sveuČiliŠte u rijeci - bib.irb.hrbib.irb.hr/datoteka/904775.tamara_zic_diplomski_rad.pdf ·...
TRANSCRIPT
SVEUČILIŠTE U RIJECI
ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU
Diplomski sveučilišni studij
Istraživanje i razvoj lijekova
Tamara Žic
Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u
timeless cirkadijalnih mutanata Drosophile
Diplomski rad
Rijeka, 2016. godina
SVEUČILIŠTE U RIJECI
ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU
Diplomski sveučilišni studij
Istraživanje i razvoj lijekova
Tamara Žic
Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u
timeless cirkadijalnih mutanata Drosophile
Diplomski rad
Rijeka, 2016. godina
Mentor rada: Dr.sc. Rozi Andretić-Waldowski
Diplomski rad obranjen je dana ______________________
pred povjerenstvom:
1. Izv. Prof. Dr. sc. Sandra Kraljević Pavelić
2. Doc. Dr.sc Karlo Wittine
3. Doc. Dr. sc. Rozi Andretić-Waldowski
Rad ima 58 stranica, 11 slika, 11 tablica i 50 literaturnih navoda
Sažetak
Ciklusi svjetla i mraka utječu na cirkadijalne gene koji su bitni za kontrolu
homeostaze te su važan faktor koji utječu na fizičke i bihevioralne promjene u 24
satnom periodu. Geni koji reguliraju cirkadijalni ritam bitni su za regulaciju
metabolizma i imaju veliki utjecaj na mehanizme starenja. Starenje je kompleksan
proces kojega opisuju velike promjene u organizmu kao što su smanjenje funkcija
stanica, veća podložnost bolestima i na kraju smrt. Jedna od teorija starenja
povezuje starenje s nakupljanjem oksidacijskog oštećenja, a oksidativne promjene
povezane su s regulacijom cirkadijalnih gena. Oksidacijski stres u obliku reaktivnih
kisikovih vrsta utječe na oštećenje proteina, lipida i DNK koje onda dovodi do
starenja. Pokazano je da mutacije u cirkadijalnom genu period (per) mogu dovesti
do ubrzanog starenja, stoga smo testirali da li mutacija u tim01 genu,
dimerizacijskom partneru per gena, kod Drosophile melanogaster dovodi do
ubrzanih procesa starenja. Ispitali smo kako dodatak polifenola, kvercetina i
tirosola, u prehranu ima utjecaj na procese starenja kod wt i tim01 mušica.
Mjerili smo bihevioralne fenotipove: negativnu geotaksiju, količinu aktivnosti i
spavanja, otpornost na strest izgladnjivanja, isušivanja, dužinu životnog vijeka,
prosječnu težinu. Ova mjerenja korelirali smo s biokemijskim parametrima:
aktivnošću katalaze i superoksid dismutaze, AGE akumulacijom, količinom mono-
di-tri glicerida i reduktivnih šećera. Ispitivanja su provedena na oba spola.
Dobiveni rezultati pokazali su da polifenoli imaju pozitivne utjecaje na dužinu
života te su isto tako pospješili motoričku sposobnost okomitog penjanja koje
starenjem opada. Polifenoli su se također pokazali uspješnim prilikom fizioloških
stresova gdje su tretirane mušice u usporedbi s netretiranim duže preživjele bez
hrane i vode. Starenjem dolazi do akumulacije AGE produkata koje smo zabilježili
u wt mušica dok kod tim mušica nisu uočene. Polifenoli nisu pokazali veća
smanjenja u AGE nakupljanju kod wt i tim mušica. Polifenoli su smanjili aktivnost
katalaze i kod wt i tim mušica oba spola, dok je njihovo djelovanje na superoksid
dismutazu bilo spolno, starosno i genotipno specifično. Polifenoli nisu pokazali
značajne utjecaje na količinu aktivnosti i spavanja, prosječnu težinu, ukupnu
količinu mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera.
Dobiveni rezultati pokazuju da polifenoli djeluju na mehanizme starenja, ali nije
potpuno jasno na koji način. Jedno objašnjenje naših rezultata je da polifenoli
djeluju na smanjivanju razine reaktivnih kisikovih vrsta te tako dovode do
smanjenja oksidativnog oštećenja. Ne znamo da li je taj ujecaj direktan
(antioksidativna aktivnost polifenola) ili indirektan preko djelovanja na aktivnosti
endogenih antioksidativnih enzima. Daljnja istraživanja trebala bi razjasniti
interakciju polifenola s cirkadijalnim genima i procesom starenja.
Ključne riječi: cirkadijalni geni, Drosophila melanogaster, starenje, polifenoli
Title: Effect of tyrosol and quercetin on ageing and redox state in Drosophila
circadian mutant timeless
Summary
Light-dark cycle have effects on circadian genes which regulate homeostasis
regulation and physical and behavioral changes during 24 hour period. Circadian
genes regulate circadian rhythmicity, metabolism and influence mechanisms on
aging. Aging is a complex that involves changes in organism: reduction in the
function of cells, larger susceptibility for disease and eventually death. One aging
theory connects aging with accumulation of oxidative damages, which are usually
connected with circadian genes regulation. Process of aging is associated with
oxidative stress as a result of reactive oxygen species damaging proteins, lipids
and DNA. It has been shown that mutations in circadian period (per) gene can lead
to accelerated aging, therefore we tested whether mutation in tim01 gene,
dimerisation partner of per gene product, has effects on accelerated aging of
Drosophila melanogaster. We tested if addition of polyphenols, quercetin and
tyrosol, in the food have effects on aging of wt and tim01 flies.
We measured behavioral phenotypes: negative geotaxis, amount of activity and
sleep, resistance to starvation and dehydration stress, longevity and average
weight. This measurments were correlated with biochemical measurments:
catalase and superoxide dismutase activity, AGE accumulation, mono-di-tri-
glycerides and reductive sugars quantity. Tests were conducted on both sexes.
Results showed positive effects of polyphenols on longevity and they improved
motor skills of horizontal climbing which normally decreases with aging.
Polyphenols also showed positive effect to physiological stress (starvation and
dehydration) where treated flies lived longer compared to not treated flies.
Accumulation of AGE products were shown in wt flies but not in tim01 flies.
Polyphenols did not affect AGE accumulation in wt and tim flies. Polyphenols
decreased catalase activity of wt and tim flies of both genders, while their effect
on superoxide dismutase were gender, age and genotype specific. Polyphenols
showed no significant effects on total amount of activity and sleep, average weight,
amount of mono-di-tri-glycerides and reductive sugars.
Results showed that polyphenols have effects on aging mechanism, but it is not
yet clear in which way. One explanation of our results is that polyphenols decrease
levels of reactive oxygen species and in that way they decrease oxidative damages.
We don't know if that influence is direct (antioxidant activity of polyphenols) or
indirect through action on endogenous antioxidant enzymes. Further research
should clarify interactions of polyphenols with circadian genes and aging process.
Key words: circadian genes, Drosophila melanogaster, aging, polyphenols
Sadržaj
1. Uvod .................................................................................................. 1
1.1. Teorije starenja .............................................................................. 1
1.2. Utjecaj cirkadijalnih ritmova kod Drosophile melanogaster na metabolizam
starenja .............................................................................................. 2
1.3. Mehanizmi oksidacijskog stresa kod starenja ....................................... 5
1.4. Utjecaj polifenola na usporavanje procesa starenja .............................. 6
1.4.1. Istraživanja s kvercetinom .......................................................... 8
1.4.2. Istraživanja s tirosolom .............................................................. 8
1.5. Testovi za mjerenje starenja kod Drosophile melanogaster .................... 9
2. Cilj rada ............................................................................................11
3. Materijali i metode ..............................................................................12
3.1. Kemijske komponente i njihove koncentracije ....................................12
3.2. Soj Drosophile i uzgoj ....................................................................12
3.3. Eksperiment aktivnosti i spavanja ....................................................12
3.4. Eksperimenti izgladnjivanja i isušivanja .............................................13
3.5. Eksperiment negativne geotaksije ....................................................13
3.6. Eksperiment preživljenja .................................................................14
3.7. AGE eksperiment ...........................................................................14
3.8. Eksperiment mjerenja enzimske aktivnosti katalaze ............................14
3.9. Eksperiment mjerenja enzimske aktivnosti superoksid dismutaze ..........14
3.10. Eksperiment mjerenja šećera .........................................................15
3.11. Eksperiment mjerenja lipida ..........................................................15
3.12. Statistička obrada rezultata ...........................................................16
4. Rezultati ............................................................................................17
4.1. Utjecaj tirosola i kvercetina na dužinu preživljenja mušica s tim mutacijom
........................................................................................................17
4.2. Utjecaj polifenola na negativnu geotaksiju divljeg tipa (wt) i tim mušica .19
4.3. Polifenolni utjecaj na ukupnu aktivnost tim mušica ..............................22
4.4. Utjecaj polifenola na količinu spavanja kod tim mušica ........................24
4.5. Učinak polifenola kod tim mušica prilikom stresa izgladnjivanja .............26
4.6. Učinak polifenola kod tim mušica prilikom stresa isušivanja ..................29
4.7. Utjecaj polifenola na stvaranje AGE produkata kod wt i tim mušica ........31
4.8. Utjeca polifenola na katalaznu aktivnost kod wt i tim mušica ................34
4.9. Utjecaj polifenola na postotak inhibicije superoksid dismutaze kod wt i tim
mušica ...............................................................................................37
4.10. Utjecaj polifenola na prosječnu težinu, mono-di-tri gliceride i reduktivne
šećere ................................................................................................40
4.11. Tablica sa statističkim značajnostima ..............................................43
5. Rasprava ...........................................................................................45
6. Zaključak ..........................................................................................51
7. Literatura ..........................................................................................52
8. Životopis ...........................................................................................56
1
1. Uvod
1.1. Teorije starenja
U toku povijesti ljudi su uvijek sanjali o mogućnosti liječenja bolesti i starosti,
potrazi za otkrićem „eliksira mladosti“ (1). Ovaj san nikada nije postao stvarnost
zbog teškoća u razumijevanju procesa povezanih sa starenjem. Do danas ne
postoje intervencije koje mogu usporiti, zaustaviti ili obrnuti procese starenja kod
ljudi. Starenje je kompleksan proces koji se događa zbog usporavanja ili izmjena
u tjelesnim procesima te dovodi do smanjene funkcionalnosti stanica, većoj
podložnosti bolestima i u konačnici smrti organizma (2). Mnoga istraživanja se
bave proučavanjem i otkrivanjem mehanizama odgovornih za starenje. Cilj takvih
istraživanja bi bila identifikacija potencijalnih meta na koje bi se moglo utjecati i
tako usporiti procese starenja. U ovom diplomskom radu proučavani su cirkadijalni
geni i njihov utjecaj na starenje te korištenje polifenola u suzbijanju mehanizama
starenja.
Starenje je popraćeno s razvitkom mnogih bolesti: rak, dijabetes, pretilost,
kardiovaskularne bolesti te degeneracija tkiva (3). To je kompleksan i
multifaktorijalan proces koji uključuje dereguliranu ishranu, disfunkciju
mitohondrija, starenje stanica, iscrpljivanje matičnih stanica, narušavanje
unutarstanične komunikacije te gubitak homeostaze u regulacijskim i fiziološkim
procesima.
Značajne teorije starenja kao što su teorija slobodnih radikala, imunološka, upalna
i mitohondrijska teorija se baziraju na jednom specifičnom uzroku starenja (1).
One omogućavaju korisne i važne uvide za razumijevanje fizioloških promjena u
toku starenja no sve više ih zamjenjuju teorije bazirane na multifaktorijalnosti koje
smatraju da nekoliko procesa sudjeluje i dolazi u interakcije prilikom starenja.
Karakteristika starenja je povećano oštećenje stanica i njihova nefunkcionalnost
(4). Jedan od primjera je bolest progerija (Hutchinson-Gilfordov sindrom) kod koje
zbog nedostatka mehanizma potrebnog za popravak DNK dolazi do ubrzanog
starenja. Progerija može nastati i kao rezultat promjene jednog gena. Mutacije u
određenim genima mogu dovesti do veće otpornosti na stres i smanjenog
nakupljanja različitih oštećenja što u konačnici dovodi do produženog životnog
vijeka. Jedan od primjera je mutacija u genu koji kodira protein p66shc bitan za
odgovor na oksidativni stres (5). Mutacija je kod miševa dovela do produžetka
2
života i omogućila zaštitu od bolesti koje se javljaju starenjem te je kod in-vitro
kultiviranih stanica povećala otpornost na apoptozu.
1.2. Utjecaj cirkadijalnih ritmova kod Drosophile melanogaster na
metabolizam starenja
Model organizam s kojim možemo proučavati brojna neurobiološka stanja i različita
kompleksna ponašanja zbog njene dobre genetičke podloge je vinska mušica,
Drosophila melanogaster (6). Brzi životni ciklus, maleni broj kromosoma i mali
genom su neke od prednosti koje su ju učinile centralnim organizmom za
proučavanje genetike razvoja i ponašanja kod životinja i ljudi (7). Genom vinske
mušice obuhvaća 5% veličine ljudskog genoma te sadrži samo 4 kromosoma,
naspram ljudi koji imaju 23 kromosoma.
Drosophila se često koristi za proučavanje molekularne osnove cirkadijalnih
ritmova i načina na koji oni utječu na metabolizam i starenje. Cirkadijalni ritmovi
su bitni za održavanje homeostaze na molekularnom, bihevioralnom i fiziološkom
nivou (2). To su fizičke, psihičke i bihevioralne ritmične promjene u aktivnosti koje
prate 24 satni ciklus. Cirkadijalni ritmovi su jasno izraženi kod mladih individua
dok se starenjem njihova amplituda smanjuje (8). Novija istraživanja ukazuju na
važnost gena koji reguliraju cirkadijalni ritam u regulaciji metabolizma, a time i
brzinu starenja.
Srž cirkadijalnog sata sastoji se od molekularne povratne petlje u kojoj je
transkripcijska aktivacija cirkadijalnih gena inhibirana proteinima koji su kodirani
istim tim genima (9). Kod Drosophile je poznato 7 gena koji utječu na funkciju
centralnog sata, a ovo istraživanje se bavilo problematikom timeless (tim) gena.
Ispitivane su razlike između divljeg soja Drosophila Canton S i cirkadijalnog
mutanta tim01. U ovom istraživanju odabran je timeless mutant zato što on isto
kao i per0 mutant pokazuje kompletan gubitak cirkadijalnog ritma, ali je tim gen
odvojen i zaseban od per gena (10). Također, važna značajka timeless mutacije je
blokada cirkadijalnog ciklusa PER proteina unutar stanice. Detaljan opis
cirkadijalnog sata opisuje se u nastavku teksta.
Mehanizam cirkadijalnog sata je kompleksan i sastoji se od velikog broja gena i
proteina. Proteini koje kodiraju Clock (Clk) i cycle (cyc) geni (CLK i CYC proteini)
pripadaju obitelji bHLH-PAS transkripcijskih faktora (9). CLK-CYC heterodimer
veže se na specifičnu sekvencu unutar promotorske regije period (per), timeless
3
(tim) i vrille (vri) gena te aktivira njihovu transkripciju. Citoplazmatsko nakupljanje
i translokacija unutar jezgre PERIOD (PER) i TIMELESS (TIM) proteina je aktivno
izbrisana zbog funkcije double-time (dbt) i shaggy (sgg) gena koji kodiraju protein
kinaze (DBT i SGG). Kao rezultat toga CLK i CYC mogu nastaviti s aktivacijom
transkripcije per i tim gena dok se PER i TIM represorski proteini nakupljaju u
citoplazmi. Nakon što PER i TIM uđu u jezgru dolazi do inhibicije transkripcije zbog
vezanja PER-TIM heterodimera na CLK-CYC dimer. Ovo gašenje traje sve dok PER
i TIM proteini nisu degradirani. Starenje utječe upravo na funkciju gore navedenih
kinaznih aktivnosti no sam proces na koji način još nije razjašnjen.
Slika 1. Clock proteini i clock geni u cirkadijalnom satu. Siva kućica pokazuje jezgru,
a sve oko nje je citoplazma (11). PER fosforilacija ovisi o DBT. Fosforilirani PER je usmjeren
za degradaciju. TIM koji se nalazi u citoplazmi skupa s PER-om tvori heterodimer
(najvjerojatnije zbog stabilizacije). PER i TIM ulaze u jezgru skupa s DBT. SGG fosforilira
TIM kako bi olakšao translokaciju TIM-a u jezgru. Jezgreni PER i TIM dovode do represije
aktivnosti CLK i CYC. Kada se smanji nivo PER i TIM-a gasi se represija što dovodi do
stvaranja novog ciklusa transkripcije iz E-box. Transkripcija Clk gena je indirektno pozitivno
regulirana pomoću PER i TIM dok je za negativnu regulaciju odgovoran VRI transkripcijski
faktor.
Cirkadijalni sustav vinske mušice, kao i ostalih organizama, sastoji se od
centralnog i perifernog sata (12). Centralni sat sastoji se od neurona koji
4
kontroliraju ritmove aktivnosti i spavanja, dok je mnoštvo perifernih satova u
senzornim neuronima, glia stanicama, masnom tkivu, abdomenu i sekretornoj
sluznici. Periferni sat može funkcionirati neovisno o centralnom satu, ali u tom
slučaju jačina perioda u konstantnim uvjetima postepeno slabi. Periferni ritmovi
su pod utjecajem centralnog sata, a na njih utječe i ritam unosa hrane i fizičke
aktivnosti. Sve je više dokaza da je za efikasno funkcioniranje važno da periodična
aktivnost perifernih i centralnog sata bude usklađena.
Periferni satovi se mogu nalaziti i u glavi te je jedna studija ispitivala bihevioralno
ponašanje vinskih mušica ovisno o ekspresiji cirkadijalnih gena u perifernim
satovima (13). Cirkadijalni geni per i tim i njihovi proteini pokazali su umanjenu
oscilaciju u perifernim satovima glava starijih mušica u usporedbi s mladim
mušicama. Ova ista studija je pokazala da ne dolazi do promjena u centralnom
satu starenjem (postoji snažan PER signal). Druga studija je pokazala
kontradiktornosti te njihovi rezultati dovode do smanjene oscilacije PER i TIM
proteina u centralnom satu starijih mušica (14).
Dijetalna restrikcija je smanjen unos hrane u organizam (ispod ad libitum razine)
bez pothranjenosti (15). Dijetalna restrikcija (eng. Dietary restriction, DR) je
produžila prosječni i maksimalni životni vijek u svim testiranim organizmima, kao
što su npr. kvasci, crvi, mušice i glodavci. Jedno od istraživanja je pokazalo da je
DR kod miševa dovela do odgode razvoja kroničnih bolesti te da je produžila njihov
životni vijek (16). Za miševe na DR zabilježena je povećana ekspresija gena za
oksidaciju masnih kiselina, naspram ad libitum hranjenih kontrola kod kojih je bila
povećana ekspresija gena za sintezu masnih kiselina.
Metabolički i signalni putevi odgovorni za životni vijek su pod utjecajem endogenog
cirkadijalnog sata (17). Dijetalna restrikcija povećava amplitudu ciklusa većine
cirkadijalnih gena uključujući i tim gena u perifernim tkivima kod vinske mušice.
Masenom spektrometrijom pokazano je da tim ima ulogu u nastanku triglicerida
srednjeg lanca i da njegova prekomjerna ekspresija u perifernim tkivima
produžava životni vijek. Ova saznanja pokazuju važnu ulogu specifičnih
cirkadijalnih gena u metabolizmu masti i starenja prilikom manipulacije količine
nutrijenata.
Mutacije u cirkadijalnim genima imaju negativne posljedice na različite biološke
procese i dovode do skraćenog životnog vijeka (18). Kod miševa kojima je
5
nedostajao clock gen BMAL1 (homolog CYC proteina koji se nalazi kod mušica)
pokazano je nekoliko simptoma starenja (sarkopenija, katarakta, atrofija organa
te mnogi drugi) (19). Slično, u mušica s mutacijom u per genu dolazi do smanjenog
životnog vijeka, ubrzanog pada funkcionalnosti i povećane neuronalne
degeneracije tijekom starenja te ubrzana akumulacija oksidativnog oštećenja (20).
1.3. Mehanizmi oksidacijskog stresa kod starenja
Oksidacijski stres i cirkadijalna regulacija su usko povezani. Tako je pokazano da
ovisno o dobu dana kada je induciran oksidativni stres, administracijom vodikovog
peroksida (H2O2), ovisila je smrtnost mušica (21). Opažen je dnevni ritam
smrtnosti s maksimalnom smrtnošću u kasnoj fazi svjetla i minimalnoj u kasnoj
fazi mraka. Veća smrtnost tijekom dana se događala zbog većeg nakupljanja
proteinskih karbonila koji su nusprodukti proteinske oksidacije (2). U per mutanata
gdje je cirkadijalni ritam narušen povećana je osjetljivost na H2O2 u usporedbi s
kontrolom (21).
Jedna od teorija starenja objašnjava interakcije među procesima glikozilacije,
oštećenja stanica zbog slobodnih kisikovih radikala, razine glukoze u organizmu i
djelovanje šaperon proteina (22). Prema njoj glukoza može postati štetna u vrlo
stabilnim konformacijama koje imaju destruktivno djelovanje u metabolizmu (23).
U procesu neenzimske glikozilacije slobodna glukoza prolazi procese pretvorbe
gdje u konačnici iz glukoze nastaju najstabilniji oblici tzv. AGE (engl. Advanced
Glycosylation Endproducts). Ovi proizvodi glikozilacije stvaraju unakrsne
poveznice s proteinima, lipidima ili DNK te umanjuju njihovu funkcionalnost. To je
spontani proces koji ovisi o koncentraciji glukoze u krvi, tkivima i citosolu. Proces
je progresivan, nepovratan i dovodi do cjelokupnih oštećenja. AGE produkti su
biomarkeri starenja te postoji način njihovog mjerenja kojega smo mi primijenili u
našim eksperimentima.
Učestalo istraživani mehanizmi oštećenja stanica proizlaze iz reakcija nastalih zbog
slobodnih kisikovih radikala (eng. ROS, Reactive Oxidative Species) (22). Disanje
i korištenje kisika kod aerobnih organizama ima svoje štetnosti. Djelomična
redukcija molekule kisika tijekom oksidativne fosforilacije u mitohondriju stvara 3
glavna tipa ROS-a: superoksidni anion (O2•-), vodikov peroksid (H2O2) te
hidroksilni radikal (•OH). Smatra se da su najdestruktivniji za mitohondrijske
membrane vodikov peroksid i njegov radikal (•OH). ROS dovode do oštećenja
6
makromolekula kao što su DNK, lipidi i proteini te tako remete funkcije stanice
(24). Nakupljanje ROS-a povećava se tijekom starenja te je jedan od bitnih faktora
koji utječe na starenje i skraćuje životni vijek. ROS-ovi se iz organizma eliminiraju
pomoću superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation peroksidaze dok
se oštećeni proteini mogu popraviti pomoću molekularnih šaperona kao što su
proteini toplinskoga šoka (engl. Heathshock protein).
Organizmi se protiv starenja povezanog s oksidativnim stresom bore na dva načina
(25). Prvi je proizvodnja endogenih antioksidativnih enzima kao što su superoksid
dismutaza, katalaza te glutation peroksidaza. Drugi način su egzogeni
antioksidansi npr. vitamini E i C. SOD katalizira dismutaciju superoksidnog aniona
u vodikov peroksid i molekulu kisika, a CAT potom razgrađuje molekulu H2O2 na
molekulu vode i molekulu kisika. SOD je prisutna u mitohondrijskom i
citoplazmatskom obliku kod Drosophile te ju kodiraju dva različita gena Sod1 i
Sod2 (26).
Mnogobrojna istraživanja o utjecaju ROS-a na starenje nisu uvijek u suglasju o
utjecaju antioksidativnih enzima. Jedan od načina za testiranje teorije starenja pod
utjecajem slobodnih radikala je taj da se povećaju razine SOD i CAT. Kod vinske
mušice je pokazano da ako se istovremeno poveća njihova ekspresija može doći
do produženog životnog vijeka, smanjenog nakupljanja oksidativnih oštećenja te
do ubrzanih metaboličkih procesa (27). Drugo istraživanje je pokazalo da su
organizmi s mutacijom u SOD genu podložniji oksidativnom stresu (28). Nedavna
ispitivanja sojeva mutanata Drosophila melanogaster koji su imali smanjeni izražaj
SOD pokazala su da te mušice imaju skraćen životni vijek te da su bile infertilne i
podložnije utjecaju parakvata (29).
1.4. Utjecaj polifenola na usporavanje procesa starenja
Dijetalni dodaci koji sadrže nutrijente ili biljne ekstrakte mogu produžiti životni
vijek te djeluju kao egzogeni antioksidansi (30). Ekstrakti iz biljaka (npr. ekstrakti
iz rodiole, kurkume i jabuke) pokazali su da pozitivno utječu na produljenje života
kod vinskih mušica tako da su doveli do smanjenog oksidativnog oštećenja. Jedno
od istraživanja kod kojeg je došlo do smanjenja oksidativnog oštećenja kod vinske
mušice je bilo prilikom primjene nektarine (31). Pokazali su da je kod skupine s
dodatkom 4% nektarine došlo do značajnog smanjenja 4-HNE proteina,
7
biomarkera lipidne oksidacije, u odnosu na skupinu koja je primala regularnu
hranu.
Pretpostavlja se da su polifenoli jedne od značajnih komponenta odgovorne za
pozitivne učinke mediteranske prehrane. To su komponente koje se mogu naći u
voću, povrću, žitaricama i napitcima (32). Oni su sekundarni metaboliti biljaka i
njihov pozitivni učinak je vidljiv u zaštiti od ultraljubičastog zračenja ili zaštiti od
različitih patogena. Epidemiološke studije su pokazale da se dugotrajna
konzumacija hrane bogate s polifenolima može povezati kao zaštitni faktor od
razvoja raka, kardiovaskularnih bolesti, dijabetesa, osteoporoze i
neurodegenerativnih bolesti (33).
Jedan od polifenola čiji je utjecaj na usporavanje starenja opsežno istraživan u
različitim organizmima je resveratrol. Njegova meta je sirtuin koji spada u klasu
nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) deacetilaza (34). Identificirano je 7 sirtuina
kod sisavaca, a najpoznatiji je SIRT-1 za kojega se smatra da utječe na zdravlje i
produženje životnog vijeka. Metabolički putevi pod regulacijom sirtuina su
glukoneogeneza i glikoliza u jetri, metabolizam masti te preživljavanje stanica.
Ovisno o uvjetima, sirtuini aktiviraju ili suprimiraju transkripcijske faktore iz
skupine forkhead O (FOXO). FOXO skupina potom aktivira ili suprimira specifične
gene koji mogu dovesti do smanjenja apoptoze, povećanja antioksidativnih
enzima, DNA zaštite, različitih protuupalnih procesa te u konačnici pokreću
mehanizme koji promoviraju zaštitu stanice i cjelokupnog organizma (34). Prvi
pozitivni učinci zabilježeni su na životnom vijeku Saccharomyces cereviseae kod
kojega je resveratrol povećao prosječni životni vijek za 70% u usporedbi s
netretiranom skupinom (35). Nakon njega pokazano je da resveratrol može
produžiti prosječni životni vijek približno za 20% kod organizama kao što su
Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans (36). Kod nematoda i vinske
mušice resveratrol je imao učinak na proteine Sir2 i SIR-2.1 koji su homologi SIRT-
1 u sisavaca.
Kod Drosophile vrlo pozitivne učinke pokazali su polifenoli iz jabuke (25).
Istraživao se utjecaj jabučnih polifenola na životni vijek vinskih mušica te njihova
interakcija s proteinima koji su prethodno bili povezani s utjecajem starenja, kao
što su: superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), gen methuselah (MTH),
Rpn11 i podjedinice III i VIb citokrom c oksidaze. Ekstrakt jabučnih polifenola koji
je sadržavao: florentin, proantocijanidin, epikatehin, katehin, ruin i druge
8
proanticijanidine i fenole produžio je životni vijek za 10%. Eksperimentalni testovi
u kojima se koristio parakvat i H2O2 pokazali su da su jabučni polifenoli produžili
vrijeme preživljenja samo za divlje tipove mušica soja Oregon R dok kod mutanata
SODn108 i Catn1 kojima je gen za SOD i CAT izbačen nije došlo do produženog
preživljenja što upućuje na interakciju polifenola s genima za SOD i CAT. Jabučni
polifenoli su pozitivni utjecali na preživljenje i sposobnost okomitog penjanja u
mušica koje su bile kronično izložene parakvatu. Pozitivni učinci jabučnih polifenola
se povezuju s njihovim djelovanjem na proteine koji su povezani sa starenjem.
1.4.1. Istraživanja s kvercetinom
Kvercetin je jedan od poznatijih flavonola u prehrani te je bio tema mnogih in vitro
istraživanja. U istraživanju sa stanicama Saccharomyces cereviseae kvercetin je
pokazao veću otpornost stanica na H2O2 (37). Smanjile su se razine ROS-a,
smanjena je oksidacija glutationa te je kvercetin spriječio karbonilaciju proteina i
peroksidaciju lipida.
Pošto kvercetin ima antioksidativne učinke smatralo se da bi mogao imati i
neuroprotektivne učinke. Jedna od studija istraživala je da li kvercetin može
povećati nivo paraoksonaze 2 (PON2), enzima bitnog za zaštitu od
neurotoksičnosti uzrokovane oksidativnim stresom (38). Istraživanje je pokazalo
da kvercetin povećava ekspresiju PON2 enzima u mišjim astrocitima striatuma (te
stanice su odabrane zbog svoje najveće ekspresije PON2 u regijama mozga) te u
neuronima striatuma.
Pozitivan učinak kvercetina pokazan je i u model organizmu Caenorhabditis
elegans (39). Kvercetin je reducirao akumulaciju lipofusicna (pigment starenja) za
40% te je produžio životni vijek za 15%. Kvercetin je također smanjio akumulaciju
ROS-a pod uvjetima toplinskog stresa za 25-35%. U našem istraživanju kvercetin
je kod vinske mušice također pokazao pozitivne učinke na produžetak životnog
vijeka.
1.4.2. Istraživanja s tirosolom
Ekstra djevičansko maslinovo ulje je centralni sastojak u Mediteranskoj prehrani
(40). Svoje pozitivne efekte na zdravlje duguje različitim antioksidansima,
posebice polifenolima koji se nalaze u njemu. Za tirosol i hidroksitirosol se smatra
da najviše pridonose okusu, stabilnosti i nutricionalnoj važnosti ulja. Pokazano je
9
da tirosol značajno povećava maksimalno preživljenje s 18.67 na 20.68 dana kod
nematoda Caenorhabditis elegans (41). Otpornost na oksidativni stres mjerena je
tako da su nematodi bili izloženi parakvatu. U eksperimentu je pokazano da
tretman s tirosolom značajno povećava preživljenje u prisutnosti 4mM parakvata.
Test somatskih mutacija i rekombinacija (eng. SMART, Somatic Mutation and
Recombination Test) na Drosophili melanogaster je pokazao antigenotoksičnu
aktivnost tirosola na DNA oksidativno oštećenje generirano vodikovim peroksidom
(42). Pokazano je da tirosol pri većoj koncentraciji značajno smanjuje stopu
genotoksičnosti te inhibicijsku stopu vodikovog peroksida blizu 66% u usporedbi
kontrolama. U našem istraživanju ispitali smo dodatnim testovima pozitivne učinke
tirosola. Također smo koristili i cirkadijalne mutante pri testiranju.
U našim istraživanjima na vinskim mušicama korišteni su kvercetin i tirosol jer su
do sada pokazali pozitivne učinke na druge model organizme. Naše istraživanje je
temeljitije ispitalo učinke ovih polifenola pomoću nekoliko bihevioralnih i
biokemijskih testova koji do sada nisu bili rađeni.
1.5. Testovi za mjerenje starenja kod Drosophile melanogaster
Postoji nekoliko metoda pomoću kojih se istražuje starenje korištenjem vinske
mušice kao model organizma (43). Te metode mogu biti različita fiziološka,
biokemijska i bihevioralna testiranja. Fiziološki testovi se baziraju na mjerenju
otpornosti mušica na različite stresove (npr. oksidativni stresovi, izgladnjivanje,
isušivanje). Otpornost na oksidativni stres se najčešće mjeri tako da se mušice
hrane s parakvatom, spojem koji dovodi do nastanka različitih reaktivnih kisikovih
vrsta. Test izgladnjivanja se izvodi tako da se mjeri preživljenje mušica koje
primaju samo vodu. Mjerenje otpornosti na izgladnjivanje je procjena mogućnosti
mušica da se nose s manjkom energije (pojava koja se javlja u stvarnim okolišnim
uvjetima). Životni vijek i odgovor na stres su usko povezani te se smatra da su
dugo živuće populacije puno otpornije na stresove.
Najbolji indikatori starenja su testovi koji mjere fizičku sposobnost organizma,
najčešće lokomotorna aktivnost koja starenjem pada (43). Kod Drosophile
negativna geotaksija je jedan od testova s kojim je moguće vrlo brzo i jednostavno
dobiti rezultat o sposobnosti okomitog penjanja mušica. Pokazano je da starenjem
brzina njihove sposobnosti za penjanjem opada (44).
10
Druga visokoprotočna metoda za mjerenje aktivnosti u Drosophile je korištenje
uređaja Drosophila Activity Monitoring System (DAMS) (43). Aktivnost se u ovim
monitorima mjeri kao frekvencija koja je zabilježena svaki put kada mušica pređe
preko infracrvene zrake koja prolazi preko sredine staklenog štapića u kojemu se
nalazi mušica. Ovakvi podaci se potom mogu koristiti za analiziranje širokog
raspona ponašanja kao što su obrasci spavanja i promijene u lokomotornoj
aktivnosti kao posljedica endogenih i egzogenih promjena.
11
2. Cilj rada
Cilj ovog istraživanja je ispitivanje utjecaja polifenola, kvercetina i tirosola, na
mehanizme starenja kod Drosophile i cirkadijalnog mutanta tim01. Polifenoli su
antioksidativne molekule koje se nalaze pretežito u mediteranskoj prehrani te
imaju pozitivne učinke u eliminaciji slobodnih radikala koji utječu na starenje.
Istraživanje se temeljilo na utjecaju polifenola na bihevioralne karakteristike
starenja kao što su lokomotorna aktivnost, spavanje, negativna geotaksija,
otpornost na izgladnjivanje, isušivanje, prosječna težina te dužina preživljenja.
Kako bi bihevioralne rezultate interpretirali u kontekstu biokemijskih mjerili smo:
aktivnost katalaze, aktivnost superoksid dismutaze, ukupnu količinu mono-di-tri
glicerida i reduktivnih šećera te akumulaciju AGE produkta. Cilj ovog istraživanja
bi bio vidjeti da li polifenoli imaju djelovanja na usporavanje mehanizma starenja,
kao npr. povećanje lokomotorne aktivnosti, povećana otpornost na stresove,
povećane aktivnosti antioksidativnih enzima te smanjeno nakupljanje spojeva koji
dovode do oštećenja stanica u organizmu. Također jedan od ciljeva bi bilo veće
razumijevanje u kojim procesima i na koji način djeluju cirkadijalni geni u
procesima starenja te da li polifenoli imaju utjecaja na njih, odnosno na koji način
polifenoli djeluju na organizam u prisutnosti i nedostatku tim01 gena.
12
3. Materijali i metode
3.1. Kemijske komponente i njihove koncentracije
Koristio se stock otopine tirosola koncentracije 1 mM te kvercetina koncentracije
0,1 M. Mušice su tretirane s koncentracijama tirosola 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 µM,
dok su koncentracije kvercetina bile 4,8 mM, 3,2 mM i 0,6 mM. Navedene kemijske
komponente dodavane su u tim koncentracijama u 10 ml obične hrane (voda,
kvasac, agar, šećer, melasa te propionska i nipaginska kiselina koje su sprječavale
nastanak gljivica i plijesni) kroz 2, 4 i 6 tjedna. Kontrolna skupina mušica hranjena
je na običnoj hrani. Mušicama je svaka 2-3 dana mijenjana hrana.
3.2. Soj Drosophile i uzgoj
Korišten je soj Drosophile melanogaster s mutacijom u genu – timeless01, muškog
i ženskog spola. Usporedba je bila s wild type (wt) mušicama Drosophile
melanogaster, iz prethodnih eksperimenata. Mušice su se čuvale u inkubatoru pri
temperaturi od 26°C te vlažnosti 60-70 %.
3.3. Eksperiment aktivnosti i spavanja
Za mjerenje lokomotorne aktivnosti koristio se DAMS (eng. Drosophila Activity
Monitor System). Sistem se sastoji od monitora povezanih s računalom. Svaki
monitor prima 32 mušice. Po jedna mušica se nalazila u staklenom štapiću koji je
s jedne strane imao hranu obloženu voskom, a s druge strane spužvasti čep.
Monitori s muhama su stavljeni u inkubator s izmjenom svjetla i mraka svakih 12
sati tijekom 5 dana. U svakom monitoru nalazi se infracrvena zraka koja prolazi
kroz sredinu štapića. Broj prelazaka preko infracrvene zrake zabilježen je kao
signal u računalu u periodu od 5 minuta. Dobiveni podaci analizirani su u Actogram
J i Excel programu. Dobiveni su podaci o ukupnoj količini aktivnosti (broj prelazaka
tube u jedinici vremena) te ukupnoj dužini spavanja u jedinici vremena. Spavanje
je definirano kao 0 prelazaka tube u 5 minutnim epizodama.
13
Slika 1. Drosophila Activity Monitoring System (DAMS).
Slika preuzeta s: http://www.trikinetics.com/Downloads/Catalog1105.pdf
3.4. Eksperimenti izgladnjivanja i isušivanja
Eksperiment izgladnjivanja proveden je tako da se po jedna mušica nalazila u
staklenom štapiću na kojemu se s jedne strane nalazio 1% agar, a s druge strane
komadić spužvice. Za eksperiment isušivanja po jedna mušica nalazila se u
praznom staklenom štapiću sa spužvastim čepovima. Stakleni štapići nalazili su se
u DAMS monitorima i aktivnost je praćena dok sve mušice nisu umrle. Analizom
podataka utvrđeno je: maksimalno vrijeme preživljenja i broj sati u kojem je 50%
mušica ostalo živo.
3.5. Eksperiment negativne geotaksije
Eksperimentom se mjeri motorička sposobnost penjanja uz okomite stijenke. Dan
prije izvođenja eksperimenta mušice su sortirane pod narkozom u 5 tuba s po 10
mušica. U svakoj tubi nalazilo se 2-3 ml hrane (s ili bez dodatka polifenola). Na
dan izvođenja eksperimenta mušice su iz tuba s hranom prebačene u tube bez
hrane te ih se ostavilo 20-ak minuta na miru da se prilagode. Tube su se potom
stavljale u drveni okvir koji prima 5 tuba. Eksperiment je trajao 5 minuta za svaku
skupinu mušica. Eksperiment se izvodio tako da se lupilo drveni stalak 3 puta o
površinu kako bi sve mušice pale na dno tube i nakon 5 sekundi tube su se slikale
pomoću digitalne kamere spojene na računalo. Nakon 55 sekundi postupak je
ponovljen. Proces se ponavljao 5 puta (jedno mjerenje svaku minutu, 5 vrijednosti
za svaku tubu). Analizom fotografskih zapisa prebrojio se broj mušica koje su
prešle polovicu tube (visina od 3 cm označena na tubi). Za svaku tubu dobivena
je srednja vrijednost na osnovu 5 ponavljanja o broju mušica koje su prešle sredinu
tube, a izražena je u postotcima.
14
3.6. Eksperiment preživljenja
Mušice su za potrebe eksperimenta čuvane u bocama s po 10 ml hrane (regularna
i hrana s dodatkom polifenola). Za svaku testiranu skupinu bilo je 50 mušica.
Mušice su se čuvale u inkubatoru. Svaka 2-3 dana mijenjana im je hrana.
Eksperiment se pratio dok sve mušice nisu umrle.
3.7. AGE eksperiment
Pet mušica je homogenizirano u 450 µl PBS-a koji je sadržavao 10 mM
EDTANa2x2H2O. Dodano je 100 µL tripsina i uzorci su stavljeni 24 sata u inkubator
na 37°C . Nakon inkubacije uzorci su centrifugirani 20 minuta na 14000 rpm i 4°C.
Za svaki uzorak pipetirani su triplikati po 150 µl u pločicu s 48 jažica. Mjerena je
fluorescencija na uređaju infinite 200Pro pri ekscitacijskoj valnoj duljini od 365 nm
i emisijskoj 440 nm. Podaci o izmjerenim vrijednostima dobiveni su u programu
Tecan i-control.
3.8. Eksperiment mjerenja enzimske aktivnosti katalaze
Enzimski ekstrakti pripremljeni su homogeniziranjem 5 mušica u 800 µl
homogenizacijske otopine koja se sastojala od 0.05 M fosfatnog pufera (pH 6.9)
te 0,1% Triton X-100. Uzorci su centrifugirani 20 min na 14000 rpm i 4°C.
Supernatant je razrijeđen s homogenizacijskom otopinom u omjeru 1:2. U
mikrotitarsku pločicu s 48 jažica pipetirano je 450 µl substratne otopine koja je
sadržavala 0.05 M fosfatni pufer (pH 6.9) i 15 mM H2O2. Rekcije su mjerene nakon
dodavanja 10, 15, 20 i 25 µl pripremljenih uzoraka. Mjereno je smanjenje optičke
gustoće pri 240 nm tokom 5 minuta na uređaju infinite 2000Pro. Podaci o
izmjerenim vrijednostima dobiveni su u programu Tecan i-control.
3.9. Eksperiment mjerenja enzimske aktivnosti superoksid dismutaze
Enzimski ekstrakti pripremljeni su na isti način kao u testu enzimske aktivnosti
katalaze. U mikrotitarsku pločicu s 48 jažica pipetirano je 450 µl reakcijske otopine
koja je sadržavala 20 mM fosfatni pufer (pH 10), 0.8 mM TEMED, 0.8 mM EDTA i
0.5 mM kvercetina. Reakcije su mjerene nakon dodavanja 10, 15, 20 i 25 µl
pripremljenih uzoraka. Mjerena je promjena u optičkoj gustoći pri valnoj duljini od
406 nm na uređaju infinite 2000Pro. Podaci o izmjerenim vrijednostima dobiveni
su u programu Tecan i-control.
15
3.10. Eksperiment mjerenja šećera
Jedna mušica homogenizirana je u 50 µl PBS-a i 450 µl otopine kloroforma i
metanola u omjeru 1:2. Uzorci su centrifugirani 20 min pri 14000 rpm i 4°C.
Pipetirano je 200 µl supernatanta, 10 µl 25 N HCl i 600 µl Benedictovog reagensa
te kuhano 20 min. Osim uzoraka pripremljene su i kalibracijske otopine sa stockom
glukoze u 0,1 mg/ml.
Kalibracijske otopine:
C1= 0 µg/ml = 600 µL Benedicta + 100 µL HCl
C2= 5 µg/ml = 565 µl Benedicta + 100 µl HCL + 35 µl glukoze
C3= 10 µg/ml = 530 µl Benedicta + 100 µL HCl + 70 µL glukoze
C4= 15 µg/ml = 495 µl Benedicta + 100 µl HCl + 105 µl glukoze
C5= 20 µg/ml = 460 µL Benedicta + 100 µL HCl + 140 µl glukoze
Uzorci i kalibracijske otopine centrifugirani su 20 min pri 14000 rpm i 14 °C. U
mikrotitarsku pločicu s 48 jažica pipetirano je u triplikatu 150 µl od uzoraka i 150
µl kalibracijske otopine. Mjerena je apsorbancija pri valnoj duljini 735 nm na
uređaju infinite 2000Pro. Podaci o izmjerenim vrijednostima dobiveni su u
programu Tecan i-control.
3.11. Eksperiment mjerenja lipida
Za ovaj eksperiment korišteni su isti uzorci koji su bili pripremljeni i za mjerenje
šećera. U staklene epruvetice pipetirano je 200 µL uzorka i 50 µL 20% NaOH te je
kuhano 20 minuta. Potom je pipetirano 600 µL destilirane vode i ostavljeno da se
ohladi. Paralelno su pripremljene i kalibracijske otopine sa stock otopinom 400 mM
glicerola.
Kalibracijske otopine:
C1= 0 mM = 800 µl H2O + 50 µL NaOH
C2= 5 mM = 789 µL H2O + 50 µL NaOH + 10,6 µl glicerola
C3= 10 mM = 779 µL H2O + 50 µl NaOH + 21 µL glicerola
C4= 50 mM = 694 µl H2O + 50 µL NaOH + 106 µL glicerola
C5= 100 mM= 587 µL H2O + 50 µl NaOH + 213 µL glicerola
16
Uzorci i kalibracijske otopine centrifugirani su 20 min pri 14000 rpm i 14 °C.
Pipetirani su u mikrotitarsku pločicu s 48 jažica triplikati po 150 µl od uzoraka i
150 µl kalibracijskih otopina. Mjerena je apsorbancija pri valnoj duljini 230 nm na
uređaju infinite 2000Pro. Podaci o izmjerenim vrijednostima dobiveni su u
programu Tecan i-control.
3.12. Statistička obrada rezultata
Rezultati su statistički obrađeni u programu Statistica 64 verzija 12. Zavisna
varijabla bilo je mjerenje od interesa (aktivnost, spavanje, negativna geotaksija,
izgladnjivanje, isušivanje, preživljenje, enzimatske reakcije) dok su nezavisne
varijable bile: spol, starost, genotip i koncentracije polifenola. Kao statistički
značajne vrijednosti prihvaćene su one čiji je p bio manji od 0,05.
17
4. Rezultati
4.1. Utjecaj tirosola i kvercetina na dužinu preživljenja mušica s tim
mutacijom
Kako bi ispitali da li polifenoli imaju utjecaj na maksimalno preživljenje mjerili smo
dužinu preživljenja mušica tretiranih s tirosolom (TYR) i kvercetinom (QUE) u
usporedbi s mušicama hranjenih na običnoj hrani. Na osnovu prethodnih rezultata
naša hipoteza bila je da će TYR i QUE utjecati na dužinu života (45,46).
Pokazano je da nisu sve koncentracije QUE i TYR imale pozitivan učinak te je
uočena razlika u djelovanju koncentracija polifenola među spolovima. Najveći
pozitivan utjecaj na produljenje životnog vijeka kod tim mužjaka imale su
koncentracije od QUE 3,2 mM te TYR 17,6 µM (Slika 1. a, b). Kod tim ženki samo
je TYR 12,45 µM produžio životni vijek (Slika 1. d). Muške mušice tretirane s QUE
koncentracije 3,2 mM te TYR koncentracije 17,6 µM preživjele su 84 dana u
usporedbi s kontrolnom skupinom čije je preživljenje bilo 60 dana. Smanjeno
preživljenje kod mužjaka uočeno je kod koncentracije od QUE 4,8 mM (Slika 1. a,
b). Maksimalno preživljenje ženskih mušica tretiranih s TYR 12,45 µM je bilo 84
dana nasuprot kontrole čije je maksimalno preživljenje bilo 71 dan. Kod ženki
koncentracije QUE 3,2 i 4,8 mM te TYR 7,6 i 17,6 µM skratile su životni vijek (Slika
1. c, d). Statističkom obradom podataka, korištenjem generalnog linearnog
modela, pokazano je da ne postoji statistički značajna razlika između spolova za
QUE (F (1, 3)=0.04, p=0.862, SE=3.31) i TYR (F (1, 3)=0.00, p=1, SE=5.22).
Također ne postoji statistička značajnost među koncentracijama QUE (F (3,
3)=1,45, p=0.384, SE=5.73) i TYR (F (3, 3)=0.34, p=0.799, SE=9.05). Ovi
rezultati upućuju na zaključak da postoji optimalna doza koja pozitivno utječe na
produljenje života kod Drosophile. Produljenje preživljenja QUE i TYR je spolno
ovisno te je tako kod ženki samo jedna koncentracija TYR izazvala produljenje
životnog vijeka. Interesantno, ženke pokazuju veću osjetljivost na negativne
efekte polifenola radi kojih dolazi do skraćenja životnog vijeka. U budućnosti će
biti potrebno ispitati dodatne koncentracije kako bi se ustanovio optimalni
odgovor.
18
Dužina
preživljenja
QUE TYR
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 0.04 0.862 3.31 1 0.00 1 5.22
Koncentracija 3 1.45 0.384 5.73 3 0.34 0.799 9.05
Tablica 1. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
1. a
1. b
0%
25%
50%
75%
100%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
pre
živ
ljenje
(%
)
Dani
tim01 mužjaci, kvercetin
Kontrola
QUE 0,6 mM
QUE 3,2 mM
QUE 4,8 mM
0%
25%
50%
75%
100%
0 10 20 30 40 50 60 70 80
pre
živ
ljenje
(%
)
Dani
tim01 mužjaci, tirosol
Kontrola
TYR 7,6 µM
TYR 12,45 µM
TYR 17,6 µM
19
1. c
1. d
Slika 1. Spolno specifičan utjecaj QUE i TYR na preživljenje Drosophile. U
eksperimentu su korišteni mužjaci (a i b) i ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan
kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6
µM, 12,45 µM i 17,6 µM (n=50 za svaku skupinu). Kontrolna skupina primala je običnu
hranu (n=50). Svaka 2-3 dana mušice su prebačene na podlogu sa svježom hranom.
4.2. Utjecaj polifenola na negativnu geotaksiju divljeg tipa (wt) i tim
mušica
Negativna geotaksija je motorička sposobnost penjanja mušica uz okomitu
stijenku tubice, a mjeri se testom koji mjeri brzinu penjanja u ograničenom
vremenskom periodu. Sposobnost penjanja slabi kod starih mušica i koristi se kao
indikator funkcionalnosti motoričkog sistema. Sposobnost penjanja je u korelaciji
0%
25%
50%
75%
100%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
pre
živ
ljenje
(%
)
Dani
tim01 ženke, kvercetin
Kontrola
QUE 0,6 mM
QUE 3,2 mM
QUE 4,8 mM
0%
25%
50%
75%
100%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
pre
živ
ljenje
(%
)
Dani
tim01 ženke, tirosol
Kontrola
TYR 7,6 µM
TYR 12,45 µM
TYR 17,6 µM
20
s neurodegenerativnim promjenama i starenjem. U ovim testovima željeli smo
vidjeti da li polifenoli usporavaju slabljenje negativne geotaksije kao posljedice
starenja.
Starenjem opada penjanje kod wt i tim mušica oba spola te su polifenoli pokazali
pozitivan učinak, no ne i značajan. Rezultati pokazuju da kod wt i tim mužjaka
starenjem dolazi do opadanja sposobnosti okomitog penjanja kod kontrolnih
skupina, dok tretman s tirosolom i kvercetinom taj proces usporava (Slika 2. a, b).
Kod kontrola ženki također dolazi do opadanja sposobnosti penjanja starenjem,
dok su veći pozitivni efekt uočeni za tretman kvercetinom u odnosu na tirosol (Slika
2. c, d). Statistička analiza, generalni linearni model, je pokazala statistički
značajnu razliku u negativnoj geotaksiji među starosti za QUE (F (2, 28)=33.49,
p>0,001, SE=2.13) i TYR (F (2, 28)=33.49, p>0,001, SE=1.4), odnosno
sposobnosti za penjanjem opadaju od 2. do 6. tjedna starosti. Statističkom
analizom, generalnim linearnim modelom, utvrđeno je da postoji statistički
značajna razlika među spolom za mušice tretirane TYR (F (1, 28)= 6.42, p=0.017,
SE=1.51) dok za tretirane s QUE ne postoji statistički značajna razlika (F (1,
28)=0.58, p=0.453, SE=1.84). Pokazano je da se muške mušice tretirane s
tirosolom bolje penju u odnosu na ženke, dok za tretirane s kvercetinom to nije
slučaj. Generalnim linearnim modelom utvrđeno je da postoji statistički značajna
razlika genotipova za QUE (F (1, 28)=6.05, p=0.02, SE=1.84) i TYR (F (1,
28)=4.58, p=0.04, SE=1.51), odnosno pokazano je da je tretman bolje utjecao
na tim te su one imale veću sposobnost penjanja u odnosu na wt. Generalni linearni
model nije pokazao statistički značajne razlike za negativnu geotaksiju među
koncentracijama QUE (F (3, 28)= 2.18, p=0.113, SE=2.61) i TYR (F(3, 28)=2.00,
p=0.136, SE=2.13), odnosno koncentracije nisu imale značajan utjecaj na
sposobnost penjanja. Pozitivan učinak polifenola se uočava kod 6 tjedna starih
mužjaka i ženki što bi se moglo objasniti da polifenoli bolje djeluju u eliminaciji
ROS-ova koji se nakupljaju starenjem. U rezultatima maksimalnog preživljenja
smo pokazali da su koncentracije QUE i TYR spolno ovisne što se primjećuje i kod
negativne geotaksije jer koncentracije tirosola imaju manje efekte kod ženki nego
kod mužjaka.
QUE TYR
21
Negativna
geotaksija
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 0.58 0.453 1.84 1 6.42 0.017 1.51
Koncentracija 3 2.18 0.113 2.61 3 2.00 0.136 2.13
Genotip 1 6.05 0.020 1.84 1 4.58 0.040 1.51
Starost 2 33.49 >0.001 2.13 2 33.49 >0.001 1.74
Tablica 2. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
2. a
2. b
2. c
0
10
20
30
40
50
60
70
wt tim01 wt tim01 wt tim01 wt tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
% m
ušic
a iznad c
rte (
3 c
m,
5sek)
Negativna geotaksija - mužjaci QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0
10
20
30
40
50
60
70
% m
ušic
a iznad c
rte (
3 c
m,
5sek)
Negativna geotaksija - mužjaci TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
22
2. d
Slika 2. Pozitivan utjecaj polifenola na negativnu geotaksiju. U eksperimentu su
korišteni mužjaci (a i b) te ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan kvercetin (QUE)
koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i
17,6 µM (n=50 za svaku skupinu). Kontrolna skupina primala je običnu hranu (n=50).
Mjerenja su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Svaki eksperiment je imao 5
ponavljanja. Rezultati su dobiveni kao prosječna vrijednost broja mušica koje su se popele
preko polovice tubice (3 cm u 5 sekundi).
4.3. Polifenolni utjecaj na ukupnu aktivnost tim mušica
Starenjem dolazi do opadanja lokomotorne aktivnosti. Kako bi vidjeli da li polifenoli
imaju učinak na usporavanje indikatora starenja, pratili smo pomoću DAMS-a
aktivnost tim mušica tretiranih kvercetinom i tirosolom te smo ih uspoređivali s
0
10
20
30
40
50
60
tim01 tim01 tim01 tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
% m
ušic
a iznad c
rte (
3 c
m, 5
sek)
Negativna geotaksija - ženke QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0
10
20
30
40
50
60
tim01 tim01 tim01 tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
% m
ušic
a iznad c
rte (
3 c
m, 5
sek)
Negativna geotaksija - ženke TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
23
netretiranim kontrolnim skupinama. Željeli smo ustanoviti hoće li polifenoli
povećati lokomotorne aktivnosti kod starijih mušica u odnosnu na kontrolne
skupine.
Rezultati pokazuju da starenjem opada lokomotorna aktivnost kod mužjaka i ženki
te je efekt polifenola uočen kod 6 tjedna starih mušica. Statistička obrada
rezultata, generalnim linearnim modelom, pokazala je da postoji statistička
značajnost za ukupnu aktivnost među spolovima kod mušica tretiranih QUE (F (1,
17)=31.97, p>0.001, SE=27.15) i TYR (F (1, 17)=27.64, p>0.001, SE=27.91),
odnosno pokazano je da su ženke aktivnije od mužjaka. Statistička značajnost
utvrđena je generalnim linearnim modelom za ukupnu aktivnost i kod starosti za
QUE (F (2, 17)=64.85, p>0.001, SE=38.40) i TYR (F (2, 17)=40.23, p>0.001,
SE=39.47), odnosno pokazano je da se aktivnost smanjuje od 2. do 6. tjedna
starenja. Između koncentracija QUE (F (3,17)=1.45, p=0.263, SE=47.03) i TYR
(F (3, 17)=2.10, p=0.138, SE=4.34) nije zabilježena statistička značajnost
generalnim linearnim modelom. Uočen je spolno ovisan efekt te su tako oba
polifenola pokazala povećanje ukupne lokomotorne aktivnosti kod mužjaka, dok je
kod ženki samo tirosol povećao ukupnu lokomotornu aktivnost. Kako je do
najvećeg pozitivnog djelovanja polifenola došlo kod 6 tjedna starih mušica,
možemo pretpostaviti da polifenoli sudjeluju u mehanizmima ubrzavanja
metabolizma te eliminaciji ROS-a koji se nakuplja starenjem.
Ukupna
aktivnost
QUE TYR
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 31.97 >0.001 27.15 1 27.64 >0.001 27.91
Koncentracija 3 1.45 0.263 47.03 3 2.10 0.138 48.34
Starost 2 64.85 >0.001 38.40 2 40.23 >0.001 39.47
Tablica 3. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
3. a
24
3. b
Slika 3. Pozitivan utjecaj polifenola na aktivnost kod 6 tjedna starih tim01 mušica.
U eksperimentu su korišteni tim01 mužjaci i ženke kojima je u hranu bio dodan kvercetin
(QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45
µM i 17,6 µM (n=16 za svaku skupinu). Kontrola je primala običnu hranu (n=16). Mjerenja
su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Eksperiment se provodio 5 dana u DAMS-u, a
podaci o aktivnosti prikupljani su u 5 minutnim epizodama. Rezultati prikazuju ukupnu
aktivnost mušica u 24 sata (ukupan broj prelazaka tube u 5 min tijekom 24 sata, prosjek
za 5 dana).
4.4. Utjecaj polifenola na količinu spavanja kod tim mušica
Starenjem dolazi do fragmentacije spavanja kod sisavaca i mušica, no podaci o
utjecaju starenja na ukupnu količinu spavanja nisu u suglasnosti. Iz podataka o
aktivnosti, derivirali smo podatak o ukupnoj količini spavanja tijekom 24 sata.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Ukupna a
ktivnost
kro
z 2
4 h
Ukupna aktivnost - mužjaci i ženke QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Ukupna a
ktivnost
kro
z 2
4 h
Ukupna aktivnost - mužjaci i ženke TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
25
Interesiralo nas je da li starenje utječe na promjenu količine spavanja kod
netretiranih mušica te da li polifenoli mijenjaju taj utjecaj.
Rezultati pokazuju postupni porast količine spavanja starenjem (kontrole mužjaka
i ženki), dok TYR smanjuje količinu spavanja kod 6 tjedna starih mužjaka (Slika 4.
b). Također primijećena je spolna razlika u količini spavanja, što potvrđuje nalaze
iz literature. Vrlo velika razlika u količini spavanja primijećena je u 2. tjednu, ali
nije moguće sa sigurnošću reći da li je to posljedica starenja ili artefakta u našem
mjerenju. Generalni linearni model pokazuje da postoji statistička značajna razlika
u spolu kod mušica tretiranih s QUE (F (1, 17)=15.82, p>0.001, SE=48.53) i TYR
(F (1, 17)=13.84, p=0.002, SE=32.75), odnosno kao i u prethodnim rezultatima
mužjaci i ženke se razlikuju u odgovor na polifenole te je tako pokazano da ženke
manje spavaju u usporedbi s mužjacima. Statistički značajna razlika u ukupnoj
količini spavanja je viđena generalnim linearnim modelom kod starenja za skupine
tretirane s QUE (F (2, 17)=3.67, p=0.05, SE=68.63) i TYR (F (2, 17)= 5.74,
p=0.012, SE=46.32), odnosno za oba polifenola viđeno je da količina spavanja
raste od 2. do 6. tjedna. Ne postoji statistički značajna razlika generalnim
linearnim modelom između koncentracija QUE (F (3, 17)=0.31, p=0.814,
SE=84.05) i TYR (F (3, 17)=0.73, p=0.548, SE=56.37). Rezultati pokazuju da
mužjaci spavaju više od ženki, stoga je zanimljiv rezultat kod 6 tjedna starih
mužjaka gdje je tirosol smanjio količinu spavanja na razinu količine spavanja ženki
(Slika 4. a, b). Ovaj rezultat pokazuje da su polifenoli aktivno djelovali kod
mužjaka, dok kod ženki nisu.
Ukupna
količina
spavanja
QUE TYR
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 15.82 >0.001 48.53 1 13.84 0.002 32.75
Koncentracija 3 0.31 0.814 84.05 3 0.73 0.548 56.37
Starost 2 3.67 0.050 68.63 2 5.74 0.012 46.32
Tablica 4. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
4. a
26
4. b
Slika 4. Tirosol smanjuje ukupnu količinu spavanja kod 6 tjedna starih mužjaka.
U eksperimentu su korišteni mužjaci i ženke kojima je u hranu bio dodan kvercetin (QUE)
koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i
17,6 (n=16 za svaku skupinu). Kontrola je primala običnu hranu (n=16). Mjerenja su
rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Odustvo kretanja mušica u periodu od 5 minuta
kroz 24 sata je zabilježeno kao spavanje. Eksperiment se provodio 5 dana u DAMS-u
4.5. Učinak polifenola kod tim mušica prilikom stresa izgladnjivanja
Izgladnjivanje je jedan od načina za izazivanje stresa čime se može zaključiti o
otpornosti, odnosno fiziološkom statusu organizma, pa bi starije mušice trebale
biti manje otporne na stres. U ovom eksperimentu mušice su bile opskrbljene samo
s vodom. Rezultati ovih ispitivanja trebali bi nam pokazati da li polifenoli utječu na
otpornost fiziološkom stresu, odnosno da li mušice tretirane s polifenolom duže
žive u odnosu na kontrole (netretirane). Na slici 5, radi preglednosti prikazana je
0
200
400
600
800
1000
1200
tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Ukupna k
oličin
a s
pavanja
kro
z
24 h
Ukupna količina spavanja - mužjaci i ženke QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0
200
400
600
800
1000
1200
tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Ukupna k
oličin
a s
pavanja
kro
z
24 h
Ukupna količina spavanja - mužjaci i ženke TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
27
samo jedna koncentracija QUE i TYR. Radi eksperimentalne pogreške nedostaju
rezultati za kontrolu 6 tjedna starih mužjaka.
Rezultati pokazuju da starenjem dolazi do smanjivanja otpornosti na stres
izgladnjivanja (maksimalno preživljenje 2 tjedna ženke=48 sati, maksimalno
preživljenje 6 tjedna ženke=19 sati). Kod netretiranih mušica uočljiva je spolna
razlika u preživljenju u svim starosnim grupama koja se može djelomično objasniti
većom tjelesnom masom ženki. Kao i u prethodnim eksperimentima neke
koncentracije QUE i TYR nisu imale pozitivne učinke i ponovno je vidljiva razlika u
djelovanju polifenola među spolovima. Kod mužjaka tirosol ima pozitivnije učinke
u odnosu na kvercetin. Kod ženki kvercetin i tirosol imaju podjednake učinke. Kod
ženki pozitivni učinci su zabilježeni tek kod 6 tjedna starih mušica, dok su kod
mužjaka uočene već kod 2 tjedna starih. Statistička analiza, generalni linearni
model, je pokazala statističku značajnost kod spola za mušice tretirane QUE (F (1,
17)=6.55, p=0.02, SE=1.32) dok za TYR ne postoji statistička značajnost (F (1,
17)=1.71, p=0.208, SE=1.81), odnosno koncentracije QUE su bolje djelovale kod
ženki i omogućile duže preživljenje. Generalni linearni model je pokazao da postoji
statistički značajna razlika kod starosti za QUE (F (2, 17)=48.32, p>0.001,
SE=1.87) i TYR (F (2, 17)=19.76, p>0.001, SE=2.57), što znači da se preživljenje
smanjuje od 2. tjedna do 6. tjedna. Generalnim linearnim modelom ne postoji
statistička značajnost među koncentracijama QUE (F (3, 17)=0.34, p=0.800,
SE=2.28) i TYR (F (3, 17)=0.37, p=0.775, SE=3.14). Ovi rezultati upućuju na
zaključak da postoji razlika između spola u djelovanju QUE i TYR jer nisu iste
koncentracije djelotvorne kod mužjaka i ženki. Spolno specifičan odgovor pokazan
je i u dobi kada polifenoli imaju najveći učinak. Kako bi potvrdili ove rezultate,
proveli smo naredni eksperiment o utjecaju polifenola na preživljavanje prilikom
stresa isušivanja.
Izgladnjivanje
maksimalno
QUE TYR
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 6.55 0.020 1.32 1 1.71 0.208 1.81
Koncentracija 3 0.34 0.800 2.28 3 0.37 0.775 3.14
28
Starost 2 48.23 >0.001 1.87 2 19.76 >0.001 2.57
Tablica 5. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
tim01, MUŽJACI
IZGLADNJIVANJE
tim01, ŽENKE
IZGLADNJIVANJE
2 t
jedna s
tare
4 t
jedna s
tare
0%
50%
100%
0 10 20 30 40 50 60
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 0,6 mM TYR 7,6 µM
0%
50%
100%
0 10 20 30 40 50%
živ
ih m
ušic
aSati
Kontrola QUE 3,2 mM TYR 12,45 uM
0%
50%
100%
0 10 20 30 40 50 60
% ž
ivih
mušic
a
SatiKontrola QUE 3,2 mM TYR 17,6 µM
0%
50%
100%
0 10 20 30 40 50
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 4,8 mM TYR 12,45 µM
29
6 t
jedna s
tare
Slika 5. Spolna ovisnost između koncetracija polifenola prilikom stresa
izgladnjivanja . U eksperimentu su korišteni mužjaci (lijevi stupac) i ženke (desni stupac)
kojima je u hranu dodan kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol
(TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 (n=16). Kontrola je primala običnu hranu
(n=16). Mjerenja su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Aktivnost mušica praćena
je u DAMS-u do uginuća.
4.6. Učinak polifenola kod tim mušica prilikom stresa isušivanja
Isušivanje je test koji ispituje kako se mušice nose sa stresom u toku starenja. U
ovom testu mušica nije opskrbljena s vodom i hranom. Na slici 6 prikazani su
podaci samo za kontrolu te po jednu koncentraciju QUE i TYR radi preglednosti.
Radi eksperimentalne pogreške nedostaju rezultati za kontrolu 6 tjedna starih
mužjaka. Na temelju prethodnih rezultata dobivenih iz eksperimenta
izgladnjivanjem naša hipoteza je bila da će dobiveni rezultati u ovom eksperimentu
biti slični.
Kod netretiranih mušica rezultati pokazuju da starenje ima manji utjecaj na
preživljenje isušivanjem, nego prethodno izgladnjivanjem. Unatoč razlikama u
tjelesnoj masi između mužjaka i ženki, kod netretiranih mušica ne postoji značajna
razlika među spolovima ili kao posljedica starenja. Međutim, kao i u prethodnim
rezultatima i uočili smo spolnu razliku djelovanja polifenola koja je bila
najizraženija kod 4 tjedna starih ženki gdje je zabilježen pozitivan učinak
koncentracije QUE 4,8 mM. Kod 6 tjedna starih ženki zabilježen je negativni utjecaj
koncentracija QUE i TYR. Statistička analiza, generalni linearni model, pokazuje
značajnu razliku kod starosti za QUE (F (2, 17)=6.34, p=0.009, SE=1.39) i TYR (F
0%
50%
100%
0 10 20 30 40 50 60
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 0,6 mM TYR 12,45 uM
0%
50%
100%
0 10 20 30 40 50
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 4,8 mM TYR 17,6 µM
30
(2, 17)=10.18, p=0.001, SE=1.31), odnosno za oba polifenola je vidljivo
smanjenje preživljenja od 2. tjedna do 6. tjedna starenja. Generalnim linearnim
modelom ne postoji statistički značajna razlika za spol kod koncentracija QUE (F
(1, 17)=0.72, p=0.409, SE=0.99) i TYR (F (1, 17)=1.60, p=0.223, SE=0.92) niti
između koncentracija QUE (F (3, 17)=0.48, p=0.700, SE=1.17) i TYR (F (3,
17)=1.12, p=0.367, SE=1.6). Ovi rezultati ukazuju na to da postoje koncentracije
kvercetina i tirosola koje imaju pozitivne učinke i omogućuju Drosophili da bude
duže otporna na fiziološki stres.
Isušivanje
maksimalno
QUE TYR
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 0.72 0.409 0.99 1 1.60 0.223 0.92
Koncentracija 3 0.48 0.700 1.17 3 1.12 0.367 1.60
Starost 2 6.34 0.009 1.39 2 10.18 0.001 1.31
Tablica 6. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
tim01, MUŽJACI ISUŠIVANJE tim01, ŽENKE ISUŠIVANJE
2 t
jedna s
tare
0%
50%
100%
0 10 20 30
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 0,6 mM TYR 12,45 µM
0%
50%
100%
0 10 20 30
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 3,2 mM TYR 7,6 µM
31
4 t
jedna s
tare
6 t
jedna s
tare
Slika 6. Spolna ovisnost na otpornost stresa isušivanja ovisna je o polifenolima.
U eksperimentu su korišteni mužjaci (lijevi stupac) i ženke (desni stupac) kojima je u hranu
dodan kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR)
koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 (n=16). Kontrola je primala običnu hranu (n=16).
Mjerenja su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Eksperiment je izvođen u DAMS-u i
praćen je dok sve mušice nisu uginule.
4.7. Utjecaj polifenola na stvaranje AGE produkata kod wt i tim mušica
AGE je engleska skraćenica za Advanced Glycosylation Endproducts, a to su
produkti nastali biokemijskim procesima iz glukoze. Oni se mogu vezati na
proteine, DNK ili lipide te tako dovesti do njihove nefunkcionalnosti koji onda
utječu na procese starenja. Ovim eksperimentom željeli smo ustanoviti da li
polifenoli utječu na mehanizam nastanka AGE-a i da li s njima možemo usporiti
0%
50%
100%
0 10 20 30
% ž
ivih
mu
šica
Sati
Kontrola QUE 4,8 mM TYR 12,45 µM
0%
50%
100%
0 10 20 30
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 4,8 mM TYR 7,6 µM
0%
50%
100%
0 10 20 30
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 3,2 mM TYR 12,45 µM
0%
50%
100%
0 10 20 30
% ž
ivih
mušic
a
Sati
Kontrola QUE 0,6 mM
TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM
32
procese starenja. Naša hipoteza bi bila da promjena u nastanku AGE produkata
kod mušica tretiranih s polifenolima u odnosu na kontrolu (netretirane) objašnjava
da postoji interakcija polifenola s nastankom AGE produkata.
Starenjem je vidljiv blagi porast nastanka AGE produkata kod wt mužjaka te je
statistička analiza t-testom pokazala da postoji statistički značajna razlika između
4 tjedna starih kontrola i 6 tjedna. Kod tim mužjaka i ženki nije zabilježena
promjena u nastanku AGE produkata starenjem. Generalnim linearnim modelom
pokazana je značajna razlika u nastanku AGE produkata između wt i tim mužjaka
za QUE (F (1, 28)=4.92, p=0.035, SE=0.06) i TYR (F (1, 28)=10.07, p=0.004,
SE=0.06), odnosno pokazano je da kod wt mušica nastaje više AGE produkata.
Rezultati pokazuju da su kvercetin i tirosol smanjili nastanak AGE produkta kod wt
6 tjedna starih mužjaka. Kod 4 tjedna starih tim mužjaka zabilježen je negativan
učinak kvercetina (Slika 7. a, b). Iako neke koncentracije imaju blagi učinak
generalnim linearnim modelom one nisu statistički značajne niti za QUE (F
(3,28)=1.45, p=0.250, SE=0.008) niti za TYR (F (3, 28)=2.91, p=0.052,
SE=0.08), dakle pokazano je da pojedina koncentracija nema značajnog učinka na
smanjenje ukupnog nastanka AGE produkata. Generalnim linearnim modelom
utvrđeno je da ne postoji statistički značajna razlika među spolovima za QUE (F
(1, 28)=0.84, p=0.368, SE=0.06) i TYR (F (1, 28)=0.82, p=0.372, SE=0.06), ne
postoji razlika u nastanku AGE produkata između mužjaka i ženki. Iz rezultata
možemo zaključiti da nastanak AGE produkata raste starenjem kod wt mušica, ali
ne i kod tim. Vidimo da neke koncentracije QUE i TYR imaju pozitivne efekte na
smanjenje količine AGE produkata kod wt dok kod tim mušica nemaju efekte ili su
ti efekti negativni (dovode do povećanja). Kod ženki koncentracije QUE i TYR
uglavnom nisu imale efekte jer količina nastalog AGE ionako nije rasla starenjem,
a zabilježeno je da su neke koncentracije možda i pogoršale, tj. povećale nastanak
AGE produkata.
AGE produkti
QUE TYR
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 0.84 0.368 0.06 1 0.82 0.372 0.06
Koncentracija 3 1.45 0.250 0.08 3 2.91 0.052 0.08
Starost 2 1.55 0.230 0.07 2 2.19 0.131 0.07
33
Genotip 1 4.92 0.035 0.06 1 10.07 0.004 0.06
Tablica 7. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
7.a
7.b
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
wt tim01 wt tim01 wt tim01 wt tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Rela
tivni in
tezitet fluore
scencije
AGE - mužjaci QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
wt tim01 wt tim01 wt tim01 wt tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Rela
tivni in
tezitet fluore
scencije
AGE - mužjaci TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
34
7.c
7.d
Slika 7. Polifenoli utječu na smanjivanje AGE produkata kod wt, ali ne tim mušica.
U eksperimentu su korišteni mužjaci (a i b) te ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan
kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosolom (TYR) koncentracija
7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 (n=5). Kontrola je primala običnu hranu (n=5). Mjerenja su
rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Iz ekstrakta 5 mušica za pojedini uzorak mjerila
se fluorescencija (ekscitacija 365 nm te emisija 440 nm). Tretirana i netretirana skupina
sveukupno je obuhvaćala 8 uzoraka, te je svaki od tih uzoraka mjeren u triplikatu. Grafovi
prikazuju vrijednosti relativnog inteziteta fluorescencije.
4.8. Utjecaj polifenola na katalaznu aktivnost kod wt i tim mušica
Katalaza je bitan enzim koji razlaže molekulu H2O2 na molekulu H20 i O2. Njena
aktivnost starenjem prati oblik zvona, aktivnost raste za 50% prva tri tjedna u
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
tim01 tim01 tim01 tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Rela
tivni in
tezitet fluore
scencije
AGE - ženke QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
tim01 tim01 tim01 tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Rela
tivni in
tezitet fluore
scencije
AGE - ženke TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
35
usporedbi s mladim mušicama, a u kasnijoj životnoj dobi dolazi do naglog pada
(47). Nivo aktivnosti katalaze jako starih mušica je sličan onome kod jako mladih
mušica. Mi smo testirali da li polifenoli nadopunjuju aktivnost katalaze te tako
usporavaju starenje. Naša hipoteza bi bila da promjena u aktivnosti CAT kod
mušica tretiranih s polifenolima u odnosu na kontrolu (netretirane) objašnjava da
postoji interakcija polifenola s aktivnošću katalaze.
Na temelju literaturnog podatka o aktivnosti katalaze, možemo vidjeti da kontrola
wt prati literaturne rezultate. Kod wt kontrola vidljiva je slična aktivnost katalaze
kod 5 dana starih mušica i 6 tjedna starih mušica. Kod tim mužjaka i ženki
zabilježen je porast u aktivnosti katalaze starenjem. Iako se na grafovima mogu
uočiti razlike među starosnim skupinama, one nisu generalnim linearnim modelom
statistički značajne za QUE (F (2, 28)=0.30, p=0.741, SE=0.05) i TYR (F (2,
28)=1.47, p=0.235, SE=0.04), odnosno pokazano je da ne postoji statistički
značajna razlika između aktivnosti katalaze za 2 tjedna i 6 tjedna starosti.
Statistička analiza t-testom dala je iste rezultate, ne postoji statistički značajna
razlika među starosti. Statističkom analizom, generalnim linearnim modelom,
pokazano je da postoji statistički značajna razlika između koncentracija QUE (F (3,
28)=10.58, p>0.001, SE=0.06) i TYR (F (3, 28)= 8.22, p>0.001, SE=0.06),
odnosno koncentracije QUE i TYR značajno su smanjile aktivnost katalaze u
usporedbi s kontrolom. Kod tim mužjaka i ženki 6 tjedna starih vidljivo je da su
sve koncentracije QUE i TYR smanjile aktivnost katalaze. Za wt mušice starih 6
tjedna ne postoji jasan odgovor polifenola na aktivnost katalaze jer su neke
koncentracije QUE i TYR dovele do smanjenja dok su neke povećale aktivnost
katalaze. Iako promjene u aktivnosti katalaze uslijed starenja nisu bile u
očekivanom smjeru, utjecaj polifenola na aktivnost katalaze je vidljiv. Polifenoli su
doveli do smanjenja aktivnosti katalaze. Da bi ispitali utjecaj polifenola na ostale
enzime koji sudjeluju u eliminaciji ROS-a u idućem eksperimentu mjeren je
postotak inhibicije SOD.
Aktivnost
CAT
QUE TYR
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 0.42 0.524 0.05 1 1.47 0.235 0.04
Koncentracija 3 10.58 >0.001 0.06 3 8.22 >0.001 0.06
36
Starost 2 0.30 0.741 0.05 2 0.68 0.513 0.05
Genotip 1 0.92 0.346 0.05 1 0.00 0.993 0.04
Tablica 8. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
8. a
8. b
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
wt tim01 wt tim01 wt tim01 wt tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Pro
mje
na O
D240/m
inuta
/0,1
mg
Aktivnost katalaze - mužjaci QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
wt tim01 wt tim01 wt tim01 wt tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Pro
mje
na O
D240/m
inuta
/0,1
mg
Aktivnost katalaze - mužjaci TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
37
8. c
8. d
Slika 8. Utjecaj polifenola na smanjenje aktivnosti katalaze. U eksperimentu su
korišteni mužjaci (a i b) te ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan kvercetin (QUE)
koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i
17,6 (n=5). Netretirana skupina primala je običnu hranu (n=5). Mjerenja su rađena za
mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Rezultati pokazuju smanjenje optičke gustoće pri valnoj
duljini od 240 nm u vremenskom periodu od 5 minuta. Katalazna aktivnost se prikazuje
kao promjena u optičkoj gustoći pri valnoj duljini od 240 nm (OD240) po minuti po jednom
mikrogramu dobivenog ekstrakta cijele mušice.
4.9. Utjecaj polifenola na postotak inhibicije superoksid dismutaze kod wt
i tim mušica
Jedan od bitnih antioksidativnih enzima je superoksid dismutaza (SOD). Ona je
zaslužna za dismutaciju superoksidnog aniona u vodikov peroksid i molekulu
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
tim01 tim01 tim01 tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
Pro
mje
na O
D240/m
inuta
/0,1
mg
Aktivnost katalaze - ženke QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
tim01 tim01 tim01 tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjednaPro
mje
na O
D240/m
inuta
/0,1
mg
Aktivnost katalaze - ženke TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
38
kisika. U prijašnjim radovima pokazano je kako aktivnost SOD starenjem raste
(47). Iz rezultata o utjecaju polifenola na aktivnosti katalaze, postavlja se pitanje
na koji način polifenol utječu na SOD. Naša hipoteza bi bila da promjena aktivnosti
SOD kod tretiranih u odnosu na netretirane znači da postoji interakcija polifenola
s aktivnošću SOD.
Literaturni rezultati pokazali su da starenjem dolazi do porasta aktivnosti SOD što
se može vidjeti i na rezultatima kontrola za wt. Kod tim mužjaka i ženki taj trend
za kontrole nije jasno uočen. Generalnim linearnim modelom pokazano da ne
postoji statistički značajna razlika između starosti za QUE (F (2, 28)=2.68,
p=0.086, SE=0.97) i TYR (F (2, 28)=0.93, p=0.406, SE=0.88), odnosno iako je
vidljiv trend rasta aktivnosti katalaze kod wt mušica on nije statistički značajan te
se ne mijenja značajno od 2. tjedna do 6. tjedna starosti. Kod 6 tjedna starih wt
mušica uočena je značajna razlika u aktivnosti SOD između kontrola i mušica
tretiranih QUE te je t-testom utvrđeno da je koncentracija QUE 4,8 mM značajno
smanjila aktivnost SOD u usporedbi s kontrolom. Kod 6 tjedna starih tim mužjaka
uočena je razlika u aktivnosti SOD između kontrola i mušica tretiranih QUE. Iako
t-testom nije potvrđena značajnost pri djelovanju QUE kod 6 tjedna starih tim
mužjaka, vidi se da su oni jako povećali aktivnost u usporedbi s kontrolom. Kod
ženki isto uočavamo veće promjene pod utjecajem QUE, ali nisu značajne. Možemo
vidjeti da TYR nije pokazao značajne efekte na wt i tim mužjake te tim ženke.
Generalnim linearnim modelom pokazano je da postoji statistički značajna razlika
između genotipa za QUE (F (1,28)=4.78, p=0.037, SE=0.84) dok za TYR nije
zabilježena statistički značajna razlika (F (1, 28)=0.158, p=0.703, SE=0.76) što
se i uočava kod 6 tjedna starih mušica. T-testom je također potvrđena statistički
značajna razlika u djelovanju kvercetina između 6 tjedna starih wt i tim mušica. Iz
rezultata možemo zaključiti da se starenjem aktivnost SOD ne mijenja značajno,
ali kvercetin pokazuje različite efekte na 6 tjedna starim mužjacima wt i tim
mušica. Tirosol nije pokazao značajnije efekte. Također možemo vidjeti da je
kvercetin slične efekte pokazao između tim mužjaka i ženki.
Aktivnost
SOD
QUE TYR
Stupnjevi
slobode F p SE
Stupnjevi
slobode F P SE
Spol 1 0.92 0.345 0.84 1 0.28 0.603 0.76
Koncentracija 3 1.13 0.353 1.19 3 0.36 0.783 1.07
39
Starost 2 2.68 0.086 0.97 2 0.93 0.406 0.88
Genotip 1 4.79 0.037 0.84 1 0.15 0.703 0.76
Tablica 9. Statistička analiza generalnim linearnim modelom
9. a
9. b
0
2
4
6
8
10
12
14
16
wt tim01 wt tim01 wt tim01 wt tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
% inhib
icije/0
,1 m
g
% inhibicije SOD - mužjaci QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0
2
4
6
8
10
12
14
16
wt tim01 wt tim01 wt tim01 wt tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
% inhib
icije/0
,1 m
g
% inhibicije SOD - mužjaci TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
40
9. c
9. d
Slika 9. Utjecaj QUE ovisi o genotipu. U eksperimentu su korišteni mužjaci (a i b) te
ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM
i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 (n=5). Kontrola je primala
običnu hranu (n=5). Mjerenja su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Promjena u
optičkoj gustoći pri valnoj duljini od 406 nm mjerena je tokom 10 minuta i potom
uspoređena s kontrolom (mjerenje rađeno prije dodatka ekstrakta mušica). Aktivnost SOD
se mjerila kao postotak inhibicije oksidacije kvercetina. Rezultati su bili linearno ovisni o
vremenu i količini ekstrakta.
4.10. Utjecaj polifenola na prosječnu težinu, mono-di-tri gliceride i
reduktivne šećere
Da bi ustanovili da li polifenoli utječu na promjenu tjelesne mase te stoga mušice
duže žive i više su otporne na stres, proveli smo mjerenja: prosječne težine,
0
5
10
15
20
tim01 tim01 tim01 tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
% inhib
icije/0
,1 m
g
% inhibicije SOD - ženke QUE
Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM
0
5
10
15
20
tim01 tim01 tim01 tim01
5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna
% inhib
icije/0
,1 m
g
% inhibicije SOD - ženke TYR
Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM
41
ukupne količine mono-di-tri glicerida i ukupne količine reduktivnih šećera. Razlog
tome bi bio da zbog veće količine lipida koji su izvor energije, kao i šećera koji
imaju sposobnost navlačenja molekula vode na sebe mušica može duže preživjeti.
Ovim eksperimentima željeli smo vidjeti da li tretirane mušice s polifenolima
pokazuju veće vrijednosti prosječne težine, količine mono-di-tri glicerida te
reduktivnih šećera u odnosu na kontrole.
Potvrdili smo statističkom analizom, generalnim linearnim modelom, da postoji
statistički značajna razlika između spola, odnosno pokazano je da mužjaci imaju
manju prosječnu težinu u usporedbi sa ženkama (QUE (F (1, 28)=34.35, p>0.001,
SE=0.03) i TYR (F (1, 28)=12.91, p=0.001, SE=0.04)). Generalnim linearnim
modelom pokazana je statistički značajna razlika u starosti kod mušica tretiranih
s kvercetinom, odnosno pokazano je smanjenje prosječne težine u rasponu od 2.
tjedna do 6. tjedna (QUE (F (2, 28)=5.01, p=0.014, SE=0.03), za TYR nije
pokazana statistička značajnost (F (2, 28)=1.71, p=0.199, SE=0.04)). Generalnim
linearnim modelom pokazana je statistički značajna razlika u količini mono-di-tri
glicerida starenjem, odnosno pokazano je da 6 tjedna stare mušice imaju manju
količinu mono-di-tri glicerida u usporedbi s 2 tjedna starim mušicama (QUE (F (2,
17)=48.88, p>0.001, SE=0.00) i TYR (F (2, 17)=64.51, p>0.001, SE=0.00)).
Generalni linearnim modelom pokazana je statistički značajna razlika u količini
reduktivnih šećera starenjem, odnosno rezultati su pokazali da mušice stare 2
tjedna imaju veću količinu šećera u usporedbi s onim starim 6 tjedna (QUE (F (2,
17)=7.07, p=0.006, SE=6.09) i TYR (F (2, 17)=5.23, p=0.017, SE=5.17)).
Generalnim linearnim modelom pokazana je statistički značajna razlika između
spola za mušice tretirane kvercetinom, mužjaci su pokazali veću količinu
reduktivnih šećera u usporedbi sa ženkama (QUE (F (1, 17)=7.65, p=0.013,
SE=4.31), za TYR ne postoji statistička značajnost (F (1, 17)=0.00, p=0.986,
SE=3.65)). Sve mjerene vrijednosti pokazuju razlike među spolom i starosti. Za
spol je očigledno da mužjaci imaju manju prosječnu težinu jer su naočigled manji.
Rezultati pokazuju prvotnu teoriju da starenjem sve ove vrijednosti opadaju. Ovi
rezultati pokazuju da polifenoli nemaju značajnog utjecaja na promjenu prosječne
težine, ukupne količine mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera, što bi nas uputilo
na zaključak da pozitivni efekti dobiveni za produženje života i sposobnosti
penjanja nisu zbog fizički jačih i otpornijih mušica, nego zato što su polifenoli doveli
do promjena u metabolizmu mušica što ih je u konačnici učinilo otpornijima.
42
10. a
10. b
Tablica 10. a) QUE i b) TYR nemaju značajni utjecaj na prosječnu težinu, mono-
di-tri gliceride i reduktivne šećere. U eksperimentu su korišteni mužjaci i ženke kojima
je hranu bio dodan kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR)
koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 µM. Kontrola je primala običnu hranu. Mjerenja su
rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. U eksperimentu mjerenja prosječne težine
korišteno je 11 mušica, a za mono-di-tri gliceride i reduktivne šećere korišten je ekstrakt
43
1 mušice. Prosječna težina i mono-di-tri gliceridi su mjereni prikazana je u miligramima
(mg), dok je količina reduktivnih šećera u mikrogramima (µg).
Tablica 10. c) Statistička analiza generalnim linearnim modelom
4.11. Tablica sa statističkim značajnostima
Generalni linearni model je statistička analiza koji se bazira na ANOVA postupku u
kojemu se izračunavanje statističkih značajnosti vrši pomoću najmanje regresije
kvadrata (eng. Least squares regression) te se pomoću ove analize opisuje
statistički odnos između jednog ili više prediktora (kategoričke varijable) za jednu
kontinuiranu varijablu. Za statistički značajne vrijednosti uzimamo podatke pri
kojima je srednja vrijednost jedne kategoričke varijable izvan 95% intervala druge
kategoričke varijable. Tablica prikazuje statističke značajnosti za sva rađena
mjerenja. U tablici nedostaju podaci za genotip koje će se nadopuniti uz pomoć
narednih eksperimenata na wt mušicama. Možemo vidjeti da se najveća statistička
povezanost odnosi na starenje što upućuje na to da naša mjerenja najviše ovise o
starosti mušica. Najmanja količina statističke značajnosti vidljiva je za
koncentracije. Koncentracije nisu bile značajne u većini slučajeva zato što se
njihove dobivene vrijednosti unutar skupina nisu značajno razlikovale. Tablica je
prikazana zbog preglednijeg i bržeg snalaženja među statističkim podacima.
44
Tablica 11. Statistička značajnost eksperimenata najviše ovisi o starosti. Prikaz
statističke analize podataka korištenjem generalnog linearnog modela. Oznaka plusa
prikazuje statistički značajne podatke, dok minus označava podatke koji nisu statistički
značajni.
45
5. Rasprava
Do sada su samo postojala istraživanja utjecaja kvercetina i tirosola na produženje
maksimalnog životnog vijeka kod drugih organizma kao što je Caenorhabditis
elegans (39,41). Naše istraživanje je prvo istraživanje koje ispituje utjecaje
kvercetina i tirosola kod cirkadijalnog mutanta, u ovom slučaju tim01 mutanta. Tim
mutanta smo koristili jer je u prijašnjim ispitivanjima pokazano da cirkadijalni per
mutanti brže stare, stoga smo željeli ispitati na koji način se ponašaju mušice s
tim mutacijom pošto je tim gen dimerizacijski partner per gena. U našim
rezultatima polifenoli, kvercetin i tirosol, pokazali su djelotvorne učinke na
produljenje dužine života kod mužjaka i ženki Drosophila melanogaster s timeless
mutacijom. Učinci su viđeni kod mužjaka pri koncentraciji QUE 3,2 mM i TYR 17,6
µM, a kod ženki pri koncentraciji TYR 12,45 µM (Slika 1. a-d). Rezultati su pokazali
da su mehanizmi djelovanja koncentracija polifenola na produženje života
uvjetovani spolnim razlikama jer vidimo da su različite koncentracije imale učinke
kod mužjaka i ženki. Naši rezultati su pokazali da polifenoli imaju pozitivan utjecaj
na mehanizme starenja te vjerojatno dolaze u doticaj s genima odgovornim za
starenje. Daljnjim ispitivanjima trebala bi se specificirati optimalna doza za
preživljenje jer kao što su rezultati pokazali nisu sve doze imale pozitivne učinke.
Slična istraživanja koja su provedena s resveratrolom i jabučnim polifenolima
također su pokazala pozitivne učinke na produljenje dužine životnog vijeka kod
Drosophile melanogaster (25,36).
Negativna geotaksija je eksperiment kojim se može mjeriti motorička sposobnost
okomitog penjanja Drosophile uz stijenku tube. Ovaj test daje direktnu povezanost
neurodegeneracije te smanjenje lokomotorne aktivnosti mušice kao indikatore
starenja. Naši rezultati pokazuju smanjenje postotka okomitog penjanja starenjem
kod wt i tim01 mušica. Rezultati su pokazali da tim01 mušice imaju veću sposobnost
penjanja u odnosu na wt. Pokazali smo da tirosolom tretirani mužjaci imaju veću
sposobnost penjanja u odnosu na ženke. Jedno od istraživanja testiralo je
neuroprotektivnu mogućnost kvercetina te su pokazali u mišjim stanicama da
kvercetin utječe na povećanje PON2 enzima koji je bitan za zaštitu od
neurotoksičnosti koja je uzorkovana oksidativnim stresom (38). Na osnovu
proteklih istraživanja mi smo pretpostavili da se starenjem povećava
neurodegeneracija koja se može vidjeti u obliku smanjene sposobnosti penjanja
te smo isto tako pretpostavili da polifenoli mogu imati blagotvorne učinke na njeno
46
smanjenje. Naši rezultati su pokazali povećanje sposobnosti okomitog penjanja
tretmanom s tirosolom i kvercetinom. Mi smo u našim istraživanju ispitivali utjecaj
kvercetina i tirosola na smanjenje neurodegeneracije i to smo pratili testom
negativne geotaksije. Pokazali smo da mušice tretirane s kvercetinom i tirosolom
imaju veću sposobnost okomitog penjanja u odnosu na netretirane mušice. U
jednom istraživanju pokazano je da su čisti polifenoli poput galne kiseline,
kumarinske kiseline, kafeinske kiseline, epikatehina i drugih doveli do oporavka i
poboljšane sposobnosti penjanja kod mušica koje su tretirane s parakvatom (48).
Mušice tretirane parakvatom model su za Parkinsonovu bolest,
neurodegenerativna bolest koju karakterizira degeneracija dopaminergičkih
neurona, smanjenje dopaminskog neurotransmitera i povećani nivo i nakupljanje
željeza u organizmu. U ovom istraživanju su osim polifenola koristili i lijek koji se
koristi kod pacijenata koji boluju od te neurodegenerativne bolesti. Lijek se sastoji
od 3 aktivne supstance koje su bitne u metabolizmu dopamina: levodopa,
carbidopa i entcapone, a oni su u istraživanju pokazali da su polifenoli bolje
povratili sposobnost penjanja u usporedbi s lijekom. Zanimljivost je da su ove tri
komponente lijeka strukturalno slične polifenolima. Ovim istraživanjem su dali
naslutiti da polifenoli imaju utjecaj na metabolizam dopamina, no ovakva saznanja
trebala bi se temeljitije ispitati. Za polifenole pretpostavljamo da su bili aktivni u
odstranjivanju ROS-ova koji se nakupljaju u organizmu i koji su odgovorni za
starenje ili su doveli do poticanja aktivacija egzogenih antioksidansa te će u
budućnosti biti od interesa ispitati da li kvercetin i tirosol djeluju na dopamin kod
tim01 mušica.
Starenjem dolazi do opadanja lokomotorne aktivnosti, te do povećane
fragmentacije spavanja. Za mušice se zna da postoji razlika u njihovoj aktivnosti i
spavanju između spola (49). Ženke su vjerojatno aktivnije zbog njihove potrage
za hranom i mjesta za lijeganje jaja, dok mužjaci mogu više vremena provoditi u
očuvanju energije (50). U našim rezultatima jasno je vidljiva razlika između spola
te smo pokazali da ženke imaju veću ukupnu aktivnost i manju ukupnu količinu
spavanja (Slika 3 i 4). Jedno od istraživanja je smatralo da zbog starenja dolazi
do povećanja oksidativnog stresa koje onda utječe na cikluse aktivnosti/spavanja
(49). Njihova teorija je da je ekspresija cirkadijalnih gena pod efektima parakvata
i starenja što onda upućuje da su mehanizmi odgovorni za aktivnost i spavanje
jednaki kod starenja i oksidativnog stresa. U našim istraživanjima koristili smo
47
polifenole kvercetin i tirosol te rezultati nisu pokazali značajno povećanje
aktivnost/smanjenje količine spavanja kod tretirane i netretirane skupine. Jedine
veće razlike prikazane su kod 6 tjedna starih mušica kod kojih je tirosol povećao
aktivnost te smanjio ukupnu količinu spavanja što pokazuje da polifenoli imaju
određene efekte.
Masno tkivo ima veliku ulogu u život mušica. Njegova funkcija je skladištenje i
otpuštanje energije ovisno o potrebama mušica. Metabolizam lipida je esencijalan
za rast i razmnožavanje te osigurava energiju tijekom dužih perioda izgladnjivanja.
Dok lipidi mogu utjecati na rezultate izgladnjivanja, količina šećera u tkivima može
utjecati na rezultate isušivanja zato što šećeri imaju puno hidroksilnih grupa i onda
se voda s lakoćom veže na njih. Stoga bi veće količine lipida i šećera kao i težina
imale važan utjecaj na preživljavanje mušica prilikom izlaganja fiziološkom stresu.
U našim rezultatima vidimo da su netretirane ženke preživjele 11 dana više u
usporedbi s mužjacima (Slika 1. a-d). U rezultatima je isto tako viđena spolna
razlika u preživljenju prilikom izgladnjivanja i isušivanja (Slika 5 i 6). Isto tako u
našim rezultatima pokazano je da ženke imaju veću tjelesnu masu u usporedbi s
mužjacima, dok se količina mono-di-tri glicerida ne mijenja (Tablica 10. a i b). U
našem istraživanju pokazano je da netretirane muške i ženske mušice starenjem
slabije podnose stresove izgladnjivanja i isušivanja (Slika 5 i 6) te isto tako dolazi
do smanjenja prosječne težine te količine mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera
(Tablica 10. a, b). U slučaju da u našem istraživanju vidimo da su polifenoli imali
utjecaje na fizičke mogućnosti mušica i tako omogućili duže preživljenje to bi vidjeli
porastom mase tretiranih mušica kao i količine mono-di-tri glicerida i reduktivnih
šećera. Mi smo pokazali da polifenoli imaju pozitivne učinke na preživljenje kod
izgladnjivanja i isušivanja, no nismo pokazali povezanost između preživljenja pod
utjecajem stresova te težine i količine mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera
kod mušica koje su tretirane s polifenolima. Iz ovih rezultata zaključujemo da
polifenoli nisu imali utjecaj na povećanje prosječne težine, ukupne količine mono-
di-tri glicerida i reduktivnih šećera što bi značilo da mušicama nije bilo potrebno
da budu fizički jače kako bi uspjele preživjeti. Pozitivni učinci polifenola na
preživljenje ukazuju na to da su polifenoli došli u interakciju na drugačiji način,
vjerojatno procesima u smanjenju nakupljanja oksidativnih oštećenja koji su bitan
faktor u procesima starenja.
48
Jedan od biomarkera starenja koji se može mjeriti je AGE, produkti nastali iz
glukoze koji dolaze u interakciju s DNK, lipidima i proteinima te dovode do njihovog
oštećenja. Naši rezultati su pokazali da kod mušica divljeg tipa dolazi do porasta
AGE-a prilikom starenja dok kod muških i ženskih tim mušica to nije slučaj. Ovi
rezultati mogli bi ukazivati da cirkadijalni sat te u ovom slučaju timeless gen ima
efekt za nakupljanje AGE-a i za njegov nastanak. Možemo napraviti korelaciju
između AGE akumulacije i testa negativne geotaksije gdje vidimo da je AGE
akumulacija kod 4 i 6 tjedna starih mužjaka bila manja kod tim mušica u odnosu
na wt, dok je njihova sposobnost penjanja bila veća u odnosu na wt. Na ovom
primjeru mogli bi reći da je AGE dobar biomarker starosti no trebale bi se provesti
i daljnje usporedbe. Točan mehanizam na koji način tim gen utječe nije poznat te
bi se trebala napraviti daljnja ispitivanja. Također naši rezultati su pokazali da je
korištenje polifenola dovelo do smanjenje nastanka AGE produkta kod wt mušica,
dok kod tim mušica taj efekt nije zabilježen. Jedan od zaključaka bi mogao biti da
polifenoli i tim gen djeluju na slične procese, odnosno možda zbog mutacije u tim
genu dolazi do sprječavanja akumulacije AGE produkata i onda polifenoli nemaju
ulogu u njihovom smanjenju. Ove zaključke trebalo bi detaljnije ispitati i
nadopuniti s podacima koji nedostaju.
U našem istraživanju željeli smo vidjeti da li kvercetin i tirosol imaju pozitivne
učinke u smanjenju oksidativnog oštećenja te da li na neki način nadopunjuju
uloge SOD i CAT kod Drosophile melanogaster. U literaturi se navodi da aktivnost
katalaze starenjem raste kroz 3 tjedna do nekih 50% u usporedbi s mladim
mušicama i nakon toga dolazi do naglog pada aktivnosti katalaze (47). Također je
u istoj studiji pokazano da jako mlade mušice i jako stare mušice imaju približne
vrijednosti aktivnosti katalaze. Rezultati iz literature rađeni su na mužjacima tipa
Oregon R. Naši rezultati za Canton S wt potvrđuju rezultate iz literature te se može
vidjeti da aktivnost katalaze raste starenjem od 5 dana starih do 4. tjedna starosti
kada dolazi do pada aktivnost. Aktivnost katalaze se smanjivala do 6. tjedna
starosti kada su vrijednosti bile slične kao kod 5 dana starih mušica (Slika 8. a, b).
Znači, naši rezultati su u potpunosti potvrdili promjene u aktivnosti katalaze
tijekom starenja. Naše novo otkriće je da aktivnost katalaze kod tim mutanta raste
kroz periode starenja te se razlikuje od aktivnosti katalaze wt mušica (Slika 8. a-
d). Postoji mogućnost da cirkadijalni gen timeless je povezan s mehanizmima
bitnim za normalnu aktivnost katalaze te njegov nedostatak dovodi do povećanja
49
aktivnosti kada bi se ona u usporedbi s wt trebala smanjivati. Ovi rezultati ukazuju
da tim mutanti ne pokazuju normalne procese starenja. Za ženke nemamo
literaturne podatke te ne možemo usporediti dobivene rezultate. Ono što možemo
vidjeti kod tim ženki je da kao i kod mužjaka aktivnost katalaze raste starenjem.
Našim istraživanjem pokazali smo da kvercetin i tirosol dovode do smanjenja
aktivnosti katalaze kod wt i tim mušica u usporedbi s netretiranim mušicama. Zbog
pokazanih promjena možemo vidjeti da polifenoli dolaze u interakciju s katalazom,
ali još ne možemo tvrditi koji je točan mehanizam njihovih djelovanja.
Literaturni podaci za SOD pokazali su da starenjem aktivnost SOD linearno raste
(47). U literaturi je pokazano da se aktivnost SOD kod starih mušica poveća za
50% uspoređujući s mladim mušicama. U našim rezultatima možemo vidjeti kod
wt mušica da SOD aktivnost raste od jako mladih prema jako starim mušicama i
da se aktivnost povećala za 50% i više, čime smo u potpunosti potvrdili literaturne
navode. Kod tim mužjaka je viđen porast aktivnosti SOD do 4 tjedna starosti, no
onda vidimo značajan pad u vrijednosti kod 6 tjedna starih mušica u usporedbi s
wt gdje je u toj starosnoj dobi najveća aktivnost SOD. Iz dobivenih rezultata
možemo zaključiti da timeless gen ima utjecaj na mehanizme antioksidativnih
enzima, ali još ne znamo točan mehanizam njegovog djelovanja. Starenjem dolazi
do povećanja oksidativnog stresa i stoga kod wt mušica aktivnost SOD raste jer je
veća potreba organizma za njenim djelovanjem. Kod tim mušica vidimo drugačiji
slučaj te dolazi do smanjenja SOD aktivnosti što bi moglo ukazati da je oksidativni
stres puno izraženiji i da dovodi do oštećenja SOD enzima i zato se njegova
aktivnost smanjuje. Naši rezultati su pokazali veliku razliku u djelovanju polifenola
kod 6 tjedna starih mušica te je tako kod 6 tjedna starih wt mužjaka kvercetin
doveo do smanjenja aktivnosti SOD, dok je kod tim mužjaka porasla aktivnosti
SOD. Ove razlike nas navode na zaključke da polifenoli imaju doticaje s aktivnosti
SOD i da ta aktivnost ovisi o cirkadijalnom satu, a u ovom slučaju specifično da
ovisi i o tim genu. Mogli bi reći da polifenoli nemaju potrebu za povećanjem
aktivnost SOD kod 6 tjedna starih wt mušica jer je endogena aktivnost SOD
dovoljno jaka, dok je kod tim mušica ona jako oslabila i zato polifenoli pokazuju
veliko povećanje aktivnosti SOD.
Naši rezultati su pokazali da starenjem dolazi do smanjene sposobnosti penjanja
te povećane AGE akumulacije. U ovom slučaju AGE nakupljanje možemo povezati
s lokomotornom aktivnošću što bi značilo da je AGE možda bitan u procesima koji
50
su bitni za kontrolu motorike. Također smo vidjeli da se AGE akumulacija ne
mijenja kod tim mušica, ali je njihova sposobnost penjanja bolja u odnosu na wt
kod kojega AGE akumulacija raste. Također smo pokazali da polifenoli povećavaju
sposobnost penjanja kod wt i smanjuju akumulaciju AGE produkata, dok kod tim
mušica vidimo samo njihov utjecaj na sposobnost penjanja. Rezultati su se
razlikovali između wt i tim mušica što nam pokazuje da je tim gen važan za
normalne mehanizme starenja. Također pokazali smo jasne razlike između spola,
npr. u aktivnost i spavanju te težini koji su bili očekivani te smo tako potvrdili razne
literaturne nalaze o spolnim razlikama. Ono što smo isto pokazali je da polifenoli
različito djeluju između spola jer nisu iste koncentracije pokazale iste rezultate.
Polifenoli su doveli do povećanja aktivnosti superoksid dismutaze koja je možda
utjecala na mehanizme polifenola koji su potom omogućili duže preživljenje te
povećanu sposobnost penjanja. Pokazali smo više značajnijih utjecaja polifenola
na bihevioralne rezultate, a manje biokemijske što bi značilo da su polifenoli
blagotvorni u svome djelovanju, ali još ne znamo preko kojih mehanizama.
Polifenoli su možda imali antioksidativna djelovanja jer iako je preživljenje poraslo
mi nismo pokazali korelaciju s fizički jačim mušicama (veća prosječna težina i veća
količina mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera).
51
6. Zaključak
Naše istraživanje je po prvi puta opisalo razlike između wt i tim mušica. Pokazali
smo da tim mušice imaju veću sposobnost penjanja nego wt mušice, što bi nam
pokazalo da su zabilježeni manje progresivni mehanizmi starenja. Isto tako
sposobnost penjanja smo korelirali s AGE akumulacijom, biokemijskim markerom
starenja. Pokazali smo da kod tim mušica ne dolazi do porasta AGE produkata
starenjem, dok kod wt mušica akumulacija raste starenjem. Zaključujemo da AGE
produkti imaju doticaja s mehanizmima motorike koji slabe starenjem te da je tim
gen mogao biti bitan faktor u kontroli tih mehanizama. Jedan od faktora starenja
je i nakupljanje oksidativnog oštećenja koje se možda događa zbog smanjenog
djelovanja antioksidativnih enzima. U našim rezultatima smo pokazali da je
aktivnost katalaze i superoksid dismutaze kod wt mušica u suglasju s literaturnim
rezultatima dok kod tim mušica nije. Možemo zaključiti da je tim gen važan faktor
kod antioksidativnih enzima i da njegova mutacija dovodi do razlika u djelovanju
katalaze i superoksid dismutaze.
Naše istraživanje je prvi puta pokazalo utjecaj kvercetina i tirosola kod tim mušica
u usporedbi s wt mušicama. Pokazali smo da polifenoli produžuju dužinu života
kod tim mušica te bi te rezultate valjalo usporediti s divljim tipom da se uoči
razlika. Polifenoli su povećali sposobnost penjanja kod wt i tim mušica što bi moglo
ukazivati na njihovu neuroprotektivnu ulogu te isto tako njihovu antioksidativnu
ulogu u odstranjivanju ROS-a. Polifenoli su osim moguće neuroprotektivne uloge
imali ulogu u smanjenju štetnih produkata koja se akumuliraju starenjem te su
tako uspješno smanjili AGE akumulaciju kod wt mušica dok kod tim nisu. Zaključak
bi bio da je možda mutacija u tim genu onemogućila nakupljanje AGE produkata
starenjem. Polifenoli su pokazali svoje djelovanje na endogene antioksidativne
enzime katalazu i superoksid dismutazu jer se vide promjene u njihovim
aktivnostima. Za sada još ne možemo tvrditi da li su polifenoli djelovali na
mehanizme starenja svojim antioksidativnim djelovanjem ili poticanjem endogenih
enzima stoga bi daljnja ispitivanja trebala ići u smjeru razjašnjenja točnih
mehanizama njihovog djelovanja.
52
7. Literatura
1. Tosato M, Zamboni V, Ferrini A, Cesari M. The aging process and potential interventions to extend life expectancy. Clin Interv Aging. 2007;2(3):401.
2. Wilking M, Ndiaye M, Mukhtar H, Ahmad N. Circadian Rhythm Connections to
Oxidative Stress: Implications for Human Health. Antioxid Redox Signal.
2013 Jul 10;19(2):192–208.
3. He Y, Jasper H. Studying aging in Drosophila. Methods. 2014
Jun;68(1):129–33.
4. Rodríguez-Rodero S, Fernández-Morera JL, Menéndez-Torre E, Calvanese V, Fernández AF, Fraga MF. Aging Genetics and Aging. Aging Dis. 2011 Apr
28;2(3):186–95.
5. Trinei M, Berniakovich I, Beltrami E, Migliaccio E, Fassina A, Pelicci P, et al. P66Shc signals to age. Aging. 2009;1(6):503–510.
6. O’Kane CJ. Drosophila as a Model Organism for the Study of
Neuropsychiatric Disorders. In: Hagan JJ, editor. Molecular and Functional
Models in Neuropsychiatry [Internet]. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2011 [cited 2016 Jul 6]. p. 37–60. Available from:
http://link.springer.com/10.1007/7854_2010_110
7. Genetic Portrait Chapters A-E [Internet]. [cited 2016 Jul 6]. Available from: http://highered.mheducation.com/sites/007352526x/student_view0/genetic
_portrait_chapters_a-e.html
8. Rakshit K, Krishnan N, Guzik EM, Pyza, E, Giebultowicz JM. Effects of Aging on the Molecular Circadian Oscillations in Drosophila. Chronobiol Int. 2012
Feb;29(1):5–14.
9. Stanewsky R. Genetic analysis of the circadian system inDrosophila
melanogaster and mammals. J Neurobiol. 2003 Jan;54(1):111–47.
10. Clark WR, Grunstein M. Are We Hardwired?: The Role of Genes in Human
Behavior. Oxford University Press; 2004. 333 p.
11. Shirasu N, Shimohigashi Y, Tominaga Y, Shimohigashi M. Molecular Cogs of the Insect Circadian Clock. Zoolog Sci. 2003 Aug;20(8):947–55.
12. Giebultowicz JM, Long DM. Aging and circadian rhythms. Curr Opin Insect
Sci. 2015 Feb;7:82–6.
13. Luo W, Chen W-F, Yue Z, Chen D, Sowcik M, Sehgal A, et al. Old flies have a
robust central oscillator but weaker behavioral rhythms that can be
improved by genetic and environmental manipulations: Circadian clocks in
aging Drosophila. Aging Cell. 2012 Jun;11(3):428–38.
14. Umezaki Y, Yoshii T, Kawaguchi T, Helfrich-Forster C, Tomioka K. Pigment-
Dispersing Factor Is Involved in Age-Dependent Rhythm Changes in
Drosophila melanogaster. J Biol Rhythms. 2012 Dec 1;27(6):423–32.
53
15. Bishop NA, Guarente L. Genetic links between diet and lifespan: shared
mechanisms from yeast to humans. Nat Rev Genet. 2007 Nov;8(11):835–
44.
16. Bruss MD, Khambatta CF, Ruby MA, Aggarwal I, Hellerstein MK. Calorie
restriction increases fatty acid synthesis and whole body fat oxidation rates.
AJP Endocrinol Metab. 2010 Jan 1;298(1):E108–16.
17. Katewa SD, Akagi K, Bose N, Rakshit K, Camarella T, Zheng X, et al.
Peripheral Circadian Clocks Mediate Dietary Restriction-Dependent Changes
in Lifespan and Fat Metabolism in Drosophila. Cell Metab. 2016
Jan;23(1):143–54.
18. Klichko VI, Chow ES, Kotwica-Rolinska J, Orr WC, Giebultowicz JM, Radyuk
SN. Aging alters circadian regulation of redox in Drosophila. Front Genet
[Internet]. 2015 Mar 9 [cited 2016 Jul 6];6. Available from: http://www.frontiersin.org/Genetics_of_Aging/10.3389/fgene.2015.00083/a
bstract
19. Kondratov RV. Early aging and age-related pathologies in mice deficient in BMAL1, the core componentof the circadian clock. Genes Dev. 2006 Jul
15;20(14):1868–73.
20. Krishnan N, Rakshit K, Chow ES, Wentzell JS, Kretzschmar D, Giebultowicz
JM. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 2012 Mar;45(3):1129–35.
21. Krishnan N, Davis AJ, Giebultowicz JM. Circadian regulation of response to
oxidative stress in Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Sep;374(2):299–303.
22. Luckinbill LS, Foley P. The role of metabolism in aging. J Am Aging Assoc.
2000;23(2):85–93.
23. Cerami A. Hypothesis. J Am Geriatr Soc. 1985;33(9):626–634.
24. Hirano Y, Kuriyama Y, Miyashita T, Horiuchi J, Saitoe M. Reactive oxygen
species are not involved in the onset of age-related memory impairment in
Drosophila. Genes Brain Behav. 2012 Feb;11(1):79–86.
25. Peng C, Chan HYE, Huang Y, Yu H, Chen Z-Y. Apple Polyphenols Extend the
Mean Lifespan of Drosophila melanogaster. J Agric Food Chem. 2011 Mar
9;59(5):2097–106.
26. Muller FL, Lustgarten MS, Jang Y, Richardson A, Van Remmen H. Trends in
oxidative aging theories. Free Radic Biol Med. 2007 Aug 15;43(4):477–503.
27. Sohal RS, Agarwal A, Agarwal S, Orr WC. Simultaneous Overexpression of
Copper- and Zinc-containing Superoxide Dismutase and Catalase Retards Age-related Oxidative Damage and Increases Metabolic Potential in
Drosophila melanogaster. J Biol Chem. 1995 Jun 30;270(26):15671–4.
54
28. Reveillaud I, Niedzwiecki A, Bensch KG, Fleming JE. Expression of bovine
superoxide dismutase in Drosophila melanogaster augments resistance of
oxidative stress. Mol Cell Biol. 1991;11(2):632–640.
29. Phillips JP, Campbell SD, Michaud D, Charbonneau M, Hilliker AJ. Null
mutation of copper/zinc superoxide dismutase in Drosophila confers
hypersensitivity to paraquat and reduced longevity. Proc Natl Acad Sci. 1989;86(8):2761–2765.
30. Lin W-S, Chen J-Y, Wang J-C, Chen L-Y, Lin C-H, Hsieh T-R, et al. The anti-
aging effects of Ludwigia octovalvis on Drosophila melanogaster and SAMP8
mice. AGE. 2014 Apr;36(2):689–703.
31. Boyd O, Weng P, Sun X, Alberico T, Laslo M, Obenland DM, et al. Nectarine
promotes longevity in Drosophila melanogaster. Free Radic Biol Med. 2011
Jun;50(11):1669–78.
32. Pandey KB, Rizvi SI. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human
health and disease. Oxid Med Cell Longev. 2009;2(5):270–8.
33. Graf BA, Milbury PE, Blumberg JB. Flavonols, flavones, flavanones, and human health: epidemiological evidence. J Med Food. 2005;8(3):281–290.
34. Markus MA, Morris BJ. Resveratrol in prevention and treatment of common
clinical conditions of aging. Clin Interv Aging. 2008 Jun;3(2):331–9.
35. Stelter P, Ulrich HD. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation. Nature. 2003 Sep
11;425(6954):188–91.
36. Wood JG, Rogina B, Lavu S, Howitz K, Helfand SL, Tatar M, et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature.
2004;430(7000):686–689.
37. Belinha I, Amorim MA, Rodrigues P, de Freitas V, Moradas-Ferreira P, Mateus N, et al. Quercetin Increases Oxidative Stress Resistance and Longevity in
Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem. 2007 Mar;55(6):2446–51.
38. Costa LG, Tait L, de Laat R, Dao K, Giordano G, Pellacani C, et al. Modulation
of Paraoxonase 2 (PON2) in Mouse Brain by the Polyphenol Quercetin: A Mechanism of Neuroprotection? Neurochem Res. 2013 Sep;38(9):1809–18.
39. Kampkötter A, Timpel C, Zurawski RF, Ruhl S, Chovolou Y, Proksch P, et al.
Increase of stress resistance and lifespan of Caenorhabditis elegans by quercetin. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2008
Feb;149(2):314–23.
40. Bendini A, Cerretani L, Carrasco-Pancorbo A, Gómez-Caravaca AM, Segura-
Carretero A, Fernández-Gutiérrez A, et al. Phenolic molecules in virgin olive oils: a survey of their sensory properties, health effects, antioxidant activity
and analytical methods. An overview of the last decade Alessandra.
Molecules. 2007;12(8):1679–1719.
55
41. Cañuelo A, Gilbert-López B, Pacheco-Liñán P, Martínez-Lara E, Siles E,
Miranda-Vizuete A. Tyrosol, a main phenol present in extra virgin olive oil,
increases lifespan and stress resistance in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 2012 Aug;133(8):563–74.
42. Anter J, Tasset I, Demyda-Peyrás S, Ranchal I, Moreno-Millán M, Romero-
Jimenez M, et al. Evaluation of potential antigenotoxic, cytotoxic and proapoptotic effects of the olive oil by-product “alperujo”, hydroxytyrosol,
tyrosol and verbascoside. Mutat Res Toxicol Environ Mutagen. 2014
Sep;772:25–33.
43. Sun Y, Yolitz J, Wang C, Spangler E, Zhan M, Zou S. Aging Studies in Drosophila Melanogaster. In: Tollefsbol TO, editor. Biological Aging
[Internet]. Totowa, NJ: Humana Press; 2013 [cited 2016 Aug 23]. p. 77–93.
Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-62703-556-9_7
44. Gargano J, Martin I, Bhandari P, Grotewiel M. Rapid iterative negative
geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline
in. Exp Gerontol. 2005 May;40(5):386–95.
45. Dokić, Helija. Ispitivanje utjecaja polifenola iz lišća masline (Olea europea)
na starenje i otpornost na stres kod Drosophile melanogaster. [Rijeka]:
Sveučilište u Rijeci, Odjel za biotehnologiju; 2014.
46. Bolonja, Ana. Utjecaj polifenola iz lišće masline na psihofizičke sposobnosti kod Drosophile melanogaster. [Rijeka]: Sveučilište u Rijeci, Odjel za
biotehnologiju; 2015.
47. Sohal RS, Arnold L, Orr WC. Effect of age on superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase, inorganic peroxides, TBA-reactive material,
GSH/GSSG, NADPH/NADP+ and NADH/NAD+ in Drosophila melanogaster.
Mech Ageing Dev. 1990 Dec;56(3):223–35.
48. Jimenez-Del-Rio M, Guzman-Martinez C, Velez-Pardo C. The Effects of
Polyphenols on Survival and Locomotor Activity in Drosophila melanogaster
Exposed to Iron and Paraquat. Neurochem Res. 2010 Feb;35(2):227–38.
49. Koh K, Evans JM, Hendricks JC, Sehgal A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles. Proc Natl Acad Sci.
2006;103(37):13843–13847.
50. Isaac RE, Li C, Leedale AE, Shirras AD. Drosophila male sex peptide inhibits siesta sleep and promotes locomotor activity in the post-mated female. Proc
R Soc B Biol Sci. 2010 Jan 7;277(1678):65–70.
56
8. Životopis
OSOBNE INFORMACIJE Žic Tamara
Brtuni 13, 51216 Viškovo (Hrvatska)
+385 91 944 9119
Spol Žensko | Datum rođenja 08 siječnja 1993 | Državljanstvo hrvatsko
OBRAZOVANJE I OSPOSOBLJAVANJE
RADNO ISKUSTVO
2014–danas
Odjel za biotehnologiju, Diplomski sveučilišni studij "Istraživanje i razvoj lijekova" Radmile Matejčić 2, 51000 Rijeka (Hrvatska) www.biotech.uniri.hr
2011–2014 Viša stručna sprema, Sveučilišna prvostupnica
Biotehnologije i istraživanja lijekova
Odjel za biotehnologiju, preddiplomski studij Biotehnologija i istraživanje lijekova Radmile Matejčić 2, 51000 Rijeka (Hrvatska) www.biotech.uniri.hr
2007–2011 Srednja stručna sprema
Gimnazija Andrije Mohorovičića Frana Kurelca 1, 51000 Rijeka (Hrvatska) www.gimnazija-amohorovicica-ri.skole.hr
2015–danas Diplomski rad
Mentorica: Dr.sc. Rozi Andretić-Waldowski Radmile Matejčić 2, 51 000 Rijeka Rijeka (Hrvatska) www.biotech.uniri.hr
Laboratorij za genetiku ponašanja
Odjel za biotehnologiju
Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u timeless cikadijalnih mutanata Drosophile
Djelatnost ili sektor Odgoj I Obrazovanje
07/07/2014–18/07/2014
Stručna praksa
Jadran Galenski Laboratorij Pulac 4a, 51 000 Rijeka Rijeka (Hrvatska) www.jgl.hr
Mentori: Sanja Vukoja; Ivana Poropat
pisanje dnevnika rada
rad u laboratoriju (pripremanje otopina, korištenje vage-mjerenje)
rad na odjelu istraživanja i preformulacija
kratka istraživanja-pretraživanje baza podataka
57
OSOBNE VJEŠTINE
DODATNE INFORMACIJE
korištenje Farmakopeja (EU, USA)
Djelatnost ili sektor Stručna, Znanstvena I Tehnička Djelatnost
Materinski jezik hrvatski
Ostali jezici RAZUMIJEVANJE GOVOR PISANJE
Slušanje Čitanje Govorna interakcija Govorna produkcija
engleski C1 C1 C1 C1 C1
njemački A2 A2 A2 A2 A2
Stupnjevi: A1 i A2: Početnik - B1 i B2: Samostalni korisnik - C1 i C2: Iskusni korisnik
Zajednički europski referentni okvir za jezike
Komunikacijske vještine
Sezonski posao kao prodavač na štandu omogućio mi je usvajanje dobrih komunikacijskih vještina s kupcima.
Nekoliko godina u debati naučilo me kako jasno i argumentirano iznositi svoje stavove.
Svakodnevni seminari u sklopu kolegija na fakultetu naučili su me kako kontrolirati tremu i pričati ispred veće skupine ljudi.
Organizacijske / rukovoditeljske vještine
Case Study Competition koji je bio u organizaciji JGL omogućio mi je dobre organizacijske vještine jer sam bila voditelj tima
Volontiranje na Europskim sveučilišnim igrama 2016. omogućilo mi je razvitak organizacijskih vještina te upravljanjem veće grupe ljudi jer sam bila attache-domaćin ekipe
Digitalna kompetencija
SAMOPROCJENA
Obrada informacija Komunikacija Stvaranje sadržaja
Sigurnost Rješavanje problema
Iskusni korisnik Iskusni korisnik Samostalni
korisnik Samostalni
korisnik Samostalni
korisnik
Informacijsko-komunikacijske tehnologije - tablica za samoprocjenu
Vozačka dozvola B
Priznanja i nagrade Stipendist Općine Viškovo 2011/12, 2012/13, 2015/2016 godine
Završila preddiplomski studij s pohvalom- CUM LAUDE
Konferencije Aktivni sudionik na poster sekciji 14-tog simpozija, Translation of basic immunology and neuroscience tools to therapies, održanog u Rijeci u srpnju 2016. godine
Ime postera: "Influence of polyphenol supplemented food on behavior and physiology of aged Drosophila melanogaster"
Autori: Ana Filošević, Tamara Žic, Franka Rigo, Rozi Andretić Waldowski
58
Pasivni sudionik na 6. Studentskom kongresu neuroznanosti - NeuRi 2016. održanom u Rijeci i Rabu od 22. do 24. travnja 2016. godine
Volonterstva Pomoć kod postave i rada Hiše eksperimentov, rad s djecom - Općina Viškovo, rujan 2016. godine
Attaché, domaćin ekipe, na Europskim sveučilišnim igrama - Rijeka i Zagreb, srpanj 2016. godine
Projekti Sudjelovanje u aktivnostima 13. i 14. Festivala znanosti
Student mentor 2014. - 2016. godine
Članstva Članica Udruge studenata biotehnologije Sveučilišta u Rijeci od 2014. godine