sveuČiliŠte josipa jurja strossmayera u...

I

SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU

ODJEL ZA BIOLOGIJU

Diplomski nastavnički studij biologije i kemije

Ivana Gračanac

USPOREDBA OSJETLJIVOSTI DVIJE KULTURE VRSTE

LEMNA GIBBA L. (LABORATORIJSKE I KULTURE IZ

RIBNJAKA NARTA) NA BAKAR

Diplomski rad

Osijek, 2012.

II

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku Diplomski rad Odjel za biologiju Diplomski nastavnički studij biologije i kemije Znanstveno područje: Prirodne znanosti Znanstveno polje: Biologija

USPOREDBA OSJETLJIVOSTI DVIJE KULTURE VRSTE LEMNA GIBBA L. (LABORATORIJSKE I KULTURE IZ RIBNJAKA NARTA) NA BAKAR

Ivana Gračanac

Rad je izrađen: Zavod za biokemiju i ekofiziologiju biljaka Mentor: Izv. prof. dr. sc. Janja Horvatić Kratak sadržaj diplomskog rada: Utjecaj bakra na rast vrste Lemna gibba L. istraživan je standardnim Lemna sp. Growth Inhibition Testom (OECD guideline 221). Za istraživanje su korištene dvije kulture, jedna uzgajana u kontroliranim laboratorijskim uvjetima te druga izolirana iz ribnjaka Narta na području Bjelovarsko-bilogorske županije. Laboratorijskim testom utvrđena je stimulacija rasta obje testirane kulture biljaka pri nižim koncentracijama bakra, dok se pri višim koncentracijama pojavljuju simptomi toksičnosti i smanjenje prirasta. Dobiveni rezultati pokazali su da je kultura izolirana iz ribnjaka Narta osjetljivija na bakar u usporedbi s kulturom uzgajanom u laboratoriju. Toksičnost bakra povećavala se s povećanjem vremena izloženosti za obje kulture vrste L. gibba. Kod kulture iz ribnjaka Narta snažan utjecaj na zaštitu stanica od toksičnog djelovanja bakra, imali su karotenoidi. Prema dobivenim rezultatima utvrđeno je da standardni testovi toksičnosti mogu podcijeniti toksičnost bakra na biljkama uzgajanim u kontroliranim uvjetima u odnosu na biljke u prirodnom okolišu. Broj stranica: 70 Broj slika: 20 Broj tablica: 13 Broj literaturnih navoda: 84 Broj priloga: 1 Jezik izvornika: hrvatski Ključne riječi: Lemna gibba L., osjetljivost, toksičnost bakra, prirast, koncentracija pigmenata, proteina, kloroza, dezintegracija kolonija, svježa tvar, suha tvar. Datum obrane: 10.12.2012. Stručno povjerenstvo za obranu: 1. Prof. dr. sc. Janja Horvatić 2. Prof. dr. sc. Melita Mihaljević 3. Prof. dr. sc. Enrih Merdić Rad je pohranjen u: u knjižnici Odjela za biologiju Sveučilišta Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku

III

BASIC DOCUMENTATION CARD Josip Juraj Strossmayer University of Osijek MS thesis Department of Biology Graduate Study of Biology and Chemistry in Education Scientific Area: Natural science Scientific Field: Biology

SENSITIVITY COMPARISON OF LABORATORY-CULTURED AND FIELD-COLLECTED LEMNA GIBBA L. ON COPPER

Ivana Gračanac

Thesis performed at: Department of Biochemistry and Plant Ecophysiology Supervisor: Izv. prof. dr. sc. Janja Horvatić

Short abstract: The toxic effect of copper on growth of Lemna gibba L. was investigated using a standard Lemna sp. Growth Inhibition Test (OECD guideline 221). For testing copper toxicity two L. gibba cultures were used, one cultured in laboratory conditions and one isolated from fishpond Narta in Bjelovar-Bilogora County. Stimulation of growth was observed in both tested cultures at lower copper concentrations, while chlorosis and lower growth rates were evident at higher concentrations. The culture of L. gibba plants isolated from Narta was more sensitive to copper in comparison to laboratory culture. The copper toxicity increased with increasing the duration of exposure. Carotenoids had significant effect on cell protection from copper toxicity in plants from Narta. Standard toxicity tests can underestimate copper toxicity when performed on plants cultured in controlled laboratory conditions in comparison to plants grown in natural conditions. Number of pages: 70 Number of figures: 20 Number of tables: 13 Number of references: 84 Original in: Croatian

Key words: Lemna gibba L., sensitivity, copper toxicity, growth rate, concentration of pigments, proteins, chlorosis, colony desintegration, fresh weight, dry weight.

Date of the thesis defense: 10.12.2012. Reviewers:

1. Prof. dr. sc. Janja Horvatić 2. Prof. dr. sc. Melita Mihaljević

3. Prof. dr. sc. Enrih Merdić

Thesis deposited in: Library of Department of Biology, University of J. J. Strossmayer in Osijek

IV

Zahvaljujem se mentorici Izv. prof. dr. sc. Janji Horvatić na velikoj pomoći i stručnim

savjetima tijekom izrade ovog diplomskog rada.

Veliko hvala asistentici Martini Jelošek na savjetima, stručnoj pomoći te iznimnom strpljenju

i razumijevanju prilikom eksperimentalne izrade diplomskog rada.

Zahvaljujem se roditeljima koji su mi velika podrška i oslonac u životu i tijekom cijelog

školovanja, kumovima koji su mi pomagali u terenskom dijelu diplomskog rada, a posebno

hvala dečku na tehničkoj potpori i strpljenju tijekom školovanja.

V

SADRŽAJ

1. UVOD .................................................................................................................................... 1

1.1. Procjena stupnja onečišćenja ........................................................................................ 2

1.1.1. Vrste i uporaba biljnih biotestova ......................................................................... 4

1.1.2. Biljke iz porodice Lemnaceae .............................................................................. 5

1.2. Bakar ............................................................................................................................. 6

1.3. Ribnjaci uz rijeku Česmu na području Bjelovarsko-bilogorske županije .................... 9

1.3.1. Izvori onečišćenja voda ribnjaka na području Bjelovarsko-bilogorske županije 11

1.4. Cilj istraživanja ........................................................................................................... 13

2. MATERIJAL I METODE .................................................................................................... 14

2.1. Biljni materijal ............................................................................................................ 14

2.2. Ribnjak Narta .............................................................................................................. 14

2.3. Uvođenje i održavanje vodene leće u kulturi ............................................................. 16

2.4. Izvedba Lemna testa ................................................................................................... 17

2.4.1. Određivanje prirasta broja biljaka ...................................................................... 17

2.4.2. Određivanje prirasta mase svježe tvari i mase suhe tvari ................................... 17

2.4.3. Određivanje omjera mase suhe i svježe tvari ..................................................... 17

2.4.4. Određivanje koncentracije proteina .................................................................... 18

2.4.5. Određivanje koncentracije pigmenata ................................................................ 18

2.5. Statistička obrada ........................................................................................................ 19

3. REZULTATI ........................................................................................................................ 20

3.1. Izgled biljaka .............................................................................................................. 20

3.1.1. Prirast broja biljaka ............................................................................................. 21

3.1.2. Prosječan broj biljaka po koloniji ....................................................................... 24

3.1.3. Svježa masa, suha masa i omjer suhe i svježe mase biljaka ............................... 25

3.1.4. Koncentracija proteina ........................................................................................ 27

3.1.5. Koncentracija fotosintetskih pigmenata ............................................................. 28

3.2. IC50 vrijednosti na temelju mjerenih pokazatelja rasta biljaka .................................. 32

4. RASPRAVA ......................................................................................................................... 34

5. METODIČKI DIO ............................................................................................................... 38

5.1. Prilog pripremi ............................................................................................................ 56

5.2. Kriteriji vrednovanja portfolia .................................................................................... 60

6. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 62

VI

7. LITERATURA ..................................................................................................................... 63

8. PRILOZI ............................................................................................................................... 70

1

1. UVOD

Zbog ljudske djelatnosti dolazi do opterećivanja okoliša mnogobrojnim fizičkim

čimbenicima (ionizirajuće x-zračenje, UV-svjetlost, temperatura) i kemijskim tvarima koje

mogu imati nepovoljan učinak na žive organizme. Nazočnost određenih oblika energije ili

tvari u ekosustavu koji prvobitno takvu energiju ili tvar nije sadržavao (ili ih nije sadržavao u

velikoj količini) nazivamo onečišćenjem (Mȕezzinglu i sur., 1994).

Ljudska je zajednica posljednjih desetljeća sve ovisnija o različitim kemijskim tvarima. Na

tržištu se učestalo pojavljuju brojne tvari koje se sve češće i u sve većim količinama koriste u

svakodnevnom životu i industrijskoj proizvodnji, uslijed čega dolazi do oslobađanja tih

kemijskih tvari i njihovih raspadnutih produkata u zrak, prirodne vode i u tlo. Stoga se

nameće potreba stroge kontrole proizvodnje kemikalija i praćenje područja njihove primjene

te procjene potencijalne opasnosti za okoliš u slučaju njihovog nekontroliranog oslobađanja

(Shkolenok, 1994). Pojedini vodeni ekosustavi su posve uništeni, dok su mnogi prilično

narušeni čovjekovim štetnim utjecajem. Teški metali uvelike pridonose onečišćenju vodenih

ekosustava, što ugrožava ne samo biljni i životinjski svijet već i samog čovjeka kao dio

hranidbenog lanca.

Bitan parametar u ocjeni kvalitete prirodnih voda je sadržaj tragova metala (Branica, 1990,

Tesseier, 1995). Osnovna podjela tragova metala u vodenom okolišu prema biološkom

kriteriju je na toksične i netoksične. Međutim, osim ove podjele, vrlo je važna i

koncentracijska razina metala u okolišu. Neki metali, kao što su živa, kadmij i olovo, toksični

su već pri niskim koncentracijama, dok su drugi, kao npr. cink i bakar, pri svojim prirodnim

koncentracijama esencijalni, te reguliraju mnoge biokemijske procese. Tragovi metala u

vodenom okolišu uvijek su prirodno prisutni, a njihova prirodna koncentracija regulirana je

prirodnim procesima kao što je razaranje stijena i tla uslijed vremenskih utjecaja. Vrlo važna

činjenica kod tragova metala je da oni nisu biorazgradivi (za razliku od organske tvari), nego

samo prelaze iz jednog oblika u drugi. Tragovi metala u prirodnim vodama raspodijeljeni su

na otopljene oblike, koloidne i suspendirane oblike. Odnos navedenih oblika ovisi o prirodi

samog metala, ali i o sastavu vode.

S obzirom da su teški metali neophodni za osnovne stanične procese, ali toksični u većim

koncentracijama, potrebna je precizna kontrola nad njihovom unutarstaničnom

koncentracijom. Taj se proces regulacije naziva homeostaza. S obzirom da su biljke, kao

sesilni organizmi vrlo laka meta različitim onečišćivačima (teškim metalima), razvile su niz

prilagodbi i obrambenih mehanizama kako bi imale što bolji nadzor nad unosom,

2

nakupljanjem, transportom i isključivanjem slobodnih iona metala iz citoplazme (Martinez,

2006).

Dosad korištene metode uklanjanja teških metala iz okoliša kao što su toplinski tretmani,

iskapanja, pokrivanje kontaminiranih mjesta sa čistim tlom pa čak i njihovo recikliranje, često

nisu učinkovite, već su destruktivne i vrlo skupe (Barazani i sur., 2004). Iz navedenih se

razloga tijekom zadnja tri desetljeća javilo posebno zanimanje za fitoremedijaciju, odnosno

upotrebu biljnih vrsta zanimljivih osobina kao jeftinog i efikasnog načina uklanjanja teških

metala iz onečišćenog tla. Takve biljne vrste nazivamo hiperakumulatori. Biljke

hiperakumulatori su razvile toleranciju na ione teških metala kroz dodatne detoksikacijske

mehanizme koji mogu uključivati selektivan unos, vezanje u komplekse s posebnim

ligandima i odjeljivanje kompleksa metal-ligand (Roscio i Navari-Izzo, 2011).

1.1. Procjena stupnja onečišćenja

Fizikalne i analitičke metode koje se redovito rabe za određivanje prisutnosti i

koncentracije kemijskih tvari u okolišu, nam ne daju podatke o potencijalnom učinku tih tvari

na živi svijet. To vrijedi pogotovo u slučaju kada je u ekosustav uneseno više različitih

kemikalija, pa su moguće njihove međusobne interakcije, te interakcije s uobičajenim

sastojcima ekosustava.

Za procjenu učinka fizičkih ili kemijskih čimbenika na žive organizme već se niz godina rabe

biotestovi koji nam omogućuju otkrivanje učinka pojedinih tvari na živi svijet u okolišu. To

su postupci u kojima životinju ili biljku, izolirani organ ili stanice u kulturi izlažemo nekom

prisutnom fizičkom ili kemijskom čimbeniku ili kombinaciji više njih, te promatramo reakciju

organizma. Krajnji cilj je otkriti utječe li primijenjeni čimbenik na testni organizam, staničnu

strukturu, tkivo ili organ i na kraju uočenu promjenu kvalitativno i kvantitativno izraziti

(Vidaković-Cifrek,1999).

Prvi biotestovi su se provodili na životinjama, najčešće na glodavcima (Goldberg i Frazier,

1989). Iako testovi na sisavcima pružaju najtočnije informacije o mogućem učinku testiranog

čimbenika na čovjeka, danas se sve više napuštaju zbog cijene, dugotrajnosti, potrebe za

velikim prostorom kao i zbog sve većeg uvažavanja prava životinja. Osim toga, naš je okoliš

toliko opterećen otpadnim tvarima da prednost interesa nije više samo učinak tih tvari na

čovjeka, već na životne zajednice u cjelini (Vidaković-Cifrek, 1999).

Općenito se testovi toksičnosti mogu svrstati u nekoliko grupa s obzirom na trajanje, način

vršenja i svrhu vršenja (Erben i Lajtner, 1995). Prema trajanju se razlikuju testovi kratka

trajanja (akutni testovi toksičnosti), testovi srednjeg trajanja (supkronični testovi toksičnosti)

3

te testovi duga trajanja (kronični testovi toksičnosti). Trajanje testa određuju vrsta toksične

tvari te testni organizam i obično je isto za različite skupine organizama. Prema načinu

vršenja postoji statični test (hranidbena otopina i testni organizam stavljeni na početku pokusa

u posudu ili prostor gdje se test izvodi te ostaju tamo do kraja izvođenja), recirkulacijski test

(testna otopina cirkulira kroz posudu ili prostor u kojem se test izvodi i tijekom tog strujanja

se filtrira, sterilizira ili prozračuje u cilju održavanja nepromijenjene kvalitete), polustatični

test (statični test s periodičnom zamjenom testne otopine svježom otopinom istog sastava) i

protočni test (test uz mehaničko miješanje otopine pomoću miješalica). Prema namjeni

vršenja razlikuju se testovi procjene kvalitete efluenta, relativne osjetljivosti, brzine rasta,

poredbene toksičnosti, biostimulacije i bioakumulacije (Erben i Lajtner,1995).

Za izražavanje stupnja toksičnosti prije se koristila LC50, EC50 i NOEL vrijednost (LC-“lethal

concentration“, EC-“effective concentration“, NOEL-“no observable effect level“). LC50

vrijednost je koncentracija kemikalije koja izaziva smrt polovice pokusnih životinja. Budući

da toksična svojstva pokazuju i mnogo niže koncentracije, umjesto LC50 vrijednosti često se

koristi EC50 (IC50) vrijednost koja predstavlja koncentraciju koja izaziva određeni učinak na

50 % promatranih organizama. NOEL vrijednost je najviša koncentracija koja još ne izaziva

očekivane promjene u organizmu (Goldberg i Fraizer, 1989).

Na temelju učinka testirane tvari na odabrane organizme može se zaključiti hoće li ona

djelovati i na ostale organizme u nekom ekosustavu. Npr. istražuje li se učinak neke tvari na

primarne producente koji su prvi organizmi u hranidbenom lancu, moći će se pretpostaviti

kakav će učinak navedena tvar imati ukoliko putem hranidbenog lanca dospije u sekundarne i

tercijarne konzumente. Na temelju tog saznanja moći će se predvidjeti granice opterećenja

onečišćivača koje neki ekosustav može podnijeti (Shigeoka i sur.,1994).

Izbor testnih organizama u velikoj mjeri ovisi o tome što je svrha samog testa i o

mogućnostima laboratorija u kojem se test vrši. Izbor vrste može biti izvršen s obzirom na

stanište (pelagijal, epibentos, bentos), trofičku razinu (primarni producenti, herbivora,

karnivora, detritofagi), tip organizma (fitoplankton, kolutićavci, mekušci, člankonošci,

ribe…). Ipak ima više činjenica koje je potrebno uzeti u obzir pri izboru testne vrste:

osjetljivost vrste prema toksičnoj tvari ili faktorima koji se promatraju. Kako osjetljivost

varira među vrstama, treba uzeti vrste široka raspona osjetljivosti kad god je moguće. Treba

uzeti u obzir geografsku raširenost vrste, brojnost i dostupnost tijekom godine, ekološku

važnost vrste. Kad god je moguće treba uzeti vrste karakteristične za ekosustave u koje može

dospjeti dotična tvar. Nema standardnih testnih vrsta koje bi se mogle koristiti za sve

4

ekosustave (Erben i Lajtner, 1995).Važno je i poznavanje ponašanja, hranidbenih navika,

razmnožavanja te rasprostranjenosti odabrane vrste u istraživanom području.

1.1.1. Vrste i uporaba biljnih biotestova

Budući da su biljke proizvođači kisika i početni organizmi svakog hranidbenog lanca,

nužno je znati kako pojedini zagađivači okoliša na njih djeluju. Biljke su filogenetski udaljene

od čovjeka, ali zbog sličnosti strukture i funkcije biljnih i životinjskih stanica, moguće je, na

temelju rezultata dobivenih u biljnim biotestovima, predviđanje štetnog djelovanja testirane

tvari na druge organizme, uključujući i čovjeka. Zbog postojanja tvari koje u određenim

koncentracijama nemaju nikakav učinak na animalne organizme (jer nemaju kemijski ustroj

koji bi sadržavao cilj djelovanja takvih toksikanata), a djeluju na procese u biljkama, nužno je

prilikom studiranja učinka tih tvari u skupinu odabranih testova uključiti i test na biljnom

organizmu. Takve tvari su pesticidi koji nakon ispiranja s obradivih površina dospijevaju u

kopnene vode, pa na taj način vodene biljke postaju njihovi ciljni organizmi (Gaggi i

sur.,1995, Wang, 1986). Danas već postoje biljni testovi koji se rutinski rabe za procjenu

toksičnosti određenih tvari (Wang, 1991).

Kao pokazatelji učinka testiranih tvari u testovima u kojima se koriste niže biljke najčešće se

mjeri količina kisika proizvedenog fotosintezom ili potrošnja kisika disanjem, količina

fotosintetskih pigmenata i prirast biomase (Matthews, 1982). U vodenih se biljaka često mjeri

rast i razvoj, duljina korijena, sadržaj klorofila, fotosintetska aktivnost, aktivnost nekih

enzima (Lewis, 1995), makroskopske morfološke promjene i ultrastrukturne promjene (Grill i

sur.,1992). Kod kopnenih se biljaka prate još i klijavost sjemena, elongacija stabljike i

korijena (Cheung i sur., 1991), mitotička aktivnost meristema, kromosomske nepravilnosti,

sadržaj pigmenata, koncentracija proteina i lipida, sadržaj DNA i RNA, sastav aminokiselina

te koncentracija fenola i šećera (Malallah i sur.,1996). Među biljnim testovima jako se često

primjenjuju oni u kojima se toksičnost primjenjuje na temelju mitotičkih i kromosomskih

promjena u meristemskim dijelovima biljke (Allium.test, Vicia-test…). Ovim je testovima

moguće otkriti i genotoksičnost pojedinih spojeva (Gerster i Grant, 1989).

5

1.1.2. Biljke iz porodice Lemnaceae

Lemna test se već niz godina koristi u biljnoj fiziologiji i fitokemiji za određivanje

biološke aktivnosti različitih tvari, te u toksikologiji za procjenu toksičnosti pojedinih

kemikalija (Hillman, 1961). Tvari čiji se učinak želi istražiti dodaju se u tekuću hranidbenu

podlogu na kojoj se uzgaja neka od vrsta iz porodice Lemnaceae. Na temelju rasta i razvoja

biljaka procjenjuje se učinak ili toksičnost istraživanih tvari (Lewis, 1995). Do danas su se

biotestovi s vodenim lećama kao testnim organizmima uspješno rabili pri procjeni učinka

teških metala (Khellaf i Zerdaoui, 2009), fenola (Cowgill i sur.,1991), herbicida (Krsnik-

Rasol i Rendić,1977), surfaktanata (Lockhart i sur.,1989).

Sve vodene leće su malene, jednostavno građene jednosupnice. Porodica Lemnaceae

obuhvaća četiri roda: Lemna, Spirodela, Wolffia i Wolffiella. Većina vrsta su slobodno

plutajuće, dok se manji broj vrsta nalazi neposredno ispod površine vode. Tijelo biljke

nalikuje duguljastim listićima duljine do 1 cm. Često je veći broj jedinki međusobno spojen

vriježama tvoreći koloniju. Korijenje je u obliku tankih niti duljine 1-5 cm, ali u nekih vrsta

ono uopće nije razvijeno (Hillman, 1961). Postoji teorija po kojoj širi dio biljke (distalni dio)

odgovara listu, a uži (proksimalni dio) reduciranoj osi izdanka. Proksimalni dio se tako naziva

zato što je kod vegetativnog razmnožavanja taj dio biljke-kćeri bliže majčinskoj biljci. Na

proksimalnom dijelu biljnog tijela nalazi se sa svake strane po jedna tvorba nazvana

reproduktivni džep u kojem se nalazi meristemska regija. Unutar tih tvorbi započinje proces

vegetativnog razmnožavanja pupanjem ili razvoj cvijeta. U hranidbenoj otopini optimalnog

sastava vegetativno razmnožavanje je gotovo eksponencijalno (Landolt, 1986). Vodene leće

cvatu rijetko i samo u optimalnim uvjetima (Krajnčič i Devidȇ, 1980). Mnoge vrste iz te

porodice imaju sposobnost akumulacije nekih tvari (npr.teških metala) u količinama koje

prelaze njihove fiziološke potrebe pa se rabe i za pročišćavanje voda (Hillman i Culley, 1978,

Bionardi, 1994).

Te vrste posjeduju brojne osobine koje ih čine prikladnim za rad u laboratoriju: malih su

dimenzija, no ipak dovoljno velike da se neke promjene uzrokovane dodatkom istraživanih

tvari u podlogu mogu promatrati golim okom, jednostavne su građe, nema potrebe za velikim

prostorom tijekom uzgoja i izvođenja pokusa, hranidbena podloga je jednostavna i jeftina,

brzo se razmnožavaju, razmnožavaju se vegetativno što osigurava genetičku homogenost

testnih organizama, osjetljive su na nazočnost različitih tvari u hranidbenoj podlozi.

Nedostatak Lemna testa je različitost postupaka u izvođenju pokusa kod različitih istraživača,

što znatno otežava usporedivost rezultata (Christen i Theuer, 1996). Različitosti u izvođenju

se odnose na vrijeme trajanja testa, promatrane pokazatelje toksičnosti, hranidbeni medij koji

6

se koristi, te volumen i oblik posude u kojoj se biljke uzgajaju. Također, prilikom testiranja

smjesa tvari treba uzeti u obzir mogućnost interakcije sastojaka hranidbene podloge s

komponentama smjese (Wang, 1992).

Lemna gibba L. (grbasta vodena leća) je globalno rasprostranjena vrsta koja nastanjuje

umjerena područja Europe, Afrike, Južne i Sjeverne Amerike te Azije. Kako se radi o

flotantnoj vrsti, često stvara guste nakupine na vodenim površinama zajedno s drugim vrstama

vodenih leća, slika 1.

Slika 1. Talus i korijen vrste Lemna gibba L. (web 1) (29.9.2012.)

1.2. Bakar

Izloženost bakru u prirodi je neizbježna. Procjenjuje se da se više od 75 000 t godišnje

ispušta bakar u atmosferu, od čega se za ¼ pretpostavlja da dolazi iz prirodnih izvora, dok je

ostatak antropogenog porijekla.

Bakar je esencijalni element koji postaje toksičan ako promašuje fiziološke potrebe. Ovaj je

odnos opisan krivuljom u obliku slova U, slika 2. Odnos između unosa i zdravlja je pod

utjecajem fizioloških čimbenika koji održavaju homeostazu, te vanjskih čimbenika koji utječu

na dostupnost bakra.

7

Smrt

Esencijalni nutrijent

Cu homeostaza

Neesencijalni toksikant

Područje toksičnosti

Područje bez štetnoga

učinka

Prag toksičnosti

Prag nedostatka

Bez štetnih učinaka

Učinci

Doza

Slika 2. Doza-odgovor odnosi; esencijalni elementi pokazuju polukružno oblikovanu krivulju

koja leži između nedostatka koji u konačnici dovodi do smrti te viška koji je otrovan, a

također može dovesti do smrti (Moore i sur.,1997)

Bakar je uključen u funkciju više različitih enzima, najviše onih koji sudjeluju u redoks

reakcijama (Linder i Hazegh-Azam,1996). Primjeri enzima su citokrom c-oksidaza, koja je

ključni enzim u transportnom lancu elektrona, superoksid dismutaza (ima ulogu hvatača

slobodnih radikala), lizil oksidaza (presudna za umrežavanje kolagenih vlakana), feroksidaza

(važna uloga u transportu željeza), dopamin β-monooksigenaza (potrebna za metabolizam

dopamina i katekolamina), tirozinaza (potrebna za proizvodnju melanina) te mnogi drugi.

Bioraspoloživost bakra uvelike ovisi o kemiji vode. Često mjerenja ukupne koncentracije

bakra nisu točna, koliko mjerenja kemijskih specijacija bakra (Allen, 1993). Specijacije

metala u tragovima uključuju određivanje fizičkih i kemijskih oblika metala. To uključuje

procjenu slobodnih iona metala, anorganskih i organskih kompleksa, te organometalnih

spojeva, tablica 1. Olovni, bakreni i kadmijevi, te mnogi drugi metalni ioni mogu formirati

komplekse s brojnim anorganskim ligandima (kao što je OH-, HCO3-, NH3), te organskim

ligandima, kao što je oksalna kiselina i EDTA (etilendiamin-tetraoctena kiselina) (Stumm i

Morgan, 1981).

Toksičnost bakra i drugih metala ovisi o njihovom kemijskom obliku (Hudson i Luoma, 1983,

O'Donnel, 1985, Fleming i Trevors, 1989). Ovisnost između specijacije bakra i toksičnosti je

najbolje proučena u radu Sunda i Guieearda (1976), koji su utvrdili da je stopa rasta algi

povezana s aktivnošću slobodnih bakrenih iona, a ne s ukupnom koncentracijom bakra. Neki

8

su istraživači dokumentirali da su i neke druge specijacije bakra, osim slobodnih bakrovih

iona toksične (Campbell, 1995). Tako je Cowan (1986) otkrio kako su neorganske specijacije

bakra toksične. Erickson i sur. su 1996. godine uočili da povećana pH vrijednost, tvrdoća,

otopljene organske tvari i suspendirane tvari uzrokuju smanjenje toksičnosti određenih

metala. To upućuje na važnost uzimanja u obzir ovih parametara unutar vodenih ekosustava.

Tablica 1. Primjeri specijacije bakra u prirodnim vodama (Batley, 1989)

Slobodni metalni ioni

Anorganski kompleksi

Organski kompleksi

Slabi kompleksi

Kompleksi topivi u lipidima

Pričvršćeni na koloide

Pričvršćeni na čestice

Cu(H2O)62+

CuCO3, Cu(CO3)2-, Cu(OH)2, Cu(OH)+

Cu-fulvinska kiselina

Cu-oxinat

Cu-Fe(OH)3-

Cu apsorbiran na ili u česticama gline

Metalna se regulacija može ostvariti na transkripcijskoj, translacijskoj ili enzimskoj razini. Na

molekularnoj razini ovi mehanizmi djeluju putem metal vezujućih proteina.

Metaloregulacijski proteini djeluju kao konformacijski prekidači koji se nalaze u aktivnoj

formi vezivanjem metalnih kationa (O'Halloran, 1993). Detoksikacijski se put bakra sastoji od

dva mehanizma za neutralizaciju viška bakra. Prvo, bakar se veže na metalotionein u

neškodljiv kompleks. Drugo, višak se bakra transportira van stanice uz pomoć crpki

(Dameron i Harnison,1991), slika 3.

9

Slika 3. Smanjenje aktivnosti slobodnih bakrovih iona stvaranjem kompleksa bakra s

organskim i anorganskim ligandima, te kompeticija bakra i kalcijevih, magnezijevih,

natrijevih i vodikovih kationa, što dovodi do smanjene sposobnosti vezivanja bakra i

biotičkih liganada, što u konačnici vodi ka smanjenju toksičnosti (Janssen i sur.,2003).

1.3. Ribnjaci uz rijeku Česmu na području Bjelovarsko-bilogorske županije

Rijeka Česma duga je 123 km, a nastaje spajanjem potoka Grđevice, Barne i Injatice

koji izviru na južnom dijelu Bilogore na oko 250 m nadmorske visine. Česma izvire i većim

dijelom protječe Bjelovarsko-bilogorskom županijom, te kod Popovače utječe u rijeku Lonju

(Program zaštite okoliša Bjelovarsko-bilogorske županije, 2003). Uz njezine poplavne i

dijelom zamočvarene obale izgrađeni su brojni gospodarski ribnjaci (Blatnica, Narta, Sišćani i

Vukšinac) koji su danas većim dijelom zapušteni. Rijeka Česma je danas gotovo cijelim

svojim tokom kanalizirana i uređena. Česma je dug niz godina zbog velike raznolikosti

staništa i iznimne kakvoće vode bogate ribljim vrstama, bila zanimljiva sportskim

ribolovcima.

Ribnjaci Narta, Blatnica i Siščani protežu se u dužini od 32 km u pravcu istok-zapad od sela

Međurače na istoku do Kostanja na zapadu. Ribnjaci zauzimaju ravničarski krajolik koji je do

polovice 20. stoljeća predstavljao močvarnu poplavnu nizinu rijeke Česme koja se nastavlja

na poplavnu dolinu rijeke Save i Lonjsko polje. Nakon sveopće regulacije vodotoka i

isušivanja dijela vlažnih područja, ovi ribnjaci predstavljaju zamjenska staništa za prvobitno

močvarna područja (Prostorni plan Bjelovarsko-Bilogorske županije, 2010).

10

Ukupna površina koju pokrivaju privredni ribnjaci u Bjelovarsko-bilogorskoj županiji iznosi

3181 ha. To je značajna površina koja ovu Županiju čini najbogatijom glede ovog privrednog

resursa u RH. Površina pod ribnjacima sliva rijeke Česme iznosi 1346 ha (Program zaštite

okoliša Bjelovarsko-bilogorske županije, 2003).

Na najuzvodnijem dijelu Česme, s njene južne strane, nalaze se ribnjaci Narta ukupne

površine 670 ha (Prostorni plan Bjelovarsko-Bilogorske županije, 2010). Okruženi su sa više

manjih, ali značajnih šumskih kompleksa (Dugački gaj, Dabrovina, Bukvik i Velika

Stražanica), prvenstveno hrasta lužnjaka (Quercus robur), slika 4. Osim ovih šuma, ribnjaci

su okruženi manjim, privatnim obradivim poljoprivrednim površinama i livadama

košanicama.

Nažalost, na ribnjacima Narta proizvodnja ribe je prestala, te još uvijek nije obnovljena. Prije

dvije godine (2010.) pod vodom su bila četiri ribnjaka (od ukupno dvanaest ribnjaka koji čine

kompleks pod nazivom-ribnjaci Narta), danas je preostao samo jedan ribnjak (Ribnjak

“Jedinica“), te Ribnjak “Dvojka“ koji je u visokom stupnju eutrofikacije, zbog čega u njemu

nisu prisutne riblje vrste (2012.).

Slika 4. Satelitski snimak kompleksa ribnjaka Narta na području Bjelovarsko-bilogorske

županije (web 2) (1.10.2012.)

Ribnjacima su osnovni izvori vode pritoci rijeke Česme i pripadajuće oborinske vode. Glavni

kanali i pritoci napajanja su: Vagovina, Batinovac i Šokot kao lijevi pritoci, te Velika,

Plavnica i Severinska kao desni pritoci rijeke Česme.

11

Na ribnjacima se mogu naći različiti tipovi staništa, prvenstveno vodena i močvarna, a zatim

ruderalna i antropogena staništa. Uz ribnjake se nalaze livadna i šumska staništa, te obradive

poljoprivredne površine. Prema CORINE klasifikaciji (Topić i Ilijanić, 2005) na ribnjacima

razlikujemo hidrofitske zajednice slatkih i boćatih voda (slobodno plivajuća vegetacija-

Lemnion, Hydrocharition, zakorijenjena submerzna vegetacija-Potamogetonetea pectinati,

zakorijenjena plutajuća vegetacija), širokolisne listopadne šume (hrastovo-grabove šume-

Carpinion betuli), priobalne, močvarne šume i šikare, vegetacija vodenih rubova (trščaci-

Phragmitetalia), zajednice trske (Scirpo-Phragmitetum), sastojine rogoza (Typhetum), slika 5.

Slika 5. Zajednice vodene leće na ribnjaku dvojci (lijevo) i zajednice trske, lokvanja i ostale

plutajuće vegetacije na rijeci Česmi kod mjesta Narta (desno) (fotografirala: Ivana Gračanac,

20.7.2012.)

1.3.1. Izvori onečišćenja voda ribnjaka na području Bjelovarsko-bilogorske županije

Glavni izvori onečišćenja su otpadne vode naselja i gospodarstva, ispiranje raznim

herbicidima (glavni sastojak bakar) i umjetnim gnojivima tretiranih poljoprivrednih površina,

te divljih, polulegalnih i napuštenih odlagališta otpada i smetlišta. Najveći zagađivači su

prehrambena industrija i stočarstvo (biološko opterećenje), no daleko opasnije je ispuštanje

opasnih tvari kao što su ulja, teških metala i kemikalija, koje se nekontrolirano bacaju na

divlja odlagališta otpada, iz kojih se štetne tvari ispiru u tlo i vodotoke. U nekoliko zadnjih

godina značajniji akcidenti na vodotocima primijećeni su u prosjeku jednom godišnje za

vrijeme niskog vodostaja. Onečišćenja su kratkotrajna, ali s pogubnim utjecajem na floru i

faunu vodotoka, nastala zbog nekontroliranog ispuštanja većih količina gnojnice s farmi ili

kvarova na uređajima za pročišćavanje otpadnih voda naselja i tvrtki. Regulacija korita

12

vodotoka i melioracija močvarnih površina dovela je do nestanka velikih poplavnih i

močvarnih površina, te nestanka nekih vrsta staništa, što je doprinijelo evidentnom smanjenju

biološke raznolikosti i brojnosti pojedinih vrsta u velikom dijelu vodotoka (Program zaštite

okoliša Bjelovarsko-bilogorske županije, 2003).

Najveći zagađivač u Županiji koji ispušta otpadne vode mješovitog tipa je Dukat (bivša

Sirela), a u emisiji suspendiranih tvari sudjeluje sa 85 %, u organskom opterećenju sa 62 %

(KPK), odnosno BPK5 sa 47 %, emisiji amonijaka sa 67 % (Program zaštite okoliša

Bjelovarsko-bilogorske županije, 2003). Od specifičnih onečišćenja koja su ustanovljena kroz

katastar treba spomenuti fenole, željezo, krom, bakar te cink.

Ostali potencijalni zagađivači rijeke Česme su Prerada, Duhan, Tvornica opruga ESCO,

Hidroregulacija, Hittner, Ljevaonica te drvne industrije koje su indirektno povezane sa

površinskim vodama.

Drugi vid ugroženosti predstavlja provedba lovnih aktivnosti na samim ribnjacima, te osobito

korištenje olovne sačme tijekom lova na ptice močvarice i tzv.“sitnu divljač“. Ova sačma se

tijekom lova rasipa po širem području ribnjaka, te predstavlja stalan izvor olova koje može

uzrokovati akutno ili kronično trovanje organizama (Mateo, 2009, Pain i sur., 2009).

Treći je vid ugroženosti prestanak proizvodnje ribe (najveći problem ribnjaka Narta) pri čemu

se oni više redovito ne pune vodom, te tako gube vrlo vrijedna vlažna i močvarna staništa za

razmnožavanje močvarnih svojti, kao i hranilišta za brojne ptice tijekom seobe ili zimovanja.

Osim isušivanja ribnjaka okolišnim uvjetima, veliki je problem i nekontrolirano vađenje

drvenih zaporki (najčešće od strane lovaca) uslijed čega dolazi do istjecanja vode iz ribnjaka u

ispusni kanal koji je povezan sa rijekom Česmom.

Tablica 2. prikazuje koncentracije metala (u mikrogramima po litri) u rijeci Česmi (kod

ribnjaka Narta) kroz vremensko razdoblje od 1.1.2010 do 31.12.2011 (Hrvatske vode, glavni

vodnogospodarski laboratorij). Na temelju navedenih koncentracija možemo uočiti povišene

vrijednosti koncentracija olova, bakra, arsena, mangana i željeza, dok su koncentracije ostalih

metala na razini prve vrste kakvoće vode (Uredba o klasifikaciji voda, NN 77/98). Prilog 1

pokazuje ostale parametre za procjenu kakvoće vode rijeke Česme na području Narte (okolica

Bjelovara). Rijeku Česmu po fizikalno kemijskim pokazateljima (pH vrijednost, električna

vodljivost, alkalitet…) svrstavamo u prvu vrstu kakvoće vode, po režimu kisika (kemijska i

biokemijska potrošnja kisika te zasićenje kisikom) u drugu i treću vrstu kakvoće vode

(najlošije vrijednosti kod biokemijske potrošnje kisika ili BPK5). Najveće su vrijednosti

koncentracija hranjivih tvari u rijeci Česmi, koje variraju od druge pa sve do pete (najlošije)

vrste kakvoće vode. Od mjerenih hranjivih vrijednosti najviše se ističe koncentracija fosfora,

13

što potkrepljuje teoriju zagađenja biljnim zaštitnim sredstvima, te umjetnim gnojenjem. Na

temelju svih uspoređenih parametara, rijeci se Česmi može pripisati druga kategorija kakvoće

vode. Međutim, stanje je 2000. godine bilo lošije zbog većeg broja tvornica na području

Bjelovara, te lošije konstrukcije, odnosno manjeg broja uređaja za pročišćavanje komunalnih i

industrijskih otpadnih voda.

Tablica 2. Koncentracije metala (μg/L) u rijeci Česmi (kod ribnjaka Narta) u razdoblju od

1.1.2010 do 31.12.2011 (Hrvatske vode, glavni vodnogospodarski laboratorij)

METALI 2.3.10. 1.6.10. 2.9.10. 2.12.10. 1.3.11. 7.6.11. 8.9.11. 6.12.11. Bakar,otopljeni (μg/L) 2.6 3.73 1.59 2.22 1.04 1.04 2.29 1.67 Cink,ukupni (μg/L) - - - - 2.6 12.2 9.73 11.7 Cink,otopljeni(μg/L) 1.6 5.67 2.79 4.44 1.89 0.215 1.77 7.77 Kadmij,otopljeni(μg/L) 0.037 0.027 <0.01 0.011 <0.01 0.0110 <0.01 <0.01 Krom, otopljeni (μg/L) 0.518 1.49 0.174 0.783 <0.18 0.22 <0.18 0.658 Nikal, otopljeni (μg/L) 0.962 6.04 1.57 3.76 1.22 1.45 2.84 0.767 Olovo, otopljeno (μg/L)

0.207 0.251 0.134 0.658 0.04 0.221 0.343 0.299

Živa,otopljena (μg/L)

<0.02 0.002 <0.002 <0.002 0.008 0.003 <0.002 0.004

Arsen, otopljeni (μg/L) 1.27 2.42 4.24 1.11 1.8 9.01 7.47 3.26 Mangan,otopljeni (μg/L)

21.3 88.5 6.2 31.6 14 23.2 23.1 30.2

Željezo,otopljeno (μg/L)

13.5 305 126 541 19.7 46.2 38 44.2

1.4. Cilj istraživanja

Cilj ovog rada bio je istražiti utjecaj različitih koncentracija bakra na dvije kulture

vrste Lemna gibba L. (sterilne laboratorijske i kulture iz ribnjaka Narta), te usporediti njihovu

osjetljivost pomoću IC50 vrijednosti izračunatih iz različitih parametara.

14

2. MATERIJAL I METODE

2.1. Biljni materijal

Za ispitivanje utjecaja bakra na rast vrste Lemna gibba korištene su dvije kulture ove

vrste. Jedna je kultura izolirana iz drenažnih kanala Istočne Hrvatske 2006. godine i od tada se

uzgaja u laboratoriju u akseničnim uvjetima te se koristi za laboratorijske testove. Druga

kultura izolirana je iz ribnjaka Narta (okolica Bjelovara) u ljeto 2012. godine.

2.2. Ribnjak Narta

Kompleks od dvanaest ribnjaka koji su ime dobili po mjestu Narta, nalaze se u blizini

Bjelovara. Ribnjaci su okruženi šumskim kompleksom hrasta lužnjaka, manjim privatnim

obradivim površinama, te livadama košanicama. Narta, Paljevine i Kolarevo Selo su tri glavna

naselja koja se nalaze u neposrednoj blizini ovih ribnjaka. Uzorci vrste Lemna gibba L.

izolirani su iz ribnjaka br. 2, slika 6. i 7.

Slika 6. Satelitski prikaz mjesta uzorkovanja vodene leće (Lemna gibba L.) na ribnjaku Narta

(br.2) (web 2) (1.10.2012.)

Na satelitskom se prikazu uočava kompleks kanala od kojeg je izgrađen ribnjak br.2. Zbog

eutrofikacije, isušivanja vodenog pokrivača (bilo prirodnim ili antropogenim učincima) te

prevelikog izlovljavanja ribljeg resursa, na ovom su ribnjaku prestale sportske i rekreativne

15

aktivnosti. Ribnjak br.1 je danas jedini u funkciji ribolovstva te rekreativnih aktivnosti, stoga

na ovom ribnjaku nema plutajućih biljnih zajednica, između ostalog i vodene leće.

Slika 7. Ribnjak Narta (br.2) (fotografirala: Ivana Gračanac, 15.6.2012.)

Vodene se leće morfološki razlikuju od onih koje su uzgajane u laboratorijskim uvjetima kroz

nekoliko godina. Njihov je korijen znatno duži te se uočava veći sadržaj pigmenta antocijana

u vakuolama donje epiderme, što upućuje na stres uzrokovan okolišnim uvjetima i

kompeticijom s ostalim biljnim vrstama prisutnim u ribnjaku Narta, slika 8. Međutim, nakon

sterilizacije i dvotjedne kultivacije u laboratorijskim uvjetima, njihov se izgled i stanje

izjednačilo sa vodenim lećama održavanim u laboratorijskim uvjetima od 2006. godine.

Slika 8. Lemna gibba L. izolirana iz ribnjaka (lijevo) i uzgajana u laboratorijskim uvjetima

(desno) (fotografirala: Ivana Gračanac, 20.7.2012)

16

2.3. Uvođenje i održavanje vodene leće u kulturi

Vodene su leće sterilizirane etanolom i živinim kloridom sljedećim postupkom

(Krajnčić i Devidȇ, 1980):

1. Ispiranje u sterilnoj destiliranoj vodi, 5 minuta

2. Ispiranje u 50 %-tnom etanolu, 45 s

3. Ispiranje u sterilnoj destiliranoj vodi, 30 s

4. Ispiranje u 0,1 %-tnoj otopini živina klorida (HgCl2), 50 s

5. Ispiranje u sterilnoj destiliranoj vodi, 30 s

6. Ispiranje u sterilnom hranidbenom mediju, 60 s

Nakon postupka sterilizacije uslijedila je kultivacija u trajanju od 14 dana. Za potrebe uzgoja

biljaka svaka je sterilna kolonija prebačena na 100 ml sterilne hranjive otopine (Pierson i

Seidl, 1950) u Erlenmeyerovoj tikvici od 300 ml. Sastav hranjive otopine za uzgoj biljka

nalazi se u tablici 3. Hranjiva otopina pripremljena je neposredno prije upotrebe u destiliranoj

vodi te je pH vrijednost podešena na 4,55 s otopinom kalijeva hidroksida koncentracije 0,1

mol dm-3. Pripremljen hranjivi medij kao i sav potreban pribor sterilizirani su autoklaviranjem

pri temperaturi 121 ºC i tlaku od 1,2 bara. Pri presađivanju biljaka metalni je pribor dodatno

steriliziran uranjanjem u 96 %-tni etanol i spaljivanjem u plamenu. Biljke su presađivane u

sterilnoj komori. Nakon presađivanja, biljke su uzgajane u inkubacijskoj komori u uvjetima

dugog dana (16 sati osvjetljenja i 8 sati tame), na temperaturi 24±1ºC uz osvjetljenje 70 μmol

m-2s-1 kroz 14 dana. Pri istim su uvjetima biljke držane i za vrijeme trajanja eksperimenta.

Tablica 3. Sastav hranidbene podloge po Pierson i Seidlu (1950)

MAKROELEMENTI mg/L KNO3 400

KH2PO4 200 MgSO4 7 H2O 300 CaCl2 ∙ 2 H2O 804

MIKROELEMENTI mg/L MnCl2 ∙ 4 H2O 0,3

H3BO3 0,5 Na2-EDTA ∙ 2 H2O 18,6

Željezni citrat 5 ORGANSKI

DODACI g/L Saharoza 10 Asparagin 0,1

17

2.4. Izvedba Lemna testa

Sterilne biljke u kulturi staroj 14 dana presađene su u Erlenmeyerove tikvice od 300

mL, u kojima se nalazilo 100 mL hranidbenog medija po Pierson i Seidlu. U svaku je tikvicu

nasađeno 12 zdravih jedinki vrste Lemna gibba L. (3 kolonije po 4 biljke ili 4 kolonije po 3

biljke), koje su izlagane različitim koncentracijama bakra (0.1; 0.3; 1; 3; 5 mg/L) tijekom

perioda od 7 dana. Svaka pojedina koncentracija priređena je u 6 replika. S obzirom na način

održavanja hranidbenog medija korišten je statički test, što znači da se hranidbeni medij

tijekom izvođenja pokusa ne mijenja. U periodu od 7 dana praćen je prirast broja biljaka,

masa svježe i suhe tvari, koncentracija pigmenata te prirast i količina proteina.

2.4.1. Određivanje prirasta broja biljaka

Prirast broja biljaka određivan je brojanjem biljaka svih 7 dana pokusa. Pri tome je

brojena svaka, pa i najmanja biljka vidljiva golim okom. Dobiveni podaci uvrštavani su u

sljedeći izraz (Ensley i sur., 1994):

broj biljaka n-tog dana - broj biljaka 1. danaPrirast broja biljaka=broj biljaka 1. dana

(n=2,3,4,5,6,7)

2.4.2. Određivanje prirasta mase svježe tvari i mase suhe tvari

Masa svježe tvari određivala se vaganjem svježih biljaka neposredno prije početka

pokusa i na kraju pokusa (7. dana). Masa suhe tvari određivala se nakon sušenja biljaka pri

temperaturi 105°C do konstantne mase. Prirast mase svježe tvari i mase suhe tvari izračunat je

prema sljedećem izrazu:

masa svježe tvari 7. dana - masa svježe tvari 1. danaPrirast mase biljaka (mg) =masa svježe tvari 1. dana

2.4.3. Određivanje omjera mase suhe i svježe tvari

Omjer mase suhe i svježe tvari izračunat je nakon uvrštavanja dobivenih podataka u

sljedeći izraz:

masa suhe tvari 7. dana Omjer mase suhe i svježe tvari =masa svježe tvari 7. dana

18

2.4.4. Određivanje koncentracije proteina

Za određivanje količine proteina rabljen je svježi biljni materijal nakon sedmodnevnog

tretmana na hranidbenim podlogama obogaćenim istraživanim tvarima.

Određena je količina biljnog tkiva (oko 0,2 grama) izvađena iz Erlenmeyerove tikvice i

osušena filter papirom. Zatim je tkivo usitnjeno u tarioniku uz dodatak tekućeg dušika.

Proteini iz tkiva ekstrahirani su 100 mM kalij-fosfatnim puferom uz dodatak PVP-a. U uzorak

je dodana boja Comassie brilliant blue (CBB) koja se specifično veže za proteine pri čemu

dolazi do promjene boje. Kompleks proteina i boje CBB ima maksimum apsorbancije pri 595

nm. Koncentracija proteina u uzorcima određena je prema baždarnoj krivulji poznate

koncentracije proteina (goveđeg serumskog albumina) i izražena kao mg proteina po gramu

svježe tvari biljaka.

2.4.5. Određivanje koncentracije pigmenata

Fotosintetski pigmenti klorofil-a, klorofil-b te karotenoidi, ekstrahirani su iz listova

biljaka donesenih sa terena i uzgajanih u laboratoriju. Biljke su najprije isprane destiliranom

vodom i osušene filter papirom, a potom je izvagano 0,2 g biljnog tkiva. Tkivo je macerirano

u tarioniku uz dodatak magnezijeva hidrogenkarbonata (MgHCO3) i 10 ml 90%-tnog acetona.

Macerirano tkivo je zatim stavljeno u plastične kivete te ekstrahirano 15 minuta u mraku pri

temperaturi 4º C. Reekstrakcija acetonom je ponovljena dok tkivo nije potpuno izgubilo

zelenu boju. Centrifugiranje je vršeno pomoću centrifuge LC 320 (Tehtnica, Železniki) pri

5000 G, 10 minuta na 4°C. Supernatant je odvojen u kivetu i mjerena je apsorbancija na 470,

644.8 i 661.6 nm pomoću spektrofotometra Specord 40, UV VIS Spectrophotometer, Analytik

Jena AG. Koncentracija klorofila i karotenoida određena je prema Lichtentaler-u (1987):

Chl-a (mg/g) = (11,24*A661,6 - 2,04*A644,8)*V/(m*1000)

Chl-b (mg/g) = (20,13*A644,8 - 4,19*A661,6)*V/(m*1000)

Chl-(a+b) (mg/g) = (7,05*A661,6 + 18,09*A644,8)*V/(m*1000)

Car(mg/g)=(1000*A470-1,90*(11,24*A661,6-2,04*A644,8)–63,14*(20,13*A644,8-4,19*A661,6))

*V/(214*m*1000)

.

19

2.5. Statistička obrada

Dobiveni podaci su statistički obrađeni aplikacijama Microsoft Office Excel 2007 i

Statistica 8 (StatSoft, Inc. 2007). Provedena je analiza varijance (ANOVA) i Tukey HSD test

na razini P<0,05. Usporedba odgovora dvije eksperimentalne kulture na tretman određenom

koncentracijom bakra uspoređen je Studentovim t-testom (P<0,05). Svi rezultati prikazani su

kao srednja vrijednost ± standardna devijacija više ponavljanja. Svako ponavljanje predstavlja

uzorak iz posebne Erlenmayerove tikvice, a točan broj ponavljanja za pojedine pokazatelje

rasta naveden je u opisu tablica i slika.

20

3. REZULTATI

3.1. Izgled biljaka

Tijekom sedam dana izlaganja biljaka različitim koncentracijama bakra uočene su

promjene vanjskog izgleda biljaka. Najintenzivnije morfološke promjene uočene su na višim

koncentracijama bakra (3 i 5 mg/L) već nakon prvog dana izlaganja. Od prvog do zadnjeg

dana eksperimenta ove su biljke svjetlije zelene boje i manje u odnosu na kontrolne skupine.

Isti se trend uočava kod obje kulture vrste Lemna gibba L. Nakon prvog dana izlaganja na

koncentraciji bakra 5 mg/L uočena je i dezintegracija kolonija (kod kultura izoliranih s

ribnjaka i na 3 mg/L bakra), te odvajanje nekih korjenčića od matične biljke. Drugog je dana

na 5 mg Cu/L uočen i početak kloroze, koji se na 3 mg Cu/L uočava tek trećeg dana izlaganja.

Međutim, uočena je razlika u klorozi (smeđenju) biljaka na 3 i 5 mg (Cu)/L. Dok je kloroza

na koncentraciji 3 mg/L ograničena na mlade biljke (eng. frond), na koncentraciji 5 mg/L

bakra je ona locirana isključivo na starijim listićima. Trećeg su se dana počeli pojavljivati i

novi listići na koncentraciji 5 mg (Cu)/L, što znači da su se biljke od trećeg dana izlaganja

višim koncentracijama bakra počele oporavljati. Preliminarnim istraživanjem je utvrđeno da

na koncentraciji 10 mg/L bakra tog oporavka nema, tj.na ovoj su koncentraciji biljke uginule

odmah prvog dana izlaganja. Četvrtog i petog dana nema znatnijih promjena, dok se stanje

šestog i sedmog dana izlaganja bitno popravilo, slika 9 i 10. Niže su koncentracije bakra (0.1,

0.3 i 1 mg/L) djelovale stimulirajuće na rast biljaka, kloroza nije uočena niti jednog dana

tretmana.

Slika 9. Izgled biljaka u kontroli (lijevo) i tretmanu s 5 mg/L bakra (desno) nakon sedam dana

izlaganja vrste Lemna gibba L. uzgajane u laboratorijskim uvjetima (fotografirala: Martina

Jelošek, 30.7.2012.)

21

Slika 10. Izgled biljaka u kontroli (lijevo) i tretmanu s 5 mg/L bakra (desno) nakon sedam

dana izlaganja vrste Lemna gibba L. izolirane iz ribnjaka (fotografirala: Martina Jelošek,

30.7.2012.)

3.1.1. Prirast broja biljaka

Prirast broja biljaka na hranjivoj otopini uz dodatak različitih koncentracija bakra

pratio se tijekom sedmodnevnog tretmana s obje kulture vrste L. gibba. Rezultati su prikazani

kao srednja vrijednost prirasta broja biljaka iz šest Erlenmeyerovih tikvica ± standardna

devijacija. Analiza varijance i Tukey HSD post hoc test pokazali su da bakar u koncentraciji 5

mg/L uzrokuje značajnu inhibiciju rasta (F(5,30)=4,05, p<0,01) već prvog dana tretmana

kulture uzgajane u laboratoriju, tablica 4. I ostale dane tretmana samo je najveća koncentracija

bakra imala statistički značajan utjecaj na smanjenje prirasta broja biljaka u odnosu na

kontrolu kod laboratorijske kulture biljaka. Koncentracije bakra u rasponu od 0,1 do 1,0 mg/L

uzrokovale su povećanje broja biljaka u odnosu na kontrolu već drugog dana tretmana te se taj

trend zadržao do kraja eksperimenta. Povećanje prirasta broja biljaka nije bilo značajno u

odnosu na kontrolu prema rezultatima analize varijance.

22

Tablica 4. Prirast broja biljaka tijekom sedmodnevnog tretmana kulture Lemna gibba

uzgajane u laboratoriju otopinom bakra. Prikazane vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost

prirasta broja biljaka u šest tikvica ± standardna devijacija.

* Značajna razlika u odnosu na kontrolu primjenom analize varijance i Tukey HSD testa

(P<0,05)

Prirast broja biljaka kulture L. gibba izolirane iz ribnjaka Narta prikazan je u tablici 5.

Tijekom sedmodnevnog tretmana, samo je koncentracija 5 mg/L uzrokovala statistički

značajno smanjenje prirasta broja biljaka u odnosi na kontrolu. Slično utjecaju na kulturu L.

gibba iz laboratorija, koncentracije bakra u rasponu od 0,1 do 1,0 mg/L potaknule su pojavu

većeg broja biljaka u odnosu na kontrolu i u ovom eksperimentu.

Tablica 5. Prirast broja biljaka tijekom sedmodnevnog tretmana kulture Lemna gibba iz

ribnjaka Narta otopinom bakra. Prikazane vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost prirasta

broja biljaka u šest tikvica ± standardna devijacija.

Konc. mg/L

Prirast broja biljaka (srednja vrijednost šest replika ± standardna devijacija) 1. dan 2. dan 3. dan 4. dan 5. dan 6. dan 7. dan

Kontrola 0,29 ± 0,11 0,28 ± 0,03 0,29 ± 0,02 0,29 ± 0,01 0,32 ± 0,03 0,32 ±0,01 0,34 ±0,01 0,1 0,35 ± 0,13 0,32 ± 0,05 0,33 ± 0,03 0,35 ± 0,02 0,35 ± 0,02 0,35 ±0,02 0,36 ±0,01 0,3 0,38 ± 0,09 0,32 ± 0,09 0,33 ± 0,03 0,34 ± 0,03 0,35 ± 0,02 0,35 ±0,01 0,36 ±0,01 1,0 0,31 ± 0,13 0,31 ± 0,05 0,31 ± 0,01 0,32 ± 0,03 0,33 ± 0,03 0,33 ±0,02 0,36 ±0,01 3,0 0,21 ± 0,05 0,28 ± 0,04 0,28 ± 0,01 0,27 ± 0,02 0,29 ± 0,02 0,29 ±0,01 0,32 ±0,01 5,0 0,15 ± 0,12* 0,20 ± 0,10* 0,19 ± 0,03* 0,18 ± 0,01* 0,17 ± 0,01* 0,16 ±0,02* 0,18 ±0,02* * Značajna razlika u odnosu na kontrolu primjenom analize varijance i Tukey HSD testa

(P<0,05).

Ako se srednja vrijednost kontrole izrazi kao 100%, a sve druge vrijednosti se izraze u odnosu

na tu kontrolu, može se usporediti trend odgovora dvije kulture na dodane koncentracije bakra

u hranjivom mediju. Za usporedbu su prikazane relativne vrijednosti prirasta broja biljaka 4. i

7. dana tretmana. Iako dolazi do blagih razlika u postotku smanjenja ili povećanja broja

biljaka u dvije kulture pod utjecajem iste koncentracije bakra, usporedba odgovora pokazala

Konc. mg/L

Prirast broja biljaka (srednja vrijednost šest replika ± standardna devijacija) 1. dan 2. dan 3. dan 4. dan 5. dan 6. dan 7. dan

Kontrola 0,31 ± 0,07 0,29 ± 0,04 0,27 ± 0,02 0,29 ± 0,02 0,31 ± 0,02 0,32 ± 0,01 0,32 ± 0,01 0,1 0,27 ± 0,07 0,31 ± 0,02 0,31 ± 0,02 0,33 ± 0,02 0,34 ± 0,02 0,34 ± 0,01 0,35 ± 0,01 0,3 0,34 ± 0,07 0,33 ± 0,04 0,34 ± 0,03 0,34 ± 0,03 0,35 ± 0,02 0,34 ± 0,02 0,35 ± 0,01 1,0 0,34 ± 0,10 0,30 ± 0,04 0,32 ± 0,03 0,32 ± 0,03 0,35 ± 0,04 0,33 ± 0,02 0,34 ± 0,03 3,0 0,26 ± 0,09 0,24 ± 0,05 0,27 ± 0,02 0,27 ± 0,02 0,29 ± 0,03 0,29 ± 0,04 0,29 ± 0,04 5,0 0,15 ± 0,12* 0,13 ± 0,10* 0,16 ± 0,06* 0,19 ± 0,03* 0,20 ± 0,02* 0,19 ± 0,01* 0,20 ± 0,02*

23

je da 4. dana nema statistički značajne razlike u prirastu broja biljaka između dvije kulture,

slika 11. Primjerice, tretman s 5 mg/L bakra uzrokuje smanjenje prirasta broja biljaka u

populaciji uzgajanoj u laboratoriju za 32% dok je smanjenje prirasta biljaka iz ribnjaka Narta

37% u odnosu na kontrolu. 7. dana eksperimenta dolazi do sličnih razlika u prirastu pri 5

mg/L bakra. U kulturi biljaka iz laboratorija smanjenje prirasta iznosi 37% dok je smanjenje u

populaciji iz ribnjaka Narta 47%. Usporedba ova dva rezultata, Studentovim t-testom,

pokazala je da se oni statistički značajno razlikuju (t=2,87, p=0.03), slika 12.

0

20

40

60

80

100

120

140

Kontrola 0,1 0,3 1,0 3,0 5,0

Koncentracija Cu (mg/L)

Rel

ativ

ni p

rira

st b

roja

bilj

aka

LaboratorijNarta

Slika 11. Relativni prirast broja biljaka 4. dana tretmana različitim koncentracijama bakra u

hranjivom mediju.

0

20

40

60

80

100

120

140

Kontrola 0,1 0,3 1,0 3,0 5,0


Rel

ativ

ni p

rira

st b

roja

bilj

aka Laboratorij

Narta

Slika 12. Relativni prirast broja biljaka 7. dana tretmana različitim koncentracijama bakra u

hranjivom mediju.

24

3.1.2. Prosječan broj biljaka po koloniji

Svakodnevnim određivanjem broja biljaka i broja kolonija u tretmanu s različitim

koncentracijama bakra praćen je proces raspada kolonija odnosno preuranjenog otpuštanja

fronda-kćeri od matičnog fronda. U sve dane tretmana samo je najveća koncentracija bakra

imala statistički značajan utjecaj na prosječan broj biljaka po koloniji u kulturi uzgajanoj u

laboratoriju, tablica 6. Već prvog dana tretmana broj biljaka po koloniji smanjio se na 1,41±

0,19 u odnosu na kontrolu (4,57 ± 0,62). U ostale dana eksperimenta prosječan broj biljaka po

koloniji u tretmanu s najvećom koncentracijom bakra zadržao se na gotovo istoj razini dok se

ukupan broj biljaka te broj kolonija povećavao u odnosu na prvi dan. Posljednjeg dana

eksperimenta, u tretmanu s 3 mg/L, prosječan broj biljaka po koloniji nešto je veći u odnosu

na kontrolu iako to povećanje nije statistički značajno.

Tablica 6. Prosječan broj biljaka po koloniji kulture uzgajane u laboratoriju u tretmanu s

različitim koncentracijama bakra po danu trajanja eksperimenta. Prikazane vrijednosti

predstavljaju srednju vrijednost prirasta broja biljaka u šest tikvica ± standardna devijacija.

Konc. mg/L

Prosječan broj biljaka po koloniji 1. dan 2. dan 3. dan 4. dan 5. dan 6. dan 7. dan

Kontrola 4,57 ± 0,62 6,01 ± 0,60 5,77 ± 1,37 6,55 ± 1,58 6,71 ± 1,53 6,95 ± 1,00 6,68 ± 0,94 0,1 4,62 ± 0,65 5,68 ± 0,45 4,59 ± 0,62 5,28 ± 0,76 4,91 ± 0,40 5,05 ± 0,48 5,08 ± 0,85 0,3 4,79 ± 0,95 5,70 ± 0,31 4,61 ± 0,54 4,73 ± 0,46 5,38 ± 0,58 5,93 ± 0,84 5,51 ± 0,51 1,0 5,03 ± 1,07 5,88 ± 1,06 4,62 ± 0,50 5,39 ± 0,59 5,71 ± 0,75 5,63 ± 0,77 5,98 ± 0,90 3,0 3,40 ± 0,58 4,42 ± 0,88 5,13 ± 1,15 5,52 ± 1,21 6,10 ± 0,70 7,24 ± 1,65 7,73 ± 1,57 5,0 1,41 ± 0,19* 1,26 ± 0,18* 1,37 ± 0,18* 1,69 ± 0,21* 1,68 ± 0,05* 1,59 ± 0,14* 1,75 ± 0,28*


(P<0,05).

Promjene prosječnog broja biljaka po koloniji kulture iz ribnjaka Narta na dodane

koncentracije bakra slične su odgovoru laboratorijske kulture. Prvog dana eksperimenta, pri 3

mg/L i 5 mg/L dolazi do raspada kolonija, odnosno do značajnog smanjenja prosječnog broja

biljaka po koloniji (2,53 ± 0,70 biljaka po koloniji za 3 mg/L, 1,14 ± 0,14 biljaka po koloniji

za 5 mg/L) u odnosu na kontrolne vrijednosti (4,33 ± 0,92 biljaka po koloniji). Četvrtog i

petog dana tretmana sve testirane koncentracije bakra uzrokovale su statistički značajno

smanjenje prosječnog broja biljaka po koloniji u odnosu na kontrolne vrijednosti. Sedmog

dana eksperimenta, koncentracija 3 mg/L bakra, i u ovom slučaju, povećala je prosječan broj

biljaka po koloniji (8,30 ± 0,23 biljaka po koloniji) u odnosu na kontrolu (4,33 ± 0,92 biljaka

25

po koloniji), dok je najveća koncentracija uzrokovala smanjenje (1,57 ± 0,20 biljaka po

koloniji), tablica 7.

Tablica 7. Prosječan broj biljaka po koloniji kulture iz ribnjaka Narta u tretmanu s različitim

koncentracijama bakra po danu trajanja eksperimenta. Prikazane vrijednosti predstavljaju

srednju vrijednost prirasta broja biljaka u šest tikvica ± standardna devijacija.

Konc. mg/l

Prosječan broj biljaka po koloniji 1. dan 2. dan 3. dan 4. dan 5. dan 6. dan 7. dan

Kontrola 4,33 ± 0,92 5,67 ± 0,74 6,77 ± 0,83 7,29 ± 1,13 8,03 ± 1,41 6,91 ± 1,07 6,42 ± 0,82 0,1 5,01 ± 1,05 5,92 ± 1,36 5,61 ± 0,81 4,97 ± 0,98* 5,84 ± 0,47* 5,57 ± 0,39 5,87 ± 0,33 0,3 5,34 ± 2,19 4,44 ± 0,47 4,93 ± 0,89 5,08 ± 0,51* 6,04 ± 0,45* 5,60 ± 0,48 5,46 ± 0,45 1,0 5,17 ± 0,95 4,66 ± 0,89 5,34 ± 0,64 5,62 ± 0,99* 6,53 ± 1,01* 6,68 ± 1,63 5,60 ± 0,51 3,0 2,53 ± 0,70* 3,24 ± 0,61* 3,90 ± 0,79* 4,43 ± 0,84* 5,70 ± 1,22* 6,33 ± 0,86 8,30 ± 0,23* 5,0 1,14 ± 0,14* 1,31 ± 0,14* 1,45 ± 0,11* 1,62 ± 0,15* 1,62 ± 0,19* 1,60 ± 0,10* 1,57 ± 0,20* * Značajna razlika u odnosu na kontrolu primjenom analize varijance i Tukey HSD testa

(P<0,05).

3.1.3. Svježa masa, suha masa i omjer suhe i svježe mase biljaka

Kao pokazatelj rasta biljaka mjerena je i masa svježe tvari, suhe tvari te omjer suhe i

svježe tvari nakon 7 dana od početka tretmana pri različitim koncentracijama bakra u

hranidbenom mediju. S obzirom da su u tretmanu s 5 mg/L bakra bile prisutne mrtve biljke i

mali broj vrlo sitnih mladih biljaka, vrijednosti za tu koncentraciju nisu prikazane zbog

nedostatne mase biljaka. Bakar je imao statistički značajan utjecaj na svježu masu biljaka u

obje testirane kulture, slika 13. U kulturi laboratorijskih biljaka sve koncentracije imale su

značajan utjecaj na svježu masu biljaka. Koncentracije u rasponu 0,1 do 1 mg/L uzrokovale su

porast mase svježe tvari. Najveći porast, 20% u odnosu na kontrolu, zabilježen je pri

najmanjoj koncentraciji bakra te se povećanje svježe mase u odnosu na kontrolu smanjivalo s

povećanjem koncentracije bakra do 10% povećanja pri 1 mg/L. Koncentracija 3 mg/L

uzrokovala je značajno smanjenje svježe mase biljaka u odnosu na kontrolu. Inhibicija

prirasta mase svježe tvari pri 3 mg/L bakra iznosila je 20,75 ± 0,15 %.

U eksperimentu s kulturom iz ribnjaka Narta, samo je koncentracija 3 mg/L imala značajan

utjecaj na svježu masu biljaka u tretmanima. Isto kao i kod laboratorijske kulture,

koncentracije 0,1 do 1 mg/L povećale su svježu masu biljaka u odnosu na kontrolu, ali to

povećanje nije statistički značajno (P < 0,05).

26

*

**

*

*

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

2,5

2,7

2,9

Kontrola 0,1 0,3 1,0 3,0Koncentracija Cu (mg/L)

Prir

ast s

vjež

e m

ase

LaboratorijNarta

Slika 13. Prirast svježe tvari biljaka uzgajanih sedam dana na hranjivoj podlozi uz dodatak

različitih koncentracija bakra. Tretmani označeni * značajno se razlikuju u usporedbi s

odgovarajućom kontrolom (P < 0,05).

Masa suhe tvari pokazala je isti trend promjena kao i mase svježe tvari biljaka. U kulturi

laboratorijskih biljaka sve koncentracije imale su značajan utjecaj na suhu masu biljaka. U

eksperimentu s kulturom iz ribnjaka Narta, samo je koncentracija 3 mg/L imala značajan

utjecaj na prirast suhe mase biljaka u tretmanima.

Udio suhe tvari u svježoj tvari biljaka nije se značajno mijenjao s promjenom koncentracije

bakra u hranjivom mediju u eksperimentu s obje korištene kulture, slika 14.

00,020,040,060,080,1

0,120,14

Kontrola 0,1 0,3 1,0 3,0


Udi

o su

he tv

ari u

svje

žoj t

vari

bi

ljaka

LaboratorijNarta

Slika 14. Omjer mase suhe i svježe tvari biljaka uzgajanih sedam dana na hranjivoj podlozi uz

dodatak različitih koncentracija bakra. Tretmani označeni * značajno se razlikuju u usporedbi

s odgovarajućom kontrolom (P < 0,05).

27

3.1.4. Koncentracija proteina

Nakon sedmodnevnog tretmana vodene leće uzgajane u laboratorijskim uvjetima došlo

je do značajnog povećanja koncentracije proteina u tretmanu s bakrom u rasponu

koncentracija od 0,1 do 1 mg/L. Najveći sadržaj proteina (8,57 ± 0,16 mg/g svježe tvari) i

pripadajući prirast (1,01 ± 0,02) su pri koncentraciji 0,1 mg/L bakra, tablica 8. U tretmanu s

koncentracijom 3 mg/L zabilježen je značajan pad koncentracije proteina (0,12 ± 0,02 mg/g

svježe tvari) na svega 1,8% vrijednosti kontrole.

Usporedi li se odgovor dvije kulture korištene u eksperimentu uočava se sličan trend

promjena, slika 15. I u slučaju kulture iz ribnjaka Narta sve su koncentracije bakra imale

značajan utjecaj na koncentraciju proteina, tablica 8. I ovdje se najveće vrijednosti

koncentracije (6,83 ± 0,02 mg/g svježe tvari) te prirasta koncentracije proteina (0,37 ± 0,01)

uočavaju kod koncentracije 0,1 mg/L bakra. Smanjenje koncentracije proteina samo je pri

najvećoj prikazanoj koncentraciji bakra (3 mg/L) i predstavlja smanjenje za 26% u odnosu na

kontrolu.

Tablica 8. Izmjerene vrijednosti koncentracije proteina i pripadajući prirast nakon sedam

dana tretmana različitim koncentracijama bakra. Prikazani rezultati su srednja vrijednost četiri

ponavljanja ± standardna devijacija.

Konc. (mg/L)

Laboratorij Narta Proteini

(mg/g svježe tvari) Prirast Proteini

(mg/g svježe tvari) Prirast Kontrola 6,61 ± 0,09 0,78 ± 0,01 6,29 ± 0,02 0,34 ± 0,01

0,1 8,57 ± 0,16 * 1,01 ± 0,02 * 6,83 ± 0,02 * 0,37 ± 0,01 * 0,3 7,46 ± 0,06 * 0,88 ± 0,01 * 4,52 ± 0,02 * 0,25 ± 0,01 * 1,0 7,61 ± 0,21 * 0,90 ± 0,03 * 4,76 ± 0,03 * 0,26 ± 0,01 * 3,0 0,12 ± 0,02 * 0,01 ± 0,01 * 0,12 ± 0,02 * 0,25 ± 0,01 *


(P<0,05).

28

*

**

**

* *

*0123456789

10


Prot

eini

(mg/

g sv

ježe

tvar

i) LaboratorijNarta

Slika 15. Koncentracija proteina (mg/g svježe tvari) biljaka uzgajanih sedam dana na

hranjivoj podlozi uz dodatak različitih koncentracija bakra. Tretmani označeni * značajno se

razlikuju u usporedbi s odgovarajućom kontrolom (P < 0,05).

3.1.5. Koncentracija fotosintetskih pigmenata

Izmjerene vrijednosti koncentracije fotosintetskih pigmenata u tkivu biljaka kulture

uzgajane u laboratoriju te pripadajući prirast tih parametara nakon sedmodnevnog tretmana

bakrom prikazan je u tablici 9. Vrijednosti iz tretmana s 5 mg/L nisu prikazane zbog

nedostatne mase biljaka potrebne za mjerenja. Analiza varijance i Tukey test pokazali su da

sve koncentracije bakra imaju značajan utjecaj na koncentraciju klorofila a, klorofila b i

ukupnog klorofila. Pri svim koncentracijama došlo je do smanjenja koncentracije klorofila pri

čemu je najveće smanjenje zabilježeno pri koncentraciji 3 mg/L bakra. U slučaju

koncentracije karotenoida, koncentracija 1 mg/L bakra značajno je povećala koncentraciju

karotenoida dok je koncentracija 3 mg/L bakra značajno smanjila sadržaj karotenoida u

tkivima, slika 16, 17, 18 i 19.

29

Tablica 9. Izmjerene vrijednosti koncentracije klorofila a, klorofila b, ukupnog klorofila i

karotenoida te pripadajući prirast nakon sedam dana tretmana kulture uzgajane u laboratoriju

pri različitim koncentracijama bakra. Prikazani rezultati su srednja vrijednost četiri

ponavljanja ± standardna devijacija.

Tretman bakrom Kontrola 0,1 mg/L 0,3 mg/L 1,0 mg/L 3,0 mg/L

Chl a (mg/g svježe tvari) 0,97 ± 0,11 0,74 ± 0,06 * 0,70 ± 0,05 * 0,86 ± 0,03 * 0,48 ± 0,12 * Prirast Chl a 0,20 ± 0,02 0,15 ± 0,01 * 0,14 ± 0,01 * 0,18 ± 0,01 * 0,10 ± 0,02 *

Chl b (mg/g svježe tvari) 0,53 ± 0,06 0,40 ± 0,04 * 0,38 ± 0,03 * 0,50 ± 0,05 * 0,32 ± 0,03 * Prirast Chl b 0,20 ± 0,02 0,15 ± 0,02 * 0,15 ± 0,01 * 0,19 ± 0,02 * 0,12 ± 0,01 *

Chl a +b (mg/g svježe tvari) 1,50 ± 0,16 1,14 ± 0,10 * 1,08 ± 0,08 * 1,36 ± 0,08 * 0,81 ± 0,15 * Prirast Chl a +b 0,20 ± 0,02 0,15 ± 0,01 * 0,15 ± 0,01 * 0,18 ± 0,01 * 0,11 ± 0,02 *

Car (mg/g svježe tvari) 0,24 ± 0,03 0,18 ± 0,02 0,17 ± 0,01 1,36 ± 0,08 * 0,14 ± 0,03 * Prirast Car 0,21 ± 0,02 0,15 ± 0,01 0,15 ± 0,01 1,15 ± 0,07 * 0,12 ± 0,02 *


(P<0,05).

U eksperimentu s kulturom iz ribnjaka Narta, bakar je značajno utjecao na koncentraciju

klorofila a i ukupnog klorofila samo pri najvećoj koncentraciji (3 mg/L), tablica 10.

Koncentracija klorofila a iznosila je 0,44 ± 0,01 mg/g svježe tvari i u usporedbi s kontrolom

(0,77 ± 0,04 mg/g svježe tvari) smanjila se za 43%. Koncentracija ukupnog klorofila pri 3

mg/L bakra iznosila je 0,78 ± 0,01 mg/g svježe tvari i u usporedbi s kontrolom (1,23 ± 0,07

mg/g svježe tvari) značajno se smanjila za 37%. Bakar je u svim testiranim koncentracijama

značajno povećao koncentraciju karotenoida u tkivima biljaka kulture iz ribnjaka Narta.

30

Tablica 10. Izmjerene vrijednosti koncentracije klorofila a, klorofila b, ukupnog klorofila i

karotenoida te pripadajući prirast nakon sedam dana tretmana kulture iz ribnjaka Narta pri

različitim koncentracijama bakra. Prikazani rezultati su srednja vrijednost četiri ponavljanja ±

standardna devijacija.

Tretman bakrom Kontrola 0,1 mg/L 0,3 mg/L 1,0 mg/L 3,0 mg/L

Chl a (mg/g svježe tvari) 0,77 ± 0,04 0,72 ± 0,03 0,81 ± 0,07 0,81 ± 0,01 0,44 ± 0,01 * Prirast Chl a 0,18 ± 0,01 0,17 ± 0,01 0,19 ± 0,02 0,19 ± 0,01 0,10 ± 0,01 *

Chl b (mg/g svježe tvari) 0,45 ± 0,04 0,41 ± 0,04 0,49 ± 0,10 0,45 ± 0,01 0,34 ± 0,01 Prirast Chl b 0,18 ± 0,02 0,16 ± 0,02 0,19 ± 0,05 0,18 ± 0,01 0,13 ± 0,01

Chl a +b (mg/g svježe tvari) 1,23 ± 0,07 1,13 ± 0,07 1,30 ± 0,16 1,26 ± 0,01 0,78 ± 0,01 * Prirast Chl a +b 0,18 ± 0,01 0,16 ± 0,01 0,19 ± 0,03 0,18 ± 0,01 0,11 ± 0,01 *

Car (mg/g svježe tvari) 0,20 ± 0,01 1,13 ± 0,07 * 1,30 ± 0,16 * 1,26 ± 0,01 * 0,78 ± 0,01 * Prirast Car 0,19 ± 0,01 1,05 ± 0,07 * 1,21 ± 0,18 * 1,18 ± 0,01 * 0,73 ± 0,01 *


(P<0,05).

*

*

**

*

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

Kontrola 0,1 0,3 1,0 3,0


Chl

a (m

g/g

svje

že tv

ari)

LaboratorijNarta

Slika 16. Koncentracija klorofila a (mg/g svježe tvari) biljaka uzgajanih sedam dana na



31

*

*

**

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70


Chl

b (m

g/g

svje

že tv

ari)

LaboratorijNarta

Slika 17. Koncentracija klorofila b (mg/g svježe tvari) biljaka uzgajanih sedam dana na



*

*

**

*

0,000,200,400,600,801,001,201,401,601,80


Chl

a+b

(mg/

g sv

ježe

tvar

i)

LaboratorijNarta

Slika 18. Koncentracija ukupnog klorofila (mg/g svježe tvari) biljaka uzgajanih sedam dana

na hranjivoj podlozi uz dodatak različitih koncentracija bakra. Tretmani označeni * značajno

se razlikuju u usporedbi s odgovarajućom kontrolom (P < 0,05).

32

*

*

*

**

*

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60


Car

(mg/

g sv

ježe

tvar

i)

LaboratorijNarta

Slika 19. Koncentracija karotenoida (mg/g svježe tvari) biljaka uzgajanih sedam dana na

hranjivoj podlozi uz dodatak različitih koncentracija bakra. Tretmani označeni * značajno

se razlikuju u usporedbi s odgovarajućom kontrolom (P < 0,05).

3.2. IC50 vrijednosti na temelju mjerenih pokazatelja rasta biljaka

Vrijednost kojom se iskazuje osjetljivost vrste na testiranu tvar je IC50 odnosno ona

koncentracija (mg/L) koja uzrokuje inhibiciju rasta u 50% testirane populacije. Vrijednosti

IC50 izračunatih na temelju pokazatelja rasta nakon sedmodnevnog izlaganja dvije kulture

vrste Lemna gibba L. različitim koncentracijama bakra prikazane su u tablici 11. Za

izražavanje stupnja toksičnosti koristi se IC50 vrijednost. Gledajuću ukupnu vrijednost IC50

izračunatu kao srednju vrijednost IC50 na temelju svih mjerenih pokazatelja rasta, kultura iz

ribnjaka Narta (IC50=4,169 mg/L) pokazala se osjetljivijom od kulture uzgajane u laboratoriju

(IC50=5,464 mg/L). Iz tablice se također uočavaju i niže vrijednosti IC50 na temelju prirasta

broja biljaka obje kulture sedmog dana eksperimenta u odnosu na vrijednosti četvrtog dana

trajanja izlaganja. Najosjetljiviji pokazatelj rasta kod kulture uzgajane u laboratoriju je

koncentracija karotenoida, dok je koncentracija proteina najosjetljiviji pokazatelj kod kulture

iz ribnjaka Narta.

33

Tablica 11. IC50 vrijednosti izračunate na temelju prirasta mjerenih pokazatelja rasta biljaka

vrste L. gibba, kulture uzgajane u laboratorijskim uvjetima te kulture uzorkovane s ribnjaka

Narta, nakon sedmodnevnog tretmana različitim koncentracijama bakra u hranjivom mediju.

Parametar

IC50 (mg/L)

Laboratorij Narta

Broj biljaka 4. dana 24,837 17,588

Broja biljaka 7. dana 18,636 7,750

Svježa masa 2,125 1,851

Suha masa 1,945 1,793

Suha/svježa masa 1,431 1,537

Koncentracija proteina 1,383 1,410

Koncentracija Chl a 1,092 1,556

Koncentracija Chl b 1,195 1,621

Koncentracija ukupnog Chl 1,118 1,593

Koncentracija Car 0,883 4,990

Srednja vrijednost 5,464 4,169

34

4. RASPRAVA

Bakar je esencijalni element te je uključen u brojne fiziološke procese (Teisseire i

Guy, 2000). Međutim, pri višim je koncentracijama toksičan, te uzrokuje štetne učinke na

ljude, životinje i biljke (Vinodhini i Narayanan, 2007). Višak bakra u okolišu može biti

rezultat antropogenih aktivnosti koje mijenjaju biokemijske cikluse metala (rudarstvo,

prerađivačka industrija, poljoprivredna tehnologija). Mnogim je istraživanjima utvrđeno da su

biljke iz porodice Lemnaceae sposobne akumulirati velike količine bakra (Jain i sur., 1989;

Zayed i sur., 1998; Miretzky i sur., 2004). Akumulacija je povezana sa tolerancijom, koja se

definira kao sposobnost biljke u sprječavanju ozljeda uzrokovanih teškim metalima (Sabreen i

sur., 2008). Međutim, ako su koncentracije teških metala veće od one koju biljka može

tolerirati dolazi do fizioloških promjena i indukcije simptoma toksičnosti.

Rast biljaka vrste L. gibba izloženih različitim koncentracijama bakra praćen određivanjem

prirasta broja biljaka, ima prednost pred drugim pokazateljima rasta zbog mogućnosti

kontinuiranog praćenja za vrijeme trajanje pokusa, dok se ostali parametri mogu izmjeriti

samo na početku pokusa i posljednjeg dana pokusa. Koncentracije bakra od 0,1 do 1 mg/L

imale su stimulirajući utjecaj na obje testirane kulture L. gibba povećavajući relativni prirast

broja biljaka, svježe i suhe mase. Bakar stimulira rast L. minor u rasponu koncentracija od

0,003 do 0,3 mg/L, a nikal u koncentracijama do 0,5 mg/L (Khellaf i Zerdaoni, 2010).

Stimulirajući efekt na rast uzrokovan niskim dozama potencijalno toksičnih tvari definira se

kao hormeza (Stabbing, 1982). Tretman s 3 mg/L bakra značajno je smanjio rast biljaka obje

testirane kulture L. gibba. Smanjenje prirasta svih pokazatelja rasta (broj biljaka, svježa i suha

masa) bilo je značajnije izraženo u kulturi izoliranoj iz ribnjaka Narta. Izraženije smanjenje

prirasta sugerira na veću osjetljivost kulture iz ribnjaka Narta na bakar u odnosu na kulturu

uzgajanu u laboratoriju. Ovaj rezultat potvrđen je izračunatim vrijednostima IC50 koje

pokazuju da kultura iz ribnjaka Narta i četvrtog i sedmog dana eksperimenta može podnijeti

niže koncentracije bakra u odnosu na kulturu uzgajanu u laboratoriju, tablica 11.

Toksičnost bakra izražena kao IC50 vrijednosti na temelju broja biljaka određena je 4 i 7 dana

eksperimenta. Toksičnost bakra za obje kulture vrste L. gibba povećala se s povećanjem

trajanja izloženosti. Povećanje toksičnosti može se izraziti omjerom IC50 4. dana/IC50 7. dana.

Omjer IC50 4. dana /IC50 7. dana za kulturu uzgajanu u laboratoriju iznosi 1,33 i predstavlja blago

povećanje toksičnosti s povećanjem trajanja izloženosti. S druge strane IC50 4. dana/IC50 7. dana

za kulturu ribnjaka Narta iznosi 2,27, smanjujući IC50 sa 17,58 mg/L 4. dana eksperimenta na

35

7,75 mg/L na kraju eksperimenta. Slično povećanje toksičnosti metala na biljke L. minor u

ovisnosti o vremenu izloženosti zabilježeno je za Zn, Cd, Cu i Ni (Drost i sur. 2007).

Praćenjem prosječnog broja biljaka po koloniji utvrđeno je da je u kulturi uzgajanoj u

laboratoriju samo najveća koncentracija bakra (5 mg/L) već prvog dana izlaganja imala

značajan utjecaj na prosječan broj biljaka po koloniji. S druge strane, na prosječan broj biljaka

po koloniji kulture ribnjaka Narta značajno djelovanje imale su koncentracije 3 i 5 mg/L,

također već prvog dana izlaganja. Kod ove se kulture četvrtog i petog dana izlaganja uočava

statistički značajno smanjenje prosječnog broja biljaka po koloniji na svim koncentracijama

bakra. Ovi rezultati ukazuju da bakar već nakon 24 h izloženosti inducira preuranjeno

otpuštanje mladih frondova što rezultira raspadom kolonija. Slični rezultati primijećeni su

nakon 24 h izlaganja L. minor biljaka različitim koncentracijama Cd, Hg i Cr (Li i Xiong,

2004). Preuranjeno otpuštanje mladih frondova iz kolonija može biti strategija preživljavanja

biljaka tako da spriječe transport metala iz starijih u mlade biljke (Li i Xiong, 2004). Pojava

raspada kolonija pri nižoj koncentraciji bakra još je jedan pokazatelj veće osjetljivosti kulture

iz ribnjaka Narta u odnosu na kulturu uzgajanu u laboratoriju.

Teški metali mogu interferirati s unosom Mg i K, nutrijenata važnih za sintezu proteina (Hou i

sur., 2007). Niže koncentracije bakra (0.1 do 1 mg/L) uzrokovale su povećanje koncentracije

ukupnih proteina u odnosu na kontrolu kod obje kulture L. gibba. Porast koncentracije

proteina pri nižim koncentracijama bakra može biti uzrokovan porastom koncentracije

specifičnih stresnih proteina, kao npr. enzima koji su uključeni u antioksidativni metabolizam

te biosintezu fitokelatina (Lei i sur., 2003). Bakar u koncentraciji 3 mg/L značajno je smanjio

sadržaj proteina kod obje kulture biljaka. Sličan odgovor zabilježen je nakon djelovanja bakra

i željeza na vrstu Spirodela polyrrhiza (Xing i sur., 2009). Kanoun-Boule i sur. (2008) utvrdili

su da se koncentracija proteina u L. minor smanjuje s povećanjem koncentracije bakra te da je

pad najizraženiji pri koncentraciji 3 i 6 mg/L. Bakar je redoks aktivan metal i u stanicama

može sudjelovati u raznim reakcijama koje mogu generirati reaktivne kisikove čestice (Babu i

sur., 2003). Dvovalentni ioni bakra direktno doprinose procesu oksidacije proteina vezanjem

u aktivno mjesto proteina u prisustvu vodikovog peroksida (Cecarini i sur., 2007). Oksidacija

proteina u uvjetima stresa mijenja konformaciju i aktivnost proteina (Stadtman, 2006). S

obzirom na vitalnu funkciju proteina u stanici (reguliranje stanične strukture, prijenos signala,

enzimske reakcije staničnog metabolizma) smanjenje koncentracije staničnih proteina može

vrlo brzo povećati stresno djelovanje metala direktno utječući na metabolizam stanice te njenu

strukturu. Kultura biljka iz ribnjaka Narta pokazala se osjetljivijom na djelovanje bakra na

temelju koncentracije proteina koja se smanjivala već od 0.3 mg/L, dok se u kulturi uzgajanoj

36

u laboratoriju koncentracija proteina smanjivala samo pri 3 mg/L. Veća osjetljivost kulture

ribnjaka Narta potvrđena je i IC50 vrijednostima, tablica 11.

Bakar je u svim primijenjenim koncentracijama značajno utjecao na koncentracije

fotosintetskih pigmenata u tkivima kulture L. gibba uzgajane u laboratoriju. Koncentracija

ukupnog klorofila smanjivala se s povećanjem koncentracije bakra. S druge strane, sadržaj

klorofila u tkivima kulture iz ribnjaka Narta značajno se smanjio samo pri najvećoj

koncentraciji bakra. Povećanje koncentracije bakra smanjilo je koncentraciju klorofila a i b u

vrsti Potamogeton pusillus nakon 7 dana tretmana (Monferrán i sur., 2009). Gubitak

fotosintetskih pigmenata povezan je sa peroksidacijom kloroplastnih membrana (Sandmann i

Böger, 1980). Bakar može reducirati molekularni kisik u ROS u kloroplastima viših biljaka

(Babu i sur., 2001). Također može zamijeniti magnezijeve iona u molekuli klorofila (Kűpper i

sur., 2002). Zamjena magnezija bakrom inhibira sintezu prekursora klorofila (δ-amino

levulinske kiseline) te protoklorofilid reduktaze, koja katalizira sintezu klorofilida iz

protoklorofilida tijekom biosinteze klorofila (Stiborova i sur., 1986; Van Assche i Clijsters,

1990). Poznato je da je smanjeni sadržaj fotosintetskih pigmenata rezultat nepravilnosti u

razvoju fotosintetskog aparata u mladim biljkama, te smanjenog prinosa fotosinteze

(Mysliwa-Kurdziel i Strzaka, 2002).

Tretman bakrom u svim testiranim koncentracijama značajno je povećao koncentraciju

karotenoida u tkivima biljaka kulture iz ribnjaka Narta, dok se ovaj porast kod kulture

uzgajane u laboratorijskim uvjetima primjećuje samo na koncentraciji 1 mg/L bakra.

Karotenoidi imaju važnu zaštitnu ulogu u sprječavanju nastanka singletnog kisika. Velike

količine energije koju apsorbiraju pigmenti, ukoliko se ne pohrane fotokemijski, mogu oštetiti

fotosintetske membrane. Ako se pobuđeno stanje klorofila zadrži, dolazi do reakcije s

molekularnim kisikom, pri čemu nastaje singletni kisik. Pobuđeno stanje karotenoida nema

dovoljno energije za nastanak singletnog kisika i brzo se vraća u osnovno stanje, otpuštajući

višak energije u obliku topline (Pevalek-Kozlina, 2002). Dok je sadržaj karotenoida u kulturi

uzgajanoj u laboratoriju najosjetljiviji parametar, karotenoidi su se pokazali kao vrlo važna

komponenta u zaštiti kulture iz ribnjaka Narta od toksičnosti bakra. Izračunate IC50

vrijednosti sugeriraju da kultura Narta može podnijeti višestruko veće koncentracije bakra

(4,990 mg/L) u odnosu na kulturu u laboratoriju (0,883 mg/L). Povećanje koncentracije

karotenoida u biljkama kulture ribnjaka Narta efikasnije je zaštitilo fotosintetske pigmente od

toksičnog djelovanja bakra u usporedbi s kulturom uzgajanom u laboratoriju.

S obzirom da se standardni testovi toksičnosti metala kao i drugih onečišćivača, izvode

uglavnom na laboratorijski uzgajanim kulturama u strogo kontroliranim uvjetima treba uzeti u

37

obzir mogućnosti podcjenjivanja rezultata dobivenih iz takvih studija kad ih se primjenjuje na

moguću toksičnost na biljke u okolišnim uvjetima. Srednja vrijednost izračunatih IC50 iz svih

mjerenih parametara niža je za kulturu ribnjaka Narta u odnosu na kulturu uzgajanu u

laboratoriju.

38

5. METODIČKI DIO

PLAN NASTAVNOG SATA

Predmet: Biologija Razred: 4. Školska godina: 2012./2013.

Nastavna cjelina: Ekologija

Nastavna tema: Onečišćavanje

Ključni pojmovi: eutrofikacija, biotestovi, vodena leća, monitoring i revitalizacija,

pokazatelji toksičnosti, fotosintetski pigmenti

Osnovni koncepti: mjerenje čovjekovih negativnih utjecaja na vodeni ekosustav na području

Bjelovara

Kompetencije učenika: učenik će znati procijeniti stupanj trofije i navesti izvore zagađenja

vodenih ekosustava. Razumjet će svrhu biotestova te ih ukratko opisati (na primjeru vodene

leće). Znati će protumačiti rezultate dobivene konkretnim biotestom.

Cilj nastavnog sata: razviti ekološku svijest učenika, razviti sposobnost uočavanja

negativnih utjecaja čovjeka na ostale organizme hranidbenog lanca, uputiti učenike u

samostalan istraživački rad, upoznati učenike sa radom u istraživačkim laboratorijima.

Postignuća (ishodi):

1. Znati objasniti osnovne ekološke pojmove te ih potkrijepiti primjerima Razrada: a) Povezati pojam ekološke valencije sa ekološkim čimbenicima (abiotičkim i biotičkim)

Razina 2.

b) Objasniti hranidbeni lanac kao kaskadni sustav Razina 3.

c) Analizirati može li uništavanje vodenih ekosustava utjecati na kopnene ekosustave (navesti primjer)

Razina 3.

2. Povezati djelovanje čovjeka sa pojmom eutrofikacije stajaćih voda Razrada: a) Objasniti razliku između prirodne i umjetne eutrofikacije Razina 1.

b) Klasificirati jezera na temelju količine nutrijenata i proizvodnje organske tvari Razina 2.

c) Navesti primjere za točkaste i netočkaste izvore zagađenja te ih prepoznati u prirodi

Razina 2.

39

3. Objasniti važnost izrade ekološke studije pri gradnji proizvodnih, prometnih i drugih objekata Razrada:

a) Povezati djelovanje čovjeka s promjenama brojnosti i izumiranjem biljnih i životinjskih vrsta

Razina 2.

b) Analizirati potrebu uvođenja zakonske zaštite ugroženih biljnih i životinjskih vrsta, ekosustava u cjelini

Razina 2.

c) Analizirati akumuliranje štetnih tvari u lancima ishrane Razina 3.

d) Objasniti što su to metode revitalizacije i na temelju čega se donose Razina 3.

4. Osmisliti postupke kojima se može procijeniti stupanj onečišćenja vodenih ekosustava Razrada: a) Objasniti prednost korištenja biotestova nad analitičkim metodama Razina 3.

b) Opisati ukratko biotest sa vodenom lećom Razina 2.

c) Navesti osobine biljnih vrsta pogodnih za istraživanje Razina 2.

d) Protumačiti zašto biljne vrste imaju prednost nad životinjskim tijekom testiranja određenih pesticida

Razina 3.

5. Povezati biokemijske sa morfološkim pokazateljima toksičnosti Razrada: a) Nabrojiti vanjske pokazatelje toksičnosti vodene leće Razina 1.

b) Analizirati utjecaj bakra (teških metala) na vodenu leću Razina 3.

c) Koristeći pojmove antagonizam i sinergizam toksikanata predložiti druge mogućnosti testiranja vodene leće

Razina 3.

6. Razviti sposobnost uočavanja stupnja i izvora zagađenja pojedinih ekosustava u prirodi Razrada: a) Objasniti nedostatke agrotehničkih i agrokemijskih metoda u poljoprivredi Razina 2.

b) Objasniti ekonomsku i ekološku važnost izdvajanja sekundarnih sirovina iz otpada (staklo, metal, tekstil…)

Razina 2.

7. Povezati obrambeni mehanizam biljke sa ljudskom prehranom Razrada: a) Shvatiti važnost unošenja antioksidanasa, kao što su karotenoidi, u organizam Razina 3.

b) Povezati starenje biljnog, ali i našeg organizma sa slobodnim radikalima Razina 3.

Tip nastavnog sata: kombinirani

Oblici rada:

frontalno grupno u parovima individualno kombinirano

Za nastavu pripremiti:

PPT, podatke u excelu, radne listiće, Program zaštite okoliša Bjelovarsko-bilogorske županije,

pribor za terenski dio nastave (čizme, ribarsku mrežu, škare za vinograd, staklenke,

40

fotoaparat), dogovoriti vrijeme laboratorijskog djela projekta u Zavodu za javno zdravstvo (ili

slične ustanove ako se radi o drugoj županiji), osigurati prijevoz učenika do ribnjaka (ako je

mjesto na kojem se odvija terenski dio udaljeno od škole), na vrijeme obavjestiti učenike o

odlasku na teren kako bi se adekvatno odjenuli (starije cipele ili tenisice gležnjače) te ponijeli

potreban pribor ako ga posjeduju (mreže ili neki ribarski pribor koji će poslužiti u dohvaćanju

biljnog materijala sa sredine ribnjaka ili rijeke).

Prethodno istražiti pogodno mjesto istraživanja (utvrditi ima li na tom području leće-ciljni

organizam i da je na njemu prisutan određeni stupanj zagađenja).

Pripremiti informatičku učionicu (na svako računalo prebaciti radni list u excelu na kojem će

učenici raditi).

LITERATURA:

Stručna:

Vidaković-Cifrek Ž. 1999. Učinak kalcij(III) bromida na fiziološke procese u vodenoj leći

(Lemna minor L.) i korijenu luka (Allium ascalonicum Auct.), Zagreb.

Pevalek-Kozlina B. 2003. Fiziologija bilja. Profil, Zagreb.

Didaktičko-metodička:

Meštrov M. 2004. Ekologija. Školska knjiga, Zagreb.

Springer O. P, Pevalek-Kozlina B. 2004. Biologija 3. Profil, Zagreb.

Ispitni katalog za državnu maturu u školskoj godini 2010./2011.

STRUKTURA NASTAVNOG SATA

UVODNI DIO Trajanje: 90 minuta

Komponente Tijek Uputa

Razgovor nastavnik-učenik, učenik-učenik

Prije uvođenja novih pojmova s učenicima ponavljam osnovne ekološke pojmove kako bi lakše shvatili sam projekt. Od učenika tražim da navedu abiotičke čimbenike (temperatura, svjetlost, voda i vlažnost) te biotičke čimbenike (odnosi među jedinkama iste i različite vrste) usmjeravajući ih ka shvaćanju važnosti određenih uvjeta koji moraju biti zadovoljeni da bi pojedina jedinka mogla normalno funcionirati i rasti. Ispitujem ih kako se zove područje najoptimalnijih uvjeta u sklopu kojeg je moguć život organizma (odgovor je ekološka valencija).Tražim od učenika da usporede hranidbeni lanac sa kaskadnim sustavom navodeći ih ka razmišljanju o važnosti svake pojedine karike unutar hranidbenog lanca te nagovještavam kako ćemo "iz prve ruke" vidjeti što se dogodi kad jedna

potpitanjima poticati učenike na razmišljanje, logičko povezivanje i zaključivanje, a tek tada dati gotove odgovore.

41

karika nestane ili se njezin broj drastično smanji. Pitanjima potičem učenike da shvate povezanost vodenih i kopnenih ekosustava u prirodi (kao primjer navodim izumiranje gmazova poput dinosaura koji su izumrli zbog promjena morskih struja što je dovelo do izumiranja vodenih organizama, a time i kopnenih zbog nedostatka hrane). Tad uvodim novi pojam eutofikacije te ga objašnjavam (proces obogaćivanja vodenih ekosustava nutrijentima najčešće pod utjecajem čovjeka, što rezultira povećanom primarnom proizvodnjom, 3 slajd). Učenike tražim da mi objasne pojam cvjetanja mora (prevelik rast prirodnih producenata-alga koje sprječavaju prodor svjetlosti u ostale slojeve mora odnosno općenito nekog vodenog ekosustava, a što dovodi do limitiranja određenih abiotičkih uvjeta drugim organizmima (bentos) te njihove smrti. Na slajdu 4 pokazujem vrste odnosno klasifikaciju jezera na temelju količine nutrijenata i proizvodnje organske tvari na oligotrofne, mezotrofne i eutrofne. Naglašavam da eutrofikacija može biti uzrokovana prirodnim, ali i umjetnim putem zbog zagađenja iz točkastih i netočkastih izvora zagađenja. Naglašavam da se točkasti izvori zagađenja lako identificiraju i kvantificiraju, dok su netočkasti izvori zagađenja široko rasprostranjeni te se zbog toga i teže kvantificiraju. Prije pokretanja 8 slajda, učenike ispitujem o praćenju kakvoće vode (znaju li nešto o analizama vode koje se vrše bilo za pitku ili površinsku vodu). Tada govorim o kriterijima za ocijenu stanja kakvoće vode te o njihovoj podjeli na obvezne i neobvezne pokazatelje. Napominjem da se na temelju tih pokazatelja vode dijele na 5 vrsta te da je peta vrsta kakvoće vode najlošija (primjer rijeka Sava koja prolazi urbanim dijelovima Zagreba). Nakon toga učenici dobivaju zadatak da iz Programa za zaštitu okoliša Bjelovarsko-bilogorske županije potraže glavne izvore zagađenja na području županije te da ih klasificiraju na točkaste i netočkaste (do najviše 10 minuta). Zadavanjem tog zadatka želim da učenici shvate da je prije terena i obilaska izvora zagađenja potrebno prvo istražiti, odnosno ograničiti se na neko područje istraživanja, a time će naučiti nešto o stupnju zagađenosti u mjestu na kojem žive. Sa završetkom zadatka prelazimo na konkretnu temu koja je vazana za projekt. Prije ulaska u tematiku projekta naglašavam cilj samog projekta-kvantifikacija onečišćenja na ribnjacima Narta (prijašnjim smo zadatkom ustanovili da je to područje zagađeno s obzirom da je povezano sa pritokom rijeke Česme-Bjelovarskom u koju se ulijevaju otpadne vode tvornice Dukat). Okretanjem

42

slajda broj 10 govorim kako postoje određeni protokoli za procjenu stupnja onečišćenja, odnosno biotestovi u kojima se određene biljne vrste (u prošlosti se više koristilo životinje) točno određenih karakteristika podvrgavaju različitim toksikantima (zagađivačima) u različitim koncentracijama, u svrhu određivanja utjecaja tih toksikanata na dotičnu vrstu, ali i u svrhu određivanja točne koncentracije koja te promjene uzrokuje. Napominjem da ćemo i mi na temelju vanjskih pokazatelja toksičnosti, odnosno na temelju grafova koje će učenici napraviti u excelu i na temelju gotovih analiza (izvor Hrvatske vode) zaključiti postoji li opasnost od zagađenja bakrom. Učenike tražim da razmisle i odgovore zašto se u raznim testiranjima koriste kontrolne skupine (odgovor-da bi se neka promjena mogla usporediti, primjetiti i pripisati djelovanju toksikanta). Tražim od učenika da na temelju prijašnjeg znanja o stanicama zaključe i navedu prednosti korištenja biljnih vrsta nad životinjskim u testovima toksičnosti ili biotestovima. Upućujem ih na zaključak da zbog sličnosti funkcije i strukture biljnih i životinjskih stanica možemo utjecaj toksikanta na biljnu vrstu projicirati i na čovjeka. Osim toga biljni su biotestovi jeftiniji, jednostavniji, ne zahtjevaju velik prostor, nema dileme oko etičnosti, a osim toga životinjske stanice nemaju ciljne strukture pesticida (fotosintetski aparat). Na 12-tom slajdu pokazujem sliku različitih vrsta vodenih leća (kako bi ih znali na terenu prepoznati i uzorkovati), također ih ispitujem koliko su upoznati sa porodicom leća, gdje ih najčešće susrećemo, u kojem godišnjem razdoblju, znaju li neku namjenu gdje se koriste vodene leće (npr.u akvarijima za pročiščavanje vode). Također naglašavam osobine koje ih čine pogodnim za istraživanja, kao brzo i vegetativno razmnožavanje čime se dobivaju genetski homogene jedinke, također su dovoljno velike da se promjene uzrokovane djelovanjem testiranih tvari uočavaju golim okom. Učenike ispitujem mogu li nabrojati neke vanjske simptome bolesti na biljkama (kao što su pjegavost lišća, smeđa područja, deformacije kore…),a tek tada navodim koji se simptomi prate na vodenim lećama (kloroza, nekroza, raspad kolonija (jer je "biljka" zapravo kolonija sastavljena od nekoliko biljčica), odvajanje korjena od ostatka biljke te sama veličina biljke. Govorim i o važnosti mjerenja biokemijskih pokazatelja toksičnosti kao što je to mjerenje aktivnosti određenih enzima i proteina (koje mi ne radimo zbog neadekvatnih uvjeta i nedostatka opreme) te pigmenata (koje radimo u suradnji sa Zavodom za javno zdravstvo), jer oni

43

prethode vanjskim pokazateljima toksičnosti. Primjer je pojava kloroze listova (nedostatak pigmentacije) zbog smanjenog sadržaja pigmenata (vidljivo iz grafa). I na kraju uvodnog djela govorim o izražavanju stupnja toksičnosti kroz EC50, IC50 i NOEL vrijednosti. Prije odlaska na teren jasno navodim zadatke koje učenici moraju izvršiti na terenu (s tim da prije započinjanja projekta učenike treba izvijestiti o odlasku na teren, kako bi se adekvatno odjenuli i ponijeli potreban pribor).

Aktivnosti učenika Aktivnosti nastavnika

sudjeluju u razgovoru, odgovaraju na pitanja, izvršavaju zadatak, pitaju za nejasnoće, terijsko znanje povezuju sa stvarnim situacijama

Za vrijeme izvođenja zadatka pribilježiti aktivnost pojedinih učenika, znanje koje su pokazali za vrijeme ponavljanja, spremnost na izvršavanje zadataka. Ove zabilješke koristiti za konačno vrednovanje učenika (test)+izrada portfolia

GLAVNI DIO Trajanje: 90 minuta


pokazna vježba

Glavni se dio nastave sastoji od terenskog i laboratorijskog djela. Na terenu (ribnjaku Narta) učenici opisuju (na temelju slajda 4) stupanj trofije samog ribnjaka, zapisuju moguće izvore zagađenja (klasificiraju ih na točkaste i netočkaste, iako na tom području prevladavaju netočkasti izvori zagađenja kao što su poljoprivredne površine i rijeka Česma koja donosi otpadne vode iz grada). Pronalaze vodene leće, zapisuju i fotografiraju njihov izgled te ih uzorkuju. Ostatak vremena fotografiraju neke biljne i životinjske vrste (sporedni cilj-uočiti karakteristike vodenog ekosustava-prethodna nastavna jedinica-Temeljna svojstva biocenoza i ekosustava). Nakon obavljenog terena slijedi odlazak na Zavod u kojemu se spektrofotometrijski određuje koncentracija pigmenata u uzorkovanim lećama. Učenicima dijelim radne listiće u kojima je objašnjen princip rada spektrofotometra i pojam apsorbancije (Izvor elektromagnetskog zračenja odašilje EM zračenje širokog spektra koje ulazi u monokromator. Monokromator propušta EM zračenje točno određene valne duljine koja prolazi kroz uzorak u kiveti duljine puta (l). Uzorak apsorbira dio zračenja, a količina apsorbiranog zračenja je proporcionalna koncentraciji uzorka. Dio zračenja koji nije apsorbiran

učenicima objasniti cilj vježbe, pojasniti cjelokupan eksperiment sa vodenom lećom, učenike uvesti u istraživački rad

44

prolazi kroz uzorak (propušteno EM zračenje) i mjeri se na detektoru te se najčešće izražava kao apsorbancija (A). Izolacija i mjerenje koncentracije pigmenata vrši se po napisanom protokolu (radni listić), samu vježbu ne izvode učenici (pokazna vježba) već nastavnik u suradnji sa gospođom Anom Grbić (dipl.ing.bio). Tijekom izvođenja pokusa, ispitujem znanje učenika o pigmentima (uloga, maksimum apsorpcije klorofila a unutar fotosustava, uloga karotenoida u fotosintezi, građa klorofila). Učenike pitanjima navodim na shvaćanje pokusa (zašto se izvodi-smanjene koncentracije pigmenata izazivaju klorozu listova), naglašavam da se pokus radi i nakon izlaganja biljke bakru, ali ga mi ne radimo, već će učenici na temelju gotovih podataka napraviti graf i protumačiti ga). Ukratko opisujem cijeli eksperiment sa vodenom lećom-nakon uzorkovanja leće slijedi sterilizacija i kultivacija (prilagodba) biljke kroz 2 tjedna na hranjivom mediju (učenike pitam što misle zašto je kultivacija potrebna, dali bi rezultati bili usporedivi bez kultivacije kada bi pokus radili sa dvije kulture vodene leće prethodno uzgajane u različitim uvjetima), nakon kultivacije biljke u sterilnim uvjetima nasađujemo na hranjivi medij u kojemu se nalaze svi potrebni nutrijenti, ali je u njih dodana i određena koncentracija bakra 0, 0.1, 0.3, 1,3 i 5 mg/L. Tijekom eksperimenta (7 dana) svakodnevno se broje biljčice (broj biljaka po koloniji) i prati njihov prirast koji se računa po formuli. Naglašavam da se osim koncentracije pigmenata i prirasta broja biljaka (koje će učenici računati u excelu) računaju i neki drugi parametri koji ukazuju na toksičnost odnosno osjetljivost leće na bakar, ali ih mi ne radimo). Učenici ispunjavaju tablicu na temelju izmjerenih podataka (masa biljnog tkiva uzeta za mjerenje pigmenata, volumen ukupnog supernatanta nakon centrifugiranja i vrijednosti apsorbancije na 470,644.8 i 661.6 nm).


prate pokaznu vježbu, zapisuju podatke, odgovaraju na pitanja, postavljaju pitanja

odgovoriti na moguća pitanja (vezana za spektrofotometar, centrifugiranje, maceriranje…) nadgledati učenike zapisuju li dobivene podatke, pratiti stupanj angažiranosti i zainteresiranosti učenika za rad.

45

ZAVRŠNI DIO Trajanje: 90 minuta


samostalan rad

Nakon pokazne vježbe i dobivenih podataka, učenici rješavaju radni listić (po formuli računaju koncentracije pigmenata). Završni se dio projekta odvija u informatičkoj učionici. Na radnom listu excela (naziv pigmenti) učenici će dobiti gotove podatke izračunatih koncentracija pigmenata (početne i konačne vrijednosti (na kraju eksperimenta-7-og dana) kontrole i svih koncentracija bakra. Također je izračunat i prirast na temelju koncentracije pigmenata (u dodanim komentarima je svaki račun dodatno pojašnjen). Na temelju prirasta učenici rade graf (na x osi idu koncentracije bakra, a na y prirast). Zadatak i vrsta grafikona su također navedeni kod gotovih podataka. Graf u slučaju nedostatka printera u školi printaju kod kuće i lijepe na za to predviđen prostor (u radni listić). Analiza grafa slijedi zadnji 6 školski sat ovog projekta, a učenici ga pišu ispod zalijepljenog grafa na radni listić. Slijedeći zadatak je računanje prirasta broja biljaka u excelu po zadanoj formuli koja se nalazi u radnom listiću. Iz prirasta učenici crtaju graf kao i iz prethodnog zadatka. Oba zadatka moraju završiti u 45 min. U slučaju da im ostane viška vremena, učenici će analizirati grafove. 6-ti školski sat učenici analiziraju grafove, raspravljaju o mogućim uzrocima dobivenih rezultata. Učenici moraju zaključiti da pri svim koncentracijama bakra dolazi do smanjenja sadržaja pigmenata, te da je to smanjenje najizraženije pri najvećoj mjerenoj koncentraciji (objasniti učenicima da mjerenje pri 5 mg/L bakra nije bilo moguće jer su biljke bile presitne te je masa za mjerenje koncentracije pigmenata bila nedostatna), a da je rezultat toga pojava kloroze listova što znači da su vodene leće u ribnjaku izložene povišenim koncentracijama metala. Učenike navodim na razmišljanje o posljedicama zamjene magnezijevih iona bakrovim u molekuli klorofila. Nakon očekivanog odgovora (smanjenje fotosinteze zbog retardacije kloroplasta) učenike potpitanjima navodim na zaključak da se ovakve promjene osim u klorofilu mogu dogoditi i u enzimima, pogotovo u onima u kojima je bakar prostetska skupina) te navodim primjer enzima Rubisco što uzrokuje promjene čitavog staničnog metabolizma. Osim da se koncentracija pigmenata smanjila na 3 mg/L bakra, učenici moraju uočiti visoke koncentracije pigmenata na 1 mg/L bakra s naglaskom na karotenoide. Na slajdu broj 22 postavljena su 3 pitanja koja učenici moraju odgovoriti. Tim pitanjima učenike navodim na

osigurati svakom učeniku rad na računalu

46

povezivanje karotenoida kao jednim od mehanizama obrane od stresa kod biljaka sa ljudskom prehranom, zato što karotenoidi i u biljkama i u našem organizmu imaju istu ulogu-ulogu antioksidansa (ulogu antioksidanasa i njegovu povezanost sa oksidativnim stresom i nastankom slobodnih radikala učenici će istražiti za zadaću koju će umetnuti u portfolio). Na slijedećem grafu učenici moraju uočiti da u rasponu koncentracija od 0.1 do 1 mg/L bakar uzrokuje povećanje broja biljaka, dok u većim koncentracijama smanjuje. Napomenuti učenicima da je ovo dokaz da je bakar esencijalni element, ali da višak bakra kao i nedostatak nepovoljno utječe na biljke. Dokaz toksičnosti bakra u višim koncentracijama je i korištenje bordoške juhe (modra galica) u vinogradarstvu. Ove zaključke učenici nadopisuju u radni listić. Na kraju projekta objasniti pojam revitalizacije (primjena različitih mjera kojima je cilj poboljšanje ekološkog stanja jezera/ribnjaka, a u svrhu smanjenja trofičkog stupnja odnosno smanjenja eutrofikacije) i naznačiti važnost izrade ekološke studije pri gradnji proizvodnih, prometnih i drugih objekata. Također navesti moguće metode za sanaciju trenutnog stanja ribnjaka Narta. Mjere revitalizacije spominjem kako bi učenici dobili predodžbu o proceduri izrade ekološke studije. Umjesto testa učenici će za zadaću izraditi portfolio u kojem će u nekoliko rečenica opisati svaki dio projekta (istraživačkog rada)-uvod, cilj, eksperimentalni dio, rezultati i zaključak (obvezni dio portfolia). U neobveznom će djelu portfolia umetnuti izborne sadržaje vezane uz temu projekta.


Riješavaju radni listić koristeći excel, odgovaraju na pitanja

objasniti princip rada u excelu, pomagati učenicima, zadati zadaću

47

PLAN PLOČE

Kako izmjeriti čovjekov negativni utjecaj na vodene ekosustave na području Bjelovara?

PORTFOLIO

Uvod: -što je bioesej

-karakteristike porodice Lemnaceae pogodne za istraživanja

-pokazatelji toksičnosti

Cilj projekta

Eksperimentalni dio-zapisi s terena

-opisati postupak mjerenja koncentracije pigmenata

-priložiti ispunjeni radni listić

Zaključak-razlozi pojave kloroze

-utjecaj bakra kao esencijalnog elementa

-moguće mjere revitalizacije ribnjaka Narta

-antioksidansi i slobodni radikali

Izborni dio:

primjeri -ukratko opisati neki znanstveni rad sa vodenom lećom

-esej-vlastita razmišljanja o razvijenosti ekološke svijesti

-članci o zagađenosti vodenih ekosustava ili nesrećama na području županije

-ugroženost ptica močvarica na području županije

Prilagodba za učenike s posebnim potrebama:

Ovisno o poteškoćama učeniku/učenicima zadati prikladne zadatke (angažirati ih u terenskom

djelu projekta, djeljenje radnih materijala, osiguravanje reda u razredu, na računalu rade u

paru…)

Prilagodba za pojedino odjeljenje: ovisno o broju učenika pripremiti potrebne materijale

Osvrt na tijek sata

U slučaju da se neki dijelovi projekta oduže, njihov sdržaj rasporediti u ostale dijelove.

Učenicima proslijediti sve materijale kako bi kvalitetnije izradili zadaću te kako se učenici ne

bi bazirali samo na prepisivanje sa slajdova (bez slušanja i razmišljanja).

48

KRITERIJI VREDNOVANJA

POSTIGNUĆE 2 3 4 5

1.Znati objasniti osnovne ekološke pojmove te ih potkrijepiti primjerima

učenik uz pomoć nastavnika objašnjava osnovne ekološke pojmove (abiotički i biotički čimbenici), učenik niti uz pomoć nastavnika ne povezuje pojam ekološke valencije sa ekološkim čimbenicima. Zna navesti primjer hranidbenog lanca, ali uz pomoć nastavnika ga objašnjava kao kaskadni sustav. Također uz pomoć nastavnika razumije povezanost vodenih i kopnenih ekosustava, primjer ne zna navesti.

učenik samostalno objašnjava osnovne ekološke pojmove. Učenik navodi primjer hranidbenog lanca ali ga uz pomoć nastavnika povezuje sa kaskadnim sustavom. Učenik razumije povezanost vodenih i kopnenih ekosustava, uz pomoć nastavnika navodi primjere.

učenik samostalno objašnjava osnovne ekološke pojmove, navodi i dodatne pojmove. Učenik navodi primjere hranidbenih lanaca vodenih i kopnenih ekosustava te ih povezuje sa kaskadnim sustavom. Učenik razumije povezanost vodenih i kopnenih ekosustava, samostalno navodi primjer.

učenik samostalno objašnjava osnovne ekološke pojmove, navodi i dodatne pojmove te za sve navodi primjere. Učenik navodi primjere hranidbenih lanaca vodenih i kopnenih ekosustava te ih povezuje sa kaskadnim sustavom. Povezuje hranidbene lance sa protokom energije. Učenik razumije povezanost vodenih i kopnenih ekosustava, samostalno navodi primjere.

49

2. Povezati djelovanje čovjeka sa pojmom eutrofikacije stajaćih voda

Učenik razumije što je eutrofikacija ali je nepotpuno objašnjava i ne povezuje sa čovjekovim utjecajem na okoliš. Učenik uz pomoć nastavnika klasificira stajaće vode prema stupnju trofije. Učenik zna da izvori zagađenja mogu biti točkasti i netočkasti, ali ne zna razliku.

Učenik razumije i povezuje pojam eutrofikacije sa negativnim utjecajima čovjeka na okoliš. Učenik samostalno klasificira stajaće vode prema stupnju trofije. Učenik uz pomoć nastavnika daje primjere za točkaste i netočkaste izvore zagađenja.

Učenik razumije i povezuje pojam eutrofikacije sa negativnim utjecajima čovjeka na okoliš. Učenik samostalno klasificira stajaće vode prema stupnju trofije. Učenik na primjeru ribnjaka Narta klasificira stupanj trofije i izvore zagađenja.

Učenik razumije i povezuje pojam eutrofikacije sa negativnim utjecajima čovjeka na okoliš. Učenik samostalno klasificira stajaće vode prema stupnju trofije. Učenik na primjeru ribnjaka Narta klasificira stupanj trofije i izvore zagađenja. Učenik detaljnije navodi primjere točkastih i netočkastih izvora zagađenja.

50

3. Objasniti važnost izrade ekološke studije pri gradnji proizvodnih, prometnih i drugih objekata

Učenik povezuje negativne utjecaje čovjeka sa izumiranjem određenih biljnih i životinjskih vrsta. Učenik uz pomoć nastavnika navodi zakonsku regulativu kao jednu od mjera zaštite nekog organizma ili ekosustava u cjelini. Učenik niti uz pomoć nastavnika ne zna objasniti kako akumulacija štetnih tvari unutar određene karike hranidbenog lanca može imati ozbiljne posljedice i za ostatak hranidbenog lanca. Učenik razumije važnost izrade ekološke studije prije gradnje nekog proizvodnog objekta, ali je ne zna ukratko opisati, uz pomoć nastavnika objašnjava metode revitalizacije.

Učenik povezuje negativne utjecaje čovjeka sa izumiranjem određenih biljnih i životinjskih vrsta. Učenik samostalno navodi zakonsku regulativu kao jednu od mjera zaštite nekog organizma ili ekosustava u cjelini. Učenik uz pomoć nastavnika objašnjava kako akumulacija štetnih tvari unutar određene karike hranidbenog lanca može imati ozbiljne posljedice i za ostatak hranidbenog lanca. Učenik razumije važnost izrade ekološke studije prije gradnje nekog proizvodnog objekta, objašnjava je uz pomoć nastavnika. Učenik zna definirati pojam revitalizacije, ali ne zna navesti primjere.

Učenik povezuje negativne utjecaje čovjeka sa izumiranjem određenih biljnih i životinjskih vrsta, navodi primjere. Učenik samostalno navodi zakonsku regulativu kao jednu od mjera zaštite nekog organizma ili ekosustava u cjelini. Govori i o inicijaciji tog postupka na ribnjacima Narta kao važnih ptičjih rezervata. Učenik samostalno objašnjava kako akumulacija štetnih tvari unutar određene karike hranidbenog lanca može imati ozbiljne posljedice i za ostatak hranidbenog lanca. Učenik razumije važnost izrade ekološke studije prije gradnje nekog proizvodnog objekta, samostalno je opisuje. Učenik zna definirati pojam revitalizacije, uz pomoć nastavnika daje primjere.

Učenik povezuje negativne utjecaje čovjeka sa izumiranjem određenih biljnih i životinjskih vrsta, navodi primjere. Govori i o remećenju neke biocenoze unošenjem stranih vrsta u biocenozu. Učenik samostalno navodi zakonsku regulativu kao jednu od mjera zaštite nekog organizma ili ekosustava u cjelini. Govori i o inicijaciji tog postupka na ribnjacima Narta kao važnih ptičjih rezervata. Učenik samostalno objašnjava kako akumulacija štetnih tvari unutar određene karike hranidbenog lanca može imati ozbiljne posljedice i za ostatak hranidbenog lanca, navodi primjere. Učenik razumije važnost izrade ekološke studije prije gradnje nekog proizvodnog objekta, samostalno je opisuje i navodi primjer. Učenik zna definirati pojam revitalizacije, samostalno navodi primjere te razumije da se metode razlikuju ovisno o stupnju zagađenja.

51

4. Osmisliti postupke kojima se može procijeniti stupanj onečišćenja vodenih ekosustava

Učenik sa nesigurnošću govori o prednosti biotestova nad analitičkim metodama, uz pomoć nastavnika opisuje biotest sa vodenom lećom te njezine osobine prikladne za istraživanja. Učenik ne razumije zašto testiranje npr.pesticida nije moguće na životinjama.

Učenik govori o prednosti biotestova nad analitičkim metodama. Uz pomoć nastavnika opisuje biotest sa vodenom lećom. Učenik zna nabrojati prednosti vodenih leća prikladnih za istraživanja. Učenik sa nesigurnošću govori o prednostima testiranja pesticida na biljkama.

Učenik sa sigurnošću govori o prednosti biotestova nad analitičkim metodama. Samostalno opisuje biotest sa vodenom lećom. Učenik zna nabrojati prednosti vodenih leća prikladnih za istraživanja. Učenik sa sigurnošću govori o prednostima testiranja pesticida na biljkama.

Učenik sa sigurnošću govori o prednosti biotestova nad analitičkim metodama, biotest povezuje sa ekološkim čimbenicima. Sa sigurnošću opisuje biotest sa vodenom lećom. Učenik sa sigurnošću govori o prednostima testiranja pesticida na biljkama.

5. Povezati biokemijske sa morfološkim pokazateljima toksičnosti

Učenik zna nabrojati vanjske pokazatelje toksičnosti, ne zna objasniti utjecaj bakra na vodenu leću. Učenik ne zna objasniti pojmove antagonizam i sinergizam i na temelju njih predložiti druge toksikante za istraživanja u biotestu sa vodenom lećom.

Učenik zna nabrojati vanjske pokazatelje toksičnosti vodene leće. Učenik zna objasniti pojmove antagonizam, i sinergizam, ali uz pomoć nastavnika predlaže korištenje drugih toksikanata u biotestu sa vodenom lećom (npr. ispitivanje kombinacije metala na leću). Uz pomoć nastavnika opisuje utjecaj bakra na leću (na temelju grafova).

Učenik sa sigurnošću zna nabrojati vanjske pokazatelje toksičnosti vodene leće. Učenik zna objasniti pojmove antagonizam i sinergizam metala, sa sigurnošću predlaže mogućnost ispitivanja kombinacije metala na vodenu leću. Samostalno opisuje utjecaj bakra na vodenu leću.

Učenik sa sigurnošću zna nabrojati vanjske pokazatelje toksičnosti vodene leće te nekih drugih biljnih vrsta (voćke…). Osim mogućnosti ispitivanja kombinacije metala učenik predlaže i testiranje drugih tvari kao što je UV zračenje, lijekova…Sa sigurnošću opisuje utjecaj bakra na vodenu leću.

52

6. Razviti sposobnost uočavanja stupnja i izvora zagađenja pojedinih ekosustava u prirodi

Učenik sposoban korištenje određenih mjera u poljoprivredi povezati sa zagađenjem. Učenik ne zna što je eko otok.

Učenik sposoban korištenje određenih mjera u poljoprivredi povezati sa zagađenjem. Učenik sa nesigurnošću govori o eko otoku.

Učenik sposoban korištenje određenih mjera u poljoprivredi povezati sa zagađenjem. Učenik sa sigurnošću govori o razvrstavanju otpada.

Učenik sposoban korištenje određenih mjera u poljoprivredi povezati sa zagađenjem, navodi primjer. Učenik osim razvrstavanja otpada spominje i neke metode pročišćavanja otpadnih voda.

7. Povezati obrambeni mehanizam biljke sa ljudskom prehranom

Učenik ne povezuje proces starenja sa stvaranjem slobodnih radikala (koji kod biljaka nastaju zbog izloženosti teškim metalima i drugim zagađivačima).

Učenik uz pomoć nastavnika govori o antioksidansima i slobodnim radikalima (njihovoj ulozi u biljnom i životinjskom organizmu).

Učenik sa sigurnošću govori o antioksidansima i slobodnim radikalima (njihovoj ulozi u biljnom i životinjskom organizmu).

Učenik sa sigurnošću govori o antioksidansima i slobodnim radikalima (njihovoj ulozi u biljnom i životinjskom organizmu), nabraja vrste antioksidanasa (npr.vrste karotenoida).

53

PITANJA ZA VREDNOVANJE

1. Koji su argumenti za opće uvjerenje da složenost hranidbene mreže povećava stabilnost

zajednice?

2. Mogu li promjene morskih struja značajno utjecati na kopnene ekosustave, objasni?

3. Poredaj proces eutrofikacije od najmanjeg do najvećeg stupnja

a)oligotrofija,eutrofija,mezotrofija

b)eutrofija,mezotrofija,oligotrofija

c)oligotrofija,mezotrofija,eutrofija

d)mezotrofija,oligotrofija,eutrofija

4. Deponije otpada su točkasti izvori zagađenja T N

5-ta je vrsta kakvoće vode najlošija T N

Bioesej služi za procjenu stupnja onečišćenja T N

5. Poveži pojmove u stupcima

Rubisco zagađenost

raspad kolonija Krebsov ciklus

spektrofotometar antioksidansi

slobodni radikali Calvinov ciklus

Lemna test pigmenti

bioesej

6. Zašto u vodenim ekosustavima kemijske analize vode nisu najbolji pokazatelj stupnja

zagađenosti?

7. Za izražavanje stupnja toksičnosti koriste se _______, ______ i ______ vrijednosti

8. Ukratko opiši postupak spektrofotometrijskog određivanja koncentracije pigmenata?

9. Objasni bioesej sa vodenom lećom (postupak, prednosti korištenja, pokazatelji toksičnosti,

zaključak na temelju grafova)?

10. ______________ su skupina različitih prirodnih spojeva koji u organizmu čovjeka igraju

važnu ulogu zaštite od štetnog djelovanja ____________ _________.

11. Zašto se i gdje u biljnom organizmu magnezijevi ioni zamjenjuju bakrovim?

12. Što je eko otok?

13. Što ćete napraviti ako netko od vas zatraži izradu studije ekološkog stanja nekog

područja?

54

ANALIZA PITANJA

BROJ PITANJA

PRETPOSTAVLJENI ODGOVORI

BODOVI

POSTIGNUĆE

RAZINA

1. Skup hranidbenih lanaca čini hranidbenu mrežu. Što je na određenom trofičkom stupnju više različitih vrsta to je mreža stabilnija. Npr. prevelik razvoj tercijarnih konzumenata uzrokuje smanjenje sekundarnih konzumenata, međutim postojanje više različitih vrsta sekundarnih konzumenata spriječit će potpuno nestajanje te karike hranidbenog lanca. Primjer je kit ubojica koji se hraneći dupinima, smanjuje broj dupina, ali ne povećava broj lososa (kojima se hrane dupini) jer se njima hrane i npr. tuljani koji su na istom stupnju hranidbenog lanca kao i dupini.

3 1 Razina: 2.

2. Morske struje mogu utjecati na kopnene ekosustave zbog povezanosti vodenih i kopnenih ekosustava. Primjer je izumiranje velikih gmazova u prahistorijsko vrijeme upravo zbog prestanka strujanja morskih struja zbog čega su izumrli prvo vodeni, a potom i kopneni organizmi. Upravo je zbog ove povezanosti potrebno zaštititi vodene ekosustave.

2 1 Razina: 3.

3. c 1 2 Razina: 1.

4. N,T,T 1 2 Razina: 1.

5. rubisco-calvinov ciklus, raspad kolonija-zagađenje,spektrofotometar-pigmenti, slobodni radikali-antioksidansi, Lemna test-bioesej

1 4 Razina: 1.

6. Zbog antagonizma i sinergizma toksikanata (metala). Analiza vode pokazuje količinski sadržaj nekog metala, ali ne govori ništa o njegovoj dostupnosti biljkama ili životinjama (ako je neki metal vezan za određene ligande, tada nije dostupan biljkama (koje ga unose u obliku iona)

5 5 Razina: 3.

7. LC50,IC50 i NOEL vrijednosti 3 5 Razina: 1.

8. -dijelovi i princip rada 6 5 Razina: 2.

55

spektrofotometra, važno spomenuti maceriranje, centrifugiranje, odvajanje supernatanta te mjerenje apsorbancije na 470, 644.8 i 661.6 nm, računanje po formuli (formule ne treba znati)

9. uzorkovanje, sterilizacija, kultivacija na hranidbenom mediju, testiranje (u hranidbeni medij se dodaju različite koncentracije bakra/testiranog spoja), svakodnevno se broje biljčice (računanje prirasta broja biljaka), određivanje koncentracije pigmenata (biokemijskih pokazatelja toksičnosti). Biokemijski se pokazatelji toksičnosti javljaju prije pojave vanjskih kao što je kloroza, nekroza, raspad kolonija. Prednosti korištenja vodenih leća u ovakvim testiranjima su osjetljivost, genetska homogenost,brzo razmnožavanje, cijena, veličina dovoljno velika za uočavanje promjena golim okom…Bakar uzrokuje prirast broja biljaka na koncentracijama od 0.1 do 1 mg/L a smanjuje koncentracije pigmenata na svim koncentracijama s naglaskom na najveće koncentracije.

10 5 Razina: 3.

10. antoksidansi, slobodnih radikala 2 7 Razina: 2.

11. u povišenim koncentracijama bakrovi ioni zamjenjuju magnezijeve u molekuli klorofila, čime se mijenja funkcija klorofila odnosno općenito kloroplasta, te se pojave očituju kroz klorozu listova i smanjenje procesa fotosinteze.

2 5 Razina: 3.

12. skupina gradskih kontejnera u koje se odvojeno sakuplja papir, plastika, staklo i stare baterije (elektronički otpad) u svrhu smanjenja onečišćenja okoliša, boljeg iskorištenja otpadnih tvari i smanjenja troškova proizvodnje spomenutih sirovina.

2 6 Razina: 2.

13. istražiti područje (locirati biljne i životinjske vrste koje bi mogle biti u opasnosti, locirati izvore zagađenja), napraviti analize vode, na temelju analiza otkriti kojeg metala ili toksikanta ima u suvišku te njega testirati na prikladnim biljnim ili

5 3 Razina: 3.

56

životinjskim vrstama (istražiti utjecaj toksikanta na testni organizam), na temelju rezultata predložiti mjere revitalizacije.

Pitanja 1. razine: 4, ukupno bodova 6



Ukupno bodova u testu: 43

Ocjene:

nedovoljan: 0-22 bodova

dovoljan: 23-28 bodova

dobar: 29-34 bodova

vrlo dobar: 35-39 bodova

odličan: 40-43 bodova

5.1. Prilog pripremi

EKSPERIMENTALNI DIO PROJEKTA

UVOD:

Budući mnoge biomolekule apsorbiraju elektromagnetsko zračenje određene valne

duljine, to se pomoću spektrofotometra (slika 20.) mjerenjem količine apsorbiranog zračenja

neka biomolekula može detektirati i identificirati ili joj se može odrediti koncentracija u

otopini.

Slika 20. Glavne komponente spektrofotometra

Izvor elektromagnetskog zračenja odašilje EM zračenje širokog spektra koje ulazi u

monokromator. Monokromator propušta EM zračenje točno određene valne duljine koja

57

prolazi kroz uzorak u kiveti duljine puta (l). Uzorak apsorbira dio zračenja, a količina

apsorbiranog zračenja je proporcionalna koncentraciji uzorka. Dio zračenja koji nije

apsorbiran prolazi kroz uzorak (propušteno EM zračenje) i mjeri se na detektoru te se

najčešće izražava kao apsorbancija (A). Dakle, izložimo li otopinu biomolekula

elektromagnetnom zračenju određene valne duljine, tada biomolekule apsorbiraju dio tog

zračenja, a dio zračenja prolazi kroz kivetu sa otopinom biomolekula i biva detektiran

(izmjeren) na detektoru. Količina zračenja kojeg biomolekule apsorbiraju ovisna je o debljini

sloja biomolekula (duljina puta kroz kivetu), te o koncentraciji biomolekula u otopini, i što su

one veće to je i količina apsorbiranog zračenja veća.

Ovisnost količine apsorbiranog zračenja definirana je Lambert-Beerovim zakonom:

gdje je I0 intenzitet ulaznog EM zračenja, I intenzitet propuštenog zračenja, logaritam njihova

omjera apsorbancija (A) koja je jednaka umnošku molarnog apsorpcijskog koeficijenta ε

(L/mol cm), koncentracije biomolekula u uzorku c (mol/L) i duljine puta kroz kivetu l (cm).

Ukoliko se mjerenje apsorbancije provodi pri konstantnoj duljini puta, tada je apsorbancija

proporcionalna koncentraciji biomolekula u otopini, te se poznavajući molarni apsorpcijski

koeficijent može odrediti koncentracija biomolekula, odnosno ukoliko je poznata

koncentracija biomolekula u otopini, tada se može odrediti molarni apsorpcijski koeficijent.

1. SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PIGMENATA

PO LICHTENTALERU

CILJ: Odrediti koncentraciju pigmenata (klorofila a, b, ukupnih klorofila a+b te karotenoida)

u acetonskom ekstraktu biljnog materijala te preračunati koncentracije na mg/g svježe tvari.

PRIBOR I KEMIKALIJE: vaga, tarionik i tučak, staklene kivete, menzura od 10 mL, filter

papir, spektrofotometar, centrifuga, MgHCO3, aceton, 0.2 grama biljnog tkiva (vodene leće)

NAČIN IZVOĐENJA VJEŽBE:

Postupak ekstrakcije i određivanja pigmenata treba izvoditi brzo, u zamračenim uvjetima

zbog fotosenzibilnosti pigmenata. Odvaže se oko 0.2 g biljnog tkiva prethodno osušenog filter

papirom. Izvagani se biljni materijal prenosi u tarionik. Na uzorak se dodaje na vrhu žličice

MgHCO3 radi neutralizacije kiselosti i 10 mL acetona. Smjesa biljnog tkiva i kemikalija se

izmacerira u tarioniku i prenosi u staklenu kivetu. Nakon 15 minuta sadržaj se kivete

58

centrifugira pri 5000 G kroz 10 min na 4 ºC. Supernatant se odvoji u novu kivetu, doda se 10

mL acetona te se postupak ponavlja dok god boja supernatanta ne izblijedi (4 replike). Mjeri

se absorbancija supernatanta na 470, 644.8 i 661.6 nm pomoću spektrofotometra.

Dobivene vrijednosti apsorbancije uvrštavaju se u Lichtentalerove jednadžbe za

izračunavanje koncentracije pigmenata u mg/g svježe tvari biljke. Sve mjerene vrijednosti piši

u tablicu 12.

Chl-a (mg/g) = (11,24*A661,6 - 2,04*A644,8)*V/(m*1000)

Chl-b (mg/g) = (20,13*A644,8 - 4,19*A661,6)*V/(m*1000)

Chl-(a+b) (mg/g) = (7,05*A661,6 + 18,09*A644,8)*V/(m*1000)

Car(mg/g)=(1000*A470-1,90*(11,24*A661,6-2,04*A644,8)–63,14*(20,13*A644,8-4,19*A661,6))

*V/(214*m*1000)

Tablica 12. Podaci potrebni za izračunavanje koncentracija fotosintetskih pigmenata

POČETNO m (g) V (mL) A470 A644.8 A661.6

Replika 1.

Replika 2.

Replika 3.

Replika 4.

Na temelju podataka iz tablice izračunaj koncentracije klorofila a, b, a+b i karotenoida za sve

4 replike te srednje vrijednosti svih replika, rezultate upiši u tablicu 13.

Tablica 13. Koncentracije fotosintetskih pigmenata

REPLIKA Klorofil a Klorofil b Klorofil a+b karotenoidi

1.

2.

3.

4.

average

59

Na temelju gotovih podataka u excelu napravi graf koji prikazuje prirast (temeljen na

koncentraciji pigmenata) u ovisnosti o različitim koncentracijama bakra. Graf isprintaj i

zalijepi na predviđeno mjesto radnog listića te u nekoliko rečenica objasni rezultate.

Graf 1. Ovisnost prirasta (temeljenog na koncentraciji pigmenata) o koncentraciji bakra.

ZAKLJUČAK:

2. ODREĐIVANJE PRIRASTA BROJA BILJAKA (VODENA LEĆA) IZLOŽENIH

RAZLIČITIM KONCENTRACIJAMA BAKRA

Prirast broja biljaka određuje se brojanjem biljaka svih 7 dana pokusa. Pri tome se

broji svaka, pa i najmanja biljka vidljiva golim okom. Dobiveni podatci uvrštavaju su u

sljedeći izraz (Ensley i sur., 1994):

broj biljaka n-tog dana - broj biljaka 1. danaPrirast broja biljaka=broj biljaka 1. dana

(n=2,3,4,5,6,7)

Zadatak: Slijedeći naputke u excelu izračunaj priraste broja biljaka (kontrola) koristeći

navedenu formulu te na temelju gotovih podataka nacrtaj graf koji prikazuje ovisnost prirasta

broja biljaka i koncentracije bakra u mg/L (koncentracije bakra idu na os x, za nejasnoće

pogledati umetnute komentare). Graf isprintaj, zalijepi i objasni u nekoliko rečenica.

Graf 2. Ovisnost prirasta broja biljaka o koncentraciji bakra (mg/L)

ZAKLJUČAK:

60

5.2. Kriteriji vrednovanja portfolia

DOVOLJAN 2.

-uvod kratak, nedovoljno jasan, tekst prepisan sa prezentacije

-cilj nejasno određen (učenik ne razumije cilj)

-zapisi s terenskog djela projekta neorganizirani (primjećuje se nedovoljan rad na

terenu te nezainteresiranost za zadatak)

-postupak mjerenja koncentracije pigmenata prepisan s radnog listića te neadekvatno

organiziran

-priloženi radni listić neuredan

-zaključak nejasan, ne proizlazi iz sadržaja, premalo razrađen

-nepovezanost između antioksidanasa i slobodnih radikala

-obrađena samo jedna tema iz izbornog djela portfolia

U portfoliu se uočava nezainteresiranost učenika za rad, manjak predznanja o prijašnjim

lekcijama iz ekologije, učenik ima slabo razvijenu ekološku svijest (ne zna što je eko otok te

ga to niti ne brine).

DOBAR 3.

-uvod djelomično jasan, uočava se pokušaj preoblikovanja teksta sa prezentacije

-cilj je djelomično određen (uočava se nesigurnost u shvaćanju projekta)

-zapisi s terenskog djela zadovoljavajući, ali je trud mogao biti veći

-postupak mjerenja koncentracije pigmenata nerazumljiv

-priloženi radni listić ispunjen, uložen manjak truda

-zaključak je djelomično jasan i djelomično proizlazi iz sadržaja

-nepovezanost antioksidanasa sa stvarnim životom (ljudska prehrana)

-obrađeno više tema izbornog djela

Učenik ima sve dijelove portfolia, međutim uočava se nedostatak truda i većeg zalaganja. Iz

esejskog se djela može uočiti poznavanje prijašnjeg gradiva, ali je to znanje na razini

reprodukcije.

61

VRLO DOBAR 4.

-uvod je jasan ali nije do kraja razrađen

-cilj je dobro obrazložen

-uočava se veliki trud tijekom terenskog djela nastave (svi zadaci terenskog djela

napravljeni)

-postupak mjerenja koncentracije pigmenata razumljiv

-radni listić uredno ispunjen, nema znakova nerazumljivosti

-zaključak je jasan i u potpunosti proizlazi iz sadržaja

-učenik pokazuje solidno znanje o antioksidansima te povezuje slobodne radikale sa

oksidativnim stresom

-obrađene sve teme izbornog djela, ali se između njih ne primjećuje povezanost

Učenik ima jako dobro razrađene sve dijelove portfolia, uočava se trud tijekom izrade svakog

pojedinog djela. Međutim, prisutno je premalo primjera te je povezanost teme sa stvarnim

životom na granici nerazumijevanja.

ODLIČAN 5.

-uvod je u potpunosti jasan i razrađen

-cilj je precizno određen i dobro obrazložen

-uočava se veliki trud tijekom terenskog djela nastave (svi zadaci terenskog djela

napravljeni)

-postupak mjerenja koncentracije pigmenata u potpunosti razumljiv

-radni listić uredan, razumljiv, grafovi jako dobro napravljeni (uočava se znanje rada u

excelu)

-zaključak je primjenjiv u rješavanju sličnih situacija

-učenik pokazuje solidno znanje o antioksidansima te povezuje slobodne radikale sa

oksidativnim stresom

-obrađene sve teme izbornog djela portfolia, između njih se uočava jasna povezanost

Učenik je pokazao izrazito zanimanje i razumijevanje projekta. Primjeri prate sadržaj i u

potpunosti ga objašnjavaju. Učenik ima razvijenu ekološku svijest te je spreman u njenom

promoviranju. Uočava se i odlično poznavanje prijašnjih lekcija o ekologiji.

62

6. ZAKLJUČAK

• Kultura biljaka Lemna gibba L. izolirana iz ribnjaka Narta osjetljivija je na bakar nego

kultura iste vrste uzgajana u laboratorijskim uvjetima.

• Toksičnost bakra na obje kulture povećavala se s vremenom izloženosti, a to

povećanje je izraženije kod biljaka kulture izolirane iz ribnjaka Narta.

• Pri nižim koncentracijama bakar je stimulirao rast biljaka obje testirane kulture, a pri

višim je ustanovljena pojava toksičnosti.

• Standardni testovi toksičnosti mogu podcijeniti toksičnost bakra na biljkama

uzgajanim u kontroliranim uvjetima u odnosu na biljke u prirodnom okolišu.

63

7. LITERATURA

Allen H.E. 1993. The significance of trace metal speciation for water, sediment and soil

quality standars. Sci. Total Eviron, vol.134, p.23.

Ambriović Ristov A. 2007. Metode u molekularnoj biologiji. Institut Ruđer Bošković,

Zagreb.

Babu S.T, Akhtar T.A, Lampi M.A, Tripuranthakam S, Dixon D.G, Greenberg B.M. 2003.

Similar stress responses are elicted by copper and ultraviolet radiation in the aquatic plant

Lemna gibba : Implication of reactive oxygen species as common signals. Plant Cell Physiol.

44(12): 1320-1329.

Barazani O, Sathiyamoorthy P, Manandhar U, Vulkan R, Golan-Goldhirsh A. 2004. Heavy

metal accumulation by Nicotiana glauca Graham in a solid waste disposal site. Chemosphere

54: 867-872.

Batley G. E, Bowles K. C, Brown P. L, Creighton N, Hales L. T, Hyne P. V, Rogers N. J,

Stauber J. L. 1989. A comparison of copper speciation measurments with toxic responses of

three sensitive freshwater organisms. Environ. Chemistry, vol. 2 (4): 320-330.

Bionardi N, Vatta G, Nano G, Rota R, Carra S. 1994. Removal of the water pollutants by

Lemna gibba. Chem. ENG. J. 54, B41-B45.

Branica M. 1990. Environmental research in aquatic systems. Scientific series of the

International Bureau, vol. 3, 1-15.

Campbell P. G. C. 1995. Interactions between metals and aquatic organisms. A critique of the

free ion activity model. Speciation and Bioavailability in Aquatic systems (Tessier i Turner),

Wiley, New York.

Cecarini V, Gree J, Fioretti E, Amiti M, Angeletti M, Eleuteri A. M, Keller J. N. 2006.

Protein oxidation and cellular homeostasis: Emphasis on metabolism. Biochimica et

Biophysica Acta 1773: 93-104.

Cheung Y. H, Wong M. H, Tam N. F. Y. 1989. Root and shoot elongation as an assessment of

heavy metal toxicity and Zn equivalent of edible crops. Hydrobiologia 188/189: 377-383.

Christen O, Theuer C. 1996. Sensitivity of Lemna bioassay interacts with stock-culture

period. J. Chem. Ecol. 22(6): 1177-1186.

64

Cowan C. E, Jenne E. A, Kinnison R. R. 1986. Methodology for determining the relationship

between toxicity and the aqueous speciation of a metal. Aquatic Toxicity and Environmental

Fate, vol. 9, ASTM STP 921 (Poston i Puray). American society for Testing and Materials,

Philadelphia p. 463.

Cowgill U. M, Milazzo D. P, Landenberger B. D. 1991. The sensitivity of Lemna gibba G-3

and four clones of Lemna gibba to eight common chemicals using a 7-day test. Research J.

WPCF 63(7): 991-998.

Daneron C. T, Harisson M. D. 1991. Mechanisms for protection against copper toxicity. Am.

J. Clin Nature. In press.

Drost W, Matzke M, Backhaus T. 2006. Heavy metal toxicity to Lemna minor: Studies on the

time dependence of growth inhibition and the recovery after exposure. Chemosphere 67(1):

36-43.

Ensley H. E, Barber J. T, Polito M. A, Oliver A. I. 1994. Toxicity and metabolism of 2,4-

dichlorophenol by the aquatic angiosperm Lemna gibba. Environ. Toxicol. Chem. 13(2): 325-

331.

Erben R, Lajtner J. 1995. Akvatički testovi toksičnosti. Hrvatska vodoprivreda br. 28: 30-32.

Erickson R. J, Benoit D. A, Mattson V. R, Nelson H. P, Leonard E. N. 1996. The effects of

water chemistry on the toxicity of copper to fathead minnows. Environ. Toxicol. Chem., vol.

15, p. 181.

Flemming C. A, Trevors J. T. 1989. Copper toxicity and chemistry in the environment: A

review. Water, Air, Soil Pollution, vol. 44, 193 pp.

Gaggi C, Sbrilli G, Hasab El Naby A. M, Bucci M, Duccini M, Bacci E. 1995. Toxicity and

hazard ranking of s-triazine herbicides using Microtox, two green algal species and a marine

crustacean. Environ. Toxicol. Chem. 14(6): 1065-1069.

Goldberg M, Fraizer M. 1989. Alternatives to animals in toxicity testing. Scientific American

261: 16-22.

Grill D, Zelling G, Bermadinger-Stabentheiner E, Mȕller M. 1992. Strukturelle

Verȁnderungen in Abhȁngingkeit verschiedener Luftschȁdstoffe. U: Wirkung von

Luftschȁdstoffen aus Gehȍlzpflanzen. Verlag Paul Parey, Hamburg, Njemačka.

Hillman W. S, Culley D. D. 1978. The uses of duckweed. Am. Sci. 66: 442-451.

65

Hou W, Chen X, Song G, Wang Q, Chang C. C. 2007. Effects of copper and cadmium on

heavy metal polluted water body restoration by duckweed (Lemna minor). Plant Physiol.

Biochem. 45: 62-9.

Hudson P. V, Borgmann U, Shear H. 1979. Toxicity of copper to aquatic biota. Copper in the

Environment. Part II. Health Effects. J. O. Nriagu. Wiley-Interscience, New York.

Ilijanić LJ, Topić J. 2005. Tipizacija staništa Hrvatske prema CORINE sustavu.

Ispitni katalog za državnu maturu u školskoj godini 2010./2011.

Jain S. K, Vasudevan P, Jha N. K. 1989. Removal of some heavy metals from polluted water

by aquatic plants: Studies on duckweed and water velvet. Biol. Wastes. 28: 115-126.

Janssen C. R, Heijerick D. G, De Schamphelaere K. A, Allen H. E. 2003. Environmental risk

assessment of metals: tools for incorporating bioavailability. Environment International 28(8):

793-800.

Jendričko J, Simončić V, Tadić L. 2003. Program zaštite okoliša Bjelovarsko-bilogorske

županije. Županijski zavod za prostorno uređenje, Bjelovar.

Kanoun-Boule M, Vicente J. A. F, Nabais C, Prasad M. N. V, Freitas H. 2008.

Ecophysiological tolerance of duckweeds exposed to copper. Aquatic Toxicology 91: 1-9

Khellaf N, Zerdaoui M. 2009. Growth response of the duckweed Lemna minor to heavy metal

pollution. Iran J. Environ. Health. Sci. Eng., vol. 6, no.3, 161-166 pp.

Khellaf N, Zerdaoui M. 2010. Growth response of Lemna gibba L. (duckweed) to copper and

nickel phytoaccumulation. Ecotoxicology 19(8): 1363-8.

Khellaf N, Zerdaoui M. 2010. Growth, photosynthesis and respiratory response to copper in

Lemna minor: A potential use of duckweed in biomonitoring. Iran. J. Environ. Health. Sci.

Eng., vol. 7, 299-306 pp.

Krajnčić B, Devide Z. 1980. Report on photoperiodic responses in Lemnaceae from Slovenia.

Berichte des Geobot. Instit ETH, Stiftung Rȕbel, Zȕrich, 47: 75-86.

Krsnik-Rasol M, Rendić L. 1977. Djelovanje nekih triazinskih derivata na rast i razvoj

vodenih leća. Acta Bot. Croat. 36: 75-82.

Kȕpper H, Šetlik J, Spiller M, Kȕpper F. C, Prašil O. 2002. Heavy metal-induced inhibition of

photosyntesis: targets of in vivo heavy metal chlorophyll formation. J. Phycd. 38: 429-441.

66

Landolt M. A. 1995. Use of freshwater plants for phytotoxycity testing: A review. Environ.

Poll. 87: 319-336.

Lei M, Baosong C, Tongbin C, Guoping Z, Yang C. 2003. Phytochelatins and their roles in

phyto-tolerance to heavy metals: A review. Acta Ecologica Sirica 23(10): 2125-2132.

Lewis M. A. 1995. Use of freshwater plants for phytotoxycity testing: A review. Environ.

Poll. 87: 319-336.

Li T. Y, Xiong Z. T. 2003. Cadmium–induced colony disintegration of duckweed (Lemna

paucicostata Hegelm.) and as biomarker of phytotoxicity. Ecotoxicology and Environmental

Safety 59: 174-179.

Lichtenthaler H. K. 1987. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic

membranes. Methods Enzymol. 148: 350-382.

Linder M. C, Hazegh-Azam M. 1996. Copper biochemistry and molecular biolohy. Am. J.

Clin Nutr., vol. 63, 797S-811S pp.

Lockhart W. L, Billeck B. N, Baron C. L. 1989. Bioassays with a floating aquatic plant

(Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrologia 188/189: 353-359.

Mallah G, Afzal M, Gulshan S, Abraham D, Kurian M, Dhami M. S. J. 1996. Vicia faba as a

bioindicator of oil pollution. Environ. Poll. 92(2): 213-217.

Martinez M, Bernal P, Almela C, Velez D, Garcia-Augustin P, Serrano R, Navarro-Avino J.

2006. An engineered plant that accumulates higher levels of heavy metals than Thlaspi

cerulescens, with yields of 100 times more biomass in mine soils. Chemosphere 64: 478-485.

Mateo R. 2009. Lead poisoning in wild birds in Europe and the regulations adopted by

different countries. U: Ingestion of Lead from Spent Ammunition: Implications for Wildlife

and Humans. The Peregrine Fund, Biose, Idaho, USA, 71-98 pp.

Matthews R. A, Buikema A. L, Cairns J, Rogers J. H. 1982. Biological monitoring. Part IIA.

Receiving system functional methods, relationships and indices. Water. Res. 16: 129-139.

Meštrov M. 2004. Ekologija. Školska knjiga, Zagreb.

Mikuška T, Podravec D. 2010. Praćenje stanja ornitofaune na području Nacionalne ekološke

mreže-Ribnjaci uz Česmu (Siščani, Blatnica, Narta i Vukšinac). Hrvatsko društvo za zaštitu

ptica i prirode.

67

Miretzky P, Saralegui A, Fernandez Cirelli A. 2004. Aquatic macrophytes potential for the

simultaneous removal of heavy metals. Chemosphere 57: 997-1005.

Montferran M. V, Sanchez Agudo J. A, Pignata M. L, Wunderlin D. A. 2009. Copper-induced

response of physiological šarameters and antioxidant enzymes in the aquatic macrophyte

Potamogeton pusillus. Environmental Pollution 157: 2570-2576.

Moore M. Z, Imray P, Dameron C, Callan P, Langley A, Mangas S. 1997. Copper: report of

an international meeting. National Environmental Health Forum.

Mȕezzinglu A, Gȕrel O, Odabasi M. 1994. Environmental chemical safety. Chemical safety-

International Reference Manual. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Njemačka.

Mysliva-Kurdziel B, Strzalka K. 2002. Influence of metals on the biosynthesis of

photosynthetic pigments. U: Physiology and Biochemistry of metal toxicity and tolerance in

plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, 201-227 pp.

OECD. 2002. Guidelines for testing of chemicals, Lemna sp. Growth Inhibition test, Draft

guideline 221, Paris, France.

O'Donnel J. R, Kaplan B. M, Allen H. E. 1985. Bioavailability of trace metals in Natural

waters. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: seventh symposium, American Society

for Testing and Materials, Philadelphia.

O'Halloran T. V. 1993. Transition metals in control of gene expression. Science, vol. 261,

715-25 pp.

Pain D. J, Fisher J. J, Thomas V. G. 2009. A global update of lead poisoning in terrestrial

birds from ammunition sources. U: Ingestion of Lead from Spent Ammunition: Implications

for Wildlife and Humans. The Peregrine Fund, Biose, Idaho, USA, 1-20 pp.

Pevalek-Kozlina B. 2003. Fiziologija bilja. Profil, Zagreb.

Pierson A, Seidl F. 1950. Zell-und Stoffwechselphysiologische Untersuchungen an der

Wurzel von Lemna minor unter besonderer berȕcksichtingung von Kalium und

Kalziummangel. Planta 38: 431-473.

Prostorni plan Bjelovarsko-bilogorske županije. 2010. Zavod za prostorno uređenje.

Roscio N, Navari-Izzo F. 2010. Heavy metal hyperaccumulating plants: how and why do they

do it? And what makes them so interesting? Plant Science, vol. 180, no. 2, 169-181 pp.

68

Sabreen S, Sugiyama S. 2008. Trade off between cadmium tolerance and relative growth rate

in 10 grass species. Environ. Experimental Bot. 63: 327-332.

Sandmann G, Bȍger P. 1980. Copper-mediated lipid peroxidation processes in the

photosynthetic membranes. Plant Physiol. 66: 797-800.

Shigeoka T, Yoshida K, Saito H. 1994. Environmental hazard assessment of chemicals. U:

Chemical Safety-International Reference Manual. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim,

Njemačka.

Shokolenok G. 1994. Global chemical pollution. U: Chemical Safety-International Reference

Manual. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Njemačka

Springer O. P, Pevalek-Kozlina B. 2004. Biologija 3. Profil, Zagreb.

Stebbing A. R. D. 1982. Hormesis-The stimulation of growth by low levels of inhibitors.

Science of The Total Environment, vol. 22(3): 213-234.

Stadtman E. R. 2006. Protein oxidation in aging and age related diseases. Annals of New

York Academy of Science, vol. 928: 22-38.

Striborova M, Doubravova M, Brezinova A, Friedrich A. 1986. Effect of heavy metal ions on

growth and biochemical characteristics of photosynthesis of barley (Hordeum vulgare L.).

Photosynthetica 20: 418-425.

Stumm W, Morgan J. J. 1981. Aquatic chemistry: chemical equilibria and rates in natural

waters. Wiley, New York, 1022 p.

Sunda W, Guillard R. R. L. 1976. The relationship between cupric ion activity and the

toxicity of copper to phytoplankton. J. Mar. Res., vol. 34, 511 p.

Teisseire H, Guy V. 2000. Copper induced changes in antioxidant enzymes activities in

fronds of duckweed (Lemna minor). Plant Sci. 153:65-72.

Van Assche F, Clijsters H. 1990. Effects of metals on enzyme activity in plants. Plant Cell

Environ. 13: 195-206.

Vidaković-Cifrek Ž, Krsnik-Rasol M, Regula I, Papeš D. 1995. Calcium chloride and calcium

bromide in Allium test, Lemna test and their effect upon peroxidase in Avena coleoptiles.

Abstract Book, 25-th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society,

Noordwijkerhout, Nizozemska.

69

Vinodhini R, Narayanan M. 2007. Bioaccumulation of heavy metals in organs of fresh water

fish Cyprinus carpio (common carp). Int. L. Environ. Sci. Tech 5 (2): 179-182.

Wang W. 1986. Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environ.

Pollut. 11: 1-14.

Wang W. 1991. Literature review on higher plants for toxicity testing. Water Air Soil Poll.

59: 381-400.

Wang W. 1992. Use of plants for the assessment of environmental contaminants. Rev.

Environ. Contam. Toxicol. 126: 87-127.

Xing W, Huang W, Liu G. 2009. Effect of excess iron and copper on physiology of aquatic

plant Spirodela polyrrhiza (L.) Schleid. Environmental Toxicology 25(2): 103-12.

Zayed A, Gowthaman S, Terry N. 1998. Phytoaccumulation of trace elements by wetland

plants. J. Environ. Qual. 27: 715-721.

Web 1. http://species.wikimedia.org/wiki/Lemna_gibba, 29.9.2012.

Web 2. www.GoogleEarth.com, 1.10.2012.

http://species.wikimedia.org/wiki/Lemna_gibba

http://www.googleearth.com/

8. PRILOZI

Prilog 1. Pokazatelji kakvoće vode rijeke Česme kod mjesta Narta (Hrvatske vode, od 1.1.2010 do 31.12.2011)

Datum 07.01.2010 02.02.2010 02.03.2010 06.04.2010 04.05.2010 01.06.2010 01.07.2010 03.08.2010 02.09.2010 05.10.2010Analitički broj 1 88 182 299 426 546 709 894 1031 1211

Fizikalno kemijski pokazateljiTemperatura vode (°C) 2,8 3,1 7,5 12 21,1 13,8 25 26,7 19,3 13,9pH vrijednost 7,71 8 7,81 7,82 7,97 7,74 7,82 7,89 7,61 7,88Električna vodljivost (μS/cm) 426 601 372 306 599 297 477 539 423 498Ukupne suspendirane tvari (mg/l) 13 10 11,6 60 5,6 90 15 15,2 14,8 13Alkalitet m-vrijednost (mgCaCO₃/l) 170 260 160 149 315 133 211 241 201 245Alkalitet p-vrijednost (mgCaCO₃/l) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0Režim kisikaOtopljeni kisik (mgO2/l) 11,6 12,4 9,7 9,1 7,7 6,6 5,2 4,5 5,9 7,2Zasićenje kisikom (%) 85,7 92,3 80,9 84,6 86,6 63,8 62,9 56 64,1 69,8BPK₅ (mgO₂/l) 2,1 2,5 3,6 7,1 2,9 4,3 3,7 2,6 3,3 1,3KPK-Mn (mgO₂/l) 9 5,2 8,3 16,2 7,2 18,1 11,2 9,3 9,9 8,2Hranjive tvariAmonij (mgN/l) 0,099 0,084 0,053 0,16 0,104 0,293 0,079 0,156 0,196 0,064Nitriti (mgN/l) 0,012 0,007 0,009 0,013 0,01 0,045 0,021 0,063 0,03 0,014Nitrati (mgN/l) 2,11 1,68 2,18 1,31 0,14 2,32 0,36 0,42 0,41 0,64Ukupni dušik (mgN/l) 2,72 2,11 2,76 2,56 0,95 3,88 1,26 1,49 1,43 1,52Anorganski dušik (mgN/l) 2,221 1,771 2,242 1,483 0,254 2,658 0,46 0,639 0,636 0,718Organski dušik (mgN/l) 0,499 0,339 0,518 1,077 0,696 1,222 0,8 0,851 0,794 0,802Ortofosfati (mgP/l) 0,081 0,047 0,071 0,117 0,066 0,198 0,082 0,147 0,091 0,076Ukupni fosfor (mgP/l) 0,147 0,12 0,142 0,352 0,24 0,509 0,175 0,276 0,218 0,161Organski spojeviDiuron (μg/l) <0,033 <0,033 <0,033 <0,033 <0,033 <0,033 <0,033 <0,033 <0,033 <0,033Izoproturon (μg/l) <0,025 <0,025 <0,025 <0,025 <0,025 <0,025 <0,025 <0,025 <0,025 <0,025

Prilog 1. Nastavak

02.11.2010 02.12.2010 11.01.2011 01.02.2011 01.03.2011 11.04.2011 03.05.2011 07.06.2011 05.07.2011 08.09.2011 06.12.20111327 1457 7 110 229 401 509 680 808 1074 1449

8,6 3,9 5,7 3 1,9 15,1 20,1 27 26,9 22 7,77,9 7,75 8,02 7,89 8,07 7,79 8 8,12 7,91 7,51 7,75

589 240 535 613 615 602 650 594 441 504 5322 113 12 14 15 26 13 13 18 28 31,3

300 113 268 313 314 340 365 327 245 273 2630 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

9,1 10,1 11,1 13,6 13 7,9 6,9 4,9 2,7 5,4 7,978 76,8 88,4 101 93,7 78,7 76,2 61,3 33,8 61,8 66,2

4,6 2,8 3,3 2,7 2,4 2,7 2,1 1 6 7 105,8 7,8 4,7 3,3 3,1 6,3 5 8,7 14,9 11 13,6

0,057 0,069 0,112 0,109 0,091 0,098 0,134 0,227 0,631 0,431 0,3150,012 0,006 0,017 0,009 0,057 0,147 0,022 0,061 0,024 0,011 0,065

0,69 0,98 1,33 1,44 1,28 0,41 0,25 0,21 0,06 0,08 0,841,15 1,83 1,74 1,78 1,69 1,06 0,79 1,13 1,93 1,51 3,78

0,759 1,055 1,459 1,558 1,428 0,655 0,406 0,498 0,715 0,522 1,220,391 0,775 0,281 0,222 0,262 0,405 0,384 0,632 1,215 0,988 2,560,064 0,18 0,059 0,057 0,022 0,0898 0,0606 0,116 0,169 0,094 <0,0050,136 0,384 0,14 0,133 0,094 0,1632 0,2072 0,5198 0,252 0,496 0,338

<0,033 <0,033<0,025 <0,025

sveuČiliŠte josipa jurja strossmayera u...

Documents