Struktura DNK i RNK

Dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) i ribonukleinska kiselina (RNK) su polimeri izgrađeni od monomernih jedinica –nukleotida.

Molekuli DNK se sastoje od dva polinukleotidna lanca koji su spiralno uvijeni i formiraju dvolančanu zavojnicu ili dupli heliks.

Molekuli RNK se sastoje od jednog polinukleotidnog lanca.

Građa nukleozida i nukleoida

ostatak fosforne kiseline

šećer – pentoza

azotna baza

nukleotid

nukleozid

Azotne baze

Pentoze Fosfatna grupa

H3PO4 - fosforna kiselina je jaka kiselina

Kiselinski ostatak fosforne kiseline se naziva fosfatni jon

Jonizuje do dihidrogenfosfatnog jona i protona (H2PO4- i H+), a

zatim dalje do monohidrogenfosfatnog jona (HPO42-)i fosfatnog

jona (PO43-)

Iako se sve ove hemijske forme se nalaze u ravnoteži u vodi, konvencijom se fosfatni jon u biologiji predstavlja kao HPO4

2- iliskraćeno Pi (neorganski fosfat)

U biološkim molekulima fosfor se najčešće javlja u formi kiselefosfatne grupe -PO4

2-

Sastav DNK nukleotida:

dezoksiriboza

azotna baza (A, G, C ili T)

ostatak fosforne kiselina

Sastav RNK nukleotida:

riboza

azotna baza (A, G, C ili U)

ostatak fosforne kiselina

Hemijske veze u nukleotidu

ostatak fosforne kiseline

šećer – pentoza

azotna baza

(Tad)

Nazivi nukleozida i nukleotida

Nukleotide možemo smatrati, s jedne strane kao estre nukleozida (fosfate), a sa druge strane kao kiseline zbog prisustva ostataka fosforne kiseline pa im u skladu sa tim dajemo i nazive.

Dezoksiribonukleotidi

dezoksiadenozin-5'-monofosfatdezoksiadenozinmonofosfat5'-dezoksiadenilna kiselinadezoksiadenilat

A, dA, dAMP

dezoksiadenozin

NUKLEOTID:

SKRAĆENICE:

NUKLEOZID:

dezoksiguanozin-5'-monofosfatdezoksiguanozinmonofosfat5'-dezoksiguanilna kiselinadezoksiguanilat

G, dG, dGMP

dezoksiguanozin

Dezoksiribonukleotidi

NUKLEOTID:

SKRAĆENICE:

NUKLEOZID:

(dezoksi)timidin-5'-monofosfat(dezoksi)timidinmonofosfat5'-(dezoksi)timidilna kiselina(dezoksi)timidilat

T, dT, dTMP

(dezoksi)timidin

dezoksicitidin-5'-monofosfatdezoksicitidinmonofosfat5'-dezoksicitidilna kiselinadezoksicitidilat

C, dC, dCMP

dezoksicitidin

Ribonukleotidi

adenozin-5'-monofosfatadenozinmonofosfat5'-adenilna kiselinaadenilat

A, AMP

adenozin

guanozin-5'-monofosfatguanozinmonofosfat5'-guanilna kiselinaguanilat

G, GMP

guanozin

NUKLEOTID:

SKRAĆENICE:

NUKLEOZID:

Ribonukleotidi

NUKLEOTID:

SKRAĆENICE:

NUKLEOZID:

uridin-5'-monofosfaturidinmonofosfat5'-uridilna kiselinauridilat

U, UMP

uridin

citidin-5'-monofosfatcitidinmonofosfat5'-citidilna kiselinacitidilat

C, CMP

citidin

Nukleozid-difosfati i nukleozid-trifosfatine ulaze u sastav nukleinskih kiselina

adenozin-5’-trifosfat (ATP)

Povezivanje nukleotida u polinukleotidni niz

fosfodiestarske veze izmeđuC3’ atom pentoze jednog nukleotida i C5’ atoma pentoze narednog nukleotida u lancu

Redosled nukleotida – primarna struktura DNK i RNK

Početak polinukleotidnog niza je 5’ kraj

Sekundarna struktura DNK

dvolančana zavojnica ili dupli heliks

Vodonične veze između komplementarnih baza

guanin citozin

timin adenin

B DNK (Watson-Crick-ov model)

• DNK najčešće zauzima ovu konformaciju• desnogira zavojnica, jedan okret je 3,4 nm (34 Å) i sadrži 10 bp (10,5)• rastojanje između dva bazna para je oko 0,34 nm (3,4 Å)• antiparalelni lanci• prečnik 2nm (20 Å)• razlikujemo veliki i mali žljeb u kojima se nalaze atomi bočnih grupa azotnih

baza• okosnicu molekula čine šećeri i fosfati• baze nalaze u unutrašnjosti, ravni baza su skoro normalne u odnosu na osu

molekula, komplementarne baze se povezuju vodoničnim vezama

B DNK

• stabilnost zavojnice

1. vodonične veze između komplementarnih baza

2. hidrofobne interakcijenegativno naelektrisane fosfatne grupe nasuprot nepolarnim bazama

3. Stacking interactions ili base stackingnastaju usled interakcije elektrona baza koje su naslagane jedna na drugu u nepolarnoj unutrašnjosti heliksa

4. Jonske interakcije soli stabilizuju heliks jer maskiraju negativno naelektrisanje fosfatnih grupa

5. Rigidne difosfatne veze u okosnici DNK lanca

Veliki žljeb je bogat hemijskom informacijom na osnovu koje se razlikuju baze

v ivice baza nalaze se u velikom i malom žljebu kreirajući određen patern donora ili akceptora vodonične veze kao i patern Van der Valsove površine koja identifikuje svaki bazni par

A - akceptor vodonične vezeD - donor vodonične vezeM - hidrofobna površinaH - nepolaran vodonik

v to je kao kod po kom se razlikuju A-T, T-A, C-G i G-C bazni parovi

v na osnovu ove hemijske informacije proteini prepoznaju DNK sekvencu

v mali žljeb je siromašan u hemijskoj informaciji (ne može se razlikovati A-T od T-A kao i G-C od C-G)

Primer: A-T bp prikazuje sledeće hemijske grupe, sledećim redosledom u velikom žljebu

Veliki žljeb

Mali žljeb

A:T T:A

A - akceptor vodonične veze – N7 adeninaD - donor vodonične veze – amino grupa vezana za C6 adenina A - akceptor vodonične veze – karbonilna grupa vezana za C4 timinaM - hidrofobna površina – metil grupa vezana za C5 timina

Veliki žljeb

Mali žljeb

Veliki žljeb

Mali žljeb

A:T T:A

G:C C:G

Polimorfizam sekundarne strukture DNK

• šira i kraća od B zavojnice• desnogira zavojnica, jedan okret sadrži 11 bp• osa zavojnice ne prolazi kroz baze, a ravni baza su pod uglom u odnosu na osu• familiji A zavojnica pripadaju konformacije označene sa A i A’ koje formiraju

dvolančani molekuli RNK, kao i hibridi RNK-DNK (dvolančana RNK ne može da formira B zavojnicu jer 2’ OH grupa riboze predstavlja sternu smetnju)

• mali žljeb je veoma plitak, fosfatne grupe vezuju manje vode nego kod B DNK i u in vitro sistemu utvrđeno je da dehidratacija favorizuje ovu konfomaciju dvolančane DNK

A DNK

• uža i duža od B zavojnice• levogira zavojnica, jedan sadrži 12 bp• ima samo jedan žljeb• okosnica molekla ima oblik cik-cak linije pa po tome nosi naziv• ovu konformaciju zauzimaju delovi polinukleoidnog lanca u kojima se purinski

i pirimidinski nukleotidi naizmenično smenjuju (kod takve primarnestrukture uzastopne glikozidne veze se nalaze u sin i anti konformaciji, dok se kod A i B zavojnice sve nalaze u anti konformaciji)

• metilacija C stabilizuje ovu strukturu• značaj u genskoj regulaciji• spoj izmedu Z i B konformacije čini niz od oko 10-ak nukleotida, na tom delu

dolazi do savijanja lanca, pa se smatra da su i delovi važni za superspiralizaciju DNK

Z DNK

Denaturacija DNK

v denaturacija - narušavanje sekumdarne strukture DNK i razdvajanje dvalanca

v denaturacija je reverzibilna, ako npr. zagrejan rastvor DNK polako hladimo dolazi do ponovnog spajanja komplementarnih lanaca – renaturacija

v denaturacija i renaturacija DNK su visoko kooperativni procesi

v hibridizacija - sposobnost jednolančanih polinukleotidnih lanaca koji imaju kompelmentarne redoslede nukleotida da nagrade dvolančani hibridni molekul

v denaturisana DNK može da hibridizuje sa denaturisanom DNK iste ili različite vrste, ili sa RNK

v hibridizacija je osnova za nekoliko izuzetno važnih tehnika u mol. biologiji

v na povišenim temperaturama ili pri visokoj pH vrednosti DNK se denaturiše (topi)

v Tm – temperatura topljenja (melting temperature)

- ona temperatura na kojoj je polovina DNK lanca denaturisana- predstavlja merilo stabilnosti DNK

Temperatura topljenja DNK

v DNK ima maksimum apsorpcije na 260 nm (zbog prisustva azotnih baza)

v denaturacijom DNK povećava se njena absorpcija na 260 nm za (30-40%) –hiperhromni efekat

v razlog: stacking interakcije uzmeđu baza u dvolančanoj zavojnici smanjuju njihovu sposobnost da apsorbuju UV svetlo

Optički test za praćenje denaturacije DNK

Kriva topljenja DNK

Unutrašnja svojstva DNK koja utiču na Tm:

1. GC sastav- više GC parova veća Tm- uticaj se može opisati jednačinom: Tm=T0 + 0,41 (% GC), T0 – razni faktori

2. Dužina lanca- duži lanac – viša Tm (preko 500 bp više nema efekta)

3. Procenat tačno sparenih baza- na 1,5% netačno sparenih baza Tm opada za 1°C

4. Redosled nukleotida u lancu- hidrofobne interakcije baza nisu iste za svih 10 nukleotida koji se mogu

naći jedan pored drugog- postoji termodinamička karakterizacija svih interakcija

Kako karakteristike rastvora u kom je DNK utiču na Tm:

1. Jonska snaga rastvora- ukoliko je veća koncentracija soli, veća je i koncentracija jona (Na+, K+, Mg2+...) koji

neutrališu negativno naelektrisanje DNK, smanjujući elektrostatičko odbijanje dva lanca, čime se povećava stabilnost DNK i Tm

- uticaj koncentracije soli se može opisati jednačinom:Tm=T0+16,6 log[NaCl], [NaCl] < 1M, T0 - razni faktori

2. pH rastvora- pri ekstremnim vrednostima pH (izvan opsega pH 5-9) baze se jonizuju i prekidaju se

vodonične veze, tako da Tm dramatično opada

3. Polarnost rastvarača- polarniji rastvarač – veća stabilnost i Tm jer su jače hidrofobne interakcije između

baza (organski rastvarači uglavnom teže da smanje Tm)

4. Temperatura- veća temperatura rastvora favorizuje neuređene strukture

5. Destabilišući agensi - formamid, urea, dimetilsulfoksid (DMSO)

Enzimi topoizomeraze kontrolišu stepen superspiralizacije.

Ako posmatramo cirkularne molekule dvolančane DNK na elektronskim mikrografijama možemo da vidimo da su izuzetno izuvijani. To se naziva superspiralizacija DNK, a prisutna je i kod linearnih DNK molekula. Superspiralizacija nastaje kada se dvolančana DNK dodatno uvija u prostoru.

Određen nivo superspiralizacije je neophodan i za cirkularne i za linearne DNK molekule, jer omogućava procese replikacije i transkripcije.

Superspiralizacija DNK

Nukeozomi su odgovorni za negativnu superspiralizaciju kod eukariota

DNK žiraza je odgovorna za negativnu superspiralizaciju prokariotskih hromozoma

Sekundarna i tercijerna struktura RNK

uracil

adenin

• tRNK i rRNK imajukarakterističnu sekundarnu itercijernu strukturu, dok je savijanje iRNK sprečeno raznim proteinima koji sa njom interaguju

Pored standardnog Watson-Crick-ovog sparivanja baza (G-C i A-U) formiranju sekundarne i tercijerne strukture RNK doprinose i nestastandardno tzv. kolebljivo sparivanje baza koje je manje stabilno (najčešće G-U) .

Invertovani ponovci

5' AGAACAnnnTGTTCT 3‘3' TCTTGTnnnACAAGA 5'

Palindromi

5' GGCC 3‘3' CCGG 5'

Ukosnica (drška + petlja)(Stem and loop or hairpin loop)

Isupčenje(bulge loop)

Spoj ili višestruka petlja

Pseudočvor(pseudoknot)

Sekundarne strukture RNK

Stem

jednolančana RNK

ukosnica

ispupčenje

unutrašnjapetlja

spoj ili višestruka petlja

pseudočvor

Sekundarna i tercijerna struktura tRNK

antikodon

vezivanjeaminokiseline

vodonične veze između baza

Zašto je DNK molekul (a ne RNK) nosilac naslednih informacija?

Genetički materijal mora da bude stabilan da bi se informacija prenela sa jedne na drugu generaciju

Dve osnovne razlike u hemijskoj građi između DNK i RNK molekula:

1. DNK sadrži deoksiribozu umesto riboze

2. DNK sadrži timin umesto uracila

üDNK je termodinamički stabilniji od RNK molekula jer nema 2’ OH grupu

üRNK je podložna alkalnoj hidrolizi, a DNK nije

1.

Alkalna hidroliza RNK Deprotonizacija u baznoj sredini i

nakon toga nukleofilni napad na P atom što dovodi do

raskidanja fosfodiestarske veze

2’,3’ ciklični fosfat(intermedijer)

§ Dvovalentni katjoni stabilizuju ciklični fosfat (intermedijer) tako da promovišu RNK degradaciju

§ Povišena temperatira i pH takođe promovišu RNK degradaciju

Slučajnom hidrolizom cikličnog fosfodiestra (intermedijer) nastaje 2’ i 3’ nukleozid monofosfati

Kompletnom alkalnom hidrolizom RNK nastaje smeša 2’NMP i 3’NMP

2.

ü Timin umesto uracila

üDeaminacijom citozina nastaje uracil kod reparacioni mehanizmi prepoznaju jer se prirodno ne nalazi u DNK molekulu

Deaminacija citozinaTimin (5 metil uracil)