensäuremonohydrat Merck
Collagenase Typ 1 Worthington
Collagenase Typ 2 Worthington
Dispase II Boehringer
Natruimchlorid-Infusionslösung 154 Serumwerk Bernburg
PBS (Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium)
PAA Laboratories GmbH
Tris-Puffer (aus Tris(hydroxymethyl)- aminomethan)
Merck
TrypLE Express (Tripsine-like Enzyme) Gibco
Trypsin/EDTA, 0,05/0,02 % Gibco
Tabelle 2.4: Enzyme und Pufferlösungen
2.1.3.3 Antikörper und zugehörige Reagenzien
Name Firma
Primärantikörper, Maus anti-Human
P63
Connexin 43
Tenascin
Cytokeratin HMW (13,14,15,16)
Cytokeratin 3/12
Vimentin (Klon V9)
DakoCytomation
Chemicon International, Sigma
Acris-antibodies
Acris-antibodies
Acris-antibodies
BioGenex
Material und Methodik 42
Primärantikörper, Kaninchen anti-Human
HCG/LH-Rezeptor
Aquaporin 5 und 9
Acris-antibodies
Chemicon
Sekundärantikörper, Ziege anti-Maus
Cy-3-gekoppelt
JacksonImmunoResearch Laboratories
Sekundärantikörper, Ziege anti-Kaninchen Cy-3-gekoppelt
JacksonImmunoResearch Laboratories
Antibody Diluent DakoCytomation
Cytomation Pen DakoCytomation
LSAB 2 System-AP DakoCytomation
Protein-Block, serum-free DakoCytomation
Vectastain ABC-Elite-Kit, PK-6101 Vector Laboratories
DAB (3,3Diaminobenzidintetra- hydrochloriddihydrat, 97 %)
Aldrich
Wasserstoffperoxid 30 % (H2O2, Perhydrol) Merck
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenyindoldilactat) Sigma
Tabelle 2.5: Antikörper und zugehörige Reagenzien
2.1.3.4 Sonstiges
Name Firma
Alizarin Red S Sigma-Aldrich
Ammoniaklösung 25 % Merck
Cacodylatpuffer Serva
CellTracker Green CMFDA Molecular Probes
Dextran T500 Roth
Einbettmedium OCT für Gefrierschnitte Leica
Einbettmedium Histowax Leica
Eindeckmedium auf Wasserbasis (Aquatex) Merck
Eindeckmedium auf Xylolbasis (DePeX) Serva
Eosin, 1 %ige alkoholische Lösung Klinikapotheke Universitätsklinikum Dresden
EPON Serva
Ethanol, 96 % Klinikapotheke Universitätsklinikum Dresden
Fluorescent Mounting Medium DakoCytomation
Formaldehydlösung 4 % SAV Liquid Production
Material und Methodik 43
Glutardialdehyd zur Fixierung für die Elektronenmikroskopie
Fluka
Glutardialdehyd zur Gewebevernetzung Roth
Glycerol, ultra pure MP Biomedicals Inc.
Hematoxylin, ChemMate DakoCytomation
Histoacrylkleber B Braun
Methanol Merck
Osmiumtetroxid 2 %, wässrig Serva
Trypanblau Lösung 0,4 % Sigma-Aldrich
Xylol (Isomere) Roth
Tabelle 2.6: Sonstiges
2.1.4 Herstellung von Medium und Pufferlösungen
2.1.4.1 Kulturmedium für Limbusepithelzellen
Das Kulturmedium basierte auf einer Mischung aus 3 Teilen DMEM und einem Teil Ham’s
Nutrient Mixture F12. Dieses Basalmedium wurde supplementiert mit 10 % FCS, Insulin
5 mg/l, Transferrin 5 mg/l, Triiodothyronin 2 nmol/l, Hydrocortison 0,4 mg/l, Glutamin
4 mmol/l, EGF 10 ng/ml, Adenin 0,18 mmol/l, Gentamicin 50 mg/l, Amphotericin B
2,5 mg/l. Einige Supplemente mussten separat angesetzt werden:
• Transferrin: 100 mg wurden in 2 ml aqua dest. gelöst.
• Triiodothyronin: Um eine Stammlösung von 20 µg/ml herzustellen, wurde 1 mg in
1 ml 1M NaOH gelöst und mit 49 ml Basalmedium aufgefüllt.
• Adenin: 10 mg wurden in 1 ml 5M HCl gelöst. Um diesen sauren Ansatz zu
neutralisieren, wurde direkt vor dem Ansetzen des Mediums dieselbe Menge
5M NaOH hinzugefügt.
• Hydrocortison: Für die Stammlösung von 50 µg/ml löst man 1 mg in 1 ml absolutem,
unvergälltem Ethanol und füllt mit 19 ml des Basalmediums auf.
• EGF: 500 µg wurden in 0,5 ml aqua dest. gelöst.
Alle Bestandteile wurden unter sterilen Bedingungen angesetzt und das komplette Medium
wurde noch einmal sterilfiltriert.
Material und Methodik 44
2.1.4.2 Tris-Puffer
Zur Herstellung einer Stammlösung wurden 60,5 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan und
90 g NaCl in 100 ml aqua dest. gelöst. Mit 1 M HCl titrierte man bis zu einem pH-Wert von
7,6 und füllte die Lösung mit aqua dest. auf einen Liter auf. Um die Gebrauchslösung
herzustellen, wurde ein entsprechendes Volumen Stammlösung direkt vor Anwendung 1:10
mit aqua dest. verdünnt.
2.1.4.3 Citrat-Puffer
0,1 M Citronensäure wurde durch Lösen von 10,505 g Citronensäuremonohydrat in 500 ml
aqua dest. hergestellt. Als zweite Pufferkomponente wurde 0,1 M Natriumcitratlösung durch
Lösen von 14,705 g Natriumcitratdihydrat in 500 ml aqua dest. hergestellt. Zur Herstellung
des Citrat-Puffers wurden 17 ml 0,1 M Citronensäure mit 83 ml 0,1 M Natriumcitratlösung
gemischt und mit aqua dest. auf 1 l aufgefüllt.
2.1.5 Gewebe
2.1.5.1 Amnion
Die Plazenten mit den Amnionmembranen wurden freundlicherweise von der
Universitätsfrauenklinik Dresden zur Verfügung gestellt. Zuvor wurde von der werdenden
Mutter eine Einwilligung zur Amnionmembranspende eingeholt. Für die Auswahl galten
bezüglich Serologie und Ausschluss von Risikogruppen dieselben Kriterien wie für
Hornhautspender.[61] Da Amnionmembranen nach Kaiserschnittgeburten eine geringere
bakterielle Kontamination als nach vaginalen Geburten aufweisen,[1] wurden nur Plazenten
nach Sectio caesarea zur Gewinnung der Amnionmembran verwendet.
2.1.5.2 Hornhäute und Corneoskleralringe
Es wurden lediglich Hornhäute benutzt, die für eine Keratoplastik aufgrund zu geringer
Endothelzellzahl nicht infrage kamen, sowie die nach einer Hornhauttransplantation
übriggebliebenen Corneoskleralringe. Die Hornhäute und Corneoskleralringe wurden
hauptsächlich von der Hornhautbank Dresden bezogen. Gelegentlich wurden aber auch
Corneoskleralringe von Hornhäuten eingesetzt, die über Eurotransplant in Leiden vermittelt
wurden.
Material und Methodik 45
2.2 Methodik
2.2.1 Amnionmembran
Präparation
Gleich nach der Kaiserschnittgeburt wurde noch in der Frauenklinik die Eihaut von der
Plazenta abgetrennt und in einem sterilen Gefäß in das Labor transportiert. Die weitere
Präparation erfolgte dann unter sterilen Bedingungen. Während der gesamten Prozedur war
zu beachten, dass das Gewebe nicht austrocknete. Zu diesem Zweck wurde es stets in
physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt. Zuerst wurde die Membran mehrfach mit
steriler physiologischer NaCl-Lösung gespült und erst danach die Amnionmembran von dem
darunterliegenden Chorion getrennt. Hierzu breitete man das Präparat in einer großen
Glaspetrischale oder auf einer Teflonscheibe so aus, dass die Seite mit der Amnionmembran
nach unten und das Chorion nach oben zeigte. Die Ausrichtung war daran ersichtlich, dass
auf der Amnionseite das Epithel glatt war und spiegelte. Auf der Chorionseite hingegen
befand sich Bindegewebe, welches eher stumpf aussah und reichlich Blutgefäße enthielt. Um
sicher zu gehen, konnte man versuchen, diese Gefäßreste mit einer Pinzette zu fassen und
abzuheben. Gelang dies, lag die Membran richtig. Nun wurde das Chorion mit einem
stumpfen Skalpell von der darunterliegenden Amnionmembran abgeschabt, ohne diese zu
zerreißen. Das Chorion wurde verworfen und die Amnionmembran mit einer Schere in ca.
3×3 cm große Stückchen geschnitten. (Abbildung 2.1) Daraufhin wurden diese Stückchen
erneut mehrmals mit steriler Kochsalzlösung gespült, um eine größtmögliche Keimarmut zu
erreichen. Es war unbedingt darauf zu achten, immer die Orientierung der Membran zu
kennen, dass heißt, zu wissen, welche die Epithel- bzw. Oberseite und welche die Chorion-
bzw. Unterseite war. Hierzu wurde die Membran mit der Epithelseite nach oben ausgebreitet
und am oberen Rand rechts eine Kerbe eingeschnitten, schematisch ist dies in Abbildung 2.2
dargestellt.
Einschnitt oben rechts
Epithel- bzw. Oberseite
Bindegewebe- bzw.
Unterseite
Abbildung 2.1:
Präparation der Amnionmembran
Von einer gereinigten Amnionmembran wird ein ca. 3×3 cm großes Stückchen ausgeschnitten.
Abbildung 2.2:
Markierung der Amnionmembranstückchen
Ein Einschnitt oben rechts zeigt an, dass die Epithelseite nach oben gerichtet ist.
Material und Methodik 46
Vernetzung
Ein Teil der Amnionmembranen wurde nach der Methode von Spörl vernetzt.[166] Dazu
wurden 2 g Dextran T500 in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung unter Rühren aufgelöst
(16,7 %ige Lösung). Danach wurden 0,04 ml 25 %iger Glutardialdehydlösung hinzugegeben
(0,1 %ige Lösung). Das Amnionstückchen wurde auf eine kleine Teflonscheibe aufgezogen,
mit einer Pinzette vorsichtig geglättet und vollständig in die Vernetzungslösung eingetaucht.
Nach einer Viertelstunde war die Membran einigermaßen stabil vernetzt und die
Teflonscheibe konnte entfernt werden. Die Membran verblieb weitere 15 min in der Lösung
und wurde anschließend mehrmals mit Kochsalzlösung gespült, um die Vernetzungslösung
vollständig abzuwaschen.
Kryokonservierung
Die fertig präparierten Amnionmembranen wurden in einer 1+1-Mischung aus DMEM und
Glycerol bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung kryokonserviert gelagert.
Deepithelialisierung
Es wurden verschiedene Enzyme in unterschiedlichen Konzentrationen und
Inkubationszeiten getestet, um das Epithel von unvernetzer, kryokonservierter Amnion-
membran abzulösen. Verwendet wurden die Enzyme Trypsin, Collagenase I und Collagenase
IV in den Konzentrationen 0,05 %, 0,1 % und 0,2 % und das Enzym Dispase II in den
Konzentrationen 0,6 U/ml, 1,2 U/ml und 2,4 U/ml. Das Amnion verblieb entweder 15, 30
oder 60 Minuten bei 37°C und 5 % CO2 in der Enzymlösung.
Material und Methodik 47
2.2.2 Hornhäute und Corneoskleralringe
Die Hornhäute wurden auf einer kleinen sterilen Teflonscheibe mit einer Skalpellklinge
radiär in 2-8 gleich große Stücke zerschnitten (siehe Abbildung 2.3). So war es möglich, von
einer Hornhaut mehrere vergleichende Ansätze durchzuführen. Mit den Corneoskleralringen
wurde genauso verfahren. Die wichtige Limbusregion war auch bei ihnen noch vorhanden, da
bei der Hornhauttransplantation vom Spender zwar die gesamte vordere Sklera und Cornea
gewonnen wird, bei der anschließenden Keratoplastik aber lediglich die zentralen, durch
erneute Trepanation ausgestanzten 6,5-8,5 mm verwendet werden. In einem nächsten Schritt
wurden überflüssige zentrale Hornhaut, Bindehaut und etwaige Irisreste abgetrennt. So
erhielt man Stücke der Limbusregion mit einer Größe von etwa 3×6 mm.
Für die statistische Auswertung wurden von den Hornhäuten bzw. Corneoskleralringen
verschiedene Daten eruiert: Hornhautspendenummer, Alter des Spenders, Geschlecht des
Spenders, Todeszeitpunkt, Entnahmezeitpunkt und eventuelles Transplantationsdatum.
2.3 Ex-vivo-Anzüchtung von Limbusepithelzellen
2.3.1.1 Isolierung und Wachstum in einer Kulturschale
Es wurden verschiedene Möglichkeiten untersucht, die Limbusepithelzellen von der
Hornhaut abzulösen und auf dem unbehandelten Boden einer 24-Loch-Kulturschale
anzuzüchten. Eine Variante war, mittels Abrasio eine Zellsuspension zu erzeugen und
einzusäen. Hierzu wurde das Hornhautstückchen in ein mit Medium gefülltes Loch einer
Kulturschale gelegt und mit einem Hockeymesser oder Skalpell wurden die oberflächlichen
Zellen der Limbusregion vorsichtig abgeschabt. So erhielt man im Medium schwimmende
Zellen. Eine andere Variante war das Einbringen eines Explantates in Kultur, um daraus
auswachsende Zellen zu erhalten. Dazu wurde ein Hornhaut- oder Skleralringstück in die
Kulturschale gelegt, entweder mit der Epithelseite nach oben oder nach unten. Als weitere
Variante wurde die enzymatische Vorbehandlung untersucht. Hierzu wurde die Hornhaut
entweder 2-3 h in Dispase II 1,2 U/ml bei 37°C (kurz) oder in Dispase II 0,8 U/ml bei 4°C
Abbildung 2.3:
Präparation eines Corneoskleralringes
Von einem Skleralring wurde 1/8 der Zirkumferenz herausgetrennt, welches anschließend für einen Versuchsansatz verwendet wurde.
Material und Methodik 48
18 h (lang) inkubiert. Nach dieser Zeit wurde versucht, die Zellen wie oben beschrieben
abzuschaben. Wenn sich nur große, zusammenhängende Zellverbände lösten, konnte man
versuchen, durch triturieren, d. h. wiederholtes Pipettieren, diese zu trennen.
Sobald die Zellen angeheftet waren, wurde das Einsaatmedium gegen frisches Medium
ausgetauscht, weitere Mediumwechsel erfolgten zweimal pro Woche. Das Wachstum der
Zellen wurde mittels Phasenkontrastmikroskop bewertet und fotodokumentiert. Es wurde
darauf geachtet, das Volumen des Mediums in der Kulturschale eher gering zu halten, um
eventuell von den Zellen oder dem Gewebe sezernierte Faktoren nicht allzu sehr zu
verdünnen.
2.3.1.2 Kultivierung auf Amnionmembran
Hierzu wurde das zuvor selbst präparierte vernetzte oder unvernetzte kryokonservierte
Amnion verwendet. Die kryokonservierte Membran wurde aufgetaut und dreimal in
physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, um sämtliches Kryomedium abzuspülen. Nun
wurde das Stückchen in einer großen Petrischale, die etwas mit NaCl-Lösung benetzt war,
mit der epithelialen Seite nach oben ausgebreitet. Da sich die Membran leicht
zusammenrollte, wurde sie mit einer Pinzette langsam auf ein großes Deckgläschen oder
einen Objektträger als Hilfsmittel aufgebracht und damit in das Loch einer 6-Loch-Schale
transferiert. Das Stückchen wurde dann auf dem Boden der Kulturschale wiederum mit der
Epithelseite nach oben ausgebreitet und mit ein wenig Histoacrylkleber an 4 Punkten am
Boden der Kulturschale fixiert.
Die Varianten, die Limbuszellen auszusäen, waren die gleichen wie bei dem Wachstum in der
Kulturschale, dass heißt das Erzeugen einer Zellsuspension durch eine Abrasio, die
enzymatische Ablösung oder das Explantat, mit dem Limbusepithel entweder nach oben oder
nach unten gerichtet. Die Explantat-Stückchen wurden zentral auf die Amnionmembran
gelegt. Um ein Wegschwimmen zu verhindern, wurden sie teilweise mit einem darauf-
gelegten Glasstückchen beschwert oder mit Histoacrylkleber auf dem darunterliegenden
Amnion fixiert. Als Glasstückchen fanden Bruchstücke eines Objektträgers Verwendung,
welche vorher sterilisiert wurden. In einigen Versuchen wurden die Explantate durch
Antrocknen auf der Amnionmembran fixiert. Dies geschah, indem sie über Nacht im
Brutschrank und danach drei Stunden offen unter der Sterilwerkbank stehengelassen
wurden, bevor Kulturmedium zugegeben wurde.
Für alle Versuche wurde nur kryokonservierte Amnionmembran benutzt, die aber
unterschiedlich vorbehandelt war (unbehandelt, vernetzt oder deepithelialisiert). Analog zum
Wachstum in der Kulturschale wurde auch hier nur soviel Medium benutzt, dass die
Hornhautstückchen gerade vollständig bedeckt waren. Ein Mediumwechsel erfolgte zwei- bis
Material und Methodik 49
dreimal pro Woche und das Wachstum wurde mittels Phasenkontrastmikroskop beobachtet
und fotodokumentiert. In den Abbildungen 2.4 und 2.5 ist dies noch einmal veranschaulicht.
Die Versuche wurden vergleichend durchgeführt, um eine optimale Vorbehandlung der
Amnionmembran sowie eine optimale Isolierung der Limbusepithelzellen feststellen zu
können. Insgesamt wurden nach diesem Prinzip 166 Versuche durchgeführt, die sich auf
neun Ansätze verteilten.
2.3.2 Fixierung und Einbettung
Sobald die Amnionmembran mit Limbusepithelzellen überwachsen war und diese bereits auf
dem Kulturschalenboden wuchsen, wurde die Membran vorsichtig an den Klebestellen
abgetrennt. Die Präparate wurden über Nacht in 4 % Formalin fixiert und daraufhin in einer
aufsteigenden Alkoholreihe entwässert. Dazu wurde die Membran zwischen zwei Papier-
stückchen in eine Einbettkapsel gelegt, so dass sie möglichst gerade blieb und sich nicht
zusammenrollen konnte. Bei dem darauffolgenden Einbetten in Paraffin wurden die beiden
Papierstückchen wieder entfernt. Es wurden Schnitte mit einer Dicke von 4 µm angefertigt.
6-Loch-
Kulturschale
Amnionmembran mit
Epithel nach oben
Limbusstückchen mit Epithel nach unten
Abbildung 2.4:
Schemazeichnung der Explantat-Technik
Ein Limbusstückchen liegt mit dem Epithel nach unten auf einer intakten Amnionmembran, deren Epithel nach oben zeigt.
Abbildung 2.5:
Aufsicht auf eine 6-Lochschale
Ein Limbusexplant liegt auf einer Amnionmembran, die an den Ecken am Schalenboden festgeklebt ist, ein Glasstückchen beschwert das Limbusexplantat.
Material und Methodik 50
2.3.3 Färbungen
2.3.3.1 Histochemische Färbungen
Trypanblau und Alizarinrot
Die Trypanblau- und Alizarinrotfärbung wurde an nativen Präparaten durchgeführt. Dazu
wurden die Proben in kleinere Stückchen geschnitten und für drei Minuten entweder in einer
Trypanblau- oder Alizarinrotlösung bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden
sie mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, mikroskopiert und fotodokumentiert.
Hämatoxyxlin-Eosin
Die Hämatoxylin-Eosinfärbung (HE-Färbung) erfolgte an Paraffinschnitten. Diese wurden
zum Entparaffinieren durch eine Badfolge mit folgenden Chemikalien gezogen: Xylol
3×10 min, absoluter Alkohol 3×3 min, 96 %iger Alkohol 2×3 min, 70 %iger Alkohol 1×3 min,
40 %iger Alkohol 1×3 min, aqua dest. 1×3 min. Anschließend erfolgte die Färbung in
Hämatoxylin für 10 min und nach gründlicher Spülung die Inkubation in aqua dest. für
10-30 min. Um die Kernfärbung noch zu verstärken, konnte an dieser Stelle bei Bedarf eine
kurze Inkubation in Ammoniak-Wasser (10 Tropfen 25 % Ammoniak in 200 ml aqua dest.)
erfolgen. Nach erneuter Spülung und Inkubation in 1 %igem Eosin für 4 min fand
anschließend die Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe und Xylol statt. (kurz
hintereinander in 40 %igen, 70 %igen, 2×90 %igen, 3× absoluten Alkohol und 3×3 min
Xylol) Zum Abschluss wurden die Präparate mit DePex eingedeckt, mikroskopiert und
fotodokumentiert.
2.3.3.2 Immunhistochemische Färbungen
LSAB 2 System-AP
Analog zur HE-Färbung wurden die Paraffinschnitte mit Xylol entparaffiniert und über die
absteigende Alkoholreihe hydriert. Anschließend erfolgte eine Spülung in 10 %igem Tris-
Puffer für 3 min. Zur Färbung wurden die Präparate auf dem Objektträger mit dem
Cytomation Pen (wasserabweisender Stift) umkreist. Anschließend erfolgte eine
Antigendemaskierung über eine 10minütige Präinkubation in Proteinase K. Lediglich zur
Färbung gegen p63 war eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung notwendig, bei der die
Schnitte 30 min lang in Citratpuffer pH6 bei 95 °C in einem Wasserbad inkubiert werden
mussten. Bei Kryoschnitten war eine Antigendemaskierung nicht erforderlich. Die gesamte
nachfolgende Färbeprozedur war für beide Präparattypen gleich. Die Schnitte wurden 3×3
min in Tris-Puffer gewaschen und 10 min in Proteinblocklösung inkubiert. Die Primär-
antikörper wurden nach den jeweiligen Vorschriften des Herstellers verwendet, mit
AntibodyDiluent auf die empfohlene Konzentration verdünnt und für 30-45 min bei
Raumtemperatur auf den Proben belassen. Sämtliche Vorgänge fanden in einer feuchten
Material und Methodik 51
Kammer statt, um ein Austrocknen der Schnitte während der Inkubationszeiten zu
vermeiden. Nach erneutem dreimaligem Waschen für je 3 min in Tris-Puffer wurde der
Sekundärantikörper (Biotin-gekoppelt) aufgetragen und für 10 min belassen. Wieder erfolgte
ein 3×3minütiger Waschvorgang in Tris-Puffer mit anschließender 10minütiger Inkubation
der Proben mit Streptavidin, gefolgt von einem weiteren Waschvorgang (3×3 min Tris-
Puffer). Abschließend wurde 10 min mit Substrat-Chromogen-Lösung inkubiert und kurz mit
aqua dest. gespült. Der nächste Schritt war die Gegenfärbung mit Hämatoxylin, das 1:10 mit
aqua dest. verdünnt für 4 min aufgetropft und anschließend in schwach ammoniakalischem
Wasser gebläut wurde. Nach letztmaligem kurzen Waschen in aqua dest. wurden die Schnitte
mit Aquatex eingedeckt, mikroskopiert und fotodokumentiert.
Vectastain ABC-Elite-Kit
Das Entparaffinieren, Rehydrieren, Waschen und die Antigendemaskierung erfolgten wie
oben beschrieben, als Waschpuffer wurde jedoch PBS statt Tris-Puffer verwendet. Nach
entsprechender Vorbehandlung wurde zur Blockierung der endogenen Peroxidase eine
Lösung von 1 % H2O2 in aqua dest. für 10 min bei Raumtemperatur aufgetragen. Diesem
Schritt folgte ein erneuter 3maliger Waschgang. Nun wurden die Schnitte 15 min lang mit
verdünntem Normalserum im Brutschrank inkubiert und anschließend wurde der
Primärantikörper aufgetragen. Gefolgt von einem weiteren 3×3minütigen Waschen wurden
die Schnitte mit dem sekundären, biotinylierten Antikörper für 15 min bei 37°C inkubiert,
gefolgt von einer weiteren Waschprozedur und anschließender Inkubation mit dem ABC-
Komplex. Nach erneutem 3maligem Waschen wurden die Schnitte 8 min mit der DAB-
Lösung (60 mg DAB auf 100 ml PBS + 10 µl H2O2) gefärbt und anschließend mit Hämalaun
5-30 s gegengefärbt. Abschließend erfolgte die Dehydrierung in aufsteigender Alkoholreihe
(40 %, 70 %, 2×96 %, 3x absoluter Alkohol, 3× Xylol, je 3 min) und Eindeckung der Schnitte
mit DePex. Die fertigen Präparate wurden mikroskopiert und fotodokumentiert.
Immunfluoreszenz
Die Vorbehandlung der Schnitte und die Inkubation mit dem Primärantikörper geschah wie
bei dem LSAB-System beschrieben. Nach dem Primärantikörper und 3maligem Waschen in
Tris-Puffer für je 3 min wurde ein FITC-konjugierter Sekundärantikörper aufgetragen und
30-45 min auf den Schnitten belassen. Ab diesem Schritt wurden alle weiteren Schritte unter
Lichtausschluss durchgeführt. Es folgte erneut ein 3maliger Waschgang für je 3 min und bei
Bedarf eine Färbung der Zellkerne mit DAPI für 1-2 min. Anschließend wurden die Schnitte 3
min in aqua dest. gewaschen und mit Fluorescent-Mounting-Medium eingedeckt. Die
Präparate wurden im Dunkeln aufbewahrt, um ein Verblassen des Farbstoffes zu verhindern.
Mikroskopie und Fotodokumentation erfolgte an einem Fluoreszenzmikroskop.
Material und Methodik 52
2.3.4 Aufbereitung der Proben für die Transmissions-
elektronenmikroskopie
Das Präparat wurde in 2,5 % Glutaraldehyd, 0,1 M Cacodylatpuffer eine Stunde fixiert und
bei 4 °C über Nacht in 0,5 % GTA inkubiert. Am nächsten Tag wurde es 3×10 min in
Cacodylatpuffer gewaschen, bevor es eine Stunde osmiert wurde. Dies geschah in einer
1+1-Mischung aus 2 % wässrigem Osmiumtetroxid mit 0,2 M Cacodylatpuffer. Nach
erneutem dreimaligem Waschen für je 10 min erfolgte die Entwässerung der Proben in einer
aufsteigenden Ethanolreihe bis 100 % Ethanol. Nun wurde das Präparat für ca. 3 h in einem
Gemisch aus gleichen Teilen EPON und 100 % Ethanol inkubiert, gefolgt von einer
Inkubation über Nacht in reinem EPON. Anschließend erfolgte die EPON-Einbettung und
Polymerisierung bei 60 °C für 48 h. Zur mikroskopischen Kontrolle erfolgte die Anfertigung
0,5 µm dicker Semidünnschnitte. Die Ultradünnschnitte wurden mit einer Dicke von 70 nm
hergestellt und anschließend mit Uranylacetat und Bleicitrat kontrastiert.
2.3.5 Statistische Auswertung
2.3.5.1 Einfluss der Kultivierungsmethode
Inwiefern die unterschiedlichen Kultivierungsmethoden einen Einfluss auf das erfolgreiche
Auswachsen von Limbusepithelzellen auf Amnionmembran haben, stand im Mittelpunkt der
ersten statistischen Untersuchung. Verglichen wurden die Methoden Zellsuspension durch
Abrasio, Explantat mit Epithel nach oben und Explantat mit Epithel nach unten. Als
prozentuale Auswachsrate wurde die Anzahl der Ansätze definiert, bei denen ein Auswachsen
von Hornhautepithelzellen mikroskopisch sichtbar war im Verhältnis zur Gesamtanzahl der
Ansätze. Um dabei die Unterschiede zwischen den verschiedenen Methoden auf ihre
Signifikanz hin zu überprüfen, wurde der exakte zweiseitige Test nach Fisher angewandt.
Eine Unterscheidung hinsichtlich der Verwendung unvernetzter oder vernetzter
Amnionmembran wurde hierbei nicht getroffen.
Material und Methodik 53
2.3.5.2 Einfluss von Spenderalter, Post-mortem-Zeit und Organkultur-
Dauer
Inwieweit die Geschichte der Spenderhornhaut bis zur Gewinnung und Kultivierung der
Limbusepithelzellen einen Einfluss auf die Auswachsrate hat, wurde in einer weiteren
statistischen Auswertung überprüft. Zuvor wurden drei verschiedene Variablen
(Spenderalter, Post-mortem-Zeit und Organkultur-Dauer) definiert und die erforderlichen
Daten eruiert. Als Spenderalter galt das Alter des Hornhautspenders zum Todeszeitpunkt, als
Post-mortem-Zeit die Spanne zwischen Tod und Organentnahme im Rahmen der
Organspende. Die Organkultur-Dauer wurde definiert als die Zeit zwischen Organentnahme
mit sofortiger Präparation und Einlagerung der Hornhaut in Hornhautmedium und
Transplantation der Hornhaut mit anschließender Weiterverarbeitung des verbleibenden
Corneoskleralringes mit Kultivierung der Limbusepithelzellen.
Als Versuchseinheit wurde die Hornhaut definiert, aus der jeweils 2 bis 8 Einzelproben
entnommen und auf die prozentuale Auswachsrate experimentell überprüft wurden. Als
statistische Methode diente eine gewichtete multiple polynomiale Regressionsanalyse
2. Grades. Die unabhängige Variable war die Auswachsrate bei mehrfachen Versuchen, wobei
die Anzahl der Versuche heuristisch als Gewicht benutzt wurde. Als abhängige Variablen
dienten das Spenderalter, die Post-mortem-Zeit und die Organkultur-Dauer. Mit der
Wichtung wurde berücksichtigt, dass die Erfolgsquote für jede ursprüngliche Hornhaut je
nach Anzahl der Proben unterschiedlich genau geschätzt wurde.
Ergebnisse 54
3 Ergebnisse
3.1 Amnionmembran
3.1.1 Kryokonservierung
Nach Kryokonservierung zeigte die Amnionmembran eine starke Anfärbbarkeit mit dem
Vitalfarbstoff Trypanblau. Auf Abbildung 3.1 sieht man deutlich die tiefblauen Zytoplasmen
der polygonalen Amnionepithelzellen und ihre hellen Zellgrenzen in der Aufsicht. Alizarinrot
hingegen färbte besonders die Zellgrenzen deutlich rot an. In der Aufsicht war ein typisches
Pflastersteinmuster des Amnionepithels erkennbar.
3.1.2 Vernetzung
Die Vernetzung der Amnionmembran führte zu einer Versteifung und Verfestigung, was eine
stark verbesserte Handhabbarkeit bedeutete. Rollten sich bei unbehandelter
Amnionmembran die Stückchen immer zusammen und machten so eine makroskopische
Unterscheidung der Seiten schwierig, behielten die vernetzen Präparate ihre Form und waren
sehr gut handhabbar. Die Färbung mit Hämatoxylin-Eosin zeigte sowohl bei vernetzter als
auch bei unvernetzter kryokonservierter Amnionmembran das gleiche Bild. (Abbildung 3.2)
Auf einem Bindegewebe saß ein einschichtiges, kubisches Epithel. Die Zellen waren alle etwa
gleich groß und enthielten einen rundlich bis ovalen, zentral liegenden Kern. An ihrer
apikalen Seite waren die Zellen in der Mitte gegenüber dem Zellrand etwas erhaben. Das
Bindegewebe bestand aus einer dichten, zellfreien Schicht und einer darunterliegenden
aufgelockerten Schicht mit wenigen Zellen.
a b
Abbildung 3.1: Kryokonservierte Amnionmembran in der Aufsicht
a) Färbung mit Trypanblau, Vergrößerung 10fach b) Färbung mit Alizarinrot, Vergrößerung 20fach Trypanblau färbt das Zytoplasma, Alizarinrot die Zellgrenzen. Man erkennt den Zellrasen als Pflastersteinrelief aus polygonalen Epithelzellen.
Ergebnisse 55
Auch in den transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen stellte sich das
Amnionepithel als einschichtiges, kubisches Epithel dar. (Abbildung 3.3 a) Mit ihrer
Unterseite saßen die Zellen glatt einer Basalmembran auf, während sie an ihrer Oberseite
gewölbt und mit zahlreichen Mikrovilli übersät waren. Wie die Detailaufnahme in Abbildung
3.3 b erkennen lässt, zeigten die Zellen auch an den Seiten viele Membranausstülpungen, so
dass sie wie ineinander verzahnt erschienen. Nach Vernetzung, wie in Abbildung 3.3 c zu
sehen, besaßen die Zellen lediglich eine flachere Oberfläche, ansonsten waren keine
Unterschiede zu erkennen.
a b
Abbildung 3.2: Kryokonservierte Amnionmembran in der HE-Färbung, Vergrößerung 20fach
a) Vernetzt b) Unvernetzt Das Amnionepithel ist ein einschichtiges, kubisches Epithel auf zellarmem Bindegewebe.
Abbildung 3.3: Amnionepithel in einer
transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahme
a) Native Amnionmembran, Vergrößerung 2156fach. b) Detail einer Zell-Zell-Verbindung, Vergrößerung 12930fach. c) Vernetzte Amnionmembran, Vergrößerung 2156fach.
c
a
b
Ergebnisse 56
3.1.3 Epithelentfernung
Die verschiedenen Enzyme zeigten große Unterschiede in ihrer Fähigkeit, unvernetzte,
kryokonservierte Amnionmembran zu deepithelialisieren. In der untenstehenden Tabelle 3.1
sind die Ergebnisse aufgelistet, in Abbildung 3.4 exemplarisch einige HE-Färbungen nach
enzymatischer Deepithelialisierung dargestellt. Sowohl Collagenase I als auch Collagenase IV
stellten sich als relativ unwirksam dar, während Trypsin und Dispase II in der Lage waren,
das Amnionepithel zu entfernen. Bei beiden zeigte sich eine Konzentrations- und
Zeitabhängigkeit. Je länger und je höher konzentriert das Enzym einwirkte, desto mehr
Epithelzellen wurden abgelöst. Unterschiede zwischen beiden Enzymen wurden
lichtmikroskopisch sichtbar: Während durch Trypsin eher ganze Zellen oder Zellverbände
abgelöst wurden, schien Dispase die Zellen eher zu zerstören oder nur einzelne Zellen
herauszulösen.
Trypsin Dispase II Collagenase I Collagenase IV
0,05 %
0,1 %
0,2 %
0,6 U/ml
1,2 U/ml
2,4 U/ml
0,05 %
0,1 %
0,2 %
0,05 %
0,1 %
0,2 %
15 min
? ++ ++ - + (+) (+) (+) - - - -
30 min
+ ++ + (+) (+) ++ - ? (+) - - (+)
60 min
++ ? ? (+) ++ ++ + - ? - - (+)
Tabelle 3.1: Deepithelialisierung kryokonservierter Amnionmembran mit verschiedenen Enzymen
- kein Erfolg, (+) geringer Erfolg, + mäßiger Erfolg, ++ großer Erfolg, ? fraglich bzw. Präparat nicht auswertbar
Abbildung 3.4: Deepithelialisierung
kryokonservierter Amnionmembran
mit verschiedenen Enzymen
Vergrößerung 10fach
a) Dispase 0,6 U/ml 30 Min (+) b) Trypsin 0,05 % 30 Min + c) Dispase 2,4 U/ml 30 Min ++
a
b
c
Ergebnisse 57
3.1.4 Immunhistochemie
Die mittels immunhistochemischer Färbungen untersuchten Amnionmembranen zeigten
eine Expression unterschiedlicher Antigene in den Bestandteilen des Amnions. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 3.5 dargestellt. In den Epithelzellen konnten die Cytokeratine
3/12 und 13, 14, 15, 16 (HMW) dargestellt werden. Weiterhin waren auch Connexin 43 und
der Hormonrezeptor für HCG/LH auf das Epithel beschränkt, letzterer prominenter in der
apikalen Zellmembran. Vimentin hingegen ließ sich nur in einigen Epithelzellen, jedoch in
allen Zellen des darunterliegenden Bindegewebes nachweisen. Auch Aquaporin 5 zeigte sich
gut, sowohl in Epithel- als auch in Bindegewebszellen. Nur schwach färben ließ sich jedoch
Aquaporin 9 in einigen Epithelzellen. Nicht nachweisen ließ sich p63.
Ergebnisse 58
CK3/12 a b CK3/12
CK 13-16 (HMW) c d CK 13-16 (HMW)
AQP5 e f AQP9
HCG/LH-Rezeptor g h HCG/LH-Rezeptor
Cx43 i j Vimentin
Abbildung 3.5: Immunhistochemische Färbungen einer Amnionmembran mittels LSAB (a,c,g), Vectastain
(e,f,h,i,j) und Fuoreszenz (b,d)
Vergrößerungen: a) 40fach, b) 60fach, c) 40fach, d) 60fach, e) 20fach, f) 20fach, Ausschnitt 100fach, g) 40fach, h) 100fach, i) 40fach, j) 40fach Amnionepithelzellen sind deutlich positiv für CK3/12, CK 13-16, AQP5, HCG/LH-Rezeptor, Cx43 und schwach positiv für AQP9 und Vimentin, Bindegewebszellen färben sich deutlich gegen AQP5 und Vimentin.
Ergebnisse 59
3.2 Hornhautepithel
3.2.1 Morphologie
Im zentralen Teil der Hornhaut (Abbildung 3.6 a) fand sich in der HE-Färbung das typische
mehrschichtige, unverhornte Plattenepithel mit 3-4 Zelllagen, welches der dichten Bowman-
Membran auflag. Gut zu erkennen war die unterschiedliche Form der Epithelzellen in den
einzelnen Schichten. So erschienen die basalen Zellen eher groß und kubisch mit rundem
mittelständigem Zellkern, während die obersten Zellen flach mit ebenfalls abgeplattetem
Kern diesen auflagen.
Am Übergang zwischen Hornhaut und Bindehaut, dem Limbus, zeigte sich eine wallartige
Erhebung, in dem sich die verzweigten Krypten befanden. (Abbildung 3.6 b,c) Hierunter
befand sich jedoch statt der dichten Bowman-Membran ein lockeres Bindegewebe mit
zahlreichen Blutgefäßen.
a b c
Abbildung 3.6: HE-Färbung einer Hornhaut, Querschnitt durch das Epithel verschiedener Regionen
a) Zentral: mehrschichtiges unverhorntes Plattenepithel auf dichter Bowman-Membran, Vergrößerung 40fach. b) Limbus: wallartige Erhebung am Übergang zwischen Hornhaut (links im Bild) und Bindehaut (rechts im Bild), Vergrößerung 4fach. c) Limbus, vergrößert: im Wall verzweigte Krypten auf lockerem, gut vaskularisiertem Bindegewebe, Vergrößerung 20fach.
Ergebnisse 60
3.2.2 Immunhistochemie
3.2.2.1 Zentrales Hornhautepithel
Die Ergebnisse für das zentrale Hornhautepithel sind in Abbildung 3.7 dargestellt.
Cytokeratine 3/12 und 13,14,15,16 (HMW)
Die Cytokeratine 13,14,15,16 (HMW), die in mehrschichtigen Epithelien vorkommen, und das
Cytokeratinpaar 3/12, welches relativ spezifisch für die Hornhaut ist, konnten im
Hornhautepithel nachgewiesen werden. Es färbte sich, dem Vorkommen der Cytokine
entsprechend, das gesamte Zytoplasma, nicht jedoch der Zellkern. Das Hornhautstroma mit
Bindegewebszellen, die bekannterweisen keine Cytokine enthalten, blieb ohne Anfärbung.
Aquaporine 5 und 9
Die Aquaporine 5 und 9 hingegen ließen sich sowohl in den Epithel- als auch in einigen
Stromazellen nachweisen.
HCG/LH-Rezeptor
Färbungen gegen den HCG/LH-Rezeptor zeigten sich nur punktförmig in den obersten
Epithelzellen, während die darunterliegenden Schichten negativ dafür waren.
Connexin 43
Im Gegenteil dazu waren für Connexin 43 die superfiziellen Zellen negativ, die folgenden
Schichten, und hier besonders die mittlere, jedoch positiv. Die Farbstoffansammlungen
fanden sich vor allem an den Zellgrenzen, auch hier mit einem teilweise punktförmigen
Aussehen. Bindegewebszellen zeigten keine Expression von Cx43.
Vimentin
Vimentin konnte in den Bindegewebs- und in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Hier
zeigte sich ein deutliches Gefälle innerhalb der verschiedenen Schichten des Epithels. War es
besonders konzentriert in den Basalzellen, nahm es nach oben hin ab und war in den
oberflächlichen Zellen kaum noch nachweisbar.
p63
P63 war nur in den Kernen der Basalzellen vorhanden.
Ergebnisse 61
CK13-16 (HMW) c d CK13-16 (HMW)
CK3/12 a b CK3/12
AQP5 e f AQP9
HCG/LH-Rezeptor g h Cx43
Vimentin i j p63
Abbildung 3.7: Immunhistochemische Färbungen von zentralem Hornhautepithel
LSAB (a,c), Vectastain (e,f,g,h,i) und Fuoreszenz (b,d,j) Vergrößerungen: a) 40fach, b) 60fach, c) 20fach, d) 60fach, e) 60fach, f) 60fach, g) 40fach, h) 40fach, i) 40fach, j) 60fach Epithelzellen aus dem Zentrum der Hornhaut sind deutlich positiv für CK3/12, CK13-16, AQP5, AQP9, Cx43 und Vimentin, die beiden letzteren jedoch wenig oder nicht in der obersten Schicht. Der HCG/LH-Rezeptor dagegen ist nur in der obersten Schicht nachweisbar. P63 kommt nur in den Kernen der Basalzellen vor. Zum Vergleich ist darunter die DAPI-Färbung der Zellkerne aller Schichten abgebildet.
Ergebnisse 62
3.2.2.2 Limbusepithel
Die Ergebnisse für das Epithel der Limbusregion sind in Abbildung 3.8 dargestellt.
Cytokeratine 3/12 und 13,14,15,16 (HMW)
Die Cytokeratine 3/12 und 13,14,15,16 (HMW) ließen sich auch in den Zellen der
Limbusregion inklusive den Zellen in den Krypten darstellen.
Aquaporine 5 und 9
Auch die Aquaporine 5 und 9 ließen sich in den Kryptenzellen des Limbus nachweisen.
HCG/LH-Rezeptor
Der HCG/LH-Rezeptor ließ sich hingegen nicht oder nur ganz vereinzelt in den
Kryptenzellen finden.
Connexin 43
Im Gegensatz dazu war Connexin 43 reichlich in den Zellen der Krypten nachweisbar. Es
stellten sich deutliche punktförmige Färbungen dar.
Vimentin
Die Färbung gegen Vimentin zeigte eine starke Immunopositivität der reichlich vorhandenen
Bindegewebszellen als auch der Limbusepithelzellen. Auffällig war, dass vereinzelte Zellen,
eine besonders starke Anfärbbarkeit besaßen.
p63
Zahlreiche Zellen in den Krypten zeigten in ihren Zellkernen p63. Die Gegenfärbung des
gleichen Bereiches mit DAPI enthüllte jedoch noch weitere Zellen, die nicht gegen p63
anfärbbar waren. In Bindegewebszellen ließ sich dieses Protein nicht nachweisen.
Ergebnisse 63
CK3/12 a b CK3/12
CK13-16 (HMW) c d CK13-16 (HMW)
AQP5 e f AQP9
HCG/LH-Rezeptor g h Cx43
Vimentin i j p63
Abbildung 3.8: Immunhistochemische Färbungen von Hornhautepithel der Limbusregion
LSAB (a,b,c), Vectastain (e,f,g,h,i) und Fuoreszenz (d,j) Vergrößerungen: a) 4fach, b) 10fach, c) 4fach, d) 40fach, e) 20fach, f) 60fach, g) 40fach, h) 40fach, i) 20fach, j) 20fach Epithelzellen aus der Limbusregion der Hornhaut sind deutlich positiv für CK3/12, CK13-16, AQP5, AQP9, Cx43 und Vimentin. Vimentin ist hierbei besonders stark in einigen Zellen der Krypte und in Bindegewebszellen vorhanden. Der HCG/LH-Rezeptor lässt sich nur sehr schwach in superfiziellen Zellen nachweisen, nicht jedoch in der Krypte. P63 zeigt sich nicht in Bindegewebszellen, jedoch in zahlreichen Kernen der Kryptenzellen. Die DAPI-Färbung des gleichen Ausschnittes enthüllt weitere Zellen, die sich nicht gegen p63 anfärben.
Ergebnisse 64
3.3 Ex-vivo-Anzüchtung von Limbusepithelzellen
3.3.1 Wachstum in einer Kulturschale
In einer ersten Versuchsreihe wurden Limbusepithelzellen von Spenderhornhäuten in
Kulturschalen übertragen, um den Erfolg verschiedener Isolierungstechniken sowie die
Kultivierungsbedingungen zu überprüfen. Zum Einsatz kamen die Explantat-Kultur und die
Kultivierung enzymatisch oder mechanisch abgelöster Epithelzellen. Dabei zeigte sich, dass
die enzymatische Auflösung der Adhäsionskontakte durch Vorbehandlung der Hornhäute
mit Dispase II in verschiedenen Konzentrationen und Inkubationszeiten keine Verbesserung
der Zellisolierung im Vergleich zur mechanischen Abrasio oder der Explantat-Kultur
erbrachte. In Abbildung 3.9 ist phasenkontrastmikroskopisch das Erscheinungsbild der
Zellen auf dem Boden der Kulturschalen dargestellt. Die Morphologie der Zellen war sowohl
zwischen einzelnen Zellen als auch zwischen den Populationen sehr unterschiedlich. Teils
bildete sich ein dichter, konfluenter Zellrasen, teils wuchsen die Zellen eher in retikulärer
Formation. Die Zellen waren oft elongiert und spindelförmig, es fanden sich aber auch Zellen
mit großem Zytoplasma und vielen Ausläufern.
a b c
d e f
Abbildung 3.9: Zellmorphologie auf Kulturschalenboden
Unterschiedliche Morphologie von aus einer Hornhaut auf Kulturschalenboden ausgewachsenen Zellen in vitro: konfluenter Zellrasen oder lockeres Netzwerk, spindelförmig oder großes Zytoplasma mit vielen Zellausläufern. Vergrößerungen: a-e) 40fach, f) 100fach
Ergebnisse 65
3.3.2 Kultivierung auf Amnionmembran
Die zweite und eigentliche Versuchsreihe hatte zum Ziel, Limbusepithelzellen auf
Amnionmembran aufzubringen und in vitro zu kultivieren. Auch hier wurden die
unterschiedlichen, oben beschriebenen Methoden getestet. Da jedoch die enzymatische
Vorbehandlung in der ersten Versuchsreihe keinen wesentlichen Vorteil erbrachte, wurde
nun darauf verzichtet. Besonders eindrücklich zu beobachten war der Verlauf in der
Explantat-Kultur. Nach wenigen Tagen konnte man mit dem Phasenkontrastmikroskop ein
Auswachsen von Zellen aus dem Explantat beobachten. Diese breiteten sich über die
Amnionmembran aus. In der Aufsicht sah man einen konfluenten Zellrasen mit relativ
glatter Begrenzung. (Abbildung 3.10) Sehr deutlich waren die Größenunterschiede der
verschiedenen Zellarten erkennbar. Die untenliegenden Amnionepithelzellen waren
erheblich kleiner als die darüberwachsenden Zellen aus dem Explantat (ca. 5fach).
Abbildung 3.10: Auswachsen von Hornhautepithelzellen auf Amnionmembran
Aufsicht (die schwarzen Pfeile markieren die Wachstumsgrenze des Hornhautepithels) a) Makroskopischer Versuchsaufbau. b) Ausschnittsvergrößerung 40fach: links das Hornhautexplantat, aus dem die Zellen nach rechts über die Amnionmembran auswachsen. c) Vergrößerung 100fach. d) Vergrößerung 100fach: Größenunterschiede: die Amnionepithelzellen (rechts oben im Bild) sind ca. 5fach kleiner als die darüberwachsenden Zellen (links unten im Bild).
b
d
a
c
Ergebnisse 66
Erreichten die auswachsenden Zellen den Rand der Amnionmembran, so wuchsen sie auf
dem Kulturschalenboden weiter. Hier war es besser möglich, die Morphologie der Zellen zu
erkennen. Wie in Abbildung 3.11 dargestellt, zeigten die Zellen eine polygonale Form mit
einem meist mittig liegenden, runden Zellkern. Im Gesamtbild ergab sich deutlich ein
Pflastersteinmuster.
a b c
Abbildung 3.11:
Morphologie von Hornhautepithelzellen, die über den Rand der Amnionmembran hinausgewachsen sind
Erkennbar ist die polygonale Form der Zellen, welches im Gesamtbild ein typisches Pflastersteinmuster ergibt. Vergrößerungen: a) und b) 40fach, c) 100fach.
Ergebnisse 67
3.3.3 Die Limbusepithel-Amnion-Transplantate
3.3.3.1 Morphologie
Querschnitte der hergestellten Limbusepithel-Amnion-Transplantate sind als HE-Färbung in
Abbildung 3.12 dargestellt. Deutlich konnte man die Amnionmembran mit ihrem
einschichtigen, kubischen Epithel erkennen. Darüber jedoch waren noch weitere Zellen
sichtbar, die vermutlich das ausgewachsene Hornhautepithel darstellten. Diese waren
mehrschichtig, unverhornt und in 3-4 Zelllagen angeordnet, bildeten eine glatte Oberfläche
und zeigten eine unterschiedliche Morphologie in den einzelnen Schichten. Die basalen
Zellen erschienen groß und kubisch mit mittig liegendem Zellkern, wohingegen die
oberflächlichen Zellen platt und langgezogen mit flachem Zellkern waren. Von den darunter-
liegenden Amnionepithelzellen ließen sie sich gut durch ihr Aussehen unterscheiden. So
zeigten sie in der HE-Färbung einen anderen, eher violetten Farbton und waren deutlich
größer als diese (Basalzellen ca. 4-8fach).
a b
Abbildung 3.12: HE-Färbung eines Limbusepithel-Amnion-Transplantates, Querschnitt
a) Übersichtsaufnahme, Vergrößerung 10fach b) Detailaufnahme, Vergrößerung 40fach
Ergebnisse 68
3.3.3.2 Immunhistochemie
Abbildung 3.13 präsentiert die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen.
Tabelle 3.2 stellt diese Beobachtungen semiquantitativ dar und zeigt im Vergleich dazu die
Verteilung der Marker in den nativen Epithelien von Hornhaut und Amnion.
Cytokeratine 3/12 und 13,14,15,16 (HMW)
Die Cytokeratine 3/12 und 13,14,15,16 (HMW) ließen sich in den darüberwachsenden Zellen
in allen Schichten sehr gut nachweisen. Hingegen stellten sich diese in den
darunterliegenden Amnionepithelzellen kaum noch dar. Lediglich unter Anwendung von
Immunfluoreszenz war in den Amnionepithelzellen CK3/12 nachweisbar, CK 13,14,15,16
(HMW) jedoch nicht.
Aquaporine 5 und 9
Aquaporin 5 zeigte sich sowohl in den auswachsenden Hornhautepithelzellen als auch in den
Amnionepithel- und -bindegewebszellen. Aquaporin 9 hingegen färbte sich sehr stark im
Amnionepithel, war jedoch völlig negativ in dem darüberliegenden Hornhautepithel.
HCG/LH-Rezeptor
Der HCG/LH-Rezeptor wiederum ließ sich gut im ausgewachsenen Hornhautepithel, jedoch
nur schwach im Amnionepithel nachweisen.
Connexin 43
Connexin 43 stellte sich gut und teilweise punktförmig in allen Schichten sowohl des Amnion
als auch des auswachsenden Hornhautepithels dar.
Vimentin
Auch Vimentin zeigte sich in allen Zellen, inklusive den Bindegewebszellen der Amnion-
membran.
p63
P63 ließ sich in den Kernen von einigen auswachsenden Zellen nachweisen, jedoch nicht in
allen, wie die DAPI-Färbung des gleichen Ausschnittes zeigte. Die Amnionepithelzellen
zeigten keinerlei Anfärbbarkeit auf p63.
Ergebnisse 69
CK3/12 a b CK3/12
CK13-16 (HMW) c d CK13-16 (HMW)
AQP5 e f AQP9
HCG/LH-Rezeptor g h Cx43
Vimentin i j p63
Abbildung 3.13: Immunhistochemische Färbungen von Limbusepithel-Amnion-Transplantaten
LSAB (a, c), Vectastain (e,f,g,h,i) und Fuoreszenz (b, d) Die ausgewachsenen Zellen sind deutlich positiv für CK3/12, CK13-16, AQP5, HCG/LH-Rezeptor, Cx43 und Vimentin, negativ für AQP9. Die darunterliegenden Amnionepithelzellen sind stark positiv für AQP9, positiv für Cx43, Vimentin und AQP5, schwach positiv für HCG/LH-Rezeptor, CK3/12 und CK13-16. P63 zeigt sich in den Kernen einiger auswachsender Zellen, die DAPI-Kernfärbung des gleichen Ausschnittes enthüllt jedoch noch weitere, nicht angefärbte Zellen.
Ergebnisse 70
Amnion- epithel
Hornhaut Limbusepithel-Amnion-
Transplantat
zentrales Epithel
Limbusepithel gewachsenes Epithel
Amnion-epithel
Cytoplasma- und Kern- marker
Cytokeratin 3/12 ++ ++ ++ ++ (+)
Cytokeratin 13,14,15,16 (HMW) ++ ++ ++ ++ (+)
Vimentin + ++ basal (+) oberflächlich
++ ++ ++
p63 - ++ basal - oberflächlich
++ + -
Oberflächenmarker
Connexin 43 ++ ++ basal - oberflächlich
++ ++ basal (+) oberflächlich
+
Aquaporin 5 + ++ ++ + +
Aquaporin 9 (+) ++ ++ - ++
HCG/LH-Rezeptor + - basal (+) oberflächlich
- + (+)
Tabelle 3.2: Semiquantitative immunhistochemische Verteilung der Marker in den verschiedenen Epithelien
– negativ, (+) schwach positiv, + mäßig positiv, ++ stark positiv
3.4 Statistische Auswertung
3.4.1 Einfluss der Kultivierungsmethode auf die
Auswachsrate
Ziel der statistischen Auswertung war, herauszustellen, ob in der Kultivierung von
Limbusepithelzellen auf Amnionmembran eine Methode den anderen überlegen ist. Diese
zeigten große Unterschiede, wobei die Zellsuspensionstechnik insgesamt am schlechtesten
abschnitt (0,0 % bei vernetzten und 8,7 % bei unvernetzten Membranen). Schon deutlich
besser stellte sich die Explantat-Technik mit nach oben gerichtetem Hornhautepithel dar
(23,1 % bei vernetzten und 28,9 % bei unvernetzten Membranen). Am überzeugendsten war
jedoch die Explantat-Technik mit nach unten gerichtetem Epithel. Hier lagen die
Auswachsraten für vernetzte Membranen bei 41,7 % und für unvernetzte Membranen bei
42,1 %. Tabelle 3.3 gibt einen Überblick über die durchgeführten Versuche und zeigt die
Auswachsraten in Bezug auf die verwendeten Methoden.
Ergebnisse 71
Vernetzt Unvernetzt
Explantat Zellsus- pension
Explantat Zellsus- pension
Gesamt Auswachs- rate
Epithel oben
Epithel unten
Epithel oben
Epithel unten
1.Ansatz
Auswachsen 1 0 0 0 0 0 1
Gesamt 3 3 3 4 4 4 21 4,8 %
2. Ansatz
Auswachsen 1 1 0 0 1 0 3
Gesamt 1 1 2 1 1 2 8 37,5 %
3. Ansatz
Auswachsen 2 0 1 2 1 6
Gesamt 2 2 2 4 6 16 37,5 %
4. Ansatz
Auswachsen 0 1 0 1 1 0 3
Gesamt 3 3 3 3 3 3 18 16,7 %
5. Ansatz
Auswachsen 1 1 0 2 1 5
Gesamt 6 3 6 9 8 32 15,6 %
6. Ansatz
Auswachsen 0 2 2
Gesamt 2 2 4 50,0 %
7. Ansatz
Auswachsen 3 4 7
Gesamt 4 4 8 87,5 %
8. Ansatz
Auswachsen 4 8 12
Gesamt 14 15 29 41,4 %
9. Ansatz
Auswachsen 4 4 8
Gesamt 15 15 30 26,7 %
Auswachsen Gesamt
3 5 0 13 24 2 47
Gesamt 13 12 16 45 57 23 166
Auswachsrate 23,1 % 41,7 % 0,0 % 28,9 % 42,1 % 8,7 % 28,3 %
Tabelle 3.3: Erfolgsraten der verschiedenen Ansätze
Ergebnisse 72
Um diese Beobachtungen auf Ihre statistische Signifikanz hin zu überprüfen, wurde aus den
Daten der Tabelle 3.3 die Kontingenztafel in Tabelle 3.4 erstellt. Um lediglich die ver-
schiedenen Methoden miteinander zu vergleichen, wurde hinsichtlich der Verwendung
vernetzter und unvernetzter Amnionmembran keine Unterscheidung mehr vorgenommen.
Tabelle 3.4: Kontingenztafel der Kultivierungsmethoden und Auswachsraten
Bei der vorliegenden Fallzahl erwies sich der exakte Test nach Fisher als die geeignetste
statistische Methode. Dieser ergab einen Wert von 18,676 und eine exakte zweiseitige
Signifikanz von kleiner als 0,0005. Somit ließ sich zeigen, dass die Explantat-Technik mit
nach untem gerichtetem Epithel den beiden anderen Methoden hinsichtlich Auswachsrate
signifikant überlegen war.
3.4.2 Einfluss von Spenderalter, Post-mortem-Zeit und
Organkultur-Dauer auf die Auswachsrate
Tabelle 3.5 zeigt die spender- und organkulturbezogenen Daten der untersuchten Hornhäute.
Das mittlere Spenderalter betrug 58,4±17,3 Jahre (14-83 Jahre), die mittlere Post-mortem-
Zeit 38,3±24,3 h (9,5-93,5 h) und die mittlere Verweilzeit in Organkultur 26,9±20,6 d
(7-90 d).
Auswachsen Gesamt ja nein
Zellsuspension 2 (5,1 %) 37 (94,9 %) 39 (100 %)
Explantat Epithel oben 16 (27,6 %) 42 (72,4 %) 58 (100 %)
Epithel unten 29 (42,0 %) 40 (58,0 %) 69 (100 %)
Gesamt 47 (28,3 %) 119 (71,7 %) 166 (100 %)
Ergebnisse 73
Hornhaut- nummer
Geschlecht Spenderalter (Jahre)
Post-mortem –Zeit
(Stunden)
Organkultur- Dauer (Tage)
Anzahl der Versuche mit erfolgreichem Auswachsen
Gesamtanzahl der Versuche
1 ? 73 73 90 0 2
2 ♂ 32 20 74 0 3
3 ♂ 32 20 74 0 3
4 ? 45 ? 30 0 3
5 ♂ 40 17,5 20 2 4
6 ♂ 67 49 8 2 4
7 ♂ ? ? ? 0 3
8 ♂ 64 33 28 1 4
9 ♂ 64 33 28 0 4
10 ♂ 53 77 21 3 4
11 ♂ 53 77 21 2 4
12 ♀ 83 49 20 1 3
13 ♀ 83 49 20 0 3
14 ♀ 61 21 15 0 3
15 ♀ 61 21 15 2 3
16 ? ? 31,75 29 0 3
17 ♀ 66 12,5 13 0 3
18 ? 14 ? 18 0 5
19 ♀ 66 10 19 0 4
20 ♀ 66 10 19 2 5
21 ♂ 72 42 18 2 6
22 ♂ 72 42 18 1 4
23 ♀ 77 70,5 15 2 5
24 ♀ 77 70,5 15 1 5
25 ♀ 52 22,5 ? 0 3
26 ♂ 43 17 16 2 4
27 ♂ 24 13,5 16 3 4
28 ♀ 49 8,5 26 4 4
29 ♀ 54 80 70 0 4
30 ? ? ? ? 2 3
31 ♀ 76 93,5 58 3 6
32 ♂ 39 9,5 23 5 6
33 ♂ 50 50 40 0 6
34 ♂ 45 24 21 3 6
35 ♂ 66 51,5 16 2 6
36 ♂ 74 27 8 4 6
37 ♂ 74 27 13 2 6
38 ♂ 78 49,5 7 0 6
Tabelle 3.5: Spender- und organkulturbezogene Daten der verwendeten Hornhäute
Ergebnisse 74
Abbildung 3.14 zeigt mittels dreier Streudiagramme den schon vermuteten negativen
Zusammenhang zwischen der Auswachsrate und jeweils einer der Variablen. In a) ist die
Auswachsrate lediglich in Bezug auf das Spenderalter, in b) auf die Post-mortem-Zeit und in
c) auf die Organkultur-Dauer dargestellt.
a Spenderalter (in Jahren)
90 80 70 60 50 40 30 20 10
100
80
60
40
20
0
Au
swac
hsr
ate
(in
%)
b Post-mortem-Zeit (in Stunden)
100 80 60 40 20 0
100
80
60
40
20
0 A
usw
ach
srat
e (i
n %
)
c Verweilzeit in Organkultur (in Tagen)
100 80 60 40 20 0
100
80
60
40
20
0
Au
swac
hsr
ate
(in
%)
Abbildung 3.14: Zusammenhang zwischen Auswachsrate und a) Spenderalter, b) Post-mortem-Zeit, c) Organkultur-Dauer.
Ergebnisse 75
Die gewichtete multiple polynomiale Regressionsanalyse 2. Grades ergab folgendes
Regressionsmodell:
Variable
Regressions- koeffizient
Standard- abweichung
95 % Konfidenzintervall
Irrtumswahr-scheinlichkeit p
Konstante 1,24447 0,21897 0,79887 ≤ x ≤ 1,69007 <0,0001
Spenderalter (Jahre)
-0,00784 0,00340 -0,01476 ≤ x ≤ -0,00092 0,0289
Post-mortem-Zeit (Stunden) - linear
-0,01641
0,00802
-0,03310 ≤ x ≤ 0,00028
0,0505 - quadratisch 0,00020844 0,00008304 0,00004 ≤ x ≤ 0,00038 0,0184
Organkultur-Dauer (Tage)
-0,00902 0,00231 -0,01372 ≤ x ≤ -0,00432 0,0006
Tabelle 3.6: Regressionsmodell
Die mittlere prädizierte Auswachsrate ergab sich somit aus der folgenden
Regressionsgleichung:
Auswachsrate = 1,24447
- 0,00784 × Spenderalter (in Jahren)
- 0,01641 × Post-mortem-Zeit (in Stunden)
+ 0,00020844 × (Post-mortem-Zeit)2 (in Stunden)
- 0,00902 × Organkultur-Dauer (in Tagen)
Die Auswachsrate war signifikant linear abhängig von dem Spenderalter (p=0,0289) und von
der Verweilzeit in Hornhautmedium (p=0,0006). Nichtlineare Terme waren für beide
Variablen nicht signifikant. Die lineare Abhängigkeit von der Post-mortem-Zeit war knapp
nicht signifikant (p=0,0505), dagegen zeigte sich jedoch eine signifikante quadratische
Abhängigkeit (p=0,0184). Zusammengenommen ergab dies bezüglich der Post-mortem-Zeit
einen degressiv abfallenden Verlaufstyp. Der knapp nicht signifikante lineare Anteil wurde
hierbei nicht herausgenommen, da dadurch eine signifikante Änderung aller anderen
Parameter resultiert hätte. Der Anteil der aufgeklärten Varianz der Auswachsrate betrug
r²=45,05 %.
Zur Modellvalidierung wurden die standardisierten Residuen der Hornhäute herangezogen.
Wie in Abbildung 3.15 zu sehen, zeigten sich drei Ausreißer, insgesamt war die
Varianzhomogenität jedoch gut erfüllt.
Ergebnisse 76
Abbildung 3.16 zeigt den Quantile-Quantile-Plot zur Darstellung der Verteilung der
Residuen. Auch hier war eine angenäherte Normalverteilung hinreichend gesichert. Somit
erschien das Regressionsmodell statistisch valide.
-3
-2
-1
0
1
2
3
-3 -2 -1 0 1 2 3
Qu
anti
le
der
S
tan
dar
dn
orm
alve
rtei
lun
g
Quantile der Residuen
Abbildung 3.16: Q-Q-Plot, Verteilung der Residuen
-3
-2
-1
0
1
2
3
5
3 0
6
9
8
1 1
1 0
1 3
1 2
1 5
1 4
1 7
2 0
1 9
2 2
2 1
2 4
2 3
2 5
1
2 9
2 8
3 1
3 2
3 3
3 4
2 6
3 5
3
2
3 7
3 6
3 8
2 7
4
1 6
1 8
7
Res
idu
um
Abbildung 3.15: Standardisierte Residuen der Hornhäute
Hornhautnummer
Diskussion 77
4 Diskussion
4.1 Amnionmembran
Die immer häufigere Verwendung von Amnionmembran resultiert neben der guten
klinischen Wirkung auch aus dem Umstand, dass sie sich einerseits leicht und nahezu
unbegrenzt gewinnen, andererseits auch relativ einfach aufbewahren lässt. In Kooperation
mit einer gynäkologischen Abteilung und unter Nutzung eines einfach ausgestatteten Labores
mit steriler Werkbank und der Möglichkeit zur Kryokonservierung kann dieses
hochwirksame biologische Produkt selbst gewonnen und für die Anwendung am Patienten
aufbereitet werden. Um die Amnionmembran für Transplantationen zu nutzen, müssen
selbstverständlich ähnlich strenge Kriterien wie für andere Gewebe- oder Organspenden
angewandt werden. Die Entnahme, Aufbereitung und Vermittlung unterliegt dem
Gewebegesetz. Bezüglich der bakteriellen Kontamination konnten Adds et al.[14] auf
Membranen nach vaginalen Geburten eine höhere bakterielle Besiedlung nachweisen als auf
solchen nach Kaiserschnittgeburten. Demzufolge empfiehlt sich lediglich die Verwendung
von Amnion nach Sectio caesarea, um die perinatale bakterielle Kontamination so gering wie
möglich zu halten.
Konservierung und Avitalität
Die anschließende Aufbewahrung sollte unaufwändig sein und die biologischen
Eigenschaften der Amnionmembran möglichst wenig beeinträchtigen. Hier hat sich die auch
in dieser Arbeit verwendete Kryokonservierung weitestgehend durchgesetzt, da sie diesen
Anforderungen gerecht wird.[174] Es werden in der Literatur jedoch auch andere Methoden
beschrieben, wie z. B. die Verwendung frischer,[185] luftgetrockneter[174] oder sterilisierter[189]
Amnionmembran. Eine Überlegenheit frischer Membranen gegenüber kryokonservierten
Membranen hinsichtlich eines Heilungserfolges konnte klinisch jedoch nicht festgestellt
werden.[2] Wichtig ist aber, dass sämtliche Amnionzellen avital sind. Würden diese noch
leben, wie es bei frischer Amnionmembran der Fall ist, bestünde die Möglichkeit, dass auch
sie neben den Limbusepithelzellen in Kultur proliferieren. Bei späterer Transplantation hätte
man dann eine Interaktion lebender Zellen dreier verschiedener Individuen auf dem
Patientenauge. Der erste Versuch galt demzufolge der Überprüfung des Zustandes der
Amnionzellen nach Kryokonservierung. Trypanblau ist hierfür ein geeigneter und oft
verwendeter Vitalfarbstoff. Lebende Zellen transportieren ihn aktiv aus dem Zytoplasma
heraus und erscheinen demzufolge ungefärbt. Die starke Anfärbbarkeit der
Amnionepithelzellen mit Trypanblau zeigte deshalb, dass diese nach Kryokonservierung
avital sind. Diese Beobachtung wurde auch von Kruse[81] und Fernandez[35] berichtet.
Diskussion 78
Vernetzt versus unvernetzt
Ein Problem bei der Verwendung von Amnionmembran ist deren schwierige Handhabung.
Native Amnionmembran rollt sich sofort zusammen und somit wird die wichtige
Unterscheidung der Seiten (Epithelseite oder Chorionseite) sehr schwierig. Jegliche
Manipulation zur Ausbreitung der Membran und zur Seitenidentifizierung kann die
Oberfläche beschädigen. Spörl et al. entwickelten daher eine Methode des Vernetzens.[166]
Durch eine Behandlung mit Glutaraldehyd kommt es zu einer Quervernetzung der
Kollagenfasern. Die Membranstückchen sind anschließend deutlich stabiler, besser zu
handhaben und widerstandsfähiger gegenüber enzymatischer Verdauung. In dieser Arbeit
konnte darüberhinaus mittels mikroskopischer Untersuchungsmethoden gezeigt werden,
dass es neben der Quervernetzung des Kollagens nicht zu Veränderungen an den
Amnionepithelzellen kommt. Sowohl licht- als auch transmissionselektronenmikroskopisch
erschienen die Zellen von unvernetztem und vernetztem Amnion gleich. Ob aber durch die
Vernetzung auch die biologischen Eigenschaften unbeeinträchtigt bleiben, kann alleine aus
der Morphologie nicht beurteilt werden. Es liegen jedoch Erfahrungsberichte aus der
klinischen Anwendung vor, dass auch die vernetzte Amnionmembran eine
wundheilungsfördernde und antiinflammatorische biologische Aktivität besitzt, die mit der
nativer Membranen vergleichbar ist.[166]
Die Entscheidung für oder gegen eine Vernetzung richtet sich demzufolge nach der
Weiterverwendung der Membran. Soll diese lediglich als schützender Verband auf das Auge
gebracht werden, ist die Vernetzung hilfreich, da die Handhabbarkeit für den Operateur
deutlich erleichtert wird. Kleine Falten oder Unebenheiten sind hierbei unwichtig und
tolerierbar. Wird die Amnionmembran jedoch als Unterlage für die Limbuszellkultivierung
angewandt, eignet sich unvernetzte Membran besser. Bei dem anschließenden Aufbringen
des Limbusepithel-Amnion-Transplantates auf die Augenoberfläche muss sich dieses
nämlich sehr genau und glatt an die Hornhaut anlegen, was mit unvernetzter
Amnionmembran besser zu realisieren ist. Im Auswachsverhalten der Limbusepithelzellen
auf vernetzter oder unvernetzter Membran gibt es keine signifikanten Unterschiede, wie in
dieser Arbeit gezeigt werden konnte.
Intakt versus deepithelialisiert
Des Weiteren stellt sich bei der Nutzung von Amnionmembran als natürlichem Träger-
material für die Herstellung von Zell- und Gewebetransplantaten die Frage, ob die
Entfernung des Amnionepithels eine Besiedelung mit anderen Zellen, z. B. Hornhaut- oder
Limbusepithelzellen, erleichtert. Die bis dato aus der Literatur vorliegenden Informationen
sind hierzu nicht eindeutig. In dieser Arbeit wurde die Entfernung des Amnionepithels mit
verschiedenen enzymatischen Methoden vergleichsweise untersucht. Ziel war es, das
komplette amnioneigene Epithel zu entfernen, so dass die Basallamina freiliegt. Diese hat,
Diskussion 79
wie oben beschrieben, gewisse Ähnlichkeiten zu der Basallamina des Hornhautepithels,[27]
was die Vermutung nahe legt, dass die Basallamina der Amnionepithelzellen nach dessen
Entfernung ein ideales Substrat für darauf anzuzüchtende Hornhautzellen bildet. Zur
Entfernung der Amnionepithelzellen verwendeten verschiedene Autoren unterschiedliche
mechanische und enzymatische Behandlungen. In dieser Arbeit wurde die Wirkung der
Enzyme Trypsin, Dispase II, Collagenase I und Collagenase IV in unterschiedlichen Konzen-
trationen und Einwirkzeiten miteinander verglichen. Collagenase I und Collagenase IV
stellten sich diesbezüglich als unwirksam heraus, Trypsin und Dispase II waren mit einer
deutlichen Konzentrations- und Zeitabhängigkeit in der Lage, das Amnionepithel zu
entfernen. Beide Enzyme verursachen eine Lockerung oder Zerstörung von Zell-Zell- und
Zell-Matrix-Verbindungen.[129] Am deutlichsten war dies bei Dispase sichtbar. In welchem
Ausmaß dabei auch die Basallamina und hiermit z. B. wichtige Adhäsions- oder Signal-
übertragungsmoleküle geschädigt werden, ließ sich lichtmikroskopisch morphologisch nicht
beurteilen. Hopkinson et al.[60] konnten jedoch zeigen, dass eine enzymatische
Vorbehandlung zwar das Epithel vollständig ablöst, dies aber auch mit einer Zerstörung der
Basalmembran einhergeht. Diese ist jedoch äußerst wichtig für eine erfolgreiche Anzüchtung
der Limbusepithelzellen. Aus diesem Grund wurde in den weiteren Versuchen von einer
Deepithelialisierung Abstand genommen und nur intakte Amnionmembran verwendet.
Immunhistochemie zur Unterscheidung der Zelltypen
Um im späteren Verlauf der Untersuchungen eine Charakterisierung und Unterscheidung
von Hornhaut- und Amnionepithel vornehmen zu können, wurden immunhistochemische
Färbungen gegen verschiedene Proteine durchgeführt. Auf diese Weise sollten Marker
gefunden werden, die entweder Limbusepithel- oder Amnionepithelzellen anfärben. Diese
könnten dann später an den Limbusepithel-Amnion-Transplantaten die zwei Zelltypen
unterscheiden.
Für Amnionepithelzellen waren bereits der HCG/LH-Rezeptor[141] [143] [178] und die Aquaporine
1[111], 8 und 9[192] [193] beschrieben. Der HCG/LH-Rezeptor ließ sich wie erwartet sehr gut
nachweisen. Er war besonders prominent an der apikalen Membran, an der das Amnion-
epithel mit dem Fruchtwasser in Kontakt kommt. Es wurden auch Nachweisreaktionen für
die Aquaporine 5 und 9 durchgeführt. Die in der Literatur beschriebene Expression von
Aquaporin 9 konnte, wenn auch etwas schwach, in den Amnionepithelzellen gezeigt werden.
Aber auch Aquaporin 5, das für die Epithelzellen der Hornhaut, aber noch nicht für die des
Amnion beschrieben ist, wurde in Amnionepithel gefunden. Der Nachweis von Aquaporin 5
konnte somit nicht zur Unterscheidung der zwei Zelltypen herangezogen werden.
Bei der Untersuchung auf Cytokeratine wurden in dieser Arbeit auch eine positive Reaktion
auf die Cytokeratine 13,14,15,16, die eher in mehrschichtigen Epithelien vorkommen, und das
Cytokeratinpaar 3/12, welches relativ spezifisch für das Hornhautepithel sein soll,[69] [70] in
Diskussion 80
den Amnionepithelzellen nachgewiesen. Dies war bis dato in der Literatur noch nicht
beschrieben, machte aber demzufolge eine Unterscheidung von Limbusepithel- und
Amnionepithelzellen anhand der Cytokeratinexpression ebenfalls nicht möglich.
Deutlich sichtbar war weiterhin die positive Anfärbbarkeit der Amnionepithelzellen auf
Connexin 43. Dies zeigt die Verbindung der Amnionepithelzellen untereinander über Nexus,
die somit zusammen ein großes Synzytium bilden.
Lediglich p63 war, wie zu erwarten, immunhistochemisch nicht in der Amnionmembran
nachweisbar, kommt es doch als wahrscheinlicher Stammzellmarker hauptsächlich in der
Basalzellschicht mehrschichtiger Plattenepithelien vor. Dieses Protein konnte demzufolge
nützlich sein in der Unterscheidung der Limbusepithel- von den Amnionepithelzellen bei den
kultivierten Transplantaten.
4.2 Hornhautepithel
Im HE-gefärbten Paraffinschnitt war zentral gut das mehrschichtige, unverhornte
Plattenepithel mit der darunterliegenden dichten Bowman-Membran zu erkennen. Im
Limbusbereich gab es an einigen Stellen wallartige Erhebungen der Hornhautoberfläche mit
Epithelverzweigungen, die sich von der Oberfläche in die Tiefe absenkten. Diese wurden
schon von Dua[25] beschrieben und als Krypten bezeichnet. Sie stellen die geschützte Nische
der Hornhautepithelstammzellen dar. Die Öffnungen der Krypten waren stets zum Zentrum
der Hornhaut gerichtet, was als Hinweis auf die zentripetale Migrationsrichtung der
Epithelzellen angesehen werden kann.
Immunhistochemie zur Unterscheidung der Zelltypen und des Differenzierungsgrades
Die Cytokeratine 13,14,15,16, welche in mehrschichtigen Epithelien vorkommen, und das
Cytokeratinpaar 3/12, welches relativ spezifisch für die Hornhaut ist, konnte sowohl bei
zentralen Hornhautepithelzellen als auch bei Zellen in den Krypten nachgewiesen werden,
was auf ein gewisses Verwandtschaftsverhältnis zwischen den Zellen hinweist.
Wie in der Literatur beschrieben, ließ sich das Aquaporin 5 deutlich in den Epithelzellen
nachweisen, hier sowohl in den Hornhaut-, Bindehaut- als auch in den Kryptenepithelzellen.
Aber auch Aquaporin 9, dessen Vorkommen im Amnion, jedoch noch nicht in der Hornhaut
beschrieben wurde, färbte sich in all diesen drei Zelltypen. Somit war es für eine
Unterscheidung der Zelltypen nicht geeignet.
Erstaunlich waren die Ergebnisse der Färbungen gegen den HCG/LH-Rezeptor. Amnion-
epithelzellen, als wichtige funktionelle Zellen in der Schwangerschaft, besitzen be-
kanntermaßen und nachvollziehbar diesen Rezeptor. Im menschlichen Auge ist er jedoch
bisher lediglich in der Netzhaut nachgewiesen worden.[133] Die in dieser Arbeit
Diskussion 81
durchgeführten Färbungen ergaben keine Hinweise auf ein Vorhandensein des Rezeptors bei
Zellen in den Krypten und des basalen Hornhautepithels, was den Erwartungen entsprach.
Allerdings zeigten sich an den oberflächlichen Zellen des Hornhautepithels starke, im
Aussehen typisch punktförmige Anfärbungen, was einer typischen Verteilung eines Re-
zeptors entspricht. Somit kann man von dem Vorhandensein von HCG/LH-Rezeptoren
lediglich an den obersten Hornhautepithelzellen ausgehen. Ein Erklärungsversuch könnte in
der Embryonalzeit zu finden sein. Bei geöffneten Augen sind hier die oberflächlichen
Hornhautepithelzellen wie die Amnionepithelzellen dem Fruchtwasser ausgesetzt, welches
unter anderem auch das Schwangerschaftshormon HCG enthält. Ob die HCG/LH-
Rezeptoren an der Augenoberfläche auch im Erwachsenenalter noch funktionell eine Rolle
spielen, lässt sich durch den alleinigen Nachweis ihrer Existenz verständlicherweise jedoch
nicht herleiten. Andererseits ist aber auch bekannt, dass manche Zellen in vitro andere
Proteine exprimieren können als sie das in vivo tun. Auch dies könnte natürlich hier der Fall
sein.
Neben der Unterscheidung zwischen Amnion- und Hornhautepithelzellen sollte die
Immunhistochemie auch als Hinweis auf den Differenzierungsgrad dienen. Wie schon
erwähnt, zeigt das Vorhandensein des gap-junction-Proteins Connexin 43 die Verbindung
und Kommunikation der Zellen untereinander mittels Nexus. Man weiß, dass die
ausgereiften Hornhautepithelzellen ein untereinander vernetzes, funktionelles Synzytium
bilden und demzufolge mehr Cx43 exprimieren. So benutzt man diesen Marker als Hinweis
auf den Differenzierungsgrad. Stammzellen besitzen kein, TACs wenig und ausdifferenzierte
Zellen viel Cx43.[48] Das Molekül ist in der zentralen Hornhaut in allen Schichten
beschrieben, in der Basalschicht der Limbusregion jedoch deutlich weniger. Auch unsere
Färbungen erbrachten eine geringere Färbung der Krypten. Am stärksten konnten wir Cx43
in der Mittelschicht des zentralen Hornhautepithels nachweisen, weniger in der Basalschicht
und gar nicht in der oberflächlichen Schicht. Die geringere Färbung der Krypten und der
zentralen Basalschicht ist gut nachvollziehbar, befinden sich doch hier die Stammzellen bzw.
TACs unterschiedlichen Reifegrades. Warum sich jedoch die oberflächliche Schicht nicht
anfärben ließ, ist nicht eindeutig zu klären. Möglicherweise spielt auch hier die Interaktion
mit dem Organkulturmedium, dem sie direkt ausgesetzt sind, eine Rolle.
Vimentin als Intermediärfilament lässt sich eigentlich in Bindegewebszellen, nicht aber in
Epithelzellen finden. Auch in der Hornhaut ist es in den Stromazellen nachweisbar. Im
Epithel hingegen kommt es nicht vor, nur in einzelnen basalen Zellen des Limbusbereichs.
Unsere Färbungen brachten jedoch ein anderes Bild. Vimentin ließ sich sehr gut im zentralen
Hornhautepithel nachweisen, mit deutlichem Gefälle innerhalb der Schichten. Die basalen
Zellen färbten sich am stärksten, nach oben hin nahm die Konzentration ab. Auch in den
Krypten war Vimentin nachweisbar, hier waren einzelne Gruppen von Zellen auffallend, die
sich besonders stark färbten. Diese zur Literatur konträren Ergebnisse könnten dem
Diskussion 82
Umstand geschuldet sein, dass die Hornhäute bis zur Transplantation lange in Organ-
kulturmedium gelagert wurden. Es wird beschrieben, dass auch Epithelzellen, wenn sie sich
in Kultur befinden, Vimentin produzieren können. Die einzelnen Gruppen stark anfärbbarer
Zellen in den Krypten könnten jedoch auch den einzelnen basalen Limbusepithelzellen
entsprechen, die in der Literatur beschrieben sind.
P63 zeigte sich nur in der Basalschicht der zentralen Hornhaut und in vielen Zellen in den
Krypten. Dies entspricht den Angaben in vielen Publikationen. Als Indikator für eine geringe
Differenzierung und ein hohes Proliferationspotenzial markiert dieses Protein somit
Stammzellen oder frühe TACs, welche genau an diesen Orten residieren.
Isolierung und Wachstum in der Kulturschale
Die Morphologie der wachsenden Zellen auf dem Kulturschalenboden zeigte kein typisch
epitheliales, sondern eher ein fibroblastisches Bild. Dies steht in Einklang mit Publikationen,
die einen normalen Kulturschalenboden nicht als geeignete Unterlage ansehen, um den
Phänotyp der Limbusepithelzellen zu erhalten. Aufgrund der widersprüchlichen Datenlage
aus der Literatur[74] [78] [197] wurde die enzymatische Vorbehandlung mit Dispase orientierend
ausprobiert. Während einige Autoren dies als wirkungsvolle Maßnahme zur Isolierung der
Zellen einsetzten, rieten andere Autoren davon ab mit dem Hinweis, dass sich die Zerstörung
der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen negativ auswirkt.[129] Auch in unserem Falle
zeigte sich keine Verbesserung in der nachfolgenden Kultivierungsphase und so wurde diese
Methode nicht weiter verwendet.
4.3 Limbusepithel-Amnion-Transplantate
Deutlich vielversprechender stellte sich die Morphologie der Zellen einer mittels Explantat-
Technik auf Amnionmembran hergestellten Kultur dar. Nach einiger Zeit konnte man einen
Zellrasen sehen, der ausgehend vom Hornhautstückchen zentrifugal auf der Amnion-
membran auswuchs. Der Wachstumsrand war relativ glatt begrenzt und erschien etwas
erhaben. Schon in der mikroskopischen Aufsicht waren deutliche Größenunterschiede
zwischen den Zellen und die unterschiedlichen Zelltypen erkennbar. Größere auswachsende
Limbusepithelzellen befanden sich über den kleineren Amnionepithelzellen. Hierbei war der
Größenunterschied ca. fünffach. Das Aussehen der auswachsenden Zellen konnte man
besonders gut beurteilen, wenn diese gerade über die Amnionmembran hinaus weiter auf
dem Kulturschalenboden wuchsen. Hier bestand ein deutlicher Unterschied zu den Zellen,
die primär in einer Kulturschale angezüchtet wurden. Diesmal zeigte sich ein typisch
epithelialer Phänotyp mit pflastersteinartiger Morphologie. Die Zellen hatten in der Aufsicht
eine polygonale Form mit meist zentral liegendem Zellkern. Rein morphologisch ließ sich
Diskussion 83
somit die Beobachtung zahlreicher Autoren bestätigen, dass intakte Amnionmembran den
epithelialen Phänotyp gut zu erhalten in der Lage ist.
Auch die HE-gefärbten Querschnitte der Limbusepithel-Amnion-Transplantate bestätigten
dies und zeigten das gewünschte und erwartete Bild: auf der intakten Amnionmembran mit
einschichtigem kubischen Epithel war ein 3-4lagiges unverhorntes Plattenepithel gewachsen,
welches in seiner Morphologie dem Hornhautepithel entsprach. Die basalen Zellen waren
groß und kubisch mit mittig liegendem Kern, zur Oberfläche hin fanden sich immer flacher
werdende Zellen. Auch hier ließen sich bereits morphologisch die ausgewachsenen Zellen
sehr gut von den Amnionepithelzellen unterscheiden, da sie zum einen 4-8fach größer waren,
zum anderen in der HE-Färbung anders gefärbt erschienen. Das Zytoplasma war bläulicher
als das der Amnionepithelzellen.
Immunhistochemie
Zur weiteren Charakterisierung und Identifizierung sollten immunhistochemische
Färbungen dienen. Im ausgewachsenen Epithel ließen sich die Cytokeratine 3/12 und
13,14,15,16 nachweisen. Das darunterliegende Amnionepithel hingegen färbte sich deutlich
schwächer. Die Cytokeratine 3/12 sind relativ spezifisch für Hornhautepithel und die
Cytokeratine 13,14,15,16 relativ spezifisch für mehrschichtige Epithelien. Das zeigt, dass die
ausgewachsenen Zellen Epithelzellen sind und auch auf der Amnionmembran ihren Horn-
hautphänotyp beibehalten.
Der HCG/LH-Rezeptor zeigte ein ähnliches Färbungsmuster: stärker in den ausgewachsenen
Zellen, schwächer im Amnionepithel. Das Vorhandensein des Schwangerschaftshormon-
rezeptors spricht aber nicht dagegen, dass die ausgewachsenen Zellen Hornhautepithelzellen
sind, da dieser, wie bereits oben beschrieben, auch in der intakten Hornhaut nachgewiesen
werden konnte. Wie bei den Cytokeratinen, so war auch bei dem HCG/LH-Rezeptor auffällig,
dass die Färbung in Amnionepithel, auf dem Limbuszellen wachsen, schwächer war als in
ursprünglichem Amnionepithel. Denkbar ist ein Abbau der Proteine in den Zellen während
der langen Kultivierungszeit. Die Amnionepithelzellen wurden, wie oben erläutert, im
Gegensatz zu den Limbusepithelzellen zuvor kryokonserviert, waren demzufolge avital und
zu keiner Proteinsynthese mehr in der Lage.
Vimentin ließ sich sowohl in den Hornhautepithelzellen als auch im Amnionepithel nach-
weisen. Eine Aussage über den Zelltyp, -charakter oder –differenzierungsgrad kann anhand
der Vimentinexpression nicht getroffen werden, zumal für einige andere Zelltypen bereits
beschrieben wurde, dass in Kultur Vimentin exprimiert wird, auch wenn dies in vivo nicht
der Fall ist.
Auch Aquaporin 5 ließ sich in allen Zellen nachweisen. Die eigentlich gewünschte und weiter
oben erläuterte Unterscheidung war demzufolge hiermit nicht möglich.
Diskussion 84
Aquaporin 9 hingegen zeigte eine starke Färbung der Amnionepithelzellen, jedoch keine
Anfärbung der aus der Hornhaut ausgewachsenen Zellen. Dies passt zu den Ergebnissen in
der Literatur, die das Vorkommen dieses Wasserkanals im Amnionepithel beschreiben,
jedoch nicht im Hornhautepithel. Neben der reinen Morphologie konnte diese Färbung
nunmehr auch eine immunhistochemische Unterscheidung zwischen Amnion- und
ausgewachsenen Hornhautepithelzellen treffen. Warum jedoch in den zuvor untersuchten
intakten Hornhäuten auch Aquaporin 9 nachweisbar war, konnte in dieser Arbeit nicht
geklärt werden. Möglich ist wiederum eine Induktion der Expression durch die Organkultur,
in der die Hornhäute zuvor einige Zeit lagen.
Connexin 43 zeigte auch in den Limbusepithel-Amnion-Transplantaten eine dem Nexus
entsprechende punktförmige Anfärbung in allen Schichten des ausgewachsenen Hornhaut-
epithels. Dies ähnelt dem Expressionsmuster in der zentralen Hornhaut, wobei in der
Literatur davon ausgegangen wird, dass ausdifferenzierte Zellen und TACs Connexin 43
enthalten, Stammzellen hingegen nicht.[41] Demnach wäre eine große Anzahl der
ausgewachsenen Zellen im Differenzierungsgrad TACs oder reiferen Nachkommen
zuzurechnen.
Auch p63 ließ sich in den Kernen einiger aus dem Explantat gewachsener Zellen nachweisen.
Die DAPI-Färbung des gleichen Abschnittes, welche alle Zellkerne sichtbar machte, zeigte
jedoch noch weitere Zellen, die sich nicht gegen p63 anfärben ließen. Somit existieren bei den
kultivierten Zellen p63-haltige neben solchen, die kein p63 besitzen. Wie schon erwähnt,
besitzen p63-haltige Zellen eine geringe Differenzierung und ein hohes Proliferations-
potenzial. Dies bedeutet wiederum, dass sich unter den ausgewachsenen Zellen Stammzellen
oder frühe TACs befinden müssen.
4.4 Stammzellen oder TACs?
Die verschiedenen Untersuchungen an den hergestellten Limbusepithel-Amnion-Trans-
plantaten zeigten, dass bei der Kultivierung die Amnionmembran samt Epithel intakt blieb.
Die darauf wachsenden Zellen waren Limbusepithelzellen, da die Amnionepithelzellen durch
die Kryokonservierung devitalisiert wurden und demzufolge nicht mehr proliferieren
konnten. Auch morphologisch und immunhistochemisch unterschieden sich die beiden
Zelltypen deutlich. Die ausgewachsenen Zellen bildeten das für die Hornhaut typische
mehrschichtige, unverhornte Plattenepithel und exprimierten das für die Cornea relativ
spezifische Cytokeratinpaar 3/12.
Eine vieldiskutierte Frage ist der Differenzierungsgrad dieser ausgewachsenen Zellen. Sind es
ausgereifte Hornhautepithelzellen, TACs oder sogar Stammzellen, die man mit dieser
Methode vermehren kann? Vor dem Hintergrund der erwünschten klinischen Anwendung
Diskussion 85
solcher Gewebekonstrukte bei Limbusstammzellinsuffizienz, bei der dem Patienten aus den
verschiedensten Gründen die eigenen Stammzellen fehlen, entwickelte sich das Bestreben,
möglichst Stammzellen anzuzüchten und zu transplantieren. Man ging anfangs zunächst
davon aus, dass nur diese gänzlich undifferenzierten Zellen die Möglichkeit haben, sich
dauerhaft am Patientenauge anzusiedeln und die Grundlage für eine kontinuierliche
Reepithelialisierung zu bilden. Eine einmal erfolgte Differenzierung von Stammzellen zu
TACs galt lange Zeit als irreversibel, die Lebenszeit der TACs als begrenzt und daher nicht
nützlich für einen dauerhaften Therapieerfolg.
Wie bereits oben erwähnt, sitzen die Stammzellen jedoch verborgen und schwer zugänglich
in den tiefer gelegenen Krypten. Von der Gesamtpopulation machen sie weiterhin nur ca. 0,5
bis weniger als 10 % aus. Es scheint daher höchst unwahrscheinlich, durch eine einfache
Abrasio, die zur Gewinnung einer Zellsuspension teilweise angewandt wird, wirklich
Stammzellen zu erhalten, die in vitro anwachsen und ihren undifferenzierten Phänotyp
beibehalten sollen. Bei der Explantat-Technik wird hingegen ein komplettes Hornhaut-
stückchen mit intakten Krypten auf die Amnionmembran gelegt. Man kann sich vorstellen,
dass in den Krypten die Proliferation der Stammzellen weiterhin stattfindet. Auch die
Migration der Zellen aus der Krypte dürfte ungestört sein, nur wachsen diese ab einem
gewissen Punkt dann nicht mehr auf der Hornhaut weiter, sondern auf der
Amnionmembran. Die Stammzellen befinden sich nur in der Krypte und differenzieren
während der Migration auf der Hornhautoberfläche zu TACs unterschiedlichen Reifegrades
und schließlich zu ausgereiften Hornhautepithelzellen. Die auf der Amnionmembran
ausgewachsenen Zellen entsprächen nach dieser Vorstellung demzufolge eher TACs und
nicht Stammzellen. Immunhistochemisch ließ sich diese Hypothese untermauern. P63 zeigt
ein hohes Proliferationspotenzial und eine geringe Differenzierung an. Dies besitzen sowohl
Stammzellen als auch TACs. Nicht nur das Vorhandensein an sich, sondern auch die
Intensität kann demnach als ein Maß für den Differenzierungsgrad angesehen werden. Cx43
ist in TACs schon vorhanden, fehlt jedoch noch in den Stammzellen. Daraus kann
geschlossen werden, dass Zellen, die nur p63 besitzen, Stammzellen sind, während TACs p63
und Cx43 exprimieren.[41] Auch in dieser Arbeit zeigten viele angezüchteten Zellen eine
Coexpression von p63 und Cx43 und entsprächen somit eher TACs. Es wäre jedoch verfrüht,
dies als Misserfolg zu betrachten und die dauerhafte Wirkung der Transplantate in Frage zu
stellen. Dachte man noch bis vor kurzem, dass gewebespezifische Stammzellen unipotent
sind und die Umwandlung von Stammzellen in TACs irreversibel sei, haben neue
Untersuchungen dieses Konzept radikal verändert. Man entdeckte auch bei adulten
Stammzellen eine viel höhere Plastizität als bisher angenommen.[48] Die Differenzierung ist
keine Einbahnstraße, sondern unter bestimmten Bedingungen scheint auch eine Entwicklung
zurück zu einem Stammzellphänotyp möglich zu sein.[91] Mehr als von der Zelle selbst hängt
dies von ihrer Umgebung ab.[29] [36] So konnten Ferraris et al.[36] zeigen, dass epitheliale TACs
Diskussion 86
eine neue Schicht ausbildeten, wobei der Differenzierungsgrad der Zellen geringer war als
der der Ausgangszellen, also konkret auch die epitheliale Differenzierung nicht irreversibel
ist. Betrachtet man nun die Limbusepithel-Amnion-Transplantate im Licht dieser neuen
Erkenntnisse, erscheint das Vorhandensein von vielen Stammzellen nicht mehr unbedingt
notwendig. Es ist z. B. vorstellbar, dass sich die transplantierten TACs in Stammzellen
zurückentwickeln, am Patientenauge niederlassen und so den Pool für eine dauerhafte
Reepithelialisierung bilden könnten. Bisherige klinische Studien unterstützen diese Ansicht
und berichten über gute Therapieergebnisse[130] mit Erfolgsraten zwischen 70-80%[159] nach
einer solchen Transplantation. Da man die Lebenszeit der TACs auf unter ein Jahr schätzt, ist
es wichtig, für einen entsprechend langen Zeitraum nach der Transplantation Nach-
untersuchungen anzustellen.[128] Tatsächlich zeigten Beobachtungen nach 21[13] und 30[140]
Monaten eine intakte Hornhautoberfläche mit regelmäßiger Epithelialisierung. Dies ist ein
Hinweis, dass sich die Zellen die Hornhautoberfläche repopularisiert haben müssen.[48]
Trotzdem ist über das genaue Schicksal der Spenderzellen nach Transplantation noch nicht
viel bekannt. Einige Autoren gehen davon aus, dass die Spenderzellen langsam durch
Wirtszellen ersetzt werden können.[140] [195] Sie ziehen die Möglichkeit in Betracht, dass die
Transplantation mit Veränderung der Mikroumgebung auf dem Patientenauge die
Aktivierung von residenten inaktiven Stammzellen des Patienten triggert.[140] Falls dies
möglich ist, scheint dieser Prozess jedoch sehr langsam zu gehen, da wiederum andere
Autoren berichten, Spenderzellen noch nach 30 Monaten nachweisen zu können.[140] Auch
über das Schicksal der Amnionmembran nach Transplantation gehen die Meinungen
auseinander. Li et al. und Ha et al.[52] [102] beobachteten, dass die ursprüngliche Basal-
membran des Amnion nach einiger Zeit aufgelöst und durch eine neue, durch die
ausgewachsenen Zellen gebildete Membran, ersetzt wird. Du et al.[23] berichteten, dass die
Membran bereits 5 Wochen nach Transplantation komplett absorbiert war, Grüterich et
al.[48] jedoch, dass sie diese noch nach 21 Monaten nachweisen konnten.
Neben Limbusepithelzellen gibt es neuerdings auch Versuche, weitere Zelltypen wie z. B.
Epithelzellen der Konjunktiva und Mundschleimhaut oder Knochenmarks-, Haarfollikel- und
Zahnpulpazellen auf Amnionmembran wachsen zu lassen, um sie bei Patienten mit
Limbusstammzellinsuffizienz anzuwenden.[142]
Diskussion 87
4.5 Statistische Auswertung
Vergleich verschiedener Kultivierungsmethoden
Wie beschrieben, herrschen in der Art der Limbuszellgewinnung und -kultivierung noch
große Heterogenität, Uneinigkeit und Forschungsbedarf. Publikationen, welche verschiedene
Kultivierungsmethoden miteinander vergleichen, sind rar. Wird die Explantat-Technik
verwendet, so wird zwischen nach oben oder nach unten gerichtetem Epithel nicht
unterschieden. Dabei zeigen schon theoretische Überlegungen große Differenzen zwischen
den verschiedenen Kultivierungsmethoden.
Bei der Zellsuspension schwimmen einzelne Zellen oder kleine Gruppen von Zellen verstreut
im Medium umher. Diese müssen sich absenken, auf die Amnionmembran setzen und
anwachsen. So gäbe es auf der Amnionmembran überall verteilt einzelne Zellen oder kleine
Gruppen, die dann proliferieren und die Lücken untereinander schließen müssten.
Funktioniert dies, läge nach einiger Zeit ein intakter Zellrasen vor.
Bei der Explantat-Technik hingegen liegt eine ganz andere Situation vor. Das transplantierte
Stückchen aus dem Limbusbereich enthält die Vogt’schen Palisaden mit Krypten und
Stammzellen. Diese befinden sich demzufolge noch innerhalb ihrer natürlichen Nische.
Proliferieren sie, wandern die Zellen aus der Krypte hinaus auf die Oberfläche. Im weiteren
Verlauf unterscheidet sich nun, ob das Hornhautgewebe mit dem Epithel auf der Membran
liegt oder mit der stromalen Seite. Liegt das Hornhautstückchen mit dem Epithel nach oben,
also mit der stromalen Seite zur Amnionmembran gerichtet, erreichen die auswachsenden
Zellen den Rand des Hornhautstückchens und müssen daran hinuntermigrieren, um auf die
Amnionmembran zu gelangen. Hierbei wachsen sie unnatürlicherweise auf den Anschnitten
von Bowman-Membran und Stroma. Liegt das Hornhautstückchen hingegen mit dem Epithel
nach unten, also der Physiologie entgegengesetzt, ist das Hornhautepithel im direkten
Kontakt mit dem Amnionepithel. Die auswachsenden Zellen müssen in diesem Fall ihre
Polarität ändern, da sie auf dem Explantat mit ihrem ursprünglich apikalen Kompartiment
auf der Membran aufliegen und diese somit in das basale Kompartiment verkehrt wird.
Wie nach den theoretischen Überlegungen zu erwarten, schnitt die Zellsuspension mit einer
Auswachsrate von 5,1 % am schlechtesten ab. Deutlich besser waren hingegen die
unterschiedlichen Explantat-Techniken. Hierbei ist die Methode mit nach unten gerichtetem
Epithel und einer Auswachsrate von 42,0 % der Methode mit nach oben gerichtetem Epithel
mit 27,6 % noch überlegen. Bei der vorliegenden Fallzahl und Konstellation war der exakte
Test nach Fisher das Mittel der Wahl, um diese Unterschiede auf ihre Signifikanz hin zu
überprüfen. Mit einem p<0,0005 konnte dies gezeigt werden. Auch bei möglichst flach
geschnittenem Explantat-Stückchen verläuft bei der Methode mit nach oben ausgerichtetem
Epithel der Weg der auswachsenden Epithelzellen über den langen unnatürlichen Anschnitt
des Stromas außerhalb ihrer gewohnten Nische. Untersuchungen hierzu machten Li et al.[101]
Diskussion 88
Er beschreibt sogar eine Invasion von Epithelzellen in das Limbusstroma und eine
Tranformation zu Mesenchymzellen. Auch hier erkennt man den großen Einfluss der
Umgebung auf das Schicksal der Zellen.
Einfacher scheint es hingegen für die Epithelzellen zu sein, ihre Polarität zu ändern und
direkt auf der Amnionmembran weiterzuwachsen, welche ununterbrochen die natürliche
Nische simuliert.
Einfluss von Spenderalter, Post-mortem-Zeit und Organkultur-Dauer auf die Auswachsrate
Um die Erfolgsrate der Kultivierung weiter zu verbessern, ist es von großer Relevanz, den
Einfluss verschiedener Parameter auf die Auswachsrate zu kennen. Spielt es beispielsweise
eine Rolle, wie alt der Hornhautspender war, wieviel Zeit zwischen Tod und Entnahme der
Augäpfel vergangen ist (Post-mortem-Zeit), oder wie lange die Hornhäute in Medium
aufbewahrt wurden (Organkultur-Dauer), bevor die Limbusepithelzellen letztendlich isoliert
und kultiviert wurden? Nach ersten theoretischen Überlegungen ist anzunehmen, dass all
diese Faktoren einen negativen Einfluss auf die Kultivierbarkeit der Limbusepithelzellen
ausüben. Es ist umso ungünstiger, je älter der Spender, je länger die Post-mortem-Zeit und je
länger die Organkultur-Dauer war. Allerdings gibt es aus der Literatur bisher keine Hinweise
darauf, ob dies wirklich zutrifft und wenn ja, welcher dieser Parameter welchen Einfluss hat.
In den Ergebnissen bestätigte sich der vermutete negative Einfluss aller Parameter auf die
Auswachsrate. Schon der Blick auf die einzelnen Streudiagramme zeigte dies. Die
Punktwolken waren zwar für die einzelnen Parameter relativ unterschiedlich, jedoch jede mit
deutlich negativem Zusammenhang. Um dies weiter zu konkretisieren und quantifizieren
wurde eine Regressionsanalyse durchgeführt. Methode der Wahl war hierbei eine gewichtete
multiple polynomiale Regressionsanalyse 2. Grades, da hiermit mehrere Einflussgrößen
zugleich untersucht werden konnten. Mit der Wichtung konnte berücksichtigt werden, dass
die Erfolgsquote für jede ursprüngliche Hornhaut je nach Anzahl der Proben unterschiedlich
genau geschätzt wurde. Dies war dem Umstand geschuldet, dass sich jede Hornhaut bei der
Präparation in einem anderen Zustand befand. Konnte man aus einer Hornhaut sechs
Einzelproben entnehmen, war es bei einer anderen aufgrund Beschädigungen oder sonstiger
Umstände lediglich möglich, zwei Proben zu gewinnen. Bei der Wichtung wäre es noch
besser gewesen, nicht die Anzahl der Versuche, sondern den Schätzfehler für die
Auswachsrate als Gewicht zu benutzen, was aber wegen aufgetretenem totalen
Nichtanwachsen nicht möglich war. Sichtbar wurde hier der negative Zusammenhang an der
Regressionsgleichung, respektive den negativen Regressionskoeffizienten. Für das Spender-
alter und die Organkultur-Dauer zeigte sich eine einfache signifikante lineare Regression. Bei
der Post-mortem-Zeit ließ sich der Zusammenhang mit einer einfachen linearen Funktion
jedoch nicht signifikant beschreiben, hier war die Hinzunahme einer quadratischen
Komponente erforderlich. Somit ergab sich für die Post-mortem-Zeit ein degressiv
Diskussion 89
abfallender Verlaufstyp. Um diesen Zusammenhang zu veranschaulichen: bei Zunahme des
Spenderalters um z. B. 10 Jahre sinkt die Auswachsrate um ca. 8 %, bei Zunahme der Ver-
weilzeit in Hornhautmedium um 10 Tage geht diese um ca. 9 % zurück. Bezüglich der Post-
mortem-Zeit bedeutet das einen Abfall der Auswachsrate in den ersten 10 Stunden um ca.
14 %, in den folgenden 10 Stunden um ca. 10 % und in den nächsten 10 Stunden um ca. 6 %.
Als Konsequenz aus diesen Ergebnissen sollten alle der Isolierung und Kultivierung
vorangestellten Phasen möglichst kurz gehalten werden. Dies würde konkret bedeuten,
Hornhäute von jungen Spendern zu bevorzugen, möglichst direkt nach dem Tod des
Spenders das Auge zu entnehmen und die Hornhäute nur kurz in Medium aufzubewahren,
bevor die Limbusepithelzellen gewonnen und kultiviert werden. Wie so oft gibt es hier jedoch
Probleme mit der Praktikabilität. Naturgemäß sind die meisten Spender älter. Bei einer
insgesamt geringen Spenderzahl kann man es sich nicht leisten, Hornhäute älterer Spender
zu verwerfen. Vom Tod des Spenders bis zur Entnahme der Augen vergehen bis zu drei Tage:
Zum einen muss die Klinik, in der der Spender verstarb, über die Möglichkeit und
Nützlichkeit einer Hornhautspende informiert sein und das Hornhautentnahmeteam kon-
taktieren. Zum anderen müssen selbstverständlich eine Einverständniserklärung des
Spenders vorliegen oder Angehörige diesbezüglich kontaktiert werden. Die Organkultur-
Dauer ist fast nicht zu verkürzen. Da es zu wenige Hornhautspenden gibt, werden die
Limbusepithelzellen nur als Nebenprodukt nach einer Hornhauttransplantation gewonnen.
Wie lange die Hornhaut vorher in ihrem Medium verweilte, liegt am
Transplantationszeitpunkt. Dieser hängt davon ab, wann ein geeigneter Patient für die
jeweils vorliegende Hornhaut gefunden wird.
Zu erwähnen ist hier eine einzige Studie von Vemuganti et al.[187] Er vergleicht das
Auswachsverhalten von Limbusepithelzellen frischer und organkonservierter Hornhäute. Im
Wachstumsmuster findet er keine Unterschiede, jedoch ist die Auswachsrate bei frischen
Hornhäuten größer (100 %) als bei organkonservierten (51,6 %). Weiterhin berichtet er,
keinen Einfluss von Alter, Post-mortem-Zeit und Organkultur-Dauer auf die Auswachsrate
finden zu können. Wie kann man sich nun die teilweise unterschiedlichen Ergebnisse aus der
Literatur im Vergleich mit der vorliegenden Arbeit erklären? Zuerst ist es wichtig zu
erwähnen, dass sich zwei unterschiedliche Arten der Aufbewahrung von Hornhäuten
entwickelt haben. Zum einen gibt es die hypotherme Kurzzeitaufbewahrung, welche bei 4 °C
in Mc-Carney-Kauffmann- oder Optisol-Medium für 3-5 Tage erfolgt und weltweit verbreitet
ist. Im Gegensatz dazu steht die Organkultivierung der Hornhäute bei einer Temperatur von
30-37 °C für 4-5 Wochen. Diese Art der Aufbewahrung ist besser für die Erhaltung des
Endothels und die Methode der Wahl in Europa.[133] In der oben erwähnten Studie von
Vemuganti et al. verwendeten die Autoren die in Indien gebräuchliche hypotherme
Kurzzeitaufbewahrung, wohingegen in dieser Arbeit die Organkultivierung bei 37 °C zur
Anwendung kam. Demzufolge sind die verschiedenen Zeitspannen bei Vemuganti et al. viel
Diskussion 90
kürzer. Ein anderer Unterschied ist die Verwendung von deepithelialisierter
Amnionmembran bei Vemuganti und intakte Amnionmembran bei dieser Arbeit. Eine
Unterscheidung bezüglich der Ausrichtung der Explantate (Epithel oben oder unten) wurde
bei ihm ebenfalls nicht getroffen. Um den Einfluss der Zeiten auf die Auswachsrate zu
überprüfen, benutzten Vemuganti et al. als statistische Methoden den exakten Test nach
Fisher und den Wilcoxon-Rangsummen-Test, wohingegen in dieser Arbeit die oben
beschriebene Regressionsanalyse zur Anwendung kam.
Zusammenfassung 91
5 Zusammenfassung
Eine schwerwiegende Erkrankung des Auges, die zum Verlust der Sehkraft führen kann, ist
die Limbusstammzellinsuffizienz. Gestört ist hierbei die Regeneration des Hornhautepithels.
Als Ursachen kommen neben angeborenen Krankheiten auch Schädigungen des Limbus-
areals durch Entzündungen, Verbrennung oder Verätzung in Frage. Pathogenetisch kommt
es zu einem Untergang der Hornhautepithelstammzellen, die sich ringförmig am Rande der
Cornea befinden. Therapeutisch bleibt in schweren Fällen oft nur die Transplantation von
gesunden Limbuszellen auf das betroffene Auge, die sogenannte Limbuszelltransplantation.
Als Spender kommen hierfür entweder gesunde Limbusareale des Patienten selbst oder die
anderer Personen, seien es lebende oder verstorbene, in Frage. Es bietet sich an, die nach
einer Hornhauttransplantation verbleibenden Corneoskleralringe hierfür zu nehmen,
enthalten sie doch genau das Limbusareal mit den gewünschten Zellen. Eine Kultivierung
dieser Limbuszellen auf einer Amnionmembran ergibt ein im Sinne des tissue engineering
erzeugtes Transplantat, welches anschließend auf das Patientenauge aufgebracht werden
kann. Die Amnionmembran wird hierbei einerseits als Wachstumsunterlage, andererseits
aber auch aufgrund ihrer exzellenten antientzündlichen, antiangiogenen und sonstigen
Eigenschaften verwandt.
Ausgehend von diesem Ziel war es in dieser Arbeit möglich, aus Corneoskleralringen
langzeitorgankonservierter Hornhäute und intakten, kryokonservierten Amnionmembranen
solche Limbusepithel-Amnion-Transplantate herzustellen. Als erfolgreichste Kultivierungs-
methode stellte sich hierbei signifikant die Explantat-Technik mit nach untem gerichtetem
Epithel heraus. Hier konnte eine Auswachsrate von 42 % erzielt werden. Es wurde weiterhin
gezeigt, dass das ausgewachsene, mehrschichtige Limbusepithel proliferationsfähige TACs
(Transient Amplifying Cells) enthält.
Weiterhin konnten mittels Regressionsanalyse signifikante Zusammenhänge zwischen
Spenderalter, Post-mortem-Zeit, Organkultur-Dauer und der Auswachsrate beschrieben
werden. Kurzgefasst wurde die Vermutung bestätigt, dass jede Verlängerung der
unterschiedlichen Zeiten eine Verringerung der Auswachsrate zur Folge hat.
Die hergestellten Limbusepithel-Amnion-Transplantate können nun für Patienten mit
Limbusstammzellinsuffizienz unterschiedlicher Genese verwendet werden. Erste klinische
Studien zeigen gute Resultate nach Transplantation mit Erfolgsraten zwischen 70-80 %.[130]
[159] Über die genauen Mechanismen herrscht jedoch noch großer Forschungsbedarf.
Abkürzungsverzeichnis 92
Abkürzungsverzeichnis
AK Antikörper
AM Amnionmembran
AQP Aquaporin
Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
Cx43 Connexin 43
CK Cytokeratin
DAB 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochloriddihydrat
DAPI 4',6-Diamidino-2-phenyindoldiactat
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
EGF Epidermal Growth Factor (epidermaler Wachstumsfaktor)
FCS Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum)
FGF Fibroblast Growth Factor (Fibroblasten-Wachstumsfaktor)
FITC Fluoresceinisothiocyanat
GTA Glutaraldehyd
HCG Humanes Choriongonadotropin
HE Hämatoxylin-Eosin
HGF Hepatocyte Growth Factor (Hepatozyten-Wachstumsfaktor)
HMW High Molecular Weight (hohes Molekulargewicht)
IL Interleukin
KGF Keratinocyte Growth Factor (Keratinozyten-Wachstumsfaktor)
LSAB Labelled (Strept-)Avidin-Biotin-Methode
MAPK Mitogen-activated Proteinkinase (Mitogen-aktivierte Proteinkinase)
MMP Matrix Metallo Proteinase
NGF Nerve Growth Factor (Nerven-Wachstumsfaktor)
PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphat-gepufferte Salzlösung)
PEDF Pigment Epithelium Derived Factor (Pigmentepithel-abstammender Faktor)
TAC Transient Amplifying Cell (vorübergehend proliferierende Zellen)
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinase (Gewebehemmer der Metalloproteinase)
TGF Transforming Growth Factor (umwandelnder Wachstumsfaktor)
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Abbildungsverzeichnis 93
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 Aufbau des Auges…………………………………………..………………………………6
Abbildung 1.2 Aufbau der Hornhaut……………………………………………………………………..7
Abbildung 1.3 Stammzellteilung…………………………………………………………………………. 11
Abbildung 1.4 Die Limbusregion in Aufsicht und Querschnitt ……………………………… 13
Abbildung 1.5 Migration und Differenzierung des Hornhautepithels…………………….. 14
Abbildung 1.6 Klinische Bilder der Limbusstammzellinsuffizienz…………………………. 22
Abbildung 1.7 Die Plazenta mit den Eihäuten Amnion und Chorion……………………… 24
Abbildung 1.8 Frühe Embryonalentwicklung………………………………………………………. 25
Abbildung 1.9 Aufbau der Eihaut……………………………………………………………………….. 25
Abbildung 2.1 Präparation der Amnionmembran………………………………………………… 45
Abbildung 2.2 Markierung der Amnionmembranstückchen…………………………………. 45
Abbildung 2.3 Präparation eines Corneoskleralringes………………………………………….. 47
Abbildung 2.4 Schemazeichnung der Explantat-Technik……………………………………… 49
Abbildung 2.5 Aufsicht auf eine 6-Lochschale…………………………………………………….. 49
Abbildung 3.1 Kryokonservierte Amnionmembran in der Aufsicht……………………….. 54
Abbildung 3.2 Kryokonservierte Amnionmembran in der HE-Färbung…………………. 55
Abbildung 3.3 Amnionepithel in einer transmissionselektronen-
mikroskopischen Aufnahme…………………………………............................ 55
Abbildung 3.4 Deepithelialisierung kryokonservierter Amnionmembran mit
verschiedenen Enzymen………………………………………………………………. 56
Abbildung 3.5 Immunhistochemische Färbungen einer Amnionmembran
mittels LSAB, Vectastain und Fluoreszenz…………………………………….. 58
Abbildung 3.6 HE-Färbung einer Hornhaut, Querschnitt durch das Epithel
verschiedener Regionen………………………………………………………………. 59
Abbildung 3.7 Immunhistochemische Färbungen von zentralem
Hornhautepithel..................................................................................... 61
Abbildung 3.8 Immunhistochemische Färbungen von Hornhautepithel der
Limbusregion……………………………………………………………………………… 63
Abbildung 3.9 Zellmorphologie auf Kulturschalenboden……………………………………… 64
Abbildung 3.10 Auswachsen von Hornhautepithelzellen auf Amnionmembran……….. 65
Abbildung 3.11 Morphologie von Hornhautepithelzellen, die über den Rand
der Amnionmembran hinausgewachsen sind………………………………… 66
Abbildung 3.12 HE-Färbung eines Limbusepithel-Amnion-Transplantates,
Querschnitt………………………………………………………………………………... 67
Abbildungsverzeichnis 94
Abbildung 3.13 Immunhistochemische Färbungen von
Limbusepithel-Amnion-Transplantaten……………................................. 69
Abbildung 3.14 Zusammenhang zwischen Auswachsrate und Spenderalter,
Post-mortem-Zeit und Organkultur-Dauer……………………………………. 74
Abbildung 3.15 Standardisierte Residuen der Hornhäute………………………………………. 76
Abbildung 3.16 Q-Q-Plot, Verteilung der Residuen……………………………………………….. 76
Tabellenverzeichnis 95
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1.1 Eigenschaften der Hornhautstammzellen......................................................... 16
Tabelle 1.2. Semiquantitative immunhistochemische Verteilung von Markern
auf Epithelzellen der menschlichen Augenoberfläche………………………………… 17
Tabelle 1.3 Hornhauterkrankungen mit Limbusstammzellinsuffizienz………………………… 21
Tabelle 2.1 Geräte…………………………………………………………………...................................... 38
Tabelle 2.2 Hilfsmittel und Instrumente…………………………………………………………………… 39
Tabelle 2.3 Medien und Supplemente………………………………………………………………………. 40
Tabelle 2.4 Enzyme und Pufferlösungen…………………………………………………………………….41
Tabelle 2.5 Antikörper und zugehörige Reagenzien……………………………………………………. 41
Tabelle 2.6 Sonstiges………………………………………………………………………………………………. 42
Tabelle 3.1 Deepithelialisierung kryokonservierter Amnionmembran mit
verschiedenen Enzymen…………………………………………………………………………. 56
Tabelle 3.2 Semiquantitative immunhistochemische Verteilung der Marker
in den verschiedenen Epithelien……………………………………………………………… 70
Tabelle 3.3 Erfolgsraten der verschiedenen Ansätze…………………………………………………… 71
Tabelle 3.4 Kontingenztafel der Kultivierungsmethoden und Auswachsraten………………. 72
Tabelle 3.5 Spender- und Organkultur-bezogene Daten der
verwendeten Hornhäute…………………………………………………………………………. 73
Tabelle 3.6 Regressionsmodell…………………………………………………………………………………. 75
Literaturverzeichnis 96
Literaturverzeichnis
[1] Adds PJ, Hunt C, Hartley S. Bacterial contamination of amniotic membrane. Br J Ophthalmol. 2001;85:228–30
[2] Adds PJ, Hunt CJ, Dart JKG. Amniotic membrane grafts, “fresh” or frozen? A clinical and in vitro comparison. Br J Ophthalmol. 2001;85:905–7
[3] Adinolfi M, Akle CA, McColl I, et al. Expression of HLA antigens, α2-microglobulin and enzymes by human amniotic membrane. Nature. 1982;295:325–7
[4] Ahmadiankia N, Ebrahimi M, Hosseini A, Baharvand H. Effects of different extracellular matrices and co-cultures on human limbal stem cell expansion in vitro. Cell Biol Int. 2009;33(9):978-87. DOI: 10.1016/j.cellbi.2009.06.019
[5] Akle CA, Adinolfi M, Welsh KI, et al. Immunogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers. Lancet. 1981;2:1003–5
[6] Anderson DF, Ellies P, Pires RT, Tseng SC. Amniotic membrane transplantation for partial limbal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol. 2001;85:567–575
[7] Axenfeld T, Pau H. Lehrbuch der Augenheilkunde. 13. Auflage. Gustav Fischer Verlag. 1992
[8] Azuara-Blanco A, Pillai CT, Dua HS. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction. Br J Ophthalmol. 1999;83:399–402
[9] Basti S, Rao SR. Current status of limbal conjunctival autograft. Curr Opin Ophthalmol. 2000;11:224-32
[10] Bender HG, Diedrich K, Künzel W. Klinik der Frauenheilkunde und Geburtshilfe – 4. Teil: Schwangerschaft I. 4. Auflage. Urban&Fischer. 2000
[11] Benirschke K, Kaufmann P. Pathology of the Human Placenta. 2nd edition. Springer. New York 1990.
[12] Benninghoff A, Drenckhahn D. Anatomie. 16. Auflage. Urban & Fischer. München. 2004
[13] Burman S, Tejwani S, Vemuganti GK, Gopinathan U, Sangwan VS. Ophthalmic applications of preserved human amniotic membrane: A review of current indications. Cell and Tissue Banking. 2004;5:161–75
[14] Chen HJ, Pires RT, Tseng SC. Amniotic membrane transplantation for severe neurotrophic corneal ulcers. Br J Ophthalmol. 2000;84:826–33
[15] Cheng CC, Wang DY, Kao MH, Chen JK. Expression of p63 Transcription Factor by Limbal Keratinocytes Indicates Low Differentiation and High Proliferative Potential. Abstract des Annual Meeting der ARVO 2005
[16] Cho BJ, Djalilian AR, Obritsch WF, Matteson DM, Chan CC, Holland EJ. Conjunctival epithelial cells cultured on human amniotic membrane fail to transdifferentiate into corneal epithelial-type cells. Cornea. 1999;18:216–24
[17] Choi TH, Tseng SCG. In vivo and in vitro demonstration of epithelial cell-induced myofibroblast differentiation of keratocytes and an inhibitory effect by amniotic membrane. Cornea. 2001;20:197–204
[18] Cooper LJ, Fullwood NJ, Koizumi N, Nakamura T, Kinoshita S. An Investigation of Removed Cultivated Epithelial Transplants in Patients After Allocultivated Corneal Epithelial Transplantation. Cornea. 2004;23:235–42
[19] Cooper LJ, Kinoshita S, German M, Koizumi N, Nakamura T, Fullwood NJ. An investigation into the composition of amniotic membrane used for ocular surface reconstruction. Cornea. 2005;24(6):722-9
Literaturverzeichnis 97
[20] Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, Sun TT, Lavker RW. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can preferentially be stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 1989;57:201–9
[21] Davis JW. Skin transplantation with a review of 550 cases at the Johns Hopkins Hospital. Johns Hopkins Med J. 1910;15:307
[22] Daya SM, Ilari FA. Living related conjunctival limbal allograft for the treatment of stem cell deficiency. Ophthalmology. 2001;108:126–33
[23] Du Y, Chen J, Funderburgh JL, Zhu X, Li L. Functional reconstruction of rabbit corneal epithelium by human limbal cells cultured on amniotic membrane. Molecular Vision. 2003;9:635-43
[24] Dua HS, Azuara-Blanco A. Amniotic membrane transplantation. Br J Ophthalmol. 1999;83:748-752
[25] Dua HS, Shanmuganathan VA, Powell-Richards AO, Tighe PF, Joseph A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. Br J Ophthalmol. 2005;89:529-32
[26] Duchesne B, Mans B, Lavalleye B, Gerard C, Marechal-Courtois C, Betz P, Tseng SC. Use of the cryopreserved human amniotic membrane for reconstruction of the ocular surface. Bull Soc Belge Ophtalmol. 1998;268:73–7
[27] Endo K, Nakamura T, Kawasaki S, Kinoshita S. Human Amniotic Membrane, Like Corneal Epithelial Basement Membrane, Manifests the α5 Chain of Type IV Collagen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:1771–4
[28] Espana EM, He H, Kawakita T, Di Pascuale MA, Raju VK, Liu CY, Tseng SCG. Human Keratocytes Cultured on Amniotic Membrane Stroma Preserve Morphology and Express Keratocan. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:5136–41
[29] Espana EM, Kawakita T, Romano A, Di Pascuale M, Smiddy R, Liu C, Tseng SCG. Stromal Niche Controls the Plasticity of Limbal and Corneal Epithelial Differentiation in a Rabbit Model of Recombined Tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;Vol44,No12:5130-35
[30] Espana EM, Pascuale MD, Grueterich M, Solomon A, Tseng SCG. Keratolimbal allograft in corneal reconstruction. Eye. 2003;00:1-12
[31] Espana EM, Romano AC, Kawakita T, Di Pascuale M, Smiddy R, Tseng SCG. Novel Enzymatic Isolation of an Entire Viable Human Limbal Epithelial Sheet. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;Vol44,No10:4275-81
[32] Espana EM, Ti SE, Grueterich M, Touhami A, Tseng SCG. Corneal stromal changes following reconstruction by ex vivo expanded limbal epithelial cells in rabbits with total limbal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol. 2003;87;1509-14
[33] Fairweather DVI, Eskes TKAB. Amniotic Fluid. Excerpta Medica. Amsterdam. 1973
[34] Fatima A, Sangwan VS, Iftekhar G, Reddy P, Matalia H, Balasubramanian D, Vemuganti GK. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. J Postgrad Med. 2006;52(4):257-61
[35] Fernandes M, Sridhar MS, Sangwan VS, Rao GN. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction. Cornea. 2005;24(6):643-53
[36] Ferraris C, Chevalier G, Favier B, Jahoda CAB, Dhouailly D. Adult corneal epithelium basal cells possess the capacity to activate epidermal, pilosebaceous and sweat gland genetic programs in response to embryonic dermal stimuli. Development. 2000;127:5487-95
[37] Francis D, Abberton K, Thompson E, Daniell M. Myogel supports the ex-vivo amplification of corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 2009;88(3):339-46
[38] Fukuda K, Chikama T, Nakamura M, Nishida T. Differential distribution of subchains of the basement membrane components type IV collagen and laminin among the amniotic membrane, cornea, and conjunctiva. Cornea. 1999;18:73–9
[39] Funaki H, Yamamoto T, Koyama Y, Kondo D, Yaoita E, Kawasaki K, Kobayashi H, Sawaguchi S, Abe H, Kihara I. Localization and expression of AQP5 in cornea, serous salivary glands, and pulmonary epithelial cells. Am J Physiol. 1998;275:C1151-7
Literaturverzeichnis 98
[40] Gabric N, Mravicic I, Dekaris I, Karaman Z, Mitrovic S. Human amniotic membrane in the reconstruction of the ocular surface. Doc Ophthalmol. 1999;98:273–83
[41] Galindo EEH, Theiss C, Steuhl KP, Meller D. Expression of ∆Np63 in Response to Phorbol Ester in Human Limbal Epithelial Cells Expanded on Intact Human Amniotic Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:2959–65
[42] Galindo EEH, Theiss C, Steuhl KP, Meller D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 2003;76(3):303-14
[43] Gicquel JJ, Dua HS, Brodie A, Mohammed I, Suleman H, Lazutina E, James DK, Hopkinson A. Epidermal Growth Factor (EGF) Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Eng Part A. 2009;Jan19.
[44] Gomes JA, Romano A, Santos MS, Dua HS. Amniotic membrane use in ophthalmology. Curr Opin Ophthalmol. 2005;16(4):233-40
[45] Gris O, Guell JL, Lopez-Navidad A, Caballero F, Del Campo Z. Application of the amniotic membrane in ocular surface pathology. Ann Transplant. 1999;4:82-4
[46] Grueterich M, Espana E, Tseng SCG. Connexin 43 Expression and Proliferation of Human Limbal Epithelium on Intact and Denuded Amniotic Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:63-71
[47] Grueterich M, Espana EM, Touhami A, Ti SE, Tseng SCG. Phenotypic study of a case with successful transplantation of ex vivo expanded human limbal epithelium for unilateral total stem cell deficiency. Ophthalmology. 2002;109:1547-52
[48] Grueterich M, Espana EM, Tseng SCG. Ex vivo expansion of limbal stem cells: amniotic membrane serving as a stem cell niche. Surv Ophthalmol. 2003;48(6):631-46
[49] Grueterich M, Espana EM, Tseng SCG. Modulation of Keratin and Connexin Expression in Limbal Epithelium Expanded on Denuded Amniotic Membrane with and without a 3T3 Fibroblast Feeder Layer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:4230–6
[50] Grueterich M, Tseng SCG. Human Limbal Progenitor Cells Expanded on Intact Amniotic Membrane Ex Vivo. Arch Ophthalmol. 2002;120:783-90
[51] Grueterich M, Tseng SCG. Strategien zur Behandlung der Limbusstammzellinsuffizienz. Klin Monatsbl Augenheilkd. 2002;219:333-9
[52] Ha HS, Song KY, Kim JC. Ultrastructural analysis of in vivo expanded corneal epithelium on amniotic membrane. J Korean Med Sci. 2006;21(3):544-9
[53] Haag P, Hanhart N, Müller M. Gynäkologie und Urologie. Medizinische Verlags- und Informationsdienste. Breisach. 2003/04
[54] Hao Y, Ma DH, Hwang DG, Kim WS, Zhang F. Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea. 2000;19:348-52
[55] Harkin DG, Barnard Z, Gillies P, Ainscough SL, Apel AJG. Analysis of p63 and cytokeratin expression in a cultivated limbal autograft used in the treatment of limbal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol. 2004;88;1154-8
[56] He H, Cho HT, Li W, Kawakita T, Jong L, Tseng SC. Signaling-transduction pathways required for ex vivo expansion of human limbal explants on intact amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;47(1):151-7
[57] Higa K, Shimazaki J. Recent advances in cultivated epithelial transplantation. Cornea. 2008:Sep;27 Suppl 1:S41-7
[58] Higa K, Shimmura S, Kato N, Kawakita T, Miyashita H, Itabashi Y, Fukuda K, Shimazaki J, Tsubota K. Proliferation and Differentiation of Transplantable Rabbit Epithelial Sheets Engineered with or without an Amniotic Membrane Carrier. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48:597-604
[59] Higa K, Shimmura S, Shimazaki J, Tsubota K. Ocular surface epithelial cells up-regulate HLA-G when expanded in vitro on amniotic membrane substrates. Cornea. 2006;25(6):715-21
Literaturverzeichnis 99
[60] Hopkinson A, Shanmuganathan VA, Gray T, Yeung AM, Lowe J, James DK, Dua HS. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 2008; 14(4):371-81
[61] Hoppe JD, Sewing KF. Richtlinien zum Führen einer Hornhautbank. Dtsch Ärzteblatt. 2000;Jg 97,Heft 31-32:A2122-24
[62] Houlihan JM, Biro PA, Harper HM, et al. The human amniotic membrane is a site of MHC class 1b expression: evidence for the expression of HLA-E and HLA-G. J Immunol. 1995;154:565-74
[63] http://www.adam.com, 25.05.2005, 13:30 Uhr
[64] http://www.city.ac.uk/optometry/Biolabs/Outer%20Coat%20Lab/Limbus.jpg, 25.05.2005, 12:35 Uhr
[65] http://www.org.chemie.tu-muenchen.de/nmr/resultate.html, 26.08.2005, 16:04Uhr
[66] http://www.univ-lille3.fr/theses/millet-sebastien/Fig/p0000013.jpg, 25.05.2005, 12:30 Uhr
[67] Ivekovic R, Tedeschi-Reiner E, Novak-Laus K, Andrijevic-Derk B, Cima I, Mandic Z. Limbal graft and/or amniotic membrane transplantation in the treatment of ocular burns. Ophthalmologica. 2005;219(5):297-302
[68] John T, Foulks GN, John ME, Cheng K, Hu D. Amniotic membrane in the surgical management of acute toxic epidermal necrolysis. Ophthalmology. 2002;109:351-60
[69] Kasper M, Moll R, Stosiek P, Karsten U. Patterns of cytokeratin and vimentin expression in the human eye. Histochemistry. 1988;89:369-77
[70] Kasper M. Cytokeratins in Intracranial and Intraspinal Tissues. aus der Reihe Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology 126. Springer. 1992
[71] Kim JS, Kim JC, Na BK, Jeong JM, Song CY. Amniotic membrane patching promotes healing and inhibits proteinase activity on wound healing following acute corneal alkali burn. Exp Eye Res. 2000;70:329-37
[72] Kinoshita S, Adachi W, Sotozono C, Nishida K, Yokoi N, Quantock AJ, Okubo K. Characteristics of the human ocular surface epithelium. Prog Retin Eye Res. 2001;20:639-73
[73] Kinoshita S, Nakamura T. Development of Cultivated Mucosal Epithelial Sheet Transplantation for Ocular Surface Reconstruction. Artificial Organs. 2004;28(1):22-7
[74] Koizumi N, Cooper LJ, Fullwood NJ, Nakamura T, Inoki K, Tsuzuki M, Kinoshita S. An Evaluation of Cultivated Corneal Limbal Epithelial Cells, Using Cell-Suspension Culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:2114-21
[75] Koizumi N, Fullwood NJ, Bairaktaris G, Inatomi T, Kinoshita S, Quantock AJ. Cultivation of corneal epithelial cells on intact and denuded human amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41:2506-13
[76] Koizumi N, Inatomi T, Suzuki T, Sotozono C, Kinoshita S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 2001;108:1569-74
[77] Koizumi N, Kinoshita S. Ocular surface reconstruction, amniotic membrane, and cultivated epithelial cells from the limbus. Br J Ophthalmol. 2003;87;1437-9
[78] Koizumi N, Rigby H, Fullwood NJ, Kawasaki S, Tanioka H, Koizumi K, Kociok N, Joussen AM, Kinoshita S. Comparison of intact and denuded amniotic membrane as a substrate for cell-suspension culture of human limbal epithelial cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2007;245(1):123-34
[79] Koizumi NJ, Inatomi TJ, Sotozono CJ, Fullwood NJ, Quantock AJ, Kinoshita S. Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. Curr Eye Res. 2000;20:173-7
[80] Kolli S, Lako M, Figueiredo F, Mudhar H, Ahmad S. Loss of corneal epithelial stem cell properties in outgrowths from human limbal explants cultured on intact amniotic membrane. Regen Med. 2008;3(3):329-42
[81] Kruse FE, Joussen AM, Rohrschneider K, You L, Sinn B, Baumann J, Völcker HE. Cryopreserved human amniotic membrane for ocular surface reconstruction. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2000;238:68-75
[82] Kruse FE, Meller D. Die Amnionmembrantransplantation zur Rekonstruktion der Augenoberfläche. Ophthalmologe. 2001;98:801-10
Literaturverzeichnis 100
[83] Kruse FE, Reinhard T. Die Limbustransplantation zur Rekonstruktion der Augenoberfläche. Ophthalmologe. 2001;98:818-31
[84] Kruse FE, Rohrschneider K, Völcker HE. Multilayer amniotic membrane transplantation for reconstruction of deep corneal ulcers. Ophthalmology. 1999;106:1504-10
[85] Kruse FE, Rohrschneider K, Völcker HE. Transplantation von Amnionmembran zur Rekonstruktion der Hornhautoberfläche. Operatives Vorgehen. Ophthalmologe. 1999;96:673-8
[86] Kruse FE, Rohrschneider K, Völcker HE. Transplantation von Amnionmembran zur Rekonstruktion der Hornhautoberfläche. Ophthalmologe. 1998;95:114-9
[87] Kruse FE, Tseng SCG. A tumor promotorresistant subpopulation of progenitor cells is larger in limbal epithelium than in corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:2501-7
[88] Kurpakus MA, Stock EL, Jones JC. The role of the basement membrane in differential expression of keratin proteins in epithelial cells. Dev Biol. 1992;150:243-55
[89] Lauweryns B, van den Oord JJ, Missotten L, The Transitional Zone Between Limbus and Peripheral Cornea. An lmmunohistochemical Study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:1991-9.
[90] Lavker RM, Dong G, Cheng SZ, Kudoh K, Cotsarelis G, Sun TT. Relative proliferative rates of limbal and corneal epithelia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991;32:1864-75
[91] Lavker RM, Sun TT. Epithelial stem cells: the eye provides a vision. Eye. 2003;17:937-42
[92] Lavker RM, Sun T-T. Epidermal stem cells: properties, markers and location. Proc Natl Acad Sci. USA 2000;97:13473-5
[93] Lavker RM, Tseng SCG, Sun TT. Corneal epithelial stem cells at the limbus: looking at some old problems from a new angle. Exp Eye Res. 2004;78:433-46
[94] Lee JH, Ryu IH, Kim EK, Lee JE, Hong S, Lee HK. Induced expression of insulin-like growth factor-1 by amniotic membrane-conditioned medium in cultured human corneal epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;47(3):864-72
[95] Lee SH,Tseng SCG. Amniotic membrane transplantation for persistent epithelial defects with ulceration. Am J Ophthalmol. 1997;123:303–12
[96] Lehrer MS, Sun T-T, Lavker RM. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 1998;111:2867-75
[97] Letko E, Stechschulte SU, Kenyon KR. Amniotic membrane inlay and overlay grafting for corneal epithelial defects and stromal ulcers. Arch Ophthalmol 2001;119:659-63
[98] Levis H and Daniels JT. New technologies in limbal epithelial stem cell transplantation. Curr Opin in Biotechnol. 2009;20:1-5
[99] Li DQ, Lee SB, Tseng SC. Differential expression and regulation of TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-betaRI, TGF-betaRII and TGF-betaRIII in cultured human corneal, limbal and conjunctival fibroblasts. Curr Eye Res. 1999;19:154-61
[100] Li W, Hayashida Y, Chen YT, Tseng SC. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 2007;17(1):26-36
[101] Li W, Hayashida Y, He H, Kuo CL, Tseng SCG. The Fate of Limbal Epithelial Progenitor Cells during Explant Culture on Intact Amniotic Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48:605-13
[102] Li W, He H, Kuo CL, Gao Y, Kawakita T, Tseng SC. Basement membrane dissolution and reassembly by limbal corneal epithelial cells expanded on amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;47(6):2381-9
[103] Licht P, Wildt L. Luteale und extraluteale Rezeptoren für hCG und LH. Zentralbl Gynakol. 1998;120:98-105
Literaturverzeichnis 101
[104] Liu H, Wintour EM. Aquaporins in development – a review. Reprod Biol Endocrinol. 2005;3:18
[105] Lopez-Garcia JS, Rivas L, Garcia-Lozano I, Murube J. Analysis of corneal surface evolution after moderate alkaline burns by using impression cytology. Cornea. 2006;25(8):908-13
[106] Ma DH, Chen HC, Lai JY, Sun CC, Wang SF, Lin KK, Chen JK. Matrix revolution: molecular mechanism for inflammatory corneal neovascularization and restoration of corneal avascularity by epithelial stem cell transplantation. Ocul Surf. 2009;7(3):128-44
[107] Ma DH, Chen JK, Zhang F, Lin KY, Yao JY, Yu JS. Regulation of corneal angiogenesis in limbal stem cell deficiency. Prog Retin Eye Res. 2006;25(6):563-90
[108] Ma DH, Tsai RJ, Chu WK, Kao CH, Chen JK. Inhibition of vascular endothelial cell morphogenesis in cultures by limbal epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999;40:1822-8
[109] Ma DHK, Yao JY, Yeh LK, Liang ST, See LC, Chen HT, Lin KY, Liang CC, Lin KK, ChenJK. In Vitro Antiangiogenic Activity in Ex Vivo Expanded Human Limbocorneal Epithelial Cells Cultivated on Human Amniotic Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:2586-95
[110] Malak TM, Bell SC. Differential expression of the integrin subunits in human fetal membranes. J Reprod Fertil. 1994;102:269-76
[111] Mann SE, Ricke EA, Yang BA, Verkman AS, Taylor RN. Expression and localization of aquaporin 1 and 3 in human fetal membranes. Am J Obstet Gynecol. 2002;Vol187,No4:902-7
[112] Matic M, Petrov IN, Chen S, Wang C, Dimitrijevich SD, Wolosin JM. Stem cells of the corneal epithelium lack connexins and metabolite transfer capacity. Differentiation. 1997;61:251-60
[113] Meallet MA, Espana EM, Grueterich MS, Goto E, Tseng SCG. Amniotic membrane transplantation for recipient and donor eyes undergoing conjunctival limbal autograft for total limbal stem cell deficiency. Ophthalmology. 2003;110:1585-92
[114] Meller D, Pires RT, Mack RJ, Figueiredo F, Heiligenhaus A, Park WC, Prabhasawat P, John T, McLeod SD, Steuhl KP, Tseng SC. Amniotic membrane transplantation for acute chemical or thermal burns. Ophthalmology. 2000;107:980-9
[115] Meller D, Pires RTF, Tseng SCG. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 2002;86:463-71
[116] Meller D, Tseng SC. Conjunctival epithelial cell differentiation on amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999b;40:878-86
[117] Meller D, Tseng SC. Rekonstruktion der kornealen und konjunktivalen Oberfläche. Transplantation von Amnionmembran. Ophthalmologe. 1998;95:805-13
[118] Meller D, Tseng SC. Transplantation von Amnionmembran mit oder ohne allogener Limbustransplantation zur Rekonstruktion der kornealen Oberfläche bei Limbusinsuffizienz. Ophthalmologe. 2000;97:100-7
[119] Mi S, Yang X, Zhao Q, Qu L, Chen S, M Meek K, Dou Z. Reconstruction of corneal epithelium with cryopreserved corneal limbal stem cells in a goat model. Mol Reprod Dev. 2008:75(11):1607-16
[120] Moghissi KS, Hafez ESE. The Placenta. Charles C Thomas Publisher. 1974
[121] Na BK, Hwang JH, Shin EJ et al. Analysis of human amniotic membrane components as protease inhibitors for development of therapeutic agent for recalcitrant keratitis. Trophoblast Res. 1999;13:459-66
[122] Nakamura T, Inatomi T, Sotozono C, Koizumi N, Kinoshita S. Successful primary culture and autologous transplantation of corneal limbal epithelial cells from minimal biopsy for unilateral severe ocular surface disease. Acta Ophthalmol Scand. 2004:82:468-71
[123] Nakamura T, Koizumi N, Tsuzuki M, Inoki K, Sano Y, Sotozono C, Kinoshita S. Successful regrafting of cultivated corneal epithelium using AM as a carrier in severe ocular surface disease. Cornea. 2003;22:70-1
Literaturverzeichnis 102
[124] Nakamura T, Yoshitani M, Rigby H, Fullwood NJ, Ito W, Inatomi T, Sotozono C, Nakamura T, Shimizu Y, Kinoshita S. Sterilized, Freeze-Dried Amniotic Membrane: A Useful Substrate for Ocular Surface Reconstruction. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:93-9
[125] Naumann GOH, Doerr W, Seifert G, Uehlinger E. Pathologie des Auges I. 2.Auflage. Band 12. Springer. Berlin. 1997
[126] Netter FH. Atlas der Anatomie des Menschen. Novartis. Basel. 1994
[127] Niknejad H, Peirovi H, Jorjani M, Ahmadiani A, Ghanavi J, Seifalian AM. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. Eur Cell Mater.2008 ;15:88-99
[128] Nishida K, Yamato M, Hayashida Y, Watanabe K, Yamamoto K, Adachi E, Nagai S, Kikuchi A, Maeda N, Watanabe H, Okano T, Tano Y. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N Engl J Med. 2004;351:1187-96
[129] Nishida K. Tissue Engineering of the Cornea. Cornea. 2003;22(Suppl 1):S28-S34
[130] Pauklin M, Steuhl KP, Meller D. Characterization of the Corneal Surface in Limbal Stem Cell Deficiency and after Transplantation of Cultivated Limbal Epithelium. Ophthalmology. 2009;116(6):1048-56
[131] Pellegrini G, Dellambra E, Golisano O, Martinelli E, Fantozzi I, Bondanza S, Ponzin D, McKeon F, De Luca M. p63 identifies keratinocyte stem cells. PNAS. 2001;Vol89,No6:3156-61
[132] Pellegrini G, Traverso CE, Franzi AT, Zingirian M, Cancedda R, De Luca M. Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium. Lancet. 1997;349:990-3
[133] Pels L. Organ culture: the method of choice for preservation of human donor corneas. Br J Ophthalmol. 1997;81:523-5
[134] Pires RT, Chokshi A, Tseng SC. Amniotic membrane transplantation or conjunctival limbal autograft for limbal stem cell deficiency induced by 5-fluorouracil in glaucoma surgeries. Cornea. 2000;19:284-7
[135] Pires RT, Tseng SC, Prabhasawat P, Puangsricharern V, Maskin SL, Kim JC, Tan DT. Amniotic membrane transplantation for symptomatic bullous keratopathy. Arch Ophthalmol. 1999;117:1291-7
[136] Prabhasawat P, Tseng SC. Impression cytology study of epithelial phenotype of ocular surface reconstructed by preserved human amniotic membrane. Arch Ophthalmol. 1997;115:1360-7
[137] Pschyrembel W. Klinisches Wörterbuch. 259. Auflage. de Gruyter. Berlin, New York. 2002
[138] Rakowska E, Zagorski Z, Kardaszewska A, Durakiewicz D. Application of amniotic membrane transplantation in severe corneal diseases. Klin Oczna. 1999;101:417-21
[139] Rama P, Bonini S, Lambiase A, Golisano O, Paterna P, De Luca M, Pellegrini G. Autologous fibrin-cultured limbal stem cells permanently restore the corneal surface of patients with total limbal stem cell deficiency. Transplantation. 2001;72:1478-85
[140] Ramaesh K, Dhillon B. Ex vivo expansion of corneal limbal epithelial/stem cells for corneal surface reconstruction. Eur J Ophthalmol. 2003;13:515-24
[141] Rao CV, Lei ZM. The Presence of Gonadotropin Receptors in Human Placenta, Amnion, Chorion and Decidua. Placenta. 1989;10:458-59
[142] Rauz S, Saw VP. Serum eye drops, amniotic membrane and limbal epithelial stem cells - tools in the treatment of ocular surface disease. Cell Tissue Bank. 2009;DOI: 10.1007/s10561-009-9128-1
[143] Reshef E, Lei ZM, Rao CV, Pridham DD, Chegini N, Luborsky JL. The Presence of Gonadotropin Receptors in Nonpregnant Human Uterus, Human Placenta, Fetal Membranes, and Decidua. J Clin Endocrinol Metab. 1990;Vol70,No2:421-30
Literaturverzeichnis 103
[144] Sachsenweger M. Augenheilkunde. 2. Auflage. Thieme. Stuttgart. 2003
[145] Sadler T. Medizinische Embryologie. 9. Auflage. Thieme. Stuttgart, New York 1998
[146] Sangwan VS, Matalia HP, Vemuganti GK, Fatima A, Ifthekar G, Singh S, Nutheti R, Rao GN. Clinical outcome of autologous cultivated limbal epithelium transplantation. Indian J Ophthalmol. 2006;54(1):29-34
[147] Sangwan VS. Limbal Stem Cells in Health and Disease. Bioscience Reports. 2001;Vol21,No4:385-405
[148] Saw VP, Minassian D, Dart J, Ramsay A, Henderson H, Warwick R, Poniatowski S, Cabral S. Amniotic membrane transplantation for ocular disease: a prospective evaluation of the first 233 cases from the UK user group. Br J Ophthalmol. 2007;Feb21 [elektronische Publikation vor Printausgabe]
[149] Schlötzer-Schrehardt U, Dietrich T, Saito K, Sorokin L, Sasaki T, Paulsson M, Kruse FE. Characterization of extracellular matrix components in the limbal epithelial stem cell compartment. Exp Eye Res. 2007;85(6):845-60
[150] Schlötzer-Schrehardt U, Kruse FE. Identification and characterization of limbal stem cells. Exp Eye Res. 2005;81:247-64
[151] Schwab IR, Reyes M, Isseroff RR. Successful transplantation of bioengineered tissue replacements in patients with ocular surface disease. Cornea. 2000;19:421-6
[152] Seigel GM, Sun W, Salvi R, Campbell LM, Sullivan S, Reidy JJ. Human corneal stem cells display functional neuronal properties. Molecular Vision. 2003; 9:159-63
[153] Shao C, Sima J, Zhang SX, Jin J, Reinach P, Wang Z, Ma JX. Suppression of Corneal Neovascularization by PEDF Release from Human Amniotic Membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:1758-62
[154] Shimazaki J, Aiba M, Goto E, Kato N, Shimmura S, Tsubota K. Transplantation of human limbal epithelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders. Ophthalmology. 2002;109:1285-90
[155] Shimazaki J, Shinozaki N, Tsubota K. Transplantation of amniotic membrane and limbal autograft for patients with recurrent pterygium associated with symblepharon. Br J Ophthalmol. 1998;82:235-40
[156] Shimazaki J, Yang H-Y, Tsubota K. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction in patients with chemical and thermal burns. Ophthalmology. 1997;104:2068-76
[157] Shimmura S, Shimazaki J, Ohashi Y, Tsubota K. Antiinflammatory effects of amniotic membrane transplantation in ocular surface disorders. Cornea. 2001;20:408-13
[158] Shimmura S, Tsubota K. Ocular surface reconstruction update. Curr Opin Ophthalmol. 2002;13:213-9
[159] Shortt AJ, Secker GA, Notara MD, Limb A, Khaw PT, Tuft SJ, Daniels JT. Transplantation of Ex Vivo Cultured Limbal Epithelial Stem Cells A Review of Techniques and Clinical Results. Surv Ophthalmol. 2007;52:483-502. DOI: 10.1016/j.survophthal.2007.06.013
[160] Shurman DL, Glazewski L, Gumpert A, Zieske JD, Richard G. In Vivo and in Vitro Expression of Connexins in the Human Corneal Epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;Vol46,No6:1957-65
[161] Sippel KC, Ma JJ, Foster CS. Amniotic membrane surgery. Curr Opin Ophthalmol. 2001;12(4):269-81
[162] Slack JMW. Stem Cells in Epithelial Tissues. Science. 2000;287:1431-33
[163] Solomon A, Pires RT, Tseng SC. Amniotic membrane transplantation after extensive removal of primary and recurrent pterygia. Ophthalmology. 2001;108:449-60
[164] Solomon A, Rosenblatt M, Monroy D, Ji Z, Pflugfelder SC, Tseng SC. Suppression of interleukin 1alpha and interleukin 1beta in human limbal epithelial cells cultured on the amniotic membrane stromal matrix. Br J Ophthalmol. 2001;85:444-9
Literaturverzeichnis 104
[165] Soost HJ, Baur S. Gynäkologische Zytodiagnostik, Lehrbuch und Atlas. 5. Auflage. Thieme.
[166] Spoerl E, Wollensak G, Reber F, Pillunat L. Cross-Linking of Human Amniotic Membrane by Glutaraldehyde. Ophtalmic Res. 2004;36:71-7
[167] Sridhar MS, Bansal AK, Sangwan VS, Rao GN. Amniotic membrane transplantation in acute chemical and thermal injury. Am J Ophthalmol. 2000;130:134-7
[168] Stoiber J, Ruckhofer J, Muss W, Grabner G. Amnion-Limbus-Transplantation zur Oberflächenrekonstruktion nach schwerer Verätzung und Verbrennung. Ophthalmologe. 2002;99:839-48
[169] Sudha B, Jasty S, Krishnan S, Krishnakumar S. Signal transduction pathway involved in the ex vivo expansion of limbal epithelial cells cultured on various substrates. Indian J Med Res. 2009;129(4):382-9
[170] Sun CC, Cheng CY, Chien CS, Pang JHS, Ku WC, Chen PYF, Yang CM. Role of Matrix Metalloproteinase-9 in Ex Vivo Expansion of Human Limbal Epithelial Cells Cultured on Human Amniotic Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:808-15
[171] Sun CC, Su Pang JH, Cheng CY, Cheng HF, Lee YS, Ku WC, Hsiao CH, Chen JK, Yang CM. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1RA) prevents apoptosis in ex vivo expansion of human limbal epithelial cells cultivated on human amniotic membrane. Stem Cells. 2006;24(9):2130-9
[172] Talmi YP, Sigler L, Inge E. Antibacterial properties of human amniotic membranes. Placenta. 1991;12:285-8
[173] Tejwani S, Kolari RS, Sangwan VS, Rao GN. Role of amniotic membrane graft for ocular chemical and thermal injuries. Cornea. 2007;26(1):21-6
[174] Thomasen H, Pauklin M, Steuhl KP, Meller D. Comparison of cryopreserved and air-dried human amniotic membrane for ophthalmologic applications. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2009;247:1691-700
[175] Thompson DA, Othman MI, Lei ZM, Li X, Huang ZH, Eadie DM, Rao CV. Localization of Receptors for Luteinizing Gormone/Chorionic Gonadotropin in Neural Retina. Life Sci. 1998;Vol63,No12:1057-1064
[176] Ti SE, Grueterich M, Espana EM, Touhami A, Anderson DF, Tseng SCG. Correlation of long term phenotypic and clinical outcomes following limbal epithelial transplantation cultivated on amniotic membrane in rabbits. Br J Ophthalmol. 2004;88:422-7
[177] Tosi GM, Massaro-Giordano M, Caporossi A, Toti P. Amniotic membrane transplantation in ocular surface disorders. J Cell Physiol. 2005;202(3):849-51
[178] Toth P, Li X, Lei ZM, Rao CV. Expression of Human Chorionic Gonadotropin (hCG)/Luteinizing Hormone Receptors and Regulation of the Cyclooxygenase-1 Gene by Exogenous hCG in Human Fetal Membranes. J Clin Endocrinol Metab. 1996;Vol81,No3:1283-88
[179] Touhami A, Grueterich M, Tseng SCG. The Role of NGF Signaling in Human Limbal Epithelium Expanded by Amniotic Membrane Culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:987-94
[180] Tsai RJ, Li LM, Chen JK. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N Engl J Med. 2000;343(2):86-93
[181] Tseng SCG, Li DQ, Ma X. Suppression of transforming growth factor-beta isoforms, TGF-beta receptor type II,and myofibroblast differentiation in cultured human corneal and limbal fibroblasts by amniotic membrane matrix. J Cell Physiol. 1999;179:325-35
[182] Tseng SCG, Prabhasawat P, Barton K, Gray T, Meller D. Amniotic membrane transplantation with or without limbal allografts for corneal surface reconstruction in patients with limbal stem cell deficiency. Arch Ophthalmol. 1998;116:431-41
[183] Tseng SCG, Zhang SH. Limbal epithelium is more resistant to 5-fluouracil toxicity than corneal epithelium. Cornea. 1995;14:391-401
[184] Tsubota K, Satake Y, Ohyama M, Toda I, Takano Y, Ono M, Shinozaki N, Shimazaki J. Surgical reconstruction of the ocular surface in advanced ocular cicatricial pemphigoid and Stevens-Johnson syndrome. Am J Ophthalmol. 1996;122:38-52
Literaturverzeichnis 105
[185] Uçakhan ÖÖ, Köklü G, Firat E. Nonpreserved Human Amniotic Membrane Transplantation in Acute and Chronic Chemical Eye Injuries. Cornea 2002;21(2):169-72
[186] Ueta M, Kweon MN, Sano Y, Sotozono Y, Yamada J, Koizumi N, Kiyono H, Kinoshita S. Immunosuppressive properties of human amniotic membrane for mixed lymphocyte reaction. Clin Exp Immunol. 2002;129:464-70
[187] Vemuganti GK, Kashyap S, Sangwan VS, Singh S. Ex-vivo Potential of Cadaveric and Fresh Limbal Tissues to Regenerate Cultured Epithelium. Indian J Ophthalmol. 2004;52:113-20
[188] Verkman AS. Role of aquaporin water channels in eye function. Exp Eye Res. 2003;76:137-43
[189] von Versen-Höynck F, Hesselbarth U, Möller DE. Application of sterilised human amnion for reconstruction of the ocular surface. Cell and Tissue Banking. 2004;5:57-65
[190] Wang DY, Cheng CC, Kao MH, Hsueh YJ, Ma DH, Chen JK. Regulation of limbal keratinocyte proliferation and differentiation by TAp63 and DeltaNp63 transcription factors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46(9):3102-8
[191] Wang DY, Hsueh YJ, Yang VC, Chen JK. Propagation and Phenotypic Preservation of Rabbit Limbal Epithelial Cells on Amniotic Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:4698-704
[192] Wang S, Chen J, Beall M, Zhou W, Roll MG. Expression of aquaporin 9 in human chorioamniotic membranes and placenta. Am J Obstet Gynecol. 2004;191:2160-7
[193] Wang S, Kallichanda N, Song W, Ramirez BA, Ross MG. Expression of aquaporin-8 in human placenta and chorioamniotic membranes: Evidence of molecular mechanism for intramembranous amniotic fluid resorption. Am J Obstet Gynecol. 2001;Vol185,No5:1226-31
[194] Watt FM, Hogan, BLM. Out of Eden: Stem Cells and Their Niches. Science. 2000;287:1427-30
[195] Yam HF, Pang CP, Fan DSP, Fan BJ, Yu EYW, Lam DSC. Growth Factor Changes in Ex Vivo Expansion of Human Limbal Epithelial Cells on Human Amniotic Membrane. Cornea. 2002;21(1):101-5
[196] Zhang X, Sun H, Li, Yuan X, Zhang L, Zhao S. Utilization of human limbal mesenchymal cells as feeder layers for human limbal stem cells cultured on amniotic membrane. J Tissue Eng Regen Med. 2009);DOI: 10.1002/term.216
[197] Zhang X, Sun H, Tang X, Ji J, Li X, Sun J, Ma Z, Yuan J, Han ZC. Comparison of cell-suspension and explant culture of rabbit limbal epithelial cells. Exp Eye Res. 2005;80:227-33
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne
Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel und Quellen angefertigt habe. Die Arbeit
entstand am Institut für Anatomie der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der
Technischen Universität Dresden unter der wissenschaftlichen Betreuung von
Frau Prof. Dr. med. Katrin Engelmann. Ich habe weder diese Dissertation an einer anderen
Stelle zur Promotion eingereicht noch bisher erfolglose Promotionsversuche unternommen.
Tassilo Henkel
Dresden, 30.03.2010
Thesen
Eine wichtige Strategie zur Behandlung der Limbusstammzellinsuffizienz ist die
Transplantation gesunder Limbuszellen auf das erkrankte Auge, die sogenannte
Limbuszelltransplantation. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, können im Sinne des tissue
engineering mittels ex-vivo-Kultivierung aus einem kleinen gesunden Limbusareal und einer
Amnionmembran Limbusepithel-Amnion-Transplantate hergestellt werden. Diese können
anschließend auf das Patientenauge transplantiert werden. Als Quelle für die
Limbusepithelzellen bieten sich Corneoskleralringe an, welche nach Keratoplastik einfach
verfügbar sind. Aus den in der vorliegenden Dissertation durchgeführten Untersuchungen
ergeben sich folgende Thesen:
1. Die Epithelzellen einer Amnionmembran, welche in einer 1+1 Mischung aus DMEM
und Glycerol bei -80 °C kryokonserviert wurde, sind avital und proliferieren nicht
mehr in Kultur.
2. Aus langzeitorgankonservierten Corneoskleralringen, die nach einer Keratoplastik
verfügbar sind, lassen sich Limbusepithelzellen gewinnen und auf intakter,
kryokonservierter Amnionmembran kultivieren.
3. Als Isolierungsmethode eignet sich insbesondere die Explantat-Technik mit nach
unten gerichtetem Epithel.
4. Das entstandene Limbusepithel-Amnion-Transplantat besteht aus der
Amnionmembran mit seiner einschichtigen Epithelzellschicht und einem darauf
gewachsenen mehrschichtigen unverhornten Plattenepithel, welches morphologisch
dem der Hornhaut ähnelt.
5. Die aus den Corneoskleralexplantaten ausgewachsenen Zellen exprimieren das
Cytokeratinpaar 3/12, welches spezifisch für Hornhautepithel ist. Weiterhin wird das
Protein p63 exprimiert, dessen Vorkommen eine geringe Differenzierung und ein
hohes Proliferationspotenzial der Zellen anzeigt. Das Vorhandensein des Nexus-
Proteins Cx43 lässt mit der Coexpression von p63 einen Rückschluss auf den
Differenzierungsgrad zu: die ausgewachsenen Zellen scheinen in ihrer Mehrheit TACs
(Transient Amplifying Cells) des Limbusepithels zu sein.
6. Der Erfolg der Kultivierung hängt mit der Geschichte der Spenderhornhaut
zusammen. Je höher das Spenderalter und je länger die Post-mortem-Zeit und
Organkultur-Dauer, desto geringer die Auswachsrate.
7. Es ist somit möglich, aus Corneoskleralringen langzeitorgankonservierter Hornhäute
und intakten, kryokonservierten Amnionmembranen Limbusepithel-Amnion-
Transplantate herzustellen. Das Potenzial dieser Transplantate zur erfolgreichen
Behandlung einer Limbusstammzellinsuffizienz bedarf weiterer Forschung.
Danksagung
Hiermit möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Anfertigung dieser
Dissertation unterstützt haben. Zunächst geht der Dank an Frau Prof. Engelmann für die
Bereitstellung des Themas und die Begutachtung der Arbeit. Die exzellente Betreuung
übernahm Monika Valtink. Danke für die Einführung in die Thematik, die Vermittlung der
wissenschaftlichen Arbeitsweisen und das stets offene Ohr für alle Fragen und Probleme! Das
notwendige Handwerk wurde mir von vielen Mitarbeitern der Universitätsaugenklinik und
des Instituts für Anatomie beigebracht - herzlichen Dank an Prof. Spörl, Viktoria Zubaty,
Silvia Bramke, Anja Neißer, Kerstin Pehlke und Doreen Streichert. Statistisch in der
Minderheit, aber eine enorme Hilfe waren mir auch Prof. Koch und Dr. Kuhlisch vom Institut
für Medizinische Informatik und Biometrie. Das Überleben der Zellkulturen während meiner
Abwesenheit garantierte Simo, im Kampf mit Word half mir Enrico. Für das gründliche
Korrekturlesen und die anregenden Ideen geht mein Dank an Monika, Claudia und Riccarda.
Danken möchte ich auch allen Menschen, die mich im Zeitraum meiner Promotion begleitet
und unterstützt haben.