“suministro local de fármacos mediante nanopartículas … · repuesta sistema reticulo...

““SuministroSuministro local de local de ffáármacosrmacos mediantemediantenanopartnanopartíículas culas magnmagnééticasticas””

M.R. Ibarra1,2

R. Fernández-Pacheco1, C. Marquina2 , J.G Valdivia1,3 M. Gutierrez1,3, A. Viloria4, M.T. García4, A. Fernandez4, J. A. Jalón4 M. Arruebo1

1Instituto de Nanociencia de Aragón INA, Edificio Interfacultades II, Zaragoza 2Instituto de Ciencia de Materiales de Aragón (CSIC/Universidad de Zaragoza) 3Hospital Clínico Universitario, Universidad de Zaragoza (Spain)4Hospital Clínico Veterinario, Universidad de Zaragoza (Spain)

http//:ina.unizar.es

CONSOLIDER-Ingenio 2010

INDICE

Nanopartículas magnéticas y su aplicaciones en biomedicina

-Aplicaciones

-Preparación

-Caracterización

Experimentación “in-vitro”

-Biocompatibilidad

-Adsorción/desorción de fármacos

Experimentación “in-vivo”

Conclusiones

NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS

PRINCIPALES APLICACIONESPRINCIPALES APLICACIONES

SEPARACIÓN MAGNÉTICA

AGENTES CONTRASTE

MRI

BIOSENSORESINMUNO-MAGNÉTICOS

SUMINISTRO LOCAL

FÁRMACOS

HIPERTERMIA

NANODIAGNÓSTICO

NANOTERÁPIA

Suministro local de fármacos mediante

partículas magnéticas

Tumor sólido

Implantar un iman

Modular el campo magnético aplicado

Inyectar las nanopartículas magnéticas cargadas con el fármaco

Nuevos desarrollos en el INAColocar un imán permanente cerca del tumor

Ventajas de la utilización de Ventajas de la utilización de nanopartículas magnéticasnanopartículas magnéticas

Se puede controlar el tamaño

Se puede funcionalizar su superficie

Respuesta frente a campos magnéticos

Versátiles para su utilización “in-vivo”, “in-vitro” y “ex-vivo”

El tamaño puede modular su repuesta frente a campos magnéticos en organismos vivos

Repuesta nanopartículas Repuesta nanopartículas magnéticasmagnéticas

ESTÁTICA

DINÁMICA

-Suministro de fármacos (Terapia)

-Detección y cuantificación de biomoléculas(Inmunoensayos)

-Inhomogeneidadesmagnéticas para contraste (MRI)

-Absorción resonante de radiación electromagnética (Hipertermina, desorción de fármacos)

-Resonancia magnética

m

B

Repuesta sistema Repuesta sistema reticuloreticulo--endotelialendotelial

Inyección intravenosaInyección intravenosa

Torrente sanguíneo

Médula ósea

Bazo

Nódulos linfáticos

Inflamación

Tumor

Hígado

OPSONIZACIÓNLos agentes extraños son rodeados por proteínas plasmáticas para poder ser detectadas por los receptores fagocíticos del RES

¿Cómo evitarla?Hidrofilizando la superficie de las nanopartículas (PEG)

Captura en células de Kupffer Nanopartículas en el bazo

Acumulación esporádica en pulmón

Útil para el tratamiento del cancer de hígado, leishmania…..

Comportamiento magnético de la materia

Diamagnetismo

Toda la materia

Paramagnetismo

Atomos aislados

Ferromagnetismo

Algunos metales

Superparamagnetismo

Nanopartículas

100 µm 20 nm

Q.A. Pankhurst et al. J. Phys. D.:Appl.

Phys. 36 (2003) R167

Dominios magnéticosPartículas monodominio

G. Goya et al. INA (2006)

Las nanopartículas tipo “core-shell” reunen las

especificaciones para aplicaciones

biomédicas:

FeCarbon

-Son pequeñas

-Tienen una fuerte repuesta magnética

-Biocompatibles

-Capacidad de adsorber fármacos rápidamente

-Desorción lenta

BIOFERROFLUIDOSBIOFERROFLUIDOS

Fe2O3Nanoparticle

GraphiteEncapsulation

Fe2O3Maghemite

HRTEM

CGraphite

Plasma Krästchmer-Hoffman

-Biocompatibilidad

-Adsorción de fármacos

-Conjugación con proteinas

Fe

SiO2 FeFe

SiO2

Silica

Fe2O3-δδδδ

Fe

NanopartNanopartíículas de hierro encapsuladas en culas de hierro encapsuladas en ssíílicalica

Dynamic Light Scattering y medidas magnéticas determinanel tamaño de agregados

0 5 10 15 20 25 30 35 400

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Data: Count3_CountModel: LogNormal Equation: y = y0 + A/(sqrt(2*PI)*w*x)*exp(-(ln(x/xc))^2/(2*w^2)) Weighting:y No weighting Chi^2/DoF = 1.63508R^2 = 0.95743 y0 0.16669 ±0.34967xc 11.02898 ±0.19318w 0.27842 ±0.01822A 133.29081 ±7.06403

coun

ts

nm

TEM: 10 nm

NANOPARTICLES SIZE DISTRIBUTIONNANOPARTICLES SIZE DISTRIBUTION

El tamaño de las nanopartículas individuales se obtiene porMicroscopía electrónica de altaresolución y por Rayos X

DLS: 220 nm

Los ferrofluidos obtenidos tienen una fuerte repuesta magnética

INDICE


-Aplicaciones

-Preparación

-Caracterización


-Biocompatibilidad



Conclusiones

TestTest de de biocompatibilidadbiocompatibilidadhematolhematolóógicagica

“In vivo” conejos de raza neozelandesa

• Se tomaron muestras de sangre antes y después de injectar lasnanopartículas.

• 1 ml de Nanoparticulas a una concentración de 12.5 mg/ml de Gelafundineno modifican la viscosidad de la sangre ni del plasma.

• La agregación eritrocitaria se presenta pequeñas variaciones sin importancia

“In vitro” en sangre humana

• Se han medido los parámetros hematológicos en sangre humana con distintas concentraciones de nanopartículas (5 ml de sangre y 0, 0.06, 0.12, 0.24 and 0.5 ml of ferrofluid). Se obtuvieron valores normales en todos lostest, con variaciones inferiores al 10% respecto de controles normales.

NanopartNanopartíículas en culas en torentetorente sangusanguííneoneoTest de biocompatibilidad

•Ausencia de “Blue Perls stain”: buen encapsulamiento por capas grafíticas

•Ausencia de partículas en monocitos y granulocitos

VS230 VS 23 VS5,7 AE5M AE5M1 AE10M AE10M1BASAL 4,44 6,7 7,2 3,4 10 8,3 22,5C.0,06 4,36 5 7,6 3,4 8,9 7,6 20,6C.0,12 4,45 7 8 3 8,4 7,6 18C.0,24 4,33 5,4 6,9 2,9 7 7,1 18,6C.0,5 4,1 6,2 6,4 2,9 6,9 8,8 20,1

0

5

10

15

20

25

VS230 VS5,7 AE5M1 AE10M1

BASALC.0,06C.0,12C.0,24C.0,5

RESULTS IN HUMAN BLOODRESULTS IN HUMAN BLOOD

AE = Erythrocyte aggregation(M: stasis, M1 minutes under low shear rate)

VS = Blood viscosity Shear rate (s-1)

C= Particles concentration (mg/ml)

Estudio de adsorción y Estudio de adsorción y desorcióndesorción de fármacosde fármacos

Doxorubicin (11x 13 Å)

300 400 500 600 700 800

1

2

3

Abs

nm

498 nm296 nm

Fe2O3Nanoparticle

GraphiteEncapsulation

Absorbance spectra of Doxorubicin. Kinetics of adsorptionAbsorbance spectra of Doxorubicin. Kinetics of adsorption

The adsorbent particles were sedimented with a 3 KOe permanent magnet, and the optical density of the

supernatant measured with a UV spectrophotometer (method proposed by Kuznetsov, A. et al, (1999) J. Mag.

Mag. Mat. 194, 22).

200 400 600 8000,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

Ab

s

λλλλ (nm)

INICIAL

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

t (min)

adso

rbed

do

xoru

bic

in (

a.u

.)

Absorbance spectra of Doxorubicin after Absorbance spectra of Doxorubicin after desorptiondesorption

The adsorbent particles were sedimented with a 3 KOe permanent magnet, and the optical density of the

supernatant measured with a UV spectrophotometer (method proposed by Kuznetsov, A. et al, (1999) J. Mag.

Mag. Mat. 194, 22).

400 600 800

0,3

0,6

0,9

Abs

λ (nm)

Final

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

0,3

0,6

0,9

DO

XR

RU

BIC

INA

DE

SO

RB

IDA

(a.

u.)

t (horas)

INDICE


-Aplicaciones

-Preparación

-Caracterización


-Biocompatibilidad



Conclusiones

Modelo quirúrgico laparoscópco de implante de iman

Experimentación in vivo de localización de partículas magnéticas mediante administación por via sistémica

Implante imán riñón izquierdo

Riñon derecho con incisión sin implante

Presencia de nanopartículas

Ausencia de nanopartículas

Conejo 22 Conejo 23

RiRiñóñón con implante magnn con implante magnéético: concentracitico: concentracióón de nanopartn de nanopartíículasculas

Conejo 25

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

-La aplicación de las nanopartículas magnéticas en medicina abre nuevas expectativas en la clínica humana tanto en el diagnostico precoz como en la terápia

-Se ha probado la biocompatibilidad sanguínea y la capacidad de adsorber y desorber doxorubicina en nanopartículas “core-shell” de Fe&C.

-Se ha comprobado la capacidad de localización con implantes magnéticos

-El reto es hacer la superficie hidrofílica para evadir la detección y captura por el RES sin perder la capacidad de portar la doxorubicina.


Comité de Dirección

SCIENTIFIC CONSOLIDER TEAM

NANOTECHNOLOGIES IN BIOMEDICINE

NANOTHERAPY NANODIAGNOSTIC

Preparation

L. Liz & M.J. Alonso

Funcionalization

A. González

“In-Vitro”

V. Puntes

“In-Vivo”

G. Valdivia

N A N O P A R T I C L E S

Electrochemical

platforms

A. Markoçi

Miniaturized

electrodes

F. Pérez-Murano

Lateral Flow

J.M. De Teresa

B I O S E N S O R S

SPION

X. Batlle

Biological barriers

E. Giralt

Targeting and

Experimental

Models

A. Trés

M R I

Early Cancer Detection


NANOMEDICINA

CIBER

CONSOLIDER CENIT

PROGRAMA INGENIOPROGRAMA INGENIO--20102010

ESCALAS DE LONGITUDESCALAS DE LONGITUDDISTANCIA TIERRA-SOL

HOMBRE

HOJA DE PAPEL DE CANTO

VIRUS

MOLÉCULA ADN

ATOMO

1.5 x 1011 m

1.5 m

10-4 m

5 x 10-8 m

2 x 10-9 m

2 x 10-10 m

1 nanómetro = 10-9 m

BARRERAS PARA LA NANOTECNOLOGÍA EN BIOMEDICINA

Físicos-Químicos

Bioquímicos-Farmaceúticos

Médicos

Los tejidos tumorales expulsan las nanopatículas y los sanos las retiran de la circulación

Funcionalización Internalización

Diferentes tipos de tejido endotelialDiferentes tipos de tejido endotelialLas células que forman el endotelio regulan la permeabilidad de los agentes y su estructura es diferente dependiendo del órgano.

Sistema nervioso central (BBB “Blood-Brain-Barrier)

Capilares continuos: Mayoriade los tejidos (Musculos, piel..)

Capilares abiertos: riñon, instentinos, glandulas..

Capilares sinusoidales: higado, bazo, médula espinal

Nanopartículas entre 60-80 nm se eliminan de la circulación en 8-10 minutos

Magnetic implant in the left kidney

Right kidney witout magnetic implant

Localization of nanoparticles

Lack of nanoparticles

Absorbance spectra of Absorbance spectra of DoxorubicineDoxorubicineafter after desorptiondesorption from carbon coated from carbon coated magnetic nanoparticlesmagnetic nanoparticles

The adsorbent particles were sedimented with a 3 KOe permanent magnet, and the

optical density of the supernatant measured with a UV spectrophotometer (method

proposed by Kuznetsov, A. et al, (1999) J. Mag. Mag. Mat. 194, 22).

144h120h72h60h48h54h

Dynamic of the adsorption and release of Dynamic of the adsorption and release of DoxorubicineDoxorubicine on carbon coated magnetic on carbon coated magnetic

nanoparticlesnanoparticlesSaturation after 20 minutes Complete release after 100 hours

AdsorptionDesorption

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

t (min)

Ado

srbe

d do

xoru

bici

n C

(a.

u.)

B

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Des

robe

d C

(a.

u.)

t (h)

B fit

A 100 µµµµg/ml solution of doxorubicin hydrochloride was mixed with 1 mg/ml of distilled water. The

suspension was incubated on a shaker at room

temperature, and samples were taken after 5, 15, 30,

60, 90, 120 and 180 minutes.

Doxorubicin loaded nanoparticles were mixed with

human blood serum at the concentration of 1 mg/ml.

The suspension was incubated on a shaker at 37 oC,

and samples were taken each 8 hours during four

days and UV absorbance spectra of the supernatant

were obtained.

Optical Microscope Imageof the permanent magnet

coated with gold.

Percutaneus insertion of the permanent magnet

The rabbits were submitted to general anaesthesia with endotracheal intubation.

A laparoscopic optic was introduced by using a 5 mm trocar.

Under endoscopic control, the permanent magnet was implanted in the lower pole of the righ kidney

Bioferrofluid

125 mg of ournanoparticles weresuspended in 100 ml of gelafundine

In coll. Hospital Clínico Veterinario

1 ml of the fluid wereinjectedintravenously in the marginal ear vein of the rabbit.

Magnet implant in the left kidney

Right kydney witout magnetic implant

Localization of nanoparticles

Lack of nanoparticles

Rabbit 22 Rabbit 23

KidneyKidney withwith magneticmagnetic implantimplant::

SomeSome concentrationconcentration of nanoparticlesof nanoparticles

In coll. Hospital Clínico Veterinario: Dr. A. Viloria, Dra. MªTeresa García, Dr. Angel Fernandez and Dr. J. A. Jalón

Liver Capture in Kuffer cells Nanoparticles in spleen

Reduced concentration of nanoparticles in lung

Macrophagycapture in

organs

OUTLINE OF THE TALKOUTLINE OF THE TALK

-Introduction

-Encapsulated nanoparticles:preparation andcharaterization

-Morphology, Structure and Magnetism of the nanoparticles

-Bioferrofluids for local drug delivery

-Invivo experiments: magnet implant and magneticlocalization

-Conclusions

Biologicallabeling

Contrastagent

Oftalmology

Hiperthermy

Selective drugdelivery

Bioferrofluid

Medical application of magnetic nanoparticles

Matter manipulationat atomic level

Inteligentnanovectors

Targeting

The The newnew worldworld of nanoscienceof nanoscience

HRTEM images of Fe encapsulated nanoparticles

Fe2O3Nanoparticle

GraphiteEncapsulatio

n

Fe2O3Maghemite

HRTEM

CGraphite

Fernandez Pacheco R., Ibarra M.R.,…J. Proceeding of the NSTI Nanotech 2005 (Anaheim, California) Vol 1 pag 144-147

If K �� 0

The supermoment followsthe Langevin law

If K>>>

The supermoment followsthe Brillouin J=1/2 law

Classic paramagnet Quantum paramagnet

CATODE

Refrigeration

Gas

Vacuum

ANODE

“SOOT”DEPOSIT

“WEB-LIKE SOOT”“COLLARETTE”

Kratschmer-Huffman Method-The anode is a graphite-metal composite

-Several carbon and graphitic structures are obtained

Bioferrofluid

125 mg of ournanoparticles weresuspended in 100 ml of gelafundine

In coll. Hospital Clínico Veterinario

1 ml of the fluid wereinjectedintravenously in the marginal ear vein of the rabbit.

30 nm �� 5 % atoms at the surface



How How smallsmall??

Crítical size for single-domain particle

-Under size reduction the coercive field increases and the the particle becomes single-domain

-When EK=KV as V � 0 then EK � 0 superparamagnetic limit

-At this situation the particle magnetic moment will fluctuate independently of the particle

KV = kBT

Real superparamagnetic system

-No hystheresis

-The isotherm presents a universal H/T behaviour

-40000 -30000 -20000 -10000 0 10000 20000 30000 40000

-200

-150

-100

-50

0

50

100

150

200

M (

emu/

g)

H (Oe)

-1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

M (

emu/

g)

H (Oe)

C

EncapsulatedEncapsulated Fe nanoparticlesFe nanoparticles


-Introduction

---EncapsulatedEncapsulatedEncapsulated nanoparticles:preparationnanoparticles:preparationnanoparticles:preparation andandandcharaterizationcharaterizationcharaterization




-Conclusions


-Introduction


---Morphology, Structure and Magnetism of the Morphology, Structure and Magnetism of the Morphology, Structure and Magnetism of the nanoparticles nanoparticles nanoparticles



-Conclusions


-Introduction



---BioferrofluidsBioferrofluidsBioferrofluids forforfor local drug local drug local drug deliverydeliverydelivery


-Conclusions


-Introduction




---InvivoInvivoInvivo experimentsexperimentsexperiments: : : magnetmagnetmagnet implantimplantimplant andandand magneticmagneticmagneticlocalizationlocalizationlocalization

-Conclusions

• Increase of:

– Plasma and blood viscosity

– Red blood cells aggregability

• Activation of Coagulation

– “Factor XII” activation

– Platelets activation

– Vascular endothelium damage

• Withdrawal of particles by phagocytes

Non desire effects of the circulating particles in the blood stream

Si consideramos el sistema circulatorio

como una red de distribución para

nanopartículas:

Asmatulu et al. JMMM, (2004)

Velocidad de flujo en la arteria carótida (Asmatulu

y cols., JMMM 2005)

Fuerza de arrastrede la sangre

Llevando las partículas a donde

se requiere

Campo magnéticoexterno

Es necesario sobrepasar un umbral de fuerza magnética:- Aumentar el campo externo- Aproximar el imán

EFTEMSiO2 plasmon

Fe2O3 Hematite

Fe

SiO2 FeFe

SiO2

HRTEM

(100)Fe

(02-3) Fe2O3

(022)Fe2O3

Fe fcc

Green Fe2O3(Hematite)Red Fe fccBlue SiO2 Plasmon

EFTEM

SAED

Magnetic Nanoparticles

•Fe@C 200 nm aggregates

•Fe3O4@SiO2 80 nm

•Fe3O4@ZY 40 nm

•SiO2 spheres with Fe3O4 1µm

OH

OH

OH

NC

OCOOH

COOHH

NH2

NH2

NN

H H

GLUTARALDEHYDEGLUTARALDEHYDE

CARBODIIMIDECARBODIIMIDE

FeSiO2 NH2

NH2

NH2NH2

NH2FeSiO2 COOH

COOH

COOHCOOH

COOH

Local drug delivery by using magnetic carriers

Solid tumor

Magnetimplantation

Intravenousadministration of magnetic carriers

New development at the INALapararoscopic implant of a permanent magnet

BIOSENSORS TEST

NANOPARTICLE PREPARATION

-Core Shell Nanoparticles

-Matrix Nanoparticles

-SPIONS

DEVELOP OF MICRO

AND NANODEVICES

FOR BIODETECTION PLATFORMS

-Microcircuitry

-Nanolithography

-Magnetoresistive sensors

-Microcoils

LINEAS DE INVESTIGACIÓN

FUNCTIONALIZATION

“IN-VITRO”“EXVIVO”

“IN-VIVO”

TECHNOLOGICAL TRANSFER

(100)Fe

(02-3) Fe2O3

(022)Fe2O3

EFTEMSiO2

plasmon

Fe2O3

Hematite

Fe fcc

ESTRUCTURA CRISTALINA EN LA NANOESCALAESTRUCTURA CRISTALINA EN LA NANOESCALA

Imagen (espacio real)Imagen (espacio real) Imagen (espacio recImagen (espacio recííproco)proco)

TransformadaFourier

FILTRADO

Nanopartículas-”Nanodevices” del futuro

Los materiales tienen una determinada funcionalidad

La reducción de tamaño la modifica, refuerza o la hace más adecuada para deteminadas aplicaciones

El tamaño es importante pero tambien lo es la superficie

-Aplicaciones electrónicas: espintrónica:

Tamaño-coulomb blockage (Magnetic Spinsingle transistor)

Superficie-Magnetoresistencia elevada (MUND)

-Aplicaciones biomédicas

Tamaño-coexisten con células en la sangre y viajan por todo el cuerpo (Drug delivery)

Superficie-se funcionalizan con grupos peptidicos con acción específica ->Nueva herramienta en ingeniería molecular con implicaciones en farmacia y biomedicina

“suministro local de fármacos mediante nanopartículas … · repuesta sistema reticulo...

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