Supplementary results: Surface Plasmon Resonance (SPR) 

Experimental details: 

For SPR experiments, the K1 sequence was ordered biotinylated on the 3’ end from Integrated DNA 

Technology (Leuven, Belgium) with standard desalting. Prior to SPR experiments, ESI‐MS analysis was 

performed to check the purity of the oligonucleotides provided. 

The experiments were done on a BIAcore T200 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). The ESI‐MS buffer 

(150 mM NH4OAc) was used for all experiments containing 0, 1 or 3 mM Mg(OAc)2. 

Hairpin K1 was diluted at 1 µM and then folded (65°C for 5 min, 4°C for 1 min, the rest of the procedure 

at room temperature). K1 was then diluted at 50 nM and immobilized at a flow rate of 5 µL/min on a 

streptavidin sensorchip (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) to reach around 250 RU. All channels were 

grafted in the same way. All complementary hairpins i.e. UC, CC, CU and UU, were diluted from 4 µM 

to 31.25 nM. Multi‐cycle kinetics of UC, CC, CU and UU were carried out in the appropriate buffer at a 

flow rate of 20 µL/min. Regeneration was achieved with a 20 µL pulse of 3 mM EDTA, followed by one 

20‐µL pulse of distilled water and finally several pulses of the running buffer. 

The global fitting (Figure S1) was done using the BIAeval software 3.1. The model used was 1:1, plus 

the bulk signal (RI) which can happen when the refractive index of the analyte solution and the flow 

buffer are different.  

To obtain the Req, we had to extrapolate the association curves to an infinite time. The association 

parts of the sensorgrams were analyzed with Table curve 2D v5.01 (Systat Software Inc.), and fitted 

with  two  first‐order  formation  kinetics  (equation: 1 1 .  The  total 

extrapolated Req was obtained by summing the fitting parameters A+B+D. 

The graphs of Req as a function of [ligand] were fitting was done using a 1:1 Langmuir binding model 

(Equation:   ), using Sigmaplot v12.5 (Systat Software Inc.).  

 

 

Results: 

 

Supplementary Figure S1. SPR results. Sensorgrams obtained for the titration of hairpin K1 attached 

to the sensorship, and each of the four variants of the hairpin K1’ injected in the microfluidics 

system. The fits in black were obtained with global fitting with a 1:1 binding model, plus a variable 

parameter for a jump of refractive index. The 1:1 binding model could not fit the data appropriately. 

The association is characterized by at least two rate constants.  

 

 

Supplementary Figure S2. KD determination by SPR. Equilibrium dissociation constants obtained by 

analyzing the steady‐state of surface plasmon resonance experiments. The steady‐state RU of each 

sensorgram was obtained by fitting the association part with two first‐order association rates, and 

Req is calculated as the sum of the RUs extrapolated at infinite time. Req is plotted as a function of the 

ligand concentration, and fitted by a 1:1 binding model to obtain the KD values indicated on the 

figure.  

Supplementary results: UV‐melting 

Experimental details: 

Melting experiments were performed on a UV mc² spectrophotometer (SAFAS, Monte Carlo, Monaco) 

equipped  with  a  Peltier  temperature  controller,  in  580‐µL  quartz  cuvette  (Hellma,  Müllheim, 

Germany). UV melting experiments were performed with K1short and all four complementary hairpins 

i.e UC, CC, CU and UU. The solutions were prepared at 1 µM of each complementary hairpin in 150 

mM NH4OAc. Three different concentrations of magnesium acetate were used: 0, 800 µM and 3 mM. 

The temperature ramp was set at 0.2°C/min from 4°C to 90°C. The absorbance was followed at 260 

nm. The results are presented as the first derivative curves of the absorbance by the temperature. Tm 

are determined using the maximum of these curves.  

 

Results: 

 

Supplementary Figure S3. UV‐melting. First derivative of the absorbance measured at 260 nm, as a 

function of the temperature. The first local maximum corresponds to the disruption of the kissing 

complex base pairs. The second local maximum obtained at >50 °C corresponds to the melting of the 

individual hairpins. The solutions without magnesium and with 800 µM magnesium were prepared 

in the same conditions as for mass spectrometry. The stability ranking is CC > UC > CU > UU (melting 

not observed, likely completed below 4°C) in both cases, in line with the mass spectrometry results. 

 

Supplementary results: mass spectrometry 

 

 

Supplementary Figure S4. ESI‐MS spectra of the full length target K1 (a‐c) and the shorter target 

K1short (e‐f), illustrated for the complex UC. Spectra a) and d) are without magnesium (150 mM 

NH4OAc only). Spectra b) and e) are with 200 µM Mg(OAc)2. Spectra c) and f) are with 800 µM 

Mg(OAc)2. On the full length sequences, the magnesium adducts make it difficult to quantify the free 

target K1. With the shorter target K1’short, there is no such interference. 

 

 

 

 

Supplementary results: molecular modeling 

 

 

 

Supplementary Figure S5.  RMSD over time for the 4 kissing complexes: evolution of the RMSD over 

time for each complex in sodium (34 Na+ ions and ~8900 water molecules) for 200 ns (black curves) 

and in magnesium (30 Na+ ions, 2 Mg2+ ions and ~8900 water molecules)  for 300 ns (red curves). The 

mean and the standard deviation are shown on the top of each graph for the respective times in ns. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Supplementary Figure S6. Density of Na+ and Mg2+ ions around the kissing complexes. The receptor 

K1  is  in  grey  and  ligands  K1’  are  in  cyan.  The  surface  shape  of  the  kissing  complex  is  shown  as 

transparent. In yellow mesh is the density of the Na+ ions calculated by grid from AmberTools with an 

isovalue of 400, and in solid yellow is shown the isovalue of 100. In red mesh is the density of the Mg2+ 

ions calculated by grid from AmberTools with an isovalue of 50, and in solid red is shown the isovalue 

of 150. We observe that the same pockets are sampled by the two types of ions: a main pocket in the 

loop‐loop region and secondary pockets next to the major groove of the hairpins and on the exit of 

the K1 loop across all four complexes. 

 

 

 

Supplementary Figure S7. Opening of  the U7•G30 base pair. The  system UC  is  shown with  the K1 

receptor in gray and the K1’ ligand in cyan. The residues U7 and G30 are labeled. The open conformation 

in a) is shown with the U7 positioned outside the loop‐loop interaction and in b) the close conformation 

with U7 base paired with G30. For checking convergence the MDs were extended to 400 ns each. We 

followed the average distance of the two hydrogen bonds between U7 and G30 in sodium (black) and 

magnesium (red) environment and plotted it as a time series in c).   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Supplementary Figure S8. Hydrogen bond network in sodium 50 to 200 ns. The target K1 on the 

right hand side of each complex contains residues 19 to 36. The ligands K1’ contain residues 1 to 18. 

The kissing complexes are named according to the identity of their bases in positions 7 and 12, 

respectively. For example, in panel (a), the kissing complex UC contains a uracil (U) in position 7 and 

a cytosine (C) in position 12. The four panels show the hydrogen bond network obtained by MD for 

each complex in sodium ions (from 50 to 200 ns). The colors are proportional to the presence or 

absence of the bond, from blue 0% (absence) to red 100% (present). The residues differing in the 

four kissing complexes in position 7 and 12 are in bold and underlined. The hydrogen bonds between 

two bases are represented by solid lines. The dashed lines represent the hydrogen bond between 

the ribose and the phosphate groups. 

 

 

 

Supplementary Figure S9. Hydrogen bond network between the two hairpins. The hydrogen bond 

network between the two hairpins (K1 in gray and K1’ in cyan) is shown. In licorice is represented 

the residues involved in the hydrogen bond: U7, C6 from the ligands K1’ and G24, G25 from the 

receptor K1. The network is shown as dotted black line between the ribose of the residues G24 and 

C6 and the phosphate group of the residues G25 and U7. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Supplementary Figure S10. Base slide in the MD in magnesium. The helicoidal parameters were 

calculated on the linearized sequence shown in a). The steps which yield to a change along the 4 

systems are shown in 3D structure in b) the steps G30pC31.G24pN7 (N for Cytosine or Uracil) and 

the step C31pG32.C23pG24 and in c) the steps G25pC26.G11pN12 (N for Cytosine or Uracil) and the 

step C27pG26.G10pG11 and their corresponding twist value (in degrees) as a boxplot in d) and e) 

respectively. The gray line in the boxplots indicates the canonical value of the slide parameter (‐1.5°) 

in an A‐helix.  In f) is shown a schematic representation of two base pairs representing a slide along 

the y‐axis. 

 

 

 

 

 

 

 

 

Supplementary Figure S11. Inter‐base pair twist in the MD  in sodium. The helicoidal parameter  is calculated on the linearized sequence shown in a). The steps which yield to a change across the four kissing complexes are shown in 3D structure in b) the steps G30pC31•G24pN7 (N for cytosine or uracil) and the step C31pG32•C23pG24 and in c) the steps G25pC26•G11pN12 (N for cytosine or uracil) and the step C26pC27•G10pG11 and their corresponding twist value (in degrees) as a boxplot in d) and e) respectively. The gray line in the boxplots indicates the canonical value of the twist parameter (32°) in an A‐helix. In f) is shown a schematic representation of two base pairs adopting a relative twist around the z‐axis. 

 

 

 

Supplementary Figure S12. Base slide in the MD in sodium. The helicoidal parameters were 

calculated on the linearized sequence shown in a). The steps which yield to a change along the 4 

systems are shown in 3D structure in b) the steps G30pC31.G24pN7 (N for Cytosine or Uracil) and 

the step C31pG32.C23pG24 and in c) the steps G25pC26.G11pN12 (N for Cytosine or Uracil) and the 

step C27pG26.G10pG11 and their corresponding twist value (in degrees) as a boxplot in d) and e) 

respectively. The gray line in the boxplots indicates the canonical value of the slide parameter (‐1.5°) 

in an A‐helix.  In f) is shown a schematic representation of two base pairs representing a slide along 

the y‐axis. 

 

 

 

 

 

Supplementary Figure S13. Energy decomposition per residue for MDs in Sodium. The 

decomposition per‐residue in kcal/mol along the sequence of the kissing complex is shown, where 

N7 and N12 can be either a uracil or a cytosine for a window of 50 to 200 ns. The symbols; triangle, 

cross, dot and star, and the blue, orange, green, red lines represent the UC, CC, CU and UU systems, 

respectively. The residues that show different energy are labeled on the graph. 

Table S1: MMPBSA calculations (data of main text Figure 5a). Thermodynamics calculations on the 

four kissing complexes in different environment (with and without magnesium ions). The ΔGassoc 

obtained by MMPBSA (kcal/mol), is reported with its relative mean error on different window 

frames (for sodium MDs, 50 to 100 ns, 100 to 150 ns , 150 to 200 ns ‐ for the magnesium MDs we 

added two windows from 200 to 250 ns and 250 to 300 ns). The global MMPBSA is calculated from 

50 to 200 ns and 50 to 300 ns for the MD in sodium and in magnesium respectively. 

 

Name  Ions  MMPBSA ΔG (kcal/ mol) 

50‐100 ns 

MMPBSAΔG (kcal/ mol) 

100‐150 ns 

MMPBSAΔG (kcal/ mol) 

150‐200 ns 

MMPBSA ΔG (kcal/ mol) 

200‐250 ns 

MMPBSAΔG (kcal/ mol) 

250‐300 ns 

MMPBSAΔG (kcal/ mol) global 

UC  34 Na+  ‐25.4 ± 0.2  ‐19.7 ± 0.3  ‐20.8 ± 0.3   NA  NA  ‐23.2 ± 0.2 

30 Na+ , 2 Mg2+ 

‐22.0 ± 0.2  ‐21.3 ± 0.2 ‐21.8 ± 0.3 ‐18 ± 0.3   ‐17.9 ± 0.2 ‐20.2 ±  0.1 

CC  34 Na+  ‐21.7 ±0.3  ‐23.5  ± 0.2 ‐23.6 ± 0.3 NA NA  ‐22.8 ± 0.2

30 Na+ , 2 Mg2+ 

‐23 ± 0.3  ‐26.7 ± 0.3  ‐24.7 ± 0.3  ‐26.5 ± 0.2  ‐27.8 ± 0.2  ‐26.3 ± 0.1 

CU  34 Na+  ‐18.3 ± 0.2  ‐19.1 ± 0.2  ‐19.6 ± 0.2  NA  NA  ‐18.3 ± 0.2 

30 Na+ , 2 Mg2+ 

‐18.3 ± 0.2  ‐17.8 ± 0.2  ‐17.8 ± 0.2  ‐18.6 ± 0.2  ‐19.5 ± 0.2  ‐18.3 ± 0.1 

UU  34 Na+  ‐13.7 ± 0.3  ‐9.3 ± 0.3  ‐9.8 ± 0.2  ‐17.1 ± 0.2  NA  ‐9.3 ± 0.3 

30 Na+ , 2 Mg2+ 

‐14.9 ± 0.3  ‐11 ± 0.3  ‐15.6 ± 0.2  ‐15.4 ± 0.2  ‐14.3 ± 0.2  ‐15.5 ± 0.1