studio dei fenomeni apoptotici negli spermatozoi e correlazione con i processi di capacitazione e...
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STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e
FAGOCITOSIFAGOCITOSI
DottorandaDottoranda Stefania LuppiStefania Luppi
XXXIII Ciclo del Dottorato di Ricerca in Medicina materno-infantile,Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia
29 Settembre 2008
Relazione I anno
APOPTOSI
Morte cellulare programmata Fagocitosi corpi apoptoticiSENZA infiammazione
Ruolo essenziale nel CONTROLLO NUMERO CELLULE GERMINALI Lee et al. 1997
Spermatogenesi: PERDITA di circa il 75% del pot. numero di spz maturi Dunkel et al.1997
Rottura equilibrio=
DIFETTI MATURAZIONE
FERTILITA’??
• Individuata via di segnalazione Fas in spz EIACULATI
• M con parametri liquido seminale anormale: % spz Fas+
“APOPTOSI ABORTIVA”In alcuni casi di INFERTILITA’ compromissionedi mecc. apoptotici durante spermatogenesi, percui Spz Fas+ NON vengono eliminati.
Sakkas et al., 1999, 2002
Il SISTEMA Fas/FasL
GERM CELL
SERTOLI
FasL
FasDD
Soggetti normo- e non normo-zoospermiciFas presente su membrana LEUCOCITI
Dati i risultati contrastanti presenti in letteratura è da chiarire la presenza o meno di Fas
su spz eiaculati
RIDUZIONE dell’INTEGRITA’ di MEMBRANA
Molto frequente in SOGGETTI INFERTILI Ricci et al.,2002; Glander et al.,1999
Perdita asimmetria PL di membrana Traslocazione Fosfatidil-Serina(PS)
Evento PRECOCE di apoptosi
ec
ic
FACS
+ PI
Spermatozoi:
• vitali (AV-/PI-)
• apoptotici (AV+/PI-)
• necrotici (AV+/PI+)
Legame AnnessinaV fluo (AV) - PS
Perticarari et al., 2007
lega DNA cell vive/apoptotiche penetra in cell necrotiche
FACS
Spermatozoi:• vitali (Syto-16++)• apoptotici (Syto-16+)• necrotici (Syto-16-/7-AAD+)
Syto-16 / 7-AAD (7-Amino-Actinomycin-D)
LEUCOCITI e APOPTOSI
Funzione cellulare fisiologica dei leucociti, in assenza di infez., responsabili
di RIMOZIONE SPZ APOPTOTICI migliorando la qualità del seme.
moAb anti-CD45FACS [ ] leuco:
• monociti• linfociti• PMN
Potenziale enorme di interazioni tra leucociti e sist.riproduttivo Ruolo leucociti nel liquido seminale non ancora spiegato
Correlazione LEUCOCITI
spze INDICE APOPTOTICO spz
in soggetti normo- e NONnormo-zoospermici Ricci et al., 2002
FAGOCITOSI degli SPZ APOPTOTICI
a. In mammiferi dopo INSEMINAZIONE una grande q di spz viene
rimossa attraverso FAGOCITOSI da parte delle cellule del tratto
genitale Suarez et al., 2002; Pandya e Cohen, 1985
b. FECONDAZIONE avviene SOLO in seguito a CAPACITAZIONE degli spz nel tratto genitale
In app genitale dopo richiamo LEUCOCITI per chemotassi,
inducono APOPTOSI spz post-capacitati che NON hanno fertilizzato
l’ovocita, a cui segue la FAGOCITOSI senza reaz infiammatoria.
OBIETTIVI della RICERCA:
1. Studio dell’APOPTOSI degli spz, in condiz. fisiologiche e dopo capacitazione in vitro:
- diversi marker dell’apoptosi- in pz normo- e NONnormo-zoospermici
Metodiche: AV/PI; Syto-16/7-AAD in FACS
2. Analisi del SISTEMA Fas/FasL negli spz, in condiz. basali e dopo capacitazione in vitro e nei leucociti
Metodiche: moAb fluoresceinati anti-Fas in combinazione con il FACSmoAb fluoresceinti anti-CD45
3. Definire il ruolo dei LEUCOCITI in rapporto all’apoptosi e alla rimozione degli spermatozoi
Metodica: moAb fluoresceinati anti-CD45 in FACS
5. Analisi del processo di FAGOCITOSI degli spz in condizioni basali e dopo capacitazione in vitro in pz normo- e NONnormo-zoospermici:
- anomalie nella fagocitosi in casi di INFERTILITA’ di COPPIA- > suscettibilità di spz di maschi infertili ad essere fagocitati
Tali informazioni fornirebbero una possibilità in più per la diagnostica delle infertilità e una possibile chiave di intervento per il loro trattamento.
4. Confermare il risultato di altri studi in cui si è dimostrato che, se
indice apoptotico spz è > 40%, si riscontra < prob di gravidanza e > prob di aborti spontanei in seguito a tecniche di PMA (IUI, FIVET)
…..
RISULTATI PRELIMINARI
1) Allestito test citometrico per verificare CAPACITA’ di FAGOCITOSI degli spz da parte di MACROFAGI (FACS)
Risultati confermati con MICROSCOPIA OTTICA A FLUORESCENZA
Phrodo succinimydil ester
2) Suscettibilità spz ad essere fagocitati PRIMA e DOPO CAPACITAZIONE in vitro
Fagocitosi può favorire RIMOZIONEspz meno efficienti
Spz non coloratiSpz non cap pHrodoSpz cap pHrodo
3) Differenza dovuta a ≠ espressione di molecole di spf come C1q (macrofagi) e C1qR (spz)
AMPLIARE CASISTICA per verificare se questa differenza è correlataa ≠ fagocitosi da parte dei macrofagi e comprendere se e come
le 2 tecniche di capacitazione in vitro (MP e SU) possano influire su tale meccanismo.
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
FL1-H: C1qr FITC
0
20
40
60
80
100
% o
f M
ax
68.2
Spermi non cap solo second.004 61.2
Spermi non cap 60.006 59
Spermi non cap 74.005 68
Spermi MP NC.007 84.7
Spermi MP solo second.008 90.7
Spermi MP 60.010 91.7Spermi MP 74.009 91.5
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
FL1-H: C1qr FITC
0
20
40
60
80
100
% o
f M
ax
52
NON CAP CAP (mp)
NON CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60
CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60